KR102176161B1 - 돼지 내인성 레트로바이러스 Envlope C 음성, GGTA1, CMAH, iGb3s, β4GalNT2 유전자가 넉아웃되고, 인간 CD46 및 TBM 유전자를 발현하는 이종장기이식을 위한 형질전환 복제돼지 및 이의 제조방법 - Google Patents

돼지 내인성 레트로바이러스 Envlope C 음성, GGTA1, CMAH, iGb3s, β4GalNT2 유전자가 넉아웃되고, 인간 CD46 및 TBM 유전자를 발현하는 이종장기이식을 위한 형질전환 복제돼지 및 이의 제조방법 Download PDF

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    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01092—(N-acetylneuraminyl)-galactosylglucosylceramide N-acetylgalactosaminyltransferase (2.4.1.92)

Abstract

본 발명은 PERV (Porcine Endogenous Retrovirus) EnvC가 음성이고, GGTA1(α1,3-galactosyltransferase), CMAH(CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase), iGb3s(Isoglobotrihexosylceramide synthase) 및 β4GalNT2(Beta-1,4-N-Acetyl-Galactosaminyl Transferase2)가 넉아웃되고, 인간 CD46 및 TBM(Thrombomodulin) 유전자를 발현하는 이종장기이식용 형질전환 복제돼지 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 형질전환 복제돼지는 이종장기이식에서 발생되는 돼지 내인성 레트로바이러스의 전이를 발생시키지 않으면서도, 초급성 및 항원-항체 매개 면역 거부반응, 혈액응고에 의한 면역 거부반응, 보체 활성에 의한 면역 거부반응을 극복할 수 있는바, 이를 이종간 장기 및 세포 이식을 위한 공여 동물로서 유용하게 활용할 수 있다.

Description

돼지 내인성 레트로바이러스 Envlope C 음성, GGTA1, CMAH, iGb3s, β4GalNT2 유전자가 넉아웃되고, 인간 CD46 및 TBM 유전자를 발현하는 이종장기이식을 위한 형질전환 복제돼지 및 이의 제조방법 {PERV EnvC- GGTA1/CMAH/iGb3s/β4GalNT2 quadra gene knock-out and human CD46 and TBM expression transgenic pigs for xenotransplantation, and producing method thereof}
본 발명은 PERV (Porcine Endogenous Retrovirus) EnvC가 음성이고, GGTA1(α1,3-galactosyltransferase), CMAH(CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase), iGb3s(Isoglobotrihexosylceramide synthase) 및 β4GalNT2(Beta-1,4-N-Acetyl-Galactosaminyl Transferase2)가 넉아웃되고, 인간 CD46 및 TBM(Thrombomodulin) 유전자를 발현하는 이종장기이식용 형질전환 복제돼지 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
2017년 기준 국내 장기이식 대기자는 27,701명인데 비해 장기 기증자는 1,693명에 불과하다(Won-Hyun Cho, J Korean Soc Transplant, 2018). 국가적으로 장기기증의 필요성에 대해 적극적으로 알리고 유가족에 대한 예우를 통해 장기기증 문화 활성에 노력을 하고 있지만, 공급과 수요의 차이는 해마다 계속 증가하는 실정이다. 이는 비단 우리나라뿐만 아니라 전 세계적으로 큰 문제가 되고 있고, 불법 장기매매가 성행할 정도로 인류가 직면한 문제 중 하나이다.
이종장기이식(Xenotransplantation)은 타 종(species)의 장기가 생체장기를 완전히 대체함으로써 활성화 될 경우 장기 공급 문제를 근절할 수 있을 것으로 기대되는 해결책 중 하나이다. 이종장기 원료동물 모델 중 미니돼지의 장기는 인간과 형태학적, 유전학적으로 비슷하고 여러 문헌들에서 검증된 바 있다. 특히, 유카탄 미니돼지(Yucatan miniature pig)는 괴팅겐 미니돼지(Gottingen miniature pig)와 함께 가장 많이 사용되는 실험 동물 모델로 그에 따라 많은 연구 결과가 도출되어져 왔다(Karina Gutierrez et al., Frontiers in Genetics, 2015). 하지만 현재까지의 연구 결과에서 미니돼지의 장기를 사람에게 이식할 경우 자가, 동종 이식 보다 훨씬 심각한 면역거부반응이 나타날 수 있는 문제점들이 다수 존재한다.
면역거부반응을 일으키는 인자 중, α-gal(α-galactosyltransferse)은 GGTA1 유전자에 의해 합성되는 항원으로, 영장류를 제외한 포유류, 설치류 등 모든 동물 세포 표면에 존재한다. 따라서 α-gal을 보유하고 있는 돼지의 장기를 α-gal이 없는 사람에게 이식하게 될 경우 항원-항체 반응에 의한 조직 괴사 및 사망에 이르게 된다. 따라서 α-gal이 결손된 형질전환 복제돼지 생산 연구가 진행되었으며, 2005년에 동형접합적으로 GGTA1 유전자가 결손된 형질전환 복제돼지의 장기를 원숭이에게 이식한 결과 초급성 면역거부반응이 나타나지 않고 생존한 것으로 보고되었다(Kenji et al., Nature medicine, 2005). GGTA1 유전자가 결손된 형질전환 복제돼지 생산을 통해 수 초에서 수 분만에 일어나는 초급성 면역거부반응은 제어가 됐으나 이후 급성, 세포성 면역거부반응에 의한 수여자의 생존 기간은 길지 않았다. 거부반응을 일으키는 유전자 중, CMAH(Cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase)는 Neu5Ac를 Neu5Gc로 합성하는 유전자로 인간을 제외한 영장류, 포유류 등 모든 생물에 존재하지만 인간은 진화를 통해 CMAH 유전자가 변형되어 Neu5Gc를 합성하지 않는다. 그에 따라 Neu5Gc는 인체 내에서 항원으로 작용하고, 장기이식이 될 경우 항원-항체 반응에 의한 면역거부반응이 발생하게 된다. 또한 iGb3s(Isogloboside 3 synthease; A3GalT2) 유전자는 글리코실 전달효소로 락토실세라마이드에 갈락토오스를 더해 복합 지질인 글리코스핑고리피드인 iGb3를 합성하며, GGTA1 유전자에 의해 합성되는 α-gal 항원을 만들어내는 대체경로로 알려져있다(Dale Christiansen et al., Plos biology, 2008). β4GalNT2(Beta-1,4-N-acetyl-galactosaminyltransferase 2) 유전자는 당사슬을 생성하는 유전자로 GalNAcβ1-4, Galβ1-4GlcNAcβ1-3Gal, Sd(a)(Sid blood group; CAD or CT) 항원을 만들어낸다. β4GalNT2 유전자는 보체 활성에 의한 세포의 용해작용, non-gal에 의한 면역 거부반응을 일으키는 것으로 보고되었다.
