CN111801103A - 猪异种抗原的鉴定 - Google Patents

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Abstract

本文提供了遗传修饰的猪、猪器官、组织和细胞，其在异种移植后在人对象中导致排斥反应的倾向性较低。具体地，本文提供了缺少非Gal异种抗原的遗传修饰的猪，和适于移植到人中的从这种遗传修饰的猪获得的猪细胞、组织和器官。本文还提供了改善人对象中排斥相关症状的方法。

Description

猪异种抗原的鉴定
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年1月30日提交的美国临时申请第62/623,571号的优先权，其全部内容通过引用合并于此。
背景技术
已经产生了经过遗传修饰(即转基因，遗传工程改造)以去除主要的异种反应性抗原(“异种抗原”)的猪，例如去除αGal，N-羟乙酰神经氨酸(NeuGc，也称为Hanganutziu-Deicher抗原)，和B4GalNT2相关聚糖的三重敲除。然而，未知的异种抗原仍然存在，这意味着来自这种转基因猪的异种移植器官可能会诱导受体的排斥(例如，急性或急性体液排斥)。因此，在本领域中仍然需要缺少异种反应性抗原的遗传修饰的猪细胞和组织，所述异种反应性抗原对临床异种移植形成了关键的障碍。
发明内容
在第一方面，本文提供了一种转基因猪，其基因组包含遗传修饰，其导致破坏的猪CD37(pCD37)基因和破坏的猪CD81(pCD81)基因中的一个或多个。由于所述遗传修饰，与野生型猪相比，在转基因猪中不存在可检测水平的pCD37和pCD81蛋白之一或两者。当将来自所述转基因猪的组织移植到人中时，与将来自野生型猪的组织移植到人中时相比，排斥相关症状得到改善。在某些情况下，转基因猪的基因组还包含一些遗传修饰，这些修饰导致相对于缺少对基因组的所述修饰的猪细胞而言功能性α(1，3)-半乳糖基转移酶(αGT)，胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β1，4N-乙酰半乳糖胺基转移酶(B4GalNT2)的任何表达缺失，与缺乏所述遗传修饰的猪相比，转基因猪表现出降低的αGal抗原，Neu5GC抗原和B4GalNT2抗原水平。与来自野生型猪的细胞相比，转基因猪的细胞与人免疫球蛋白的结合减少。
在另一方面，本文提供获自本文描述的转基因猪的猪器官，组织或细胞。猪的器官，组织或细胞可以选自皮肤，心脏，肝脏，肾脏，肺，胰腺，甲状腺和小肠或其部分。
在另一方面，本文提供了遗传修饰的猪细胞，其包含对猪细胞的基因组的修饰，其导致以下一种或多种：(i)缺乏功能性pCD37的任何表达(pCD37KO)和(ii)缺乏功能性pCD81的任何表达(pCD81KO)，其中相对于缺乏所述遗传修饰的猪细胞，所述遗传修饰的猪细胞与人免疫球蛋白的结合减少。所述遗传修饰的猪细胞可进一步包含对所述猪细胞的基因组的修饰，其导致相对于缺少对基因组的所述修饰的猪细胞功能性α(1，3)-半乳糖基转移酶(αGT)，胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β1，4N-乙酰半乳糖胺基转移酶(B4GalNT2)的任何表达缺失，其中经修饰的猪细胞与缺乏所述遗传修饰的猪细胞相比显示出降低的αGal抗原水平，降低的Neu5GC抗原水平和降低的B4GalNT2抗原水平。
在另一方面，本文提供了衍生自遗传修饰的细胞的转基因猪。另外，本文提供了从遗传修饰的猪获得的猪器官，组织或细胞。猪的器官，组织或细胞可以选自皮肤，心脏，肝脏，肾脏，肺，胰腺，甲状腺、小肠或其部分。
在另一方面，本文提供了一种改善人对象中排斥相关症状的方法，该方法包括将具有降低的pCD37抗原水平和降低的pCD81抗原水平的猪移植材料移植到需要移植的人对象中，其中与将来自野生型猪的猪移植材料移植到人对象中相比，排斥相关症状得到改善。排斥相关症状可以选自细胞排斥反应相关症状，体液排斥反应相关症状，超急性排斥相关症状，急性体液异种移植反应排斥相关症状和急性血管排斥反应相关症状。
附图说明
当考虑以下的详细描述时，本发明将被更好地理解，并且除了上述内容之外的特征，方面和优点将变得显而易见。这样的具体实施方式参考了以下附图，其中：
图1显示了猪(p)pCD37和pCD81。CMV启动子用于产生pCD37和pCD81的载体。
