KR102019992B1

KR102019992B1 - 이소글로보트리헥소실세라마이드 신타제 넉아웃 세포주, 및 이를 이용한 복제난자 및 형질전환 동물

Info

Publication number: KR102019992B1
Application number: KR1020170122777A
Authority: KR
Inventors: 황성수; 임기순; 우제석; 오건봉; 옥선아; 박미령; 양현; 황인설; 곽태욱; 이주영; 형남웅
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2017-09-22
Filing date: 2017-09-22
Publication date: 2019-09-11
Also published as: KR20190033971A

Abstract

본 발명은 이소글로보트리헥소실세라마이드 신타제(isoglobotrihexosylceramide synthase, iGb3s) 넉아웃 세포주, 및 이를 이용한 복제난자 및 형질전환 동물에 관한 것이다. 더욱 상세하게 본 발명은 일반 돼지 체세포 또는 초급성 면역거부반응 유전자인 알파 1,3 갈락토실트랜스퍼라제(alpha1,3-Galactosyltransferase, GT)가 제어(knock-out)되고 CD46(MCP: membrane cofactor protein)이 삽입(knock-in)된 형질전환 돼지(GT^- ^MCP ^/- ^MCP)의 체세포를 이용한 iGb3s 넉아웃 세포주, 및 이를 이용한 복제난자 및 바이오 이종장기용 형질전환 동물에 관한 것이다.

Description

이소글로보트리헥소실세라마이드 신타제 넉아웃 세포주, 및 이를 이용한 복제난자 및 형질전환 동물{Isoglobotrihexosylceramide synthase knock-out cell line, and cloned embryos and cloned animals using the same}

본 발명은 이소글로보트리헥소실세라마이드 신타제(isoglobotrihexosylceramide synthase, iGb3s) 넉아웃 세포주, 및 이를 이용한 복제난자 및 형질전환 동물에 관한 것이다. 더욱 상세하게 본 발명은 일반 돼지 체세포 또는 초급성 면역거부반응 유전자인 알파 1,3 갈락토실트랜스퍼라제(alpha1,3-Galactosyltransferase, GT)가 제어(knock-out)되고 CD46(MCP: membrane cofactor protein)이 삽입(knock-in)된 형질전환 돼지(GT^-MCP/-MCP)의 체세포를 이용한 iGb3s 넉아웃 세포주, 및 이를 이용한 복제난자 및 바이오 이종장기용 형질전환 동물에 관한 것이다.

최근 신장 및 간장 등 고형장기이식을 기다리는 대기자 대비 이식건수는 장기에 따라 약간의 차이는 있지만 약 10% 내외로 공여 장기부족 현상은 더욱 심각해지는 추세이다(Korean Network for Organ Sharing). 또한, 국제 당뇨병 연맹(International Diabetes Federation)에 따르면 2013년 국가별 당뇨병 환자 수에서 한국은 332만 명(20위)으로 보고가 되었다.

이렇게 급격히 증가하고 있는 당뇨병 환자뿐만 아니라 이로 인한 합병증 등으로 인해 잠재적인 장기이식 필요 환자 수는 더욱 늘어날 것으로 보고되고 있다. 최근 생명공학기술의 발달과 줄기세포 분야 및 3D 프린팅 기술의 발달 등으로 과거에 비하여 바이오 장기 분야에 대한 실용화 가능성이 매우 높아지고 있는 실정이다.

이와 같은 추세에 맞추어 바이오 이종장기이식용 형질전환돼지를 생산하기 위한 연구가 미국, 일본, 유럽 등 선진국을 중심으로 활발하게 추진되고 있으며, 면역 유전자 적중 형질전환 복제돼지 생산 및 생산된 돼지의 장기를 영장류에게 이식하는 연구가 진행되고 있다.

그러나 바이오 이종장기이식이 실현되기 위해서 해결되어야 할 과제들 중에서 가장 먼저 고려되어야 하는 문제는 이종장기를 이식할 때 발생하는 이종간 면역거부반응을 최소화할 수 있는 면역거부반응 제어 기술 개발과 이들 기술이 적용된 형질전환동물의 생산이라 할 수 있다.

면역거부반응 단계는 초급성, 급성, 세포성 및 만성 등으로 구분하고 있으며, 현재 초급성 면역거부반응 유발 유전자인 GT를 제거한 돼지와 추가적으로 면역반응 유전자를 형질전환시킨 돼지가 개발되어 이종장기이식 연구에 활용되고 있다.

그러나 전 세계적으로 GT^-/- 형질전환돼지로부터 생산된 바이오 장기를 이종이식할 경우 이식된 이종장기에서 GT 유전자 발현이 일부 확인되어 여전히 문제점으로 지적이 되고 있는 실정이다. 또한, GT 유전자가 양쪽 염색체에서 모두 제어된 호모(GT^-/-) 돼지의 경우에도 일부 GT 유전자를 완전히 제어하지 못하여 생기는 현상으로 보고되고 있다. 따라서 초급성 면역거부반응 유발 인자인 iGb3s를 추가적으로 제어할 수 있는 돼지를 생산하여 기개발된 돼지들과의 교배를 통해 초급성 면역거부반응을 현저히 줄일 수 있는 돼지의 개발이 필요하다.

본 발명의 배경기술로는 한국 특허공개 제10-2007-0002057호가 있으며, 상기 특허에는 기능성 알파 1,3 갈락토실트랜스페라제(알파-1,3.GT)의 어떠한 발현도 결여된 동물로부터 유래된 조직을 제공한다고 기재되어 있다.