또한, 항원-항체 매게 면역거부반응 조절을 통한 초급성, 급성 면역거부반응 제어뿐만 아니라 돼지의 장기가 사람에게 이식될 경우 혈액응고 작용 및 인간의 보체 활성에 의한 면역거부반응이 일어난다. 이와 관련하여, CD46(Membrane Cofactor Protein; MCP) 유전자는 표면막당단백질로 상기 MCP는 표면막 상에서 보체 활성화 성분의 C3b나 C4b에 결합하여 보조인자로서 작용하며, C3b나 C3b의 분해를 촉진함으로써 보체 활성 억제 작용을 한다. 또한, TBM(Thrombomodulin) 유전자는 혈액응고 경로에서 트롬빈에 결합해 Thrombomodulin-Thrombin complex를 생성하고 단백질 C를 활성화시켜 요소(factor) V, 요소 VII 활성에 의한 혈액응고 억제 작용을 한다.
국내특허출원번호 10-2015-0092205 국내특허출원번호 10-2017-0058264
상기와 같은 배경하에서 본 발명자들은 이종장기이식에 이용될 수 있는 형질전환 복제돼지를 개발하기 위한 노력을 계속한 결과, PERV (Porcine Endogenous Retrovirus) EnvC가 음성이고, GGTA1(α1,3-galactosyltransferase), CMAH(CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase), iGb3s(Isoglobotrihexosylceramide synthase) 및 β4GalNT2(Beta-1,4-N-Acetyl-Galactosaminyl Transferase2)가 넉아웃되고, 인간 CD46 및 TBM(Thrombomodulin) 유전자를 발현하는 이종장기이식용 형질전환 복제돼지를 제조하고, 상기 형질전환 복제돼지를 이용할 경우 기존에 개발된 형질전환 복제돼지에 의해 이종장기이식에서 발생하는 돼지 내인성 레트로바이러스의 전이 문제를 발생시키지 않으면서도 초급성 및 항원-항체 매개 면역 거부반응, 혈액응고에 의한 면역 거부반응, 보체 활성에 의한 면역 거부반응을 극복함으로써 수여자의 생존기간을 늘릴 수 있는 우수한 효과를 가지고 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 PERV (Porcine Endogenous Retrovirus) EnvC가 음성이고, GGTA1(α1,3-galactosyltransferase), CMAH(CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase), iGb3s(Isoglobotrihexosylceramide synthase) 및 β4GalNT2(Beta-1,4-N-Acetyl-Galactosaminyl Transferase2)가 넉아웃되고, 인간 CD46 및 TBM(Thrombomodulin) 유전자를 발현하는 이종장기이식용 형질전환 복제돼지 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 GGTA1 (Alpha 1,3-Galactosyltransferase) 넉아웃용 재조합 벡터, CMAH(CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) 넉아웃용 재조합 벡터, iGb3s(Isoglobotrihexosylceramide synthase) 넉아웃용 재조합 벡터, β4GalNT2(Beta-1,4-N-Acetyl-Galactosaminyl Transferase2) 넉아웃용 재조합 벡터, 인간 CD46 발현용 재조합 벡터 및 인간 TBM(Thrombomodulin) 발현용 제조합 벡터가 도입되고, PERV(Porcine Endogenous Retrovirus) EnvC(Envlope C)가 음성인, 이종장기이식용 형질전환 복제돼지의 제조를 위한 형질전환 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환 세포를 탈핵된 난자에 이식하여 핵 이식란을 형성하는 단계; 및 상기 핵이식란을 대리모의 난관에 이식하는 단계를 포함하는, 이종장기이식용 형질전환 복제돼지의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 생산한 이종장기이식용 형질전환 복제돼지를 제공한다.
본 발명에 따른 형질전환 복제돼지는 돼지 내인성 레트로바이러스 EnvC가 음성이고, 유전자 가위인 CRISPR-Cas9에 의해 GGTA1, CMAH, β4GalNT2 및 iGb3s 등 4개의 유전자가 넉아웃되었으며, 인간 CD46 및 TBM 유전자를 발현하는 특징을 가지고 있다. 이에 따라, 본 발명에 따른 형질전환 복제돼지는 이종장기이식에서 발생되는 돼지 내인성 레트로바이러스의 전이를 발생시키지 않으면서도, 초급성 및 항원-항체 매개 면역 거부반응, 혈액응고에 의한 면역 거부반응, 보체 활성에 의한 면역 거부반응을 극복할 수 있는바, 이를 이종간 장기 및 세포 이식을 위한 공여 동물로서 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 GGTA1, CMAH, iGb3s, β4GalNT2 유전자를 결손시키기 위한 타겟팅 벡터를 나타낸 도이다.
도 2는 인간 CD46 발현을 위한 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 3은 인간 TBM 발현을 위한 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 4는 돼지 내인성 레트로바이러스 Envlope C 검사 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 형질도입 후 인간 CD46 항체를 이용한 면역 형광 염색 및 세포 분류 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 형질전환 세포 내 인간 CD46 및 TBM 발현 벡터 도입 유무를 확인한 도이다.
도 7은 형질전환 세포 내 GGTA1, CMAH, iGb3s 및 β4GalNT2 유전자 별 염기 서열을 나타낸 도이다.
도 8은 형질전환 세포주 #18에서 DNA 및 RNA 분석을 통해 콜로니 돼지 내인성 레트로바이러스 Envlope C 음성 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 형질전환 세포주 #18을 콜로니 면역 형광 염색한 후 형광현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 형질전환 세포주 #18을 콜로니 면역 형광 염색한 후 FACS 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 형질전환 세포주 #18 콜로니에 대한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 형질전환 세포주 세포주 #18을 이용한 체세포 복제를 통해 생산된 형질전환 복제돼지의 사진이다.
도 13은 형질전환 세포주 세포주 #18을 이용한 체세포 복제를 통해 생산된 형질전환 복제돼지들의 유전자 분석을 나타낸 도이다.
도 14는 형질전환 세포주 세포주 #18을 이용한 체세포 복제를 통해 생산된 형질전환 복제돼지 혈액 유래 PBMCs를 이용해 면역 형광 염색한 후 FACS 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 형질전환 세포주 세포주 #18을 이용한 체세포 복제를 통해 생산된 형질전환 복제돼지의 귀 섬유아세포를 이용한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 형질전환 세포주 세포주 #18을 이용한 체세포 복제를 통해 생산된 형질전환 복제돼지의 각막 내피세포를 이용해 면역 형광 염색한 후 FACS 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 형질전환 세포주 세포주 #18을 이용한 체세포 복제를 통해 생산된 형질전환 복제돼지의 장기를 이용한 조직 면역 형광 염색 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 형질전환 세포주 세포주 #18을 이용한 체세포 복제를 통해 생산된 형질전환 복제돼지의 비장 세포에서 APC (Activated Protein C) 정량 결과를 나타낸 도이다.
도 19는 형질전환 세포주 세포주 #18을 이용한 체세포 복제를 통해 생산된 형질전환 복제돼지의 귀 섬유아세포를 이용한 C3 퇴적 분석 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
일 양태로서 본 발명은 GGTA1 (Alpha 1,3-Galactosyltransferase) 넉아웃용 재조합 벡터, CMAH(CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) 넉아웃용 재조합 벡터, iGb3s(Isoglobotrihexosylceramide synthase) 넉아웃용 재조합 벡터, β4GalNT2(Beta-1,4-N-Acetyl-Galactosaminyl Transferase2) 넉아웃용 재조합 벡터, 인간 CD46 발현용 재조합 벡터 및 인간 TBM(Thrombomodulin) 발현용 제조합 벡터가 도입되고, PERV(Porcine Endogenous Retrovirus) EnvC(Envlope C)가 음성인, 이종장기이식용 형질전환 복제돼지의 제조를 위한 형질전환 세포를 제공한다.