图2证明了在用pCD37和pCD81转染的HEK293T细胞中的外源表达。48小时后裂解转染的细胞。Western印迹显示pCD37和pCD81在这些细胞上的表达。
图3证明人IgG/IgM与HEK293T细胞上的pCD37和pCD81的结合。
图4表示在图3的HEK293T细胞上与pCD37和pCD81结合的人IgG/IgM的平均荧光强度(MFI)比。
图5证明了pCD37和pCD81的野生型或Gal敲除(GalKO)猪成纤维细胞的过表达。
图6证明了人IgG与过表达pCD37和pCD81的野生型猪成纤维细胞的结合。
图7证明了人IgG与过表达pCD37和pCD81的GalKO猪成纤维细胞的结合。
图8证明了猪CD37序列的同种型。
图9显示了pCD37基因中的CRISPR/Cas9诱导的突变。
图10证明了人IgG与四联基因敲除(GGTA1/CMAH/B4GALNT2/CD37)肝衍生细胞(LDC)的结合。
尽管本发明可以进行大量的改变和采用替代形式，但在附图和以下详述中以示例的方式显示了本发明的示例性实施方式。但是应当理解，示例性实施方式的描述并不旨在将本发明的范围限制在所揭示的特定形式，反之，本发明应涵盖所附权利要求书所限定的本发明范围内的所有变化、等价形式和替代形式。
具体实施方式
说明书中所引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请通过引用纳入本文，如同它们完全示于本申请中那样。
本文提供的转基因动物，器官，组织和细胞至少部分基于发明人对新猪四跨膜蛋白作为非Gal异种反应抗原的鉴定和表征。四跨膜蛋白在细胞和体液免疫反应中起重要作用，与关键的白细胞受体相互作用，包括MHC(主要组织相容性复合物)分子，整联蛋白，CD4/CD8 T细胞和B细胞受体复合物。本文所述的遗传修饰动物及其猪器官，组织和细胞的优点包括，包含遗传修饰以敲除一个或两个新近鉴定的猪四跨膜蛋白的转基因动物所呈现的可能诱发超急性排斥(HAR)以及猪到人移植中的其他异种移植排斥问题的异种反应性抗原较少。因此，作为解决异种移植供体动物器官短缺的方法，转基因猪具有广阔的前景。另外，本文所述的遗传修饰的猪适合于临床试验，并提供了用于研究非Gal异种反应性抗原在对猪到人异种移植的免疫应答和凝血应答中的作用的动物模型。
因此，在第一方面，本文提供了遗传修饰的猪细胞，其中遗传修饰包含对猪细胞的基因组的修饰，其导致以下一种或多种：(i)缺乏功能性pCD37的任何表达(pCD37KO)和(ii)缺乏功能性pCD81的任何表达(pCD81KO)，其中相对于缺乏所述遗传修饰的猪细胞，所述遗传修饰的猪细胞与人免疫球蛋白的结合减少。
在某些实施方式中，经遗传修饰以缺乏功能性pCD37和/或pCD81表达的猪细胞被进一步遗传修饰以缺乏其他异种反应性抗原的表达。例如，在某些情况下，产生三，四或五基因敲除转基因猪是有利的，其中其基因组已被遗传修饰以突变或敲除编码pCD37和pCD81的基因(例如pCD37/pCD81双敲除)和编码α-1，3-半乳糖基转移酶-1(GGTA1)，胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β1，4-N-乙酰半乳糖胺基转移酶(β4GalNT2)的基因中的一个或多个。α-1，3-半乳糖基转移酶-1(GGTA1)酶是合成αGal抗原所必需的，而CMAH酶是合成N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)所必需的，N-羟乙酰神经氨酸是在大多数非人类哺乳动物中发现的唾液酸分子。人类无法合成Neu5Gc，因为人类基因CMAH是不可逆突变的，因此是无功能的。当进一步遗传修饰以包含GGTA1，CMAH和β4GalNT2的敲除时，与缺少所述遗传修饰的猪细胞相比，遗传修饰的猪细胞的αGal抗原水平降低，Neu5GC抗原水平降低，且B4GalNT2抗原水平降低。在某些情况下，在三基因敲除(KO)猪(Gal-KO/CMAH-KO/B4GalNT2-KO)的细胞中进行敲除pCD37和pCD81之一或两者的遗传修饰，而这些猪缺乏主要的异种抗原αGal，Neu5Gc和B4GalNT2相关聚糖。