이러한 기술적 배경하에서, 본 발명자들은 돼지 iGb3s 유전자 또는 이의 단편, 및 Cas9-GFP 유전자가 포함된 벡터로 일반돼지 또는 GT^- ^MCP ^/- ^MCP 돼지 세포에 형질전환된 (iGb3s^-/-또는 GT^- ^MCP ^/- ^MCP + iGb3s^-/-) 형질전환 세포주, (iGb3s^-/- 또는 GT^- ^MCP ^/-MCP + iGb3s^-/-) 형질전환 복제난자, 및 (iGb3s^-/- 또는 GT^- ^MCP ^/- ^MCP + iGb3s^-/-) 형질전환 복제돼지의 생산방법을 구축하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 특정 염기가 결손된 이소글로보트리헥소실세라마이드 신타제(isoglobotrihexosylceramide synthase, iGb3) 넉아웃 세포주(iGb3s^-/- 또는 GT^-MCP/-MCP + iGb3s^-/-)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 (iGb3s^-/- 또는 GT^- ^MCP ^/- ^MCP + iGb3s^-/-) 형질전환 세포주를 이용하여 형질전환된 복제난자 및 이의 생산방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 (iGb3s^-/- 또는 GT^- ^MCP ^/- ^MCP + iGb3s^-/-) 형질전환 복제난자를 대리모에 이식하여 생산된 (iGb3s^-/- 또는 GT^- ^MCP ^/- ^MCP + iGb3s^-/-) 형질전환 복제돼지 및 이를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 측면에 의하면, 서열번호 3의 염기서열을 포함하는, 이소글로보트리헥소실세라마이드 신타제(isoglobotrihexosylceramide synthase, iGb3s) 넉아웃 세포주가 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 서열번호 3의 염기서열은 서열번호 2의 야생형 유전자의 염기서열(NCBI Reference Sequence: XM_021095855.1) 중 ATG로부터 503-506번째 염기인 GCCT 염기가 결손된 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 iGb3s 넉아웃 세포주는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 iGb3s 유전자 단편; 및 상기 iGb3s 유전자 결손을 위한 유전자를 포함하는 벡터에 의해 형질전환된 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 iGb3s 유전자 결손을 위한 유전자가 Cas9일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 벡터는 U6 프로모터, 서열번호 1의 유전자 단편, CBh 프로모터, NLS, hSpCas9, NLS, GFP 및 bGHpA가 작동 가능하도록 순서대로 포함된 벡터일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 iGb3s 넉아웃 세포주는 알파 1,3 갈락토실트랜스퍼라제(alpha1,3-Galactosyltransferase, GT)가 넉아웃(knock-out)되고 CD46(MCP: membrane cofactor protein)이 삽입(knock-in)된 형질전환 돼지(GT^- ^MCP ^/-MCP)의 체세포가 형질전환된 것일 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 상기 기재된 iGb3s 넉아웃 세포주를 이용하여 핵치환된 복제난자가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 기재된 복제난자로 생산된 iGb3s 넉아웃 형질전환 돼지가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 체외성숙된 돼지 난자의 핵을 제거하는 단계; 상기 기재된 iGb3s 넉아웃 동결 세포주를 융해하는 단계; 및 융해된 상기 세포주를 핵이 제거된 돼지 난자에 주입하고 상기 세포주의 핵으로 핵치환을 하는 단계를 포함하는, iGb3s 넉아웃 복제난자의 생산 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 세포주를 이용하여 핵치환하여 복제난자를 생산하는 단계; 및 상기 복제난자를 대리모의 자궁에 이식하여 발달시키는 단계를 포함하는, iGb3s 넉아웃 형질전환 돼지의 생산 방법이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 복제난자는 생산 후 2시간 내에 대리모에 이식되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 복제난자 이식 시 단위발생 난자와 함께 이식되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 초급성 면역거부반응이 현저하게 감소한 이종장기용 형질전환 동물을 생산할 수 있는, iGb3s 유전자의 염기가 일부 결실된 iGb3s 넉아웃 세포주를 제공할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, iGb3s 넉아웃 세포주를 이용하여 바이오 이종장기이식에 따른 gal 에피토프(epitope)의 발현이 현저히 줄어든 이종장기용 형질전환동물을 생산할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, gal 에피토프(epitope)의 발현이 현저히 줄어든 이종장기용 형질전환동물을 효율적으로 생산할 수 있는 형질전환 돼지 생산 방법을 제공할 수 있다.

따라서, 본 발명은 바이오 이종장기이식 분야에서 매우 유용하게 활용될 수 있다.

도 1a 및 1b는 본 발명의 일 실시예에 의한 Cas9 시스템을 이용한 초급성 면역거부반응 유발 유전자 iGb3s를 결손 시키기 위해 가이드 RNA(guide RNA, gRNA) 위치 후보군 및 이의 선정 과정을 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 의한 Cas9-GFP-iGb3s 벡터 구조체(vector construct)를 보여주는 모식도이다.
도 3a 및 3b는 본 발명의 일 실시예에 의해 Cas9-GFP-iGb3s 포지티브 세포(positive cell)를 선별하는 결과를 보여주는 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 의해 Cas9-GFP-iGb3s 포지티브 세포(positive cell)로 선별된 세포주(#5번)를 시퀀싱하여 4개 염기가 결손된 iGb3s 넉아웃(knock-out) 세포주인 것을 확인한 결과를 보여주는 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 의한 세포주(#5번)에 의한 α-Gal 에프토프 발현 특성을 확인하기 위해 BS-I-B4 렉틴(lectin) 항체를 이용하여 측정한 FACs 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 의해 GT^- ^MCP ^/- ^MCP + iGb3s^-/- 형질전환 복제난자를 대리모에 이식하여 GT^- ^MCP ^/- ^MCP + iGb3s^-/- 형질전환 복제돼지를 생산한 결과를 보여주는 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 의한 GT^- ^MCP ^/- ^MCP + iGb3s^-/- 형질전환 복제돼지를 시퀀싱에 의해 확인한 결과를 보여주는 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 의한 GT^- ^MCP ^/- ^MCP + iGb3s^-/- 형질전환 복제돼지의 면역억제 효과를 확인하기 위해, Wild type(J-5021), GT^- ^MCP ^/- ^MCP 및 GT^- ^MCP ^/- ^MCP + iGb3s^-/- 형질전환 체세포를 이용하여 LC-MS/MS 분석을 실시한 결과 Gal-Gal 연결된 당구조가 GT^- ^MCP ^/- ^MCP + iGb3s^-/- 형질전환 세포에서 현저하게 감소하는 결과를 보여주는 도면이다.

본 발명을 더 쉽게 이해하기 위해 편의상 특정 용어를 본원에 정의한다. 본원에서 달리 정의하지 않는 한, 본 발명에 이용된 과학 용어 및 기술 용어들은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 또한, 문맥상 특별히 지정하지 않는 한, 단수 형태의 용어는 그것의 복수 형태도 포함하는 것이며, 복수 형태의 용어는 그것의 단수 형태도 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명에서 사용되는 “넉아웃(knock-out)"이라 함은 염기서열 중 특정 유전자가 발현될 수 없도록 이를 변형 또는 제거하는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 "넉인(Knock-in)"은 다른 종 또는 원래부터 해당 생명체에 존재하지 않았던 외래의 염기서열을 해당 생명체의 게놈 또는 해당 생명체로부터 유래한 DNA 염기서열에 유전자 재조합 기술을 이용하여 삽입하는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 “iGb3s”는 이소글로보트리헥소실세라마이드 신타제를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 “가이드 RNA”는 표적 DNA에 특이적인 RNA로, Cas 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, Cas 단백질을 표적 DNA에 가져오는 RNA를 말한다.

본 발명에서 사용되는 “GT”는 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 상동 재조합에서의 "상동"은 제1영역 또는 제2영역과 이에 해당하는 유전자의 핵산 서열과의 동일성 정도를 나타내는 것으로, 적어도 90% 이상 동일하고, 바람직하게는 95% 이상 동일하다.