본 발명에 있어서 “벡터”는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작도 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 포함하는 유전자 작제물을 의미하는 것으로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 세포 내에서 복제 가능한 것이라면 특별히 한정되지 않고 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있으며, 예컨대 플라스미드, 코즈미드, 파지 입자, 바이러스 벡터일 수 있다.
본 발명에 있어서, 넉아웃용 재조합 벡터는 GGTA1 (Alpha 1,3-Galactosyltransferase), CMAH(CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase), iGb3s(Isoglobotrihexosylceramide synthase) 및 β4GalNT2(Beta-1,4-N-Acetyl-Galactosaminyl Transferase2)에 대한 sgRNA를 암호화하는 염기서열이 하나의 벡터에 모두 포함된 형태거나, 상기 각 sgRNA를 암호화하는 염기서열이 별개의 벡터에 하나 이상 포함된 다수 개의 벡터의 군으로 이루어진 형태일 수 있다. 즉, 목적 서열을 포함할 수 있는 한 벡터의 형태 및 개수에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 GGTA1 (Alpha 1,3-Galactosyltransferase), CMAH(CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase), iGb3s(Isoglobotrihexosylceramide synthase) 및 βTransferase2)에 대한 sgRNA를 각각 포함하는 4종의 넉아웃용 재조합 벡터를 이용하였으며, 이의 구체적인 벡터맵을 도 1에 나타내었다.
본 발명에 있어서, 'GGTA1(알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제)' 유전자는 α-Gal의 생합성을 담당하는 것으로, 돼지의 경우 8개의 인트론과 9개의 엑손으로 구성되어 있다. 상기 GGTA1 유전자는 GenBank accession No. AH010595.2일 수 있다.
상기 GGTA1 넉아웃용 재조합 벡터는 돼지 염색체 1의 엑손 4번에 위치한 서열번호 1로 표시되는 염기서열 부위, 즉 가이드 서열 부위를 인지하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 'CMAH(CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxlase)' 유전자는 Neu5Gc의 생합성을 담당하는 것이다. 상기 CMAH 유전자는 GenBank accession No. NM_001113015.1일 수 있다.
상기 CMAH 넉아웃용 재조합 벡터는 돼지 염색체 7의 엑손 9번에 위치한 서열번호 2로 표시되는 염기서열 부위, 즉 가이드 서열 부위를 인지하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 'iGb3s(Isogloboside 3 synthase)' 유전자는 글리코스핑고리피드인 igb3를 합성한다. 상기 iGb3s 유전자는 Genbank accession No. XM_021095855일 수 있다.
상기 iGb3s 넉아웃용 재조합 벡터는 돼지 염색체 6의 엑손 4번에 위치한 서열번호 3으로 표시되는 염기서열 부위, 즉 가이드 서열 부위를 인지하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 'β4GalNT2(beta-1,4-N-acetyl-galactosaminyltransferase 2)' 유전자는 SDa 항원을 합성한다. 상기 β4GalNT2 유전자는 Genbank accession No. NM_001244330.1일 수 있다.
상기 β4GalNT2 넉아웃용 재조합 벡터는 돼지 염색체 12의 엑손 1번에 위치한 서열번호 4로 표시되는 염기서열 부위, 즉 가이드 서열 부위를 인지하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 gRNA는 Cas9 단백질로 복합체를 형성할 수 있고, Cas 단백질을 표적 DNA에 가져오는 RNA로서, 예를 들어, 서열번호 1 내지 4로 표시되는 DNA로부터 전사될 수 있다. 다시 말해, 본 발명에서는 gRNA 서열과 이에 대응하는 DNA 서열을 혼용하여 사용하고 있으며, 이는 gRNA가 벡터 내에 포함되어 전사를 통해 발현되는바, 실험적으로 DNA 서열로 기재될 수 있음은 당업자에게 자명하다.
본 발명에 있어서, 'CRISPR-Cas9'은 유전자 가위의 한 종류로, 유전자 제거를 위한 클로닝에 이용된다. 본 발명에 있어서, 상기 Cas9 단백질은 CRISPR/Cas9 시스템에서 필수적인 단백질 요소를 의미하고, CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA (transactivating crRNA, tracrRNA)로 불리는 두 RNA와 복합체를 형성할 때, 활성 엔도뉴클레아제 또는 니카아제 (nickase)를 형성한다. Cas9 단백질을 암호화하는 유전자는 일반적으로 CRISPR-반복 스페이서 배열(CRISPR repeat-spacer array)와 관련이 있으며, 40개 이상의 서로 다른 Cas 단백질 패밀리가 존재한다. 대표적으로 세 종류의 CRISPR-Cas 시스템이 존재하며 그 중 Cas9 단백질을 수반하는 타입 Ⅱ CRISPR/Cas 시스템이 대표적이다.
본 발명에 있어서, '유전자 가위'란 유전체에서 원하는 부위의 DNA를 잘라내는 기술로, 유전체에서 특정 염기서열을 인식한 후 해당 부위의 DNA를 정교하게 잘라내는 유전자 교정(genome editing) 기술을 의미한다.
본 발명의 넉아웃용 재조합 벡터에는 DNA 결합과 관련된 gRNA(guide RNA) 외에 DNA 절단을 위한 스트렙토코커스 피요제네스(Streptococcus pyogenes) 유래 SpCas9이 포함되며, 상기 gRNA 도메인에는 DNA 내의 어떤 서열에도 결합할 수 있는 클로닝 부위가 있어 genomic DNA 중 원하는 특정서열에 결합할 수 있다. 특정부위에 결합한 gRNA의 유도 및 Cas9 단백질의 활성을 통해 DNA 절단을 유도한다.
본 발명에 있어서 hCD46(Membrane Cofactor Protein; MCP) 유전자는 보체활성 억제를 담당하는 것이다.
상기 인간 CD46 발현용 재조합 벡터는 인간 CD46 유전자를 도입하기 위한 것으로, 예를 들어 도 2에 개시된 벡터맵으로 이루어진 벡터일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서 hTBM (Thrombomodulin) 유전자는 혈액응고 억제를 담당하는 것이다.
상기 인간 TBM(Thrombomodulin) 발현용 재조합 벡터는 인간 TBM 유전자를 도입하기 위한 것으로, 예를 들어 도 3에 개시된 벡터맵으로 이루어진 벡터일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 벡터는 프라이머 서열을 포함할 수 있으며, 예를 들어 CAG 프로모터를 포함할 수 있고, 그 외에 통상 CAG 프로모터와 동등하다고 여겨지는 EF1α 프로모터와 같이 포유류에서 발현될 수 있는 프로모터는 모두 이용될 수 있다. 또한, ICAM2 프로모터와 같이 포유류 조직 특이적 프로모터도 이용될 수 있다. 상기 CAG는 유전자 발현 프로모터 중 하나로, 외래 유전자 발현에 이용된다.