如本文所用，术语“遗传修饰”及其语法等同物可以指核酸、例如生物体或其细胞的基因组内的核酸的一种或多种改变。例如，遗传修饰可以指基因的改变、添加和/或缺失。遗传修饰的细胞也可以指带有添加、缺失和/或改变的基因的细胞。在一些情况下，从野生型(非遗传修饰)的非人类动物(如猪或另一种哺乳动物)中分离的细胞经过遗传修饰，以供根据本文提供的方法使用。在一些情况下，遗传修饰的细胞是从遗传修饰的非人类动物(如遗传修饰的猪)中分离的细胞。来自遗传修饰的非人类动物的遗传修饰的细胞可以是从这种遗传修饰的非人类动物中分离的细胞。在一些情况下，非人类动物的遗传修饰的细胞可以包含与非遗传修饰的对应动物相比有所减少的一种或多种基因表达。非遗传修饰的对应动物可以是与遗传修饰的动物基本相同但在基因组中没有遗传修饰的动物。例如，非遗传修饰的对应动物可以是与遗传修饰的动物相同物种的野生型动物。
在另一方面，提供了适用于异种移植的转基因非人哺乳动物和产生适用于异种移植的转基因非人哺乳动物的方法。特别地，本申请描述了纯合的单和双转基因哺乳动物的产生。如本文所用，术语“转基因”是指其中给定基因已被改变，去除或破坏的非人哺乳动物。
在某些实施方式中，转基因动物是猪CD37和猪CD81中一种或多种非Gal异种反应性抗原表达降低的猪。本文还提供了转基因动物，其进一步包含一种或多种其他异种反应性抗原或免疫相关蛋白的表达破坏和/或人基因的过表达。例如，缺乏合成表位Galαl-3Galβ1-4GlcNAc-R(αGal)的α1，3-半乳糖基转移酶(αGT)的转基因猪可用作进一步遗传修饰的背景种系。在其他情况下，在三敲除GalKO/CMAH-KO/B4GalNT2-KO背景中进行了遗传修饰。
如本文所用，术语“敲除”是指其中给定基因已被改变，去除或破坏的转基因非人哺乳动物。该术语旨在涵盖所有后代。因此，无论后代是通过初始建立动物或后代动物的基因编辑或体细胞核移植(SCNT)产生的，还是通过传统生殖方法产生的，初始建立动物及其所有后代F1，F2，F3等都包括在内。“单敲除”是指其中一个基因已被改变，去除或破坏的转基因哺乳动物。“双敲除”是指其中两个基因已被改变，去除或破坏的转基因哺乳动物。“三敲除”是指其中三个基因已被改变，去除或破坏的转基因哺乳动物。“四敲除”是指其中四个基因已被改变，去除或破坏的转基因哺乳动物。“五敲除”是指其中五个基因已被改变，去除或破坏的转基因哺乳动物。
转基因哺乳动物可能具有破坏的目的基因序列的一个或两个拷贝。在破坏目的核酸序列的仅一个拷贝或等位基因的情况下，转基因动物称为“杂合转基因动物”。术语“无效”突变包括这两种示例情况，其中目的核苷酸序列的两个拷贝被不同地破坏，但是破坏重叠使得从两个等位基因中去除了某些遗传物质的示例情况，以及其中目的核苷酸序列的两个等位基因均有相同的破坏的示例情况。在各种实施方式中，猪CD37和猪CD81的破坏可发生在转基因动物的至少一种细胞，该动物细胞中的的至少多个，该动物细胞的至少一半，该动物细胞的至少大部分，该动物细胞的至少绝大部分，该动物细胞的至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或99％中。
本发明的哺乳动物的物种不受限制，只要是非人类即可。农场动物和实验动物是示例。更特别地，例如猪，牛，马，绵羊，山羊，狗，兔，小鼠，大鼠，豚鼠和仓鼠的动物是示例。尽管本申请描述了典型的非人动物(猪)，但其他动物也可以类似地进行遗传修饰。如上所述，猪在向人的器官移植中是理想的。如本文所用，术语“猪”是指本领域已知的任何猪，包括但不限于野生猪，驯化猪，小型猪，家猪(Sus scrofa pig)，驯化家猪(Sus scrofadomesticus pig)，以及育成猪。猪没有限制，可以选自兰德瑞斯猪，约克夏猪，汉普夏猪，杜洛克猪，中国眉山猪，切斯特白猪，伯克希尔哥廷根猪，兰德瑞斯/约克夏/切斯特白猪，尤卡坦猪，巴马香猪，五指山猪，西双版纳猪和皮特兰猪。猪的器官，组织或细胞包括来自猪的器官，组织，失活的动物组织和细胞。
如本文所述的转基因猪可通过例如改变，去除或破坏pCD37等位基因和/或pCD81等位基因，或用遗传修饰的序列替代pCD37和/或pCD81等位基因来实现。在某些情况下，使用同源重组和体细胞核转移(SCNT)方法生产转基因猪，例如美国专利号7,989,675；US-2009-0241203-A1；Rogers等，Science 321：1837-1841，2008；Rogers等，J.Clin.Invest.118(4)：1571-1577，2008；Ostedgaard等，Sci.Transl.Med.3(74)：74ra24，2011，其各自通过引用全文纳入本文。最初由Vajta等(Cloning 2001；3：89-95)描述的手工克隆(HMC)基于SCNT，但它是一种无需使用微操纵器即可进行体细胞克隆的更简单技术。也参见Vajta等，Trends Biotechnol.2007，25(6)：250-3。