본 발명에서 사용되는 "선별 마커(selection marker)"란 세포로 유전자 타겟팅 넉아웃 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있고, 양성 선별마커와 음성 선별마커가 있다.

상기 양성 선별 마커는 선택제가 처리된 환경에서 당해 특정 마커를 발현하는 세포만 생존하도록 하여 양성 선택을 가능하게 하는 마커를 의미하며, 양성 선별 마커 유전자는 상기 양성 선별 마커를 암호화하는 유전자를 의미하는데, 예를 들어, 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제는 항생제 네오마이신이 첨가된 배지에서 진핵세포가 생존할 수 있도록 하는 항생제 내성을 부여함으로써, 진핵세포에 있어서 안정적 형질감염 세포를 선별하는데 사용된다.

상기 음성 선별 마커 유전자는 무작위적 삽입이 일어난 세포를 선별하여 제거하는 음성 선택을 가능하게 하는 마커 유전자로서, 당해 유전자를 발현하는 세포만을 선별적으로 사멸시킴으로써, 무작위적 삽입에 의한 형질도입을 방지하는 역할을 수행한다.

본 발명에서 사용되는 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 형질전환은 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 플라스미드 또는 비플라스미드성 나출(naked DNA)에 의한 진핵세포의 형질전환을 세포의 종양화의 의미로서의 형질전환과 구분하기 위해, "형질감염(transfection)"이라고 부르기도 하는데, 본 문서에서는 동일한 의미로 사용된다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 측면에 의하면, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 구성되는 분리된 이소글로보트리헥소실세라마이드 신타제(iGb3s) 유전자 및 이를 포함하는 벡터가 제공된다.

본 발명에서, 이소글로보트리헥소실세라마이드 신타제(isoglobotrihexosylceramide synthase, iGb3s) 유전자는 당전이효소(glycosyltransferase)의 패밀리 중 하나이다.

본 발명의 목적상 상기 iGb3s 유전자는 세포에서 넉아웃 되기 위한 대상으로서, 상기 iGb3s 유전자의 유래는 넉아웃 하고자 하는 세포의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 특별히 이에 제한되지 않으나, 포유류 유래가 적합하고, 바람직하게는 미니돼지 또는 돼지 유래일 수 있다.

상기 iGb3s 유전자의 정보는 미국국립보건원 GeneBank와 같이 공지의 데이터로부터 얻을 수 있으나 (NCBI Reference Sequence: NM_001009819.2), 특별히 이에 제한이 되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 돼지 유래의 iGb3s 유전자 정보를 이용하여 iGb3s 유전자 넉아웃 효율을 높일 수 있는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 iGb3s 유전자 특이적 가이드 RNA로 제공한다. 또한, 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA도 본 발명에 권리범위에 포함된다.

상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열은 표적의 대상이 되는 유전자의 서열과 동일한 서열뿐만 아니라, 이와 상동 재조합이 가능한 서열이라면 유사성을 가지는 서열도 포함하며, 바람직하게는 표적 대상이 되는 유전자의 서열과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 유사성을 나타내는 서열도, 상동 재조합이 가능한 서열이라면 본 발명의 범주에 포함된다.

도 1a 및 도 1b는 본 발명의 일 실시예에 의한 Cas9 시스템을 이용한 초급성 면역거부반응 유발 유전자 iGb3s를 결손시키기 위해 가이드 RNA(guide RNA, gRNA) 위치 후보군 및 이의 선정 과정을 나타내는 도면이다. 상기 도면에 나타난 바와 같이 #4로 표시된 염기서열(서열번호 1)로 구성된 돼지 이소글로보트리헥소실세라마이드 신타제(iGb3s) 유전자 단편이 가장 높은 indel이 확인되어 iGb3s 결손 세포주를 구축하는데 유용하게 이용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 gal 에피토프(epitope)의 발현을 제어하여 초급성 면역거부반응이 현저하게 감소된 돼지를 생산할 수 있는 상기 유전자 단편을 포함하는 벡터를 제공할 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 벡터는 게놈의 특정 유전자 위치에서 상동 유전자 재조합이 일어나도록 넉-아웃 하고자 하는 특정 유전자의 상동 염기서열을 포함하는 벡터를 의미한다. 이러한 벡터는 원형(circular) 또는 선형(linear) 형태 일 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, iGb3s 유전자 또는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 구성되는 iGb3s 유전자 단편; 및 상기 iGb3s 유전자 결손을 위한 유전자를 포함하는 벡터가 제공된다.

상기 iGb3s 유전자 결손을 위한 유전자는 다양한 공지된 유전자 및 방법을 이용할 수 있으며 특별한 제한이 있는 것은 아니다. 예를 들어 ZFN과 TALEN 기법을 이용할 수도 있으며, 본 실험적 기법을 이용하여 NaCl co-transporter에 영향을 주는 WNK가 제거된 세포주를 만들었다는 연구 결과뿐만 아니라, 치명적인 유전질환을 일으키는 것으로 알려진 Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH)의 경우 적중벡터를 만들어 마우스 난자에 직접 미세 주입함으로써 형질전환 동물을 만드는 등, 본 연구 기법은 최근 유전자 편집을 위한 세포주 개발 및 동물생산 등 다양한 분야에 이용되고 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 iGb3s 유전자 결손을 위한 유전자는 Cas9일 수 있고, 이에 한정되는 것은 아니나 hSpCas9일 수 있다.

본 발명의 “Cas”는 CRISPR/Cas 시스템에서 필수적인 단백질 요소를 의미하고, CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(trans-activating crRNA, tracrRNA)로 불리는 두 RNA와 복합체를 형성할 때, 활성 엔도뉴클레아제 또는 니카아제를 형성한다. 본 발명에서 Cas 단백질은 가이드 RNA와 복합체를 형성할 때, 엔도뉴클레아제 또는 니카아제 활성을 갖는다면, 어떠한 Cas 단백질일 수 있다. Cas9 단백질 또는 이의 변이체가 적합할 수 있고, hSpCas9(humanized S. pyogenes Cas9)가 더욱 적합할 수 있다. 또한, CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 적중 벡터 및 세포주를 개발하는 방법은 이전의 유전자 교정 방법 (ZFN 또는 TALEN) 에 비해 개발에 드는 시간 및 비용을 줄일 수 있는 장점이 있고, gRNA 와 결합하는 부분이 ZFN과 TALEN에서는 각각 6개, 15개의 아미노산만 일치하면 적중 벡터가 작동을 하는 방식인 반면에 CRISPR/Cas9 방식에서는 20 베이스가 일치해야지 적중벡터가 작용을 함에 따라 보다 적중 효율을 높일 수 있다는 장점이 있다.

Cas 유전자 및 단백질의 정보는 NCBI의 GenBank에서 구할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 벡터는 다양한 공지의 선별 마커를 포함할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, 상기 벡터는 Cas9-GFP-iGb3s 벡터의 구조를 가질 수 있다.