본 발명에 있어서, '프로모터'는 일반적으로 전사 개시점으로 발현시키고자 하는 유전자의 유전정보를 지니고 있는 DNA 염기서열 앞부분에 위치하며, 전사시작지점으로부터 수백 염기 이내에 위치한다. 진핵생물에서는 전사조절인자라고 하는 단백질들이 프로모터 부분에 결합함으로써 RNA 중합효소의 결합에 관여한다.
본 발명에 있어서, “형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 형질전환은 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있으며, 예를 들어 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온성 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 플라스미드 또는 비플라스미드성 나출(naked DNA)에 의한 진핵세포의 형질전환을 세포의 종양화의 의미로서의 형질전환과 구분하기 위해, '형질감염(transfection)'이라고 부르기도 하는데, 본 발명에서는 동일한 의미로 사용된다.
상기 형질전환 세포는 바람직하게는 섬유아세포이며, 보다 바람직하게는 돼지의 섬유아세포이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 형질전환 세포는 2019년 1월 30일에 한국세포주연구재단(KCLRF)에 기탁된 수탁번호 KCLRF-BP-00464의 세포일 수 있다.
다른 양태로서 본 발명은 상기 형질전환 세포를 탈핵된 난자에 이식하여 핵 이식란을 형성하는 단계; 및 상기 핵이식란을 대리모의 난관에 이식하는 단계;를 포함하는, 이종장기이식용 형질전환 복제돼지의 제조방법 및 상기 방법에 의해 생산된 이종장기이식용 형질전환 복제돼지를 제공한다.
본 발명에 있어서, '핵 이식'은 핵이 없는 세포에 다른 세포의 핵 DNA를 인공적으로 결합시켜 동일한 형질을 갖도록 하는 유전자 조작기술을 말하며, 당 분야에서 공지된 방법을 사용하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서, '핵 이식란'은 공여핵원세포가 도입 또는 융합된 난자를 말한다.
본 발명에 있어서, '탈핵 난자'는 난자의 핵이 제거된 것을 말한다.
본 발명에 따른 형질전환 복제돼지는 돼지 내인성 레트로바이러스 EnvC가 음성이고, 유전자 가위인 CRISPR-Cas9 시스템에 의해 GGTA1, CMAH, β4GalNT2 유전자의 두 좌위 및 iGb3s 유전자의 한 좌위가 제거되어 있고, 인간 CD46 및 TBM 유전자를 발현하는 특징을 가지고 있는바, 이종장기이식에서 발생되는 돼지 내인성 레트로바이러스의 전이를 발생시키지 않으면서도, 초급성 및 항원-항체 매개 면역 거부반응, 혈액응고에 의한 면역 거부반응, 보체 활성에 의한 면역 거부반응을 극복할 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 형질전환 복제돼지는 이종간 장기 및 세포 이식을 위한 공여 동물로서 유용하게 활용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. GGTA1 , CMAH , iGb3s 및 β4GalNT2 유전자 타겟팅 벡터 제조
돼지 GGTA1, CMAH, iGb3s 및 β4GalNT2 유전자 넉아웃을 위하여, 각각의 유전자 염기서열을 분석한 후 gRNA가 결합할 수 있는 엑손의 염기서열 부위를 결정하였다. 이때 유전자 타겟팅을 위한 gRNA는 단순히 공지된 gRNA를 이용하지 않았으며, 스크리닝 과정을 통해 유전자 타겟팅 효율을 가장 높일 수 있는 엑손 부위를 결정하고, 해당 엑손 부위에서 우수한 효과를 나타내는 gRNA를 선별하는 실험을 선 수행하였다. 상기 과정을 통해 선별된 gRNA는 벡터 내 삽입을 위해 바이오니아에 의뢰하여 합성하였다(서열번호 1 내지 4). 유전자 별 gRNA의 서열, NCBI 등록 번호, 염색체 위치 및 엑손 위치를 표 1에 나타내었다.
Figure 112019075593148-pat00001
표 1에 개시한 돼지 GGTA1, CMAH, iGb3s 및 β4GalNT2 엑손 염기서열 부위에 결합할 수 있는 gRNA 염기서열을 포함하도록, 표 2에 나타낸 각 유전자 별 두 개의 프라이머를 혼성화 한 후 그 산물을 Cas9-GFP 벡터에 각각 삽입하였다. 보다 구체적으로, 각 유전자 별로 두 개의 프라이머를 100 pmol씩 섞은 뒤 95 ℃ 10분, 85 ℃ 10분 후 12 ℃까지 초당 0.1 ℃씩 온도를 내려 혼성화를 진행하였다. 혼성화 된 산물을 제한효소 BbsI으로 자른 Cas9-GFP 벡터를 주형으로 이용하였으며, 유전자 별로 각각 T4 DNA ligase (NEB)를 이용해 라이게이션 및 형질전환을 수행했다. 완성된 벡터의 서열 분석을 수행하여 가이드 RNA 서열 도입 유무를 확인하였고, 벡터 맵을 도 1에 나타내었다 (제노텍).
Figure 112019075593148-pat00002
실시예 2. 인간 CD46 및 TBM 유전자 발현 벡터 제조
인간 CD46 및 TBM 유전자 발현 플라스미드 벡터 제작을 위해 NCBI에 개시된 서열을 기초로 Genbank number D84105.1 (인간 CD46), Genbank number J02973.1 (인간 TBM)에 대한 염기서열을 각각 증폭하였다. 보다 구체적으로, 제한효소를 이용한 클로닝을 위해 5' 말단에 XbaI 제한효소 서열을 삽입하고 3' 말단에 EcoRI 제한효소 서열을 삽입된 프라이머 (human CD46 : forward primer : 5'-TATCTAGAATGGAGCCTCCCGGC-3' , reverse primer : 5'-CGGATATCTATTCAGCCTCTCTGCTCTGCTGGA-3'; human TBM : forward primer : 5'-CCTGGGTAACGATATCATGCTTGGGG-3', reverse primer : 5'-GACGGAGGCCGAATTCGCTCAGAGTC-3')와 인간 cDNA 라이브러리를 주형으로 pfu taq 폴리머라제를 이용하여 유전자 증폭을 실시하였다. 생산된 각각의 PCR 산물을 A-tailing 후 TA-클로닝을 실시하였다. 염기서열 분석 후 변형 없이 클로닝 된 플라스미드 DNA를 XbaI과 EcoRI으로 절단된 pCX 벡터에 삽입하였다. 구축된 재조합 벡터 모식도를 도 2 및 도 3에 각각 나타내었다.