生产遗传修饰的非人细胞的其他方法是本领域公知的，并且描述于Sambrook等，《分子克隆，实验室手册》，冷泉港出版社，冷泉港，纽约(1989)，通过引用纳入本文。在一些情况下，遗传修饰是采用基因编辑的形式产生的。如本文所用，术语“基因编辑”及其语法等同物指在基因组中插入一个或多个核苷酸、将基因组中的一个或多个核苷酸取代、或者从基因组中移除一个或多个核苷酸。例如，基因编辑可以采用核酸酶(例如天然存在的核酸酶或人工改造的核酸酶)来实施。迄今为止，已经使用锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)基因编辑技术生产了几种基因敲除猪。
在某些实施方式中，Cas基因编辑采用CRISPR/Cas系统(例如II型CRISPR/Cas系统)来实施。例如，CRISPR/cas系统可以用来减少球状体的细胞中的一种或多种基因的表达。在一些情况下，采用CRISPR/Cas系统来减少一种或多种内源基因的蛋白质表达。在另一些情况下，可以采用CRISPR/Cas系统来实施位点特异性插入。例如，可以通过CRISPR/Cas在基因组的插入位点形成一个缺口，以促进转基因在插入位点的插入。适合用于根据本文提供的方法的遗传修饰的其它制备方法包括但不限于体细胞核转移(SCNT)和转基因的引入。如本文所用，术语“转基因”是指可以转移到生物体或其细胞中的基因或遗传物质。获得重组或遗传修饰的细胞的方法是本领域公知的，并且描述于Sambrook等人，《分子克隆，实验室手册》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，冷泉港出版社，冷泉港，纽约州(1989)，通过引用纳入本文。
在一些情况下，通过用pCD37和pCD81基因的双顺反子sgRNA/Cas9基因敲除载体转染猪细胞来生产本文所述的遗传修饰的猪。转染的细胞表现出双等位基因沉默突变事件。分离后，成功突变的细胞可用于通过SCNT或其他方法生成克隆动物。可以对所得转基因动物的基因组DNA进行测序，以确认双等位基因移码突变事件，表明在靶向的pCD37和pCD81基因座处的基因沉默。在某些情况下，可以使用Gal-KO/CMAH-KO/B4GalNT2-KO三敲除猪的细胞进行此类基因编辑步骤，从而产生缺乏功能性非Gal异种抗原(例如pCD37和pCD81)和Gal异种抗原(例如αGal)以及其他非Gal异种抗原(例如Neu5Gc和β4GalNT2)表达的五敲除。
在另一方面，本文提供获自本文描述的遗传修饰的猪的猪器官，组织和细胞。在某些情况下，转基因猪的猪器官，组织和细胞是可用于移植的器官，组织和细胞，包括但不限于皮肤，皮肤相关产品，心脏，肝脏，肾脏，肺，胰腺，甲状腺，小肠及其成分。如本文所用，术语“皮肤相关产品”是指从皮肤分离的产品和旨在与皮肤一起使用的产品。从皮肤或其他组织中分离出来的皮肤相关产品可能在与皮肤一起使用之前经过修饰。皮肤相关产品包括但不限于替代敷料，烧伤覆盖物，真皮产品，替代真皮，真皮成纤维细胞，胶原蛋白，软骨素，结缔组织，角质形成细胞，无细胞异种真皮，无细胞猪真皮，复合皮肤替代物和表皮以及临时伤口覆盖物。
在另一方面，本文提供了移植材料，其包含来自动物的用作异种移植物的器官，组织和/或细胞。用作异种移植物的移植材料可以从表达降低的pCD37和/或pCD81的转基因动物中分离，或从缺乏pCD37和/或pCD81的转基因动物中分离。可以从产前，新生儿，未成熟或完全成熟的动物中分离出来自基因敲除猪的转基因移植材料。所述移植材料可以用作需要器官移植的人对象的临时或永久器官替代物。可以使用任何猪器官，包括但不限于脑，心脏，肺，眼，胃，胰腺，肾脏，肝，肠，子宫，膀胱，皮肤，头发，指甲，耳朵，腺体，鼻子，嘴，唇，脾脏，牙龈，牙齿，舌头，唾液腺，扁桃体，咽，食道，大肠，小肠，小肠，直肠，肛门，甲状腺，胸腺，骨头，软骨，肌腱，韧带，肾上膜，骨骼肌肉，平滑肌，血管，血液，脊