발명의 일 실시예에 의하면, 상기 벡터는 도 2에 도시된 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 U6 프로모터(promoter) 뒤에 iGb3s gRNA가 삽입되고, 유전자 결손을 위한 hSpCas9 유전자와 선별 마커 GFP 유전자가 삽입된다. 이 두 유전자는 Cas9 시스템에 효율적인 CBh 프로모터에 의해 전사되며, 효과적인 핵 내부 도입을 위해 hSpCas9 유전자 양 옆에는 NLS(Nuclear localization sequence)가 삽입된다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 벡터로 형질전환된 세포주가 제공된다.

본 발명에 있어, 상기 세포주는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는, 이소글로보트리헥소실세라마이드 신타제(isoglobotrihexosylceramide synthase, iGb3s) 넉아웃 세포주이다(도 4 참조). 본 발명에서 선별된 다양한 형질전환 세포주 중에 4개의 염기가 결손된 세포주(#5번)를 이용하였다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 의한 세포주(#5번)에 의한 α-Gal 에프토프 발현 특성을 확인하기 위해 BS-I-B4 렉틴 항체를 이용하여 측정한 FACs 그래프이다. 도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에 의해 확립된 세포주(iGb3s^-/- #5)의 경우, 인간 세포주와 피크가 거의 일치하기 때문에 IB4-렉틴이 거의 발현 되지 않은 것을 확인할 수 있다. 따라서 본원발명에 의한 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 4개 염기가 결손된 iGb3s 넉아웃(knock-out) 세포주를 이용하면 효율적으로 초급성 면역거부반응이 현저하게 감소한 돼지를 생산할 수 있고(도 6), 인간 장기 이식 효율을 극대화할 수 있는 효과가 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 서열번호 3의 염기서열은 서열번호 2의 야생형 유전자의 염기서열(NCBI Reference Sequence: XM_021095855.1)중 ATG로 부터 503-506번째 염기인 GCCT 염기가 결손된 것일 수 있다(도 7 참조).

본 발명에 있어, 상기 벡터 제작은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다. 또한, 상기 형질전환은 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온성 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 세포주로 사용될 세포의 종류에는 제한이 없으며, 동물세포 또는 동물세포 유래의 세포일 수 있고, 바람직하게는 포유류, 보다 바람직하게는 돼지 또는 미니어처 돼지 유래의 체세포가 될 수 있으며, 보다 바람직하게는 돼지 또는 미니어처 돼지의 간, 신장, 비장, 뼈, 골수, 흉선, 심장, 근육, 허파, 뇌, 정소, 난소, 소도(islet), 내장, 골수, 귀, 피부, 쓸개, 전립선, 방광, 배아(embryo), 면역계 및 조혈계 세포가 될 수 있고, 가장 바람직하게는 돼지 또는 미니어처 돼지 유래의 섬유아세포 또는 귀 조직의 세포가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 세포주는 알파 1,3 갈락토실트랜스퍼라제(alpha1,3-Galactosyltransferase, GT)가 넉아웃(knock-out)되고 CD46(MCP: membrane cofactor protein)이 넉인(knock-in)된 형질전환 돼지(GT^-MCP/-MCP)의 체세포일 수 있다.

상기 알파 1,3 GT^- ^MCP ^/- ^MCP 돼지는 초급성 면역거부반응 유전자인 알파 1,3 갈락토실트랜스퍼라제(alpha1,3-Galactosyltransferase, GT)가 넉아웃(knock-out)되고 사람 CD46(MCP: membrane cofactor protein)이 삽입(knock-in)된 형질전환 돼지로서 이종간 장기이식용 기관 공여자로 사용된다.

본 발명에 있어서, 상기 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제(α1,3-galactosyl transferase, α1,3-GT)은 UDP-갈락토스를 당, 스핑고신, 세라미드, 디아실글리세롤, 히드록시리신 등의 수용체 기질의 히드록실기에 α-1,3 연결고리로 전이시키는 효소를 의미하는데, 특히 사람에게는 존재하지 않고 돼지에만 존재하는 항원 단백질인 Galα(1,3)Gal의 합성에 관여하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 목적상 상기 α1,3-GT는 상기 Galα(1,3)Gal에 의한 이식용 장기의 면역거부반응의 발생을 억제하기 위하여, 상기 이식용 장기로부터 활성을 제거하기 위한 대상으로서 사용되지만, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 일반적으로 돼지의 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자는 8개의 인트론과 9개의 엑손으로 구성되어 있고, 엑손 9에 해당하는 단백질 부위에서 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제의 효소 활성을 나타낸다고 알려져 있으므로(Yifan Dai, Nature, 20: 251-255, 2002), 엑손 9의 기능을 저해하도록 넉인 벡터를 제조할 경우에는 보다 효과적으로 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자의 기능을 저해할 수 있는 장점이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 CD46(MCP: membrane cofactor protein)은 사람 CD46(막공동조절단백질; membrane cofactor protein)이 적합할 수 있다. 막공동조절단백질인 CD46(MCP)은 항원-항체와 보체가 결합(C1)하여 세포막을 파괴하는 단백질복합체(C9)로 전개되는 과정 중 C3b와 C4b의 분해를 촉진시키고, CD55(DAF)는 C3와 C5의 결합체를 붕괴하는 역할을 하여 보체의 활성화를 억제시킨다. CD46과 CD55는 보체에 의한 세포사를 예방할 뿐만 아니라 C3a와 C5a의 생성과 세포 표면에서 백혈구의 식균작용을 돕는 물질인 옵소닌의 생성도 억제하는 역할을 한다. 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라아제 유전자가 제거되었음에도 불구하고 다른 경로를 통해 유발되는 보체활성을 통해 장기 이식시 심각한 거부반응이 초래될 수 있다는 보고가 있다(Tanemura, M. et al ., Biochem. Biophys. Res. Commun., 235:359-364, 1997; Komoda, H. et al., Xenotransplantation, 11; 237-246, 2004). 이에 CD46은 일반적인 경로뿐만 아니라 일반적이지 않은 경로에 의한 보체활성에 따른 세포사를 억제하는데 크게 효과적이기 때문에 장기이식시 일어나는 거부반응을 좀 더 효과적으로 억제할 수 있다. 상기 돼지(GT^- ^MCP ^/- ^MCP)의 체세포에 대해서는 KR 10-1236724에 기재된 방법을 사용할 수 있으며, 상기 특허문헌들은 모두 본 문서에 참조로 삽입된다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 벡터로 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 iGb3s 유전자 넉아웃 세포주 제조 방법이 제공된다.

본 발명에 있어, 형질전환은 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온성 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.