실시예 3. 돼지 내인성 레트로바이러스 Envlope C 음성 개체 선별
돼지 내인성 레트로바이러스 Envlope C 음성 개체 선별을 위하여, 개체 별로 게놈 DNA를 추출한 후, 표 3에 나타낸 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. 보다 구체적으로, 귀 개체별 귀 조직을 수득한 후, Dneasy Blood & tissue kit(QIAGEN, Germany)를 이용하여 각각의 게놈 DNA를 추출하였다. 추출된 게놈 DNA 및 프라이머를 이용하여 최초 변성을 위해 95 ℃에서 5분간 반응한 후, 95 ℃에서 40 초, 61 ℃에서 40초, 72 ℃에서 1분의 사이클을 총 35회 반복하였으며, 마지막으로 72 ℃에서 7 분간 반응하였다. PCR 결과를 2% 아가로즈 TAE 젤에 로딩하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
Figure 112019075593148-pat00003
도 4에 나타난 바와 같이, W16-172 개체에서 돼지 내인성바이러스 envlope C가 음성임을 확인하였다. 상기 W16-172 개체로부터 귀 섬유아세포를 분리하였으며, 이를 이후 형질전환 복제돼지 생산을 위한 주형 세포로 사용하였다.
실시예 4. GGTA1 , CMAH , iGb3s 및 β4GalNT2 유전자가 제거되고 인간 CD46 및 TBM 유전자를 발현하는 형질전환 세포주의 구축
4-1. GGTA1 , CMAH , iGb3s 및 β 4GalNT2 유전자가 제거되고 인간 CD46 및 TBM 유전자를 발현하는 형질전환 세포주의 제조
상기 실시예 3에서 분리한 돼지 내인성 레트로바이러스 Envlope C가 음성인 W16-172 개체 유래 섬유아세포에 Lipofectamine 3000(Invitrogen)을 이용하여 실시예 1에서 제조한 GGTA1, CMAH, iGb3s 및 β4GalNT2 타겟팅 재조합 벡터를 도입하였다. 타겟팅 재조합 도입 후 FACS AriaII 장비를 이용하여 Cas9 벡터에 삽입되어 있는 GFP 유전자 양성 세포만 1차 선별하였다. 1차로 선별된 세포에 Lipofectamine 3000을 이용하여 실시예 2에서 제조한 인간 CD46 및 TBM 발현 재조합 벡터 2종을 모두 도입하였다. 선별 효율을 높이기 위해 발현 벡터 도입 후 인간 CD46 항체를 이용해 세포 면역 염색을 수행하였으며, FACS AriaII 장비를 이용하여 인간 CD46 양성 세포만을 분리함으로써 형질전환 세포를 2차로 선별하였다. 이 과정을 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이 FACS AriaII 분리 결과 인간 CD46 양성 세포만 분리가 잘 되었음을 확인하였다.
다음으로, FACS AriaII 장비를 이용하여 분리된 세포의 단일 세포 콜로니 배양을 수행한 후, 콜로니 유전자 분석을 진행하였다. 보다 구체적으로, Dneasy Blood & tissue kit를 이용하여 각각의 형질전환 세포 콜로니로부터 게놈 DNA를 추출한 후 인간 CD46 및 TBM 발현 재조합 벡터 내 각각의 위치가 포함된 프라이머 (human CD46 forward primer : CGAGTTTGGTTATCAGATGCA, reverse primer : CGTGCTCTCTCCAATAAGTGA; human TBM forward primer : TACGGGAGACAACAACACCA, reverse primer : AACCGTCGTCCAGGATGTAG)를 이용하여 PCR을 수행하였다. 수득한 PCR 산물을 1% 아가로오스 TAE 겔에 로딩하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이 다수의 콜로니에서 인간 CD46 및 TBM 발현 벡터가 잘 삽입되었음을 확인하였다.
추가적으로, 형질전환 세포 콜로니로부터 추출된 DNA를 이용해 GGTA1, CMAH, iGb3s 및 β4GalNT2 타겟팅 부위가 포함되도록 표 4에 나타낸 프라이머 쌍을 이용해 PCR을 수행하였다. 수득한 PCR 산물을 ㈜솔젠트 사에 의뢰하여 염기서열을 분석하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
Figure 112019075593148-pat00004
도 7에 나타낸 바와 같이, 인간 CD46 및 TBM을 발현하는 형질전환 세포주 #18에서 표적 유전자 부위인 GGTA1, CMAH, β4GalNT2 유전자의 두 좌위가 모두 제거되었고, iGb3s 유전자의 한 좌위가 제거되었음을 확인하였다.
4-2. 선별된 형질전환 세포주에서 돼지 내인성 레트로바이러스 EnvlopeC 분석
실시예 4-1에서 선별된 형질전환 세포주 #18로부터 돼지 내인성 레트로바이러스 Envlope C 분석을 진행하였다. 보다 구체적으로, Dneasy Blood & tissue kit를 이용하여 형질전환 세포주 #18로부터 게놈 DNA를 추출한 후 3편의 참고문헌에 나온 프라이머를 이용해 PCR을 수행하였다. 증폭된 산물은 1% 아가로오스 TAE 겔에 로딩하였다.
이와 별도로, 실시예 4-1에서 선별된 형질전환 세포주 #18로부터 Trizol(Ambion) 방법을 이용해 전체 RNA를 분리하였고 RT-PCR premix(제넷바이오)를 이용해 mRNA를 주형으로 cDNA 합성을 진행하였다. 합성된 cDNA 및 추출한 DNA를 주형으로 real-time PCR을 수행하였다.
이상의 실험에 이용된 프라이머 서열에 대한 정보는 표 5에 나타내었으며, PCR 및 real-time PCR 결과를 도 8에 나타내었다.
Figure 112019075593148-pat00005
도 8에 나타낸 바와 같이, 형질전환 세포주 #18는 DNA 및 RNA 수준 모두에서 Envlope C 음성임을 확인하였다.
4-3. 선별된 형질전환 세포주에서 단백질 발현 분석
실시예 4-1에서 선별된 #18 콜로니로부터 단백질 발현 분석을 위해 면역형광염색을 진행하였다. 보다 구체적으로 야생형 (wildtype; WT)과 #18 콜로니 세포를 1x104개씩 각각 round glass가 들어간 4-웰 디쉬에 배양하였다. DPBS로 세척 후 인간 CD46 항체, FITC 형광이 접합된 항-마우스 항체, PE 형광이 접합된 인간 TBM 항체를 각각 1:100 농도로 상온에서 1시간 반응시켰다. 염색된 세포는 1% 포르말린으로 고정한 후, round glass만 분리하여 형광현미경을 이용해 분석을 진행하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이 야생형 대비 형질전환 세포주 #18(TG)에서 인간 CD46 및 인간 TBM 단백질이 잘 발현됨을 확인하였다.
상기와 같은 면역형광염색을 통해 분석된 #18 콜로니로부터 세포 수준에서 단백질 발현 추가 분석을 위해 FACS 분석을 진행하였다. 보다 구체적으로 야생형 (wild-type; WT)과 #18 콜로니 세포(TG)를 DPBS로 세척 후 0.25% 트립신-EDTA 용액으로 3분간 처리한 후 세포를 수득하였다. 소 태아 혈청 (FBS)을 이용해 트립신-EDTA를 불활화시키고, DPBS로 세척한 후 인간 CD46 항체와 인간 TBM 항체를 이용해 염색을 진행하였다. 염색된 세포는 1% 포르말린으로 고정한 후 FACS caliber II를 이용해 분석을 진행하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타낸 바와 같이, 야생형 대비 형질전환 세포주 #18(TG)에서 인간 CD46 및 TBM 단백질이 잘 발현됨을 확인하였다.
추가적인 단백질 발현을 확인하기 위해 웨스턴-블롯 분석을 진행하였다. 보다 구체적으로 야생형 (wild-type; WT)과 #18 콜로니 세포(TG)에 각각 프로테이나제 불활성화제가 포함된 RIPA 완충액을 처리한 후 초음파분쇄기를 이용해 분쇄하였다. 원심분리를 통해 상층액을 수득한 후 SDS-PAGE 겔에 로딩한 뒤 PVDF 멤브레인에 이동시키고, 5% 탈지유를 이용해 블로킹을 진행하였다. 블로킹 된 멤브레인에 인간 CD46 항체와 인간 TBM 항체가 포함된 5% 탈지유를 처리하고, 상기 멤브레인에 2차 항체를 처리한 후 반응시켰다. 반응 종료 후 ECL 용액을 처리하고 chemiDoc imaging system(BioRAD)을 이용해 분석하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 야생형 대비 형질전환 세포주 #18(TG)에서 인간 CD46 및 TBM 단백질이 발현됨을 확인하였다.
이상 실험을 통해 확인한 형질전환 세포주 #18을 H-01의 이름으로 2019년 1월 30일에 한국세포주연구재단(KCLRF)에 기탁하였으며, 수탁번호 KCLRF-BP-00464를 부여받았다.
실시예 5. GGTA1 , CMAH , iGb3s 및 β4GalNT2 유전자가 제거되고 인간 CD46 및 TBM 유전자를 발현하는 형질전환 돼지의 제조
5-1. 난모세포( oocyte )의 준비
미성숙 암돼지의 난소를 수득한 후, 35℃의 0.9 % NaCl 용액에 넣어 실험실로 운반하였다. COCs(Cumulus-oocyte complexes)는 10 mL 일회용 주사기에 고정된 18-게이지 바늘을 이용하여 2-6 mm 지름의 미성숙 난포(antral follicle)로부터 흡입되었다. COCs를 0.1 % 폴리비닐알코올, 3.05 mM D-글루코스, 0.91 mM 피루브산 나트륨, 0.57 mM 시스테인, 0.5 μg/mL LH(L-5269, Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA), 0.5 μg/mL FSH(F-2293, Sigma-Aldrich Corp.), 10 ng/mL 표피생장인자(E-4127, Sigma-Aldrich Corp.), 75 μg/mL 페니실린 G 및 50 μg/mL 스트렙토마이신을 포함한 TCM 199 (31100-035, Gibco Grand Island, NY, USA)로 3회 세척하였다. 약 50-60 COCs를 미네랄 오일로 덮인 4-웰 멀티디쉬(Nunc, Roskilde, Denmark)에 옮긴 후, 500 mL의 동일한 배지를 첨가하고, 5 %의 CO2 및 39℃의 조건에서 배양하였다.
5-2. 핵 이식
핵 이식(nuclear transfer)은 Park 등(Biol. Reprod. 66:1001-1005, 2002)의 방법을 약간 수정하여 수행하였다. 보다 구체적으로, 배양 42 내지 44시간 후에, 0.1 % PVA 및 0.2 % 히알루로니다아제를 포함하는 TL-HEPES에서 4분 동안 강하게 볼텍싱하여 난구세포(cumulus cell)로부터 난모세포를 분리하였다. 0.3 % BSA (Sigma-Aldrich Corp., A-8022) 및 7.5 μg/mL 시토칼라신 B를 포함하는 TCM 199에서 미세 유리 피펫을 이용하여 제1 극체 및 인접 세포질을 흡입함으로써 난구세포-없는 난모세포에서 세포핵을 제거하였다. SCNT에 앞서 혈청 기아(serum starvation)를 위하여, 상기 실시예 4에서 제조한 공여 세포를 0.5 % FBS를 포함하는 DMEM 배지에서 3일 동안 배양하였다. 단일 공여 세포를 난모세포 막과 접촉하는 난모세포의 위란강(perivitelline space)에 위치시켰다. 접종된 난모세포를 0.3 M 만니톨, 1.0 mM CaCl2H2O, 0.1 mM MgCl26H2O 및 0.5 mM HEPES로 이루어진 배지에서 1 mm 간격의 0.2 mm 직경의 두 백금 전극 사이에 배치하였다. 융합/활성화(Fusion/activation)는 30 μs (BTX, USA) 동안 1.1 kV/cm의 DC 펄스를 2회 연속적으로 가하여 유도하였다. 그 후, 20 내지 30개의 재구성된 배아(reconstructed embryos)를 미네랄 오일이 덮인 4-웰 멀티디쉬에 옮기고, 500 mL의 0.4 % BSA를 보충한 NCSU(North Carolina State University)-23 배지를 첨가하였다. 배양 1 또는 2일 후, NT 배아를 승가 허용기(standing estrus)의 첫날인 암돼지의 난관으로 외과적으로 이식하였다. 임신 상태는 초음파 스캐너(Mysono 201, Medison Co., LTD, Seoul, Korea)로 확인하였다.
실시예 6. GGTA1 , CMAH , iGb3s 및 β4GalNT2 유전자가 제거되고 인간 CD46 및 TBM 유전자를 발현하는 형질전환 돼지의 검증
6-1. 형질전환 복제돼지의 확인
상기 실시예 5에서 제조한 형질전환 돼지 (#1)의 외형을 도 12에 나타내었다.
또한, 상기 형질전환 돼지의 염기서열을 확인하기 위하여, 산자의 섬유아세포를 수득한 후, 돼지 내인성 레트로바이러스 Envlope C 및 형질전환 여부를 분석하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 5에서 제조한 형질전환 돼지 (#1)의 섬유아세포에서 인간 CD46 및 TBM 유전자 도입이 정상적으로 이루어졌으며, 돼지 내인성 레트로바이러스 Envlope C가 음성인 것을 확인하였다.
6-2. 형질전환 복제돼지 검증
상기 실시예 6-1에서 확인된 형질전환 복제돼지 #1의 혈액 유래 말초혈액 단핵구 세포(PBMCs)를 분리한 후 결손된 유전자 별 FACS 분석을 진행하였다. 보다 구체적으로, 야생형, TKO(GGTA1/CMAH/iGb3s triple knock-out), QKO(PERVc+GGTA1/CMAH/iGb3s/
Figure 112019075593148-pat00006
4GalNT2 quadra knock-out) 및 본 발명의 C-QKO(PERV Envc-GGTA1/CMAH/iGb3s/
Figure 112019075593148-pat00007
4GalNT2 quadra knock-out, hCD46/hTBM)등 각각의 개체에서 주사기를 이용해 채혈한 후, DPBS에 1:1 비율로 희석하였다. 희석된 혈액을 ficoll-paque(GE healthcar)에 1:1(부피/부피)로 넣은 뒤, 500 g에서 40분간 원심분리를 수행하였다. 중간의 버피코트층을 분리한 뒤, DPBS로 세척하고 각각의 유전자 별 항체를 이용해 FACS 분석을 진행하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 볼 때 본 발명에 따른 형질전환 복제돼지(C-QKO) 유래 PBMCs에서 유전자(GGTA1, CMAH, β4GalNT2)가 정상적으로 결손되어 단백질이 생성되지 않는 것을 확인하였다.