상기 세포주로 사용될 세포의 종류에는 제한이 없으며, 동물세포 또는 동물세포 유래의 세포일 수 있고, 돼지 또는 미니어처 돼지 유래의 섬유아세포 또는 귀 조직의 세포가 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 기재된 벡터 및 선별 마커(selection marker)를 포함하는 벡터로 세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 세포를 배양한 후 상동 재조합(homologous recombination)이 된 세포로 선별하는 단계를 포함하는 형질전환 세포주 제조 방법이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 돼지 세포는 알파 1,3 갈락토실트랜스퍼라제(alpha1,3-Galactosyltransferase, GT)가 넉아웃(knock-out)되고 CD46(MCP: membrane cofactor protein)이 삽입(knock-in)된 형질전환 돼지(GT^-MCP/-MCP)의 체세포일 수 있다.

상기 형질전환은 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다.

상기 벡터는 상동 재조합에 의하여, α1,3-GT 유전자를 불활성화 또는 제거할 수 있는데, 이러한 상동 재조합의 효율을 향상시키기 위하여, 상기 α1,3-GT 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열과 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

이때, 상기 돼지의 체세포는 10일령 돼지의 귀로부터 수득한 세포를 사용함이 적합할 수 있고, 상기 세포의 배양은 귀 조직을 글루코오스 및 15% FBS, 비필수 아미노산, 피루브산나트륨 및 베타-머르캅토에탄올이 포함된 DMEM 배지에서 계대 배양함에 의해 수행될 수 있으나, 배지조건, 배양조건 등은 특별히 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 형질전환된 체세포를 선별하는 방법은 상기 벡터에 포함된 양성 선별마커가 발현된 세포를 인식할 수 있는 장치 또는 처리제를 이용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, GFP 형광을 이용하여 상기 벡터가 정상적으로 도입된 세포를 셀 소터를 이용하여 GFP 형광을 발현하는 세포들만 선별할 수 있다. 또한, 양성 선별마커로서 네오마이신을 사용할 경우, 처리제로서 G418을 포함하는 선별배지를 사용하여 형질전환된 체세포를 배양하여 선별할 수 있는데, 이때, 상기 선별배지에 포함된 G419의 처리농도는 200 내지 400㎍/㎖가 될 수 있고, 배양기간은 이에 제한되는 것은 아니나 11 내지 12일 동안 수행할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 세포주를 이용하여 핵치환된 복제난자가 제공된다.

본 발명에서, 상기 핵치환은 세포의 핵을 이미 핵을 제거한 난자에 넣어 이식시키는 것을 의미하며, 이런 핵치환된 복제난자를 대리모에 착상시켜서 태어난 개체는 핵공여 세포의 유전적 물질이 핵수여 세포질로 그대로 전달되었기 때문에 유전적으로 완전히 동일한 복제 개체이다. 본 발명에 의한 핵치환 복제난자는 GT 및 iGb3s가 동시에 넉아웃된 것을 특징으로 한다.

이에 한정되는 것은 아니나, 본 발명에서는 핵치환하기 전에 40 ~ 44시간 동안 체외성숙이 완성된 돼지 난자의 핵을 제거하고, 동결융해 후 배양기에서 1시간 동안 안정화시킨 후 Gb3s^-/- 또는 GT^- ^MCP ^/- ^MCP + iGb3s^-/- 형질전환 체세포를 핵이 제거된 난자의 위란강에 넣어 세포질과 밀착시켜 핵치환을 실시할 수 있다. 본 발명은 복제난자 생산 후 당일 이식하는 것을 프로토콜화 하였고(Molecular Biotechnology, 2013. 55:212-216; Transgenic Research 2017. 26:153-163), 통상의 3일 정도의 추가 배양은 필요하지 않다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 핵치환된 복제난자를 발달시켜 생산된 iGb3s 넉아웃 형질전환 돼지가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 기재된 벡터를 돼지 세포로 도입하는 단계; 상기 벡터가 도입된 세포를 선별한 후 체세포 핵치환을 수행하는 단계; 및 상기 핵치환된 세포를 발달시키는 단계를 포함하는 iGb3s 유전자 넉아웃 돼지의 생산 방법이 제공된다.

이에 한정되는 것은 아니나, 상기 돼지는 NIH-미니어처 복제 돼지일 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면, 벡터가 알파 1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자에 타겟팅된 형질전환 NIH 미니어처 돼지를 제공될 수 있다. 상기 복제동물의 생산에 이용되는 핵치환 방법은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하는 것이 가능하나, 보다 바람직하게는 US6,781,030B, US6,603,059B, US6,235,969B, US7,355,094B, US7,071,372B, KR862298B, KR500412B, KR807644B, JP4153878B, US6,700,037B, US7,291,764B, US6,258,998B, US6,548,741B, WO03/089632A, US7,371,922B 등이 사용될 수 있고, 특히 돼지의 경우에는 KR500412B, KR807644, JP4153878B, US6,700,037B,US7,291,764B, US6,258,998B, US6,548,741B, WO03/089632A 또는 US7,371,922B에 기재된 방법을 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 상기 특허문헌들은 모두 본 문서에 참조로 삽입된다.

상기 핵 치환을 수행하는 단계는 핵이 제거된 난자에 벡터가 포함된 선별된 세포의 핵을 도입하는 단계이다. 상기 핵이 제거된 난자는 공지된 핵치환 방법, 즉 물리적인 방법, 화학적인 방법 및/또는 사이토칼라신(cytochalasin) B를 사용한 원심분리법 등을 사용하여 난자로부터 생산할 수 있다.

상기 iGb3s 유전자 표적화된 체세포를 핵이 제거된 난자 내로 도입하는 방법은, 세포막 융합법, 세포질 내 미세주입법 등을 이용할 수 있는데, 세포막 융합법은 간단하며 대규모의 수정란 생산에 적합하다는 장점이 있으며, 세포질 내 미세주입법은 핵과 난자 내 물질과의 접촉을 극대화시킨다는 장점이 있다. 체세포와 핵이 제거된 난자와의 융합은 전기자극을 통하여 세포막의 점도를 변화시켜 융합시키는 방법을 통하여 재조합할 수 있으며，이때，미세전류·전압을 자유롭게 조정할 수 있는 전기 융합기를 이용할 수 있다.

핵치환된 수정란은 이식 가능한 단계까지 발생시킨 후 대리모의 자궁에 착상시킬 수 있으며, 세포주기 정지요소인 MPF, MAP 키나제 등의 세포신호전달물질의 활성을 저하시키는 것이 바람직하며, 이를 위해 복제 수정란 내 칼슘 이온을 증가시키기 위해 세포막 투과도를 변형시키거나, 세포 외로부터 칼슘 유입을 급격히 증가시키거나, 이노마이신(ionomycin) 및 6-DMAP 등의 화학적 물질을 이용하여 세포주기 정지요소의 활성을 직접적으로 저해시키는 방법 등을 이용할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명에 의한 세포주를 이용하여 핵치환하여 복제난자를 생산하는 단계; 및 상기 복제난자를 대리모의 자궁에 이식하여 발달시키는 단계를 포함하는, iGb3s 넉아웃 형질전환 돼지의 생산 방법이 제공된다.