또한, 야생형과 형질전환 복제돼지 #1 유래 귀 섬유아세포를 수득한 후 이를 이용하여 인간 CD46 및 TBM 단백질 발현 확인을 위한 웨스턴블롯 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 형질전환 복제돼지 #1 유래 귀 섬유아세포(TG)에서 인간 CD46 및 TBM 유전자가 잘 생성되는 것을 확인하였다.
추가적으로 조직별 단백질 발현을 확인하기 위해, 형질전환 복제돼지 #1 유래 각막내피세포를 분리하였으며, 인간 CD46 및 TBM 항체를 이용해 FACS 분석을 진행하였다. 구체적으로, 야생형과 형질전환 복제돼지 유래 안구를 70% 알코올에 5분간 처리하여 외피를 제거한 뒤 윤부와 각막을 제거한 후 안쪽 내피층만 5mm 크기로 잘랐다. 0.25% trypsin-EDTA 용액을 30분간 처리한 후 현미경 관찰하에 유리 니들로 데스메막(Emebraan van Descemet)을 긁어서 내피세포를 분리하였으며, 1500rpm에서 3분간 원심분리한 후 펠렛만 수득하여 배양을 진행하였다. 배양된 세포에 대해 인간 CD46 및 인간 TBM 항체를 이용해 세포 면역 염색 및 FACS 분석을 진행하였다. 그 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타낸 바와 같이, 야생형 대비 본 발명에 따른 형질전환 복제돼지 #1 유래 각막내피세포(TG)에서 인간 CD46 및 TBM 유전자에 의한 형광신호가 검출됨을 확인하였다.
다음으로, 동복에서 태어난 같은 유전 형질의 개체를 희생시킨 후 조직면역염색을 수행하였다. 구체적으로, 야생형과 형질전환 개체의 심장과 신장을 파라핀 블록으로 제작한 후, 탈파라핀화를 수행하였다. 이를 블로킹하고, 인간 CD46 및 인간 TBM 항체를 이용하여 면역 형광 염색을 수행한 후, DAB 시약을 이용해 현미경을 사용하여 이미지를 분석하였다. 그 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타낸 바와 같이, 야생형 대비 본 발명에 따른 형질전환 복제돼지 #1과 같은 유전 형질의 형질전환 복제돼지에서 인간 CD46 및 TBM 단백질이 DAB 양성임을 확인하였다. 특히, 심장내 혈관, 심근, 신장내 사구체에서 강한 양성을 확인하였으며 본 결과를 토대로 인간 CD46 및 TBM 단백질이 근육 및 혈관에서 잘 발현함을 확인하였다.
실시예 7. GGTA1 , CMAH , iGb3s 및 β4GalNT2 유전자가 제거되고 인간 CD46 및 TBM 유전자를 발현하는 형질전환 돼지의 기능 분석
7-1. 활성 프로테인 C(Activated Protein C; APC) 검증
인간 TBM 유전자는 트롬빈과 결합해 트롬빈-트롬보모듈린 복합체를 생성한 후 프로테인 C를 활성화시켜 항응고제 및 항염증제의 역할을 하는 것으로 밝혀져 있는바, 이종장기이식 시 발생하는 혈액응고 문제를 해결할 수 있는 방안이 될 수 있을 것으로 판단하였다. 이에 따라 항 응고제의 표지자로 알려진 활성 프로테인 C를 정량해 형질전환 복제돼지에서의 프로테인 C 생성량을 확인하였다. 구체적으로, 야생형 및 본 발명에 따른 형질전환 복제돼지(#1)와 같은 유전 형질의 개체를 희생시킨 후, 106 개의 비장세포(splenocyte)를 수득하였다. 수득한 비장세포에 인간 트롬빈(Merck,Australia)과 프로테인 C(Merck, Australia)를 30분간 37℃에서 처리한 후, 반응 정지를 위한 히루딘(Merck, Australia)을 처리하였다. 2000 rpm에서 5분간 회전시켜 상등액을 수득한 후, 96-웰 플레이트에 분주하였다. 여기에 1 mM 스펙트로자임 PCa1(American Diagnostica, USA)을 처리하고 NanoQuant(Tecan) 장비를 이용해 37 ℃에서 405 nm의 파장으로 값을 측정하였다. 그 결과를 도 18에 나타내었다.
도 18에 나타낸 바와 같이, 야생형 대비 본 발명에 따른 형질전환 돼지(TG)의 비장세포에서 활성 프로테인 C가 더 많이 생성되는 것을 확인하였다. 본 결과를 통해, 본 발명에 따른 형질전환 돼지를 이용한 이종장기이식 시 인간 TBM 단백질 생성에 의해 혈액 응고가 억제되어 수여자의 생존기간이 늘어날 것으로 예상된다.
7-2. C3 퇴적 (C3 deposition) 검증
이종장기이식 시 초급성 면역 거부반응 이후 보체 활성에 의한 면역 반응은 조절되어야 할 문제 중 하나이다. 보체 활성 억제 유전자 중 hCD46 (Membrane Cofacter Protein; MCP)은 막 상에서 보체 활성 성분의 C3b 또는 C4b에 Factor I가 결합하도록 하고, Factor I와 CD46은 C3b의 불활화 (Inactivated C3b)를 만들어 보체 활성을 억제하는 것으로 밝혀져 있다.
이와 관련하여, 야생형과 형질전환 복제돼지(#1) 유래 귀 섬유아세포를 수득한 후, 일반 인간 혈청 (Normal Human Serum; NHS)을 2일간 12.5, 25, 37.5, 50% 등 각각의 농도로 처리하고, C3 항체를 이용해 FACS 분석을 진행하였다. 그 결과를 도 19에 나타내었다.
도 19에 나타낸 바와 같이, 야생형 대비 본 발명에 따른 형질전환 돼지(TG) 유래 귀 섬유아세포에서 C3 퇴적이 적게 일어남을 확인하였다. 본 결과를 통해, 본 발명에 따른 형질전환 돼지에서는 인간 CD46 유전자 발현에 따라 C3 퇴적이 감소하는바, 이종장기이식시 보체 활성이 억제되며 면역 거부반응의 감소에 따른 수여자의 생존기간이 늘어날 것으로 예상된다.
종합적으로, 상기 실험을 통하여 본 발명에 따른 형질전환 복제돼지는 돼지 내인성 레트로바이러스 EnvC가 음성이고, 유전자 가위인 CRISPR-Cas9에 의해 GGTA1, CMAH, β4GalNT2 및 iGb3s 등 4개의 유전자가 넉아웃되었으며, 인간 CD46 및 TBM 유전자를 발현하는 특징을 가지고 있음을 확인하였으며, 이에 따라, 본 발명에 따른 형질전환 복제돼지는 이종장기이식에서 발생되는 돼지 내인성 레트로바이러스의 전이를 발생시키지 않으면서도, 초급성 및 항원-항체 매개 면역 거부반응, 혈액응고에 의한 면역 거부반응, 보체 활성에 의한 면역 거부반응을 극복할 수 있는바, 이를 이종간 장기 및 세포 이식을 위한 공여 동물로서 유용하게 활용할 수 있다.
한국세포주연구재단 KCLRF-BP-00464 20190130
<110> Optipharm.CO.,LTD <120> PERV EnvC- GGTA1/CMAH/iGb3s/b4GalNT2 quadra gene knock-out and human CD46 and TBM expression transgenic pigs for xenotransplantation, and producing method thereof <130> 1-82 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA <400> 1 aatgaatgtc aaaggaagag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA <400> 2 aactcctgaa ctacaaggct 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA <400> 3 acttggcgcg tgagcggcgc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA <400> 4 cgatacagac ttcagtctcc 20

Claims (10)

  1. 서열번호 1로 표시되는 gRNA(guide RNA)를 암호화하는 염기서열을 포함하는 GGTA1 (Alpha 1,3-Galactosyltransferase) 넉아웃용 재조합 벡터,
    서열번호 2로 표시되는 gRNA(guide RNA)를 암호화하는 염기서열을 포함하는 CMAH(CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) 넉아웃용 재조합 벡터,
    서열번호 3으로 표시되는 gRNA(guide RNA)를 암호화하는 염기서열을 포함하는 iGb3s(Isoglobotrihexosylceramide synthase) 넉아웃용 재조합 벡터,
    서열번호 4로 표시되는 gRNA(guide RNA)를 암호화하는 염기서열을 포함하는 β4GalNT2(Beta-1,4-N-Acetyl-Galactosaminyl Transferase2) 넉아웃용 재조합 벡터,
    인간 CD46 발현용 재조합 벡터 및
    인간 TBM(Thrombomodulin) 발현용 제조합 벡터가 도입되고,
    PERV(Porcine Endogenous Retrovirus) EnvC(Envlope C)가 음성인, 이종장기이식용 형질전환 복제돼지의 제조를 위한 형질전환 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 GGTA1 넉아웃용 재조합 벡터는 돼지 염색체 1의 엑손 4번을 인지하여 GGTA1 유전자를 넉아웃시키는 것을 특징으로 하는, 형질전환 세포.
  3. 제1항에 있어서, 상기 CMAH 넉아웃용 재조합 벡터는 돼지 염색체 7의 엑손 9번을 인지하여 CMAH 유전자를 넉아웃시키는 것을 특징으로 하는, 형질전환 세포.
  4. 제1항에 있어서, 상기 iGb3s 넉아웃용 재조합 벡터는 돼지 염색체 6의 엑손 4번을 인지하여 iGb3s 유전자를 넉아웃시키는 것을 특징으로 하는, 형질전환 세포.
  5. 제1항에 있어서, 상기 β4GalNT2 넉아웃용 재조합 벡터는 돼지 염색체 12의 엑손 1번을 인지하여 β4GalNT2 유전자를 넉아웃시키는 것을 특징으로 하는, 형질전환 세포.
  6. 제1항에 있어서, 인간 CD46 발현용 재조합 벡터는 도 2에 개시된 벡터맵으로 이루어진 것을 특징으로 하는, 형질전환 세포.
  7. 제1항에 있어서, 인간 TBM(Thrombomodulin) 발현용 재조합 벡터는 도 3에 개시된 벡터맵으로 이루어진 것을 특징으로 하는, 형질전환 세포.
  8. 제1항에 있어서, 상기 형질전환 세포는 수탁번호 KCLRF-BP-00464인 것을 특징으로 하는, 형질전환 세포.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 형질전환 세포를 탈핵된 난자에 이식하여 핵 이식란을 형성하는 단계; 및
    상기 핵이식란을 대리모의 난관에 이식하는 단계를 포함하는, 이종장기이식용 형질전환 복제돼지의 제조방법.
  10. 제9항의 방법으로 생산한 이종장기이식용 형질전환 복제돼지.
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150092205A (ko) 2012-11-30 2015-08-12 닛산 가가쿠 고교 가부시키 가이샤 액정 배향막의 제조 방법, 액정 배향막 및 액정 표시 소자
KR20170002152A (ko) * 2015-06-29 2017-01-06 주식회사 옵티팜 이종장기이식을 위한 형질전환 복제돼지 및 이의 제조방법
KR20170058264A (ko) 2015-11-18 2017-05-26 삼성전자주식회사 이동체, 로봇 청소기, 바닥 상태 판단 장치, 상기 이동체의 제어 방법 및 상기 로봇 청소기의 제어 방법
KR20180121748A (ko) * 2017-04-28 2018-11-08 서울대학교산학협력단 ＨＯ-1 유전자 및 ＴＮＦＲ1-Ｆｃ 유전자를 동시에 발현하며 GGTA1 유전자 및 CMAH 유전자가 넉아웃된 형질전환 돼지 및 이의 용도

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2002217606A1 (en) * 2001-12-29 2003-11-03 Woo Suk Hwang Gfp-transfected clon pig, gt knock-out clon pig and methods for production thereof
KR102659529B1 (ko) * 2014-10-22 2024-04-23 인디애나 유니버시티 리서치 앤드 테크놀로지 코퍼레이션 이종이식에 적합한 삼중 트랜스제닉 돼지
AU2016319131B2 (en) * 2015-09-09 2022-10-13 Revivicor, Inc. Multi-transgenic pig for xenotransplantation
KR101843427B1 (ko) * 2016-04-06 2018-03-30 대한민국 돼지의 이소글로보트리헥소실세라마이드 신타제 넉아웃 세포주 및 그의 제조 방법
KR102019992B1 (ko) * 2017-09-22 2019-09-11 대한민국 이소글로보트리헥소실세라마이드 신타제 넉아웃 세포주, 및 이를 이용한 복제난자 및 형질전환 동물
CN108486152B (zh) * 2018-02-13 2021-04-20 深圳市臻质医疗科技有限公司 转基因猪的培育方法和应用
CN108588123A (zh) * 2018-05-07 2018-09-28 南京医科大学 CRISPR/Cas9载体组合在制备基因敲除猪的血液制品中的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150092205A (ko) 2012-11-30 2015-08-12 닛산 가가쿠 고교 가부시키 가이샤 액정 배향막의 제조 방법, 액정 배향막 및 액정 표시 소자
KR20170002152A (ko) * 2015-06-29 2017-01-06 주식회사 옵티팜 이종장기이식을 위한 형질전환 복제돼지 및 이의 제조방법
KR20170058264A (ko) 2015-11-18 2017-05-26 삼성전자주식회사 이동체, 로봇 청소기, 바닥 상태 판단 장치, 상기 이동체의 제어 방법 및 상기 로봇 청소기의 제어 방법
KR20180121748A (ko) * 2017-04-28 2018-11-08 서울대학교산학협력단 ＨＯ-1 유전자 및 ＴＮＦＲ1-Ｆｃ 유전자를 동시에 발현하며 GGTA1 유전자 및 CMAH 유전자가 넉아웃된 형질전환 돼지 및 이의 용도

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Anim Front.,9(3):13-20(2019.6.25.)* *
Scientific Reports.,6:29081(2016.6.29.)* *
Xenotransplantation.,22(1):20-31(2014.9.2.)* *

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