이에 한정되는 것은 아니나, 상기 복제난자는 생산 후 2시간 내에 발정기 대리모의 자궁에 이식되는 것이 적합하다. 이는 복제난자가 부적절한 배양환경에 노출되어 임신율이 저하되는 것을 방지하고자 하는 것이다.

이에 한정되는 것은 아니나, 상기 복제난자 이식 시 단위발생 난자와 함께 이식되는 것이 적합하다. 상기 복제난자는 단독 이식도 가능하나, 상기 단위발생 난자는 초기 착상에 도움을 주어 초기 임신율을 현저하게 증가시킬 수 있다.

본 발명에 의해 생산된 돼지는 이종간 장기 이식시 초급성 면역반응이 현저히 저해되어 보다 효율적으로 인간 맞춤형 장기를 생산하는데 이용될 수 있다.

이하, 본 발명은 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

Cas9-GFP-iGb3s gRNA 위치(site) 선정

Cas9 시스템을 이용한 초급성 면역거부반응 유발 유전자 iGb3s를 결손 시키기 위해 가이드 RNA(guide RNA, gRNA) 위치 후보군을 선정하였다(도 1a). 후보군은 총 4개로 각각 NGG의 PAM(Protospacer Adjacent Motif) 시퀀스 앞 20 염기(base)를 선정하였고, gRNA의 효율을 확인하기 위하여 T7E1 분석(T7E1 assay)을 수행하였다. 그 결과 벡터 4번에서 가장 높은 indel을 확인하였고(도 1b), iGb3s 결손 세포주를 구축하는데 이 벡터를 이용하였다.

Cas9 - GFP - iGb3s 벡터 구조체(vector construct) 구축

iGb3s 유전자를 결손시키기 위하여 사용된 기본 벡터는 Addgene 사에서 분양받아 사용을 하였으며 [pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)], Cas9-GFP-iGb3s 벡터의 구조는 다음과 같다. U6 프로모터(promoter) 뒤에 iGb3s gRNA를 삽입하였고, 유전자 결손을 위한 hSpCas9 유전자와 선별 마커 GFP 유전자를 삽입하였다. 이 두 유전자는 Cas9 시스템에 효율적인 CBh 프로모터에 의해 전사되도록 하였고, 효과적인 핵 내부 도입을 위해 hSpCas9 유전자 양 옆에는 NLS(Nuclear localization sequence)를 삽입하였다. 또한, GFP 뒤에 bGH-pA를 삽입하여 효율적인 전사과정을 유도하였으며, gRNA 삽입된 벡터를 보다 편리하게 선별하기 위해 암피실린(Ampiciliin) 저항성 유전자를 삽입하여 벡터 선별 및 구축을 보다 용이하게 하였다.

미니돼지 체세포 배양

상기 제작된 벡터를 도입하기 위한 숙주세포는 α1,3 GT^- ^MCP ^/- ^MCP 돼지의 귀에서 유래된 체세포를 이용하였으며, 체세포의 배양은 1X10⁶ 개의 세포를 10cm 배양 접시에서 배양을 하였으며, 배양에 사용된 배양액의 성분은 다음과 같다. DMEM을 기본 배지로 하여, 20% defined Fetal Bovine Serum, 1% 100X Non-essential amino acid, 1% 100X Sodium pyruvate, 0.1% 1000X b-mercaptoethanol을 첨가하여 세포 배양에 사용하였다.

Cas9-GFP-iGb3s 벡터의 형질전환

상기 제작된 Cas9-GFP-iGb3s 벡터를 배양된 α1,3 GT^- ^MCP ^/- ^MCP 돼지의 귀에서 유래된 체세포에 리포펙트아민(Lipofectamine)을 이용하여 도입 및 형질전환체를 유도하였다. 10cm 배양 접시에 세포가 약 80~90% 정도의 세포수를 보일 때 형질전환 유도를 하였으며, 그 방법은 다음과 같다. Cas9-GFP-iGb3s 벡터 12㎍, Plus regent 12㎍, Opti-MEM 750㎕를 같이 혼합하여 상온에서 5분간 반응시키고, Lipofectamine 2000과 Opti-MEM 750㎕을 혼합하여 상온에서 5분간 반응시켰다. 그 사이 배양 접시에 배양액은 Opti-MEM으로 교체해 주고, 각각 상온 반응이 끝나면 이 둘을 혼합하여 상온에서 20분간 반응시킨 후 Opti-MEM 10ml가 든 10cm 배양 접시에 넣고 부드럽게 섞어주었다. 4시간 동안 37℃/5% CO₂ 인큐베이터에서 배양 후 기존 배양액인 체세포 배양액으로 교체 후 배양하였다.

Cas9 - GFP - iGb3s 양성세포 (positive cell) 선별

상기와 같이 세포에 리포펙트아민(Lipofectamine)를 이용하여 Cas9-GFP-iGb3s 벡터를 형질 도입 후, 도입 유무를 확인하기 위하여 세포를 형광현미경으로 관찰하였다(도 3a). 그 결과 세포에서 GFP 형광을 확인할 수 있었고, 이는 벡터가 정상적으로 세포에 도입되어 있다는 것을 의미한다. 이 세포들을 BD FACSAria 셀 소터(cell sorter)를 이용하여 Cas9-GFP-iGb3s 벡터가 도입되지 않은 대조구 (α1,3 GT^- ^MCP ^/- ^MCP 돼지 체세포)와 비교했을 때 GFP 형광을 발현하는 세포들(GT^- ^MCP ^/- ^MCP + iGb3s^-/-)만 선별하였다(도 3b).

시퀀싱에 의한 iGb3s 넉아웃(knock-out) 세포주의 확인

FACS 소팅(sorting)을 통하여 선별된 세포들을 배양 및 증식시킨 후 유전자 염기서열을 분석하였다. 그 결과 #46은 야생형과 3 염기 결손, #47번은 야생형과 1 염기 삽입, #42번은 3 염기 결손과 10 염기 결손, #5번은 양쪽 염색체 모두 4 염기 결손으로 확인되었다. 이는 4개의 세포주가 프레임 시프트에 의한 초급성 면역거부반응 유발 유전자인 iGb3s가 결손된 세포주라는 것을 의미한다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 의해 Cas9-GFP-iGb3s 포지티브 세포(positive cell)로 선별된 세포주(#5번)를 시퀀싱하여 4개 염기가 결손된 iGb3s 넉아웃(knock-out) 세포주인 것을 확인한 결과를 보여주는 도면이다.

이들 세포주 중에서 #42번과 #5번 세포주가 양쪽 염색체에서 iGb3s가 결손된 호모화된 세포주였으며, 특히 #5번 세포주가 형태적으로 사용하기에 적합할 뿐만 아니라 FACS 분석 결과 형질전환 복제돼지 생산에 적합한 것으로 나타났다.

도 5는 본 발명의 일 실시예에 의한 세포주(#5번)에 의한 α-Gal 에프토프 발현 특성을 확인하기 위해 BS-I-B4 렉틴 항체를 이용하여 측정한 FACs 그래프이다. 도 5에서 검은 실선은 인간 세포주(HeLa cell)이고, 청색 실선은 돼지 세포주(Pig immortalized cells)이고, 적색 실선이 iGb3s 넉아웃(knock-out) 세포주(#5번)을 나타낸다. 주지된 바와 같이, IB4-렉틴은 gal-에피토프(epitope)를 바인딩하는 것으로, IB4-렉틴의 발현 양상은 iGb3s를 넉아웃 효율의 평가지표가 될 수 있다. iGb3s가 넉아웃되면 IB4-렉틴이 거의 발현이 되지 않기 때문에 인간 세포주 방향으로 (즉, 도 5에서 왼쪽으로) 많이 치우치는 경향을 나타낸다. 도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에 의해 확립된 세포주(iGb3s^-/- #5)의 경우, 인간 세포주와 피크가 거의 일치하기 때문에 IB4-렉틴이 거의 발현 되지 않은 것을 확인할 수 있다. 따라서 본원발명에 의한 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 4개 염기가 결손된 iGb3s 넉아웃(knock-out) 세포주를 이용하면 효율적으로 초급성 면역거부반응이 현저하게 감소한 돼지를 생산할 수 있고, 인간 장기 이식 효율을 극대화할 수 있는 효과가 있다.

iGb3s 넉아웃 (knock-out) 세포주를 이용한 복제난자 생산 방법

40 ~ 44시간 동안 체외성숙이 완성된 돼지 난자의 핵을 제거하고, 동결융해된 iGb3s^-/- 또는 GT^-MCP/-MCP+ iGb3s^-/- 형질전환 체세포를 배양기에서 1시간 정도만 안정화를 시킨 후 핵이 제거된 난자의 위란강에 넣어 세포질과 밀착시켰다.

30분 동안 안정화가 끝난 재구축 난자를 250㎛ 폭의 전기선으로 구성된 융합 챔버(fusion chamber, BLS Fusion Electrode, Budapest, Hungary)에 0.3M mannitol, 0.1 mM MgSO₄과 1.0 mM CaCl₂ 및 0.5 mM Hepes가 첨가된 용액으로 침지하였다.

그 다음, 1초 간격으로 30μsec 동안 1.2kV/cm 전압의 DC 전극을 2회 LF101 Electro Cell Fusion Generator(NepaGene Co., Ltd., Japan) 장비로 통전을 실시하여 복제난자를 생산하였다.

iGb3s 넉아웃 복제돼지의 생산 방법

전기융합이 확인된 재구축 복제난자는 2시간 이내에 발정기 대리모의 자궁에 이식하였다. 복제난자를 이식할 때 초기 착상에 도움이 될 수 있도록 단위발생 난자를 함께 이식하였다. 단위발생 난자의 생산은 체외성숙이 완료된 돼지 난자를 재구축 난자와 동일한 조건으로 전기자극을 실시하여 단위발생을 유도하였다.

상기 재구축 복제난자를 단위발생 난자와 함께 대리모의 자궁에 이식하면 초기임신율이 12%에서 61%로 향상되었다. 즉, 체세포 핵 이식(Somatic Cell Nuclear Transfer, SCNT) 복제 난자만 대리모의 자궁에 이식한 경우의 임신율은 12%(3/25 대리모)였고, 단위발생 난자(parthenotes)와 함께 이식한 경우의 임신율은 61%(11/18 대리모)였다(표 1).

약 114일 동안의 임신기간을 거친 GT^- ^MCP ^/- ^MCP + iGb3s^-/- 형질전환 복제 태아는 생산된 후(도 6), 곧바로 탯줄에서 분리된 세포의 시퀀싱을 실시하였다. 그 결과 도 7에 도시된 바와 같이, 4개 염기가 결손된 세포주(#5번)를 이용하였기 때문에 프레임 시프트에 의한 초급성 면역거부반응 유발 유전자인 iGb3s가 결손 되었음을 확인하였다.

iGb3s 넉아웃 세포주를 이용한 당단백 발현 분석

본 발명의 일 실시예에 의한 GT^- ^MCP ^/- ^MCP + iGb3s^-/- 형질전환 복제돼지의 면역억제 효과를 확인하기 위해, Wild type(J-5021), GT-MCP/-MCP 및 GT-MCP/-MCP + iGb3s-/- 형질전환 체세포를 이용하여 LC-MS/MS(nano LC - Orbitrap Tribrid Fusion Lumos mass spectrometer(Thermo Fisher Scietific, USA) 분석을 실시한 다음 GPA (GlycoProteome Analyzer) database(20170627_sus scrofa_1419ea_reviewed => NeuAc for sialic acid)에서 검색하였다.

정량결과는 3반복을 실시하였으며 재현성을 위하여 1) 정성 및 정량된 당펩타이드의 머무름 시간(RT)의 표준편차(STDEV)가 3분보다 큰 것은 삭제; 2) STDEV (RT) 계산할 수 없는 1번만 정량된 경우 삭제; 3) 정량 값의 CV (3TIQ) 30% 이상 삭제한 필터 방법(cGPA)을 적용시켰다(참고문헌: Scientific Reports | 6:21175 | DOI: 10.1038/srep21175)

그 결과 도 8에 나타난 바와 같이, Gal-Gal 연결된 당구조가 WT(8.17%), GT^-MCP/-MCP(6.91%), GT^-MCP/-MCP + iGb3s^-/-(0.65%) 순으로 감소하는 결과를 확인하였다.

또한, 후코스(fucose)를 포함하는 당펩타이드가 WT, GT^- ^MCP ^/- ^MCP, GT^- ^MCP ^/- ^MCP + iGb3s^-/- 순으로 증가하였다. 나아가, 시알산(sialic acid)를 포함하는 당펩타이드는 WT, GT^- ^MCP ^/- ^MCP, GT^- ^MCP ^/- ^MCP + iGb3s^-/- 순으로 증가하였다(Mono-sialic acid: 증가, Di-, Tri-sialic acid: 감소).

따라서, 본 발명에 의한 iGb3s 넉아웃 세포주를 이용하면, gal 에피토프(epitope)의 발현이 현저히 줄어든 이종장기용 형질전환 동물을 효율적으로 생산할 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Isoglobotrihexosylceramide synthase knock-out cell line, and cloned embryos and cloned animals using the same <130> NPF30993 <160> 3 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR PRIMER <400> 1 gccatgcccc gcctgctgct 20 <210> 2 <211> 1080 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 2 atgtatatat gtggaaatta cacacacaca catatatatt ttgtgttgct aatgtccctc 60 cctactcccc gcccacccag ggcctggaag agaatcttct ggtggttgat cctacttgca 120 cttgacctct tagggctgct cctgtttggc ctccctgctg tcaggcatct ggaagtcctt 180 gtccccatgg gtgtctgccc tttgaccaga acacccctgc tgagagacaa cttcacgggt 240 cccctgcatc cttgggcccg gcctgaagtc ctgacctgca cctcctgggg ggcccccatt 300 atatgggacg gcaccttcga cccagatgtg gcccagcaag aggctgccca gcagaacctc 360 accattggcc tgacggtctt tgctgtgggc aggtacctgg agaagtacct ggcacacttc 420 ctggagacag cagagcagca cttcatggtg ggccagtgcg tcgtgtacta cgtgttcacc 480 gagcgccctg cagccatgcc ccgcctgctg ctgggccccg accgtgggct acgggtggag 540 cacttggcgc gtgagcggcg ctggcaggac gtgtccatgg cgcgcatgcg cgcgctgcac 600 ccggcgctcg gggggcgcct gggccacggg gcgtgcttcg tgttctgcat ggacgtggat 660 cagcacttca gtggcgcctt cgggcccgag gcgctggccg agtcggtggc gcagctgcac 720 gcctggcact accgctggcc gcggtggctg ctgccctttg agcgtgacac gcgctcggcc 780 gccgtgctgg gcccgggcga gggcgacctc tactaccatg cggccgtgtt cgggggcagc 840 gtggccgcgc tgcggcgtct gacggcgcac tgcgcccggg gcctgcggcg ggaccgctcg 900 cgcggcctgg aggcgcgctg gcacgacaag agccacctca ataagttctt ctggctgcac 960 aagcccacca agctgctgtc gcctgagttt tgctggagcc ccgatcttgg ccgctgggct 1020 gagatccact gcccgcgcct gctctgggcg cccaaggagt atgccctgct gcaaagctag 1080 1080 <210> 3 <211> 1076 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 3 atgtatatat gtggaaatta cacacacaca catatatatt ttgtgttgct aatgtccctc 60 cctactcccc gcccacccag ggcctggaag agaatcttct ggtggttgat cctacttgca 120 cttgacctct tagggctgct cctgtttggc ctccctgctg tcaggcatct ggaagtcctt 180 gtccccatgg gtgtctgccc tttgaccaga acacccctgc tgagagacaa cttcacgggt 240 cccctgcatc cttgggcccg gcctgaagtc ctgacctgca cctcctgggg ggcccccatt 300 atatgggacg gcaccttcga cccagatgtg gcccagcaag aggctgccca gcagaacctc 360 accattggcc tgacggtctt tgctgtgggc aggtacctgg agaagtacct ggcacacttc 420 ctggagacag cagagcagca cttcatggtg ggccagtgcg tcgtgtacta cgtgttcacc 480 gagcgccctg cagccatgcc ccgctgctgg gccccgaccg tgggctacgg gtggagcact 540 tggcgcgtga gcggcgctgg caggacgtgt ccatggcgcg catgcgcgcg ctgcacccgg 600 cgctcggggg gcgcctgggc cacggggcgt gcttcgtgtt ctgcatggac gtggatcagc 660 acttcagtgg cgccttcggg cccgaggcgc tggccgagtc ggtggcgcag ctgcacgcct 720 ggcactaccg ctggccgcgg tggctgctgc cctttgagcg tgacacgcgc tcggccgccg 780 tgctgggccc gggcgagggc gacctctact accatgcggc cgtgttcggg ggcagcgtgg 840 ccgcgctgcg gcgtctgacg gcgcactgcg cccggggcct gcggcgggac cgctcgcgcg 900 gcctggaggc gcgctggcac gacaagagcc acctcaataa gttcttctgg ctgcacaagc 960 ccaccaagct gctgtcgcct gagttttgct ggagccccga tcttggccgc tgggctgaga 1020 tccactgccc gcgcctgctc tgggcgccca aggagtatgc cctgctgcaa agctag 1076

Claims

서열번호 3의 염기서열을 포함하고,
U6 프로모터, 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 iGb3s 유전자 단편, CBh 프로모터, NLS, hSpCas9, NLS, GFP 및 bGHpA가 작동 가능하도록 순서대로 포함된 벡터에 의해 형질전환되고,
알파 1,3 갈락토실트랜스퍼라제(alpha1,3-Galactosyltransferase, GT)가 넉아웃(knock-out)되고 CD46(MCP: membrane cofactor protein)이 삽입(knock-in)된 형질전환 돼지(GT^-MCP/-MCP)의 체세포인, 이소글로보트리헥소실세라마이드 신타제(isoglobotrihexosylceramide synthase, iGb3s) 넉아웃 세포주.
제1항에 있어서,
상기 서열번호 3의 염기서열은 서열번호 2의 야생형 유전자의 염기서열(NCBI Reference Sequence: XM_021095855.1) 중 ATG로부터 503-506번째 염기인 GCCT 염기가 결손된 것인, iGb3s 넉아웃 세포주.
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제1항 또는 제2항에 기재된 iGb3s 넉아웃 세포주를 이용하여 핵치환된, 인간 유래가 아닌 복제난자.
제7항에 기재된 복제난자로 생산된 iGb3s 넉아웃 형질전환 돼지.
체외성숙된 돼지 난자의 핵을 제거하는 단계;
제1항 또는 제2항에 기재된 iGb3s 넉아웃 동결 세포주를 융해하는 단계; 및
융해된 상기 세포주를 핵이 제거된 돼지 난자에 주입하고 상기 세포주의 핵으로 핵치환을 하는 단계를 포함하는, 돼지의 iGb3s 넉아웃 복제난자의 생산 방법.
제1항 또는 제2항에 기재된 세포주를 이용하여 핵치환하여 복제난자를 생산하는 단계; 및
상기 복제난자를 인간 제외 동물의 대리모의 자궁에 이식하여 발달시키는 단계를 포함하는, iGb3s 넉아웃 형질전환 돼지의 생산 방법.
제10항에 있어서,
상기 복제난자는 생산 후 2시간 내에 대리모에 이식되는 것을 특징으로 하는, iGb3s 넉아웃 형질전환 돼지의 생산 방법.
제10항에 있어서,
상기 복제난자 이식 시 단위발생 난자와 함께 이식되는 것을 특징으로 하는, iGb3s 넉아웃 형질전환 돼지의 생산 방법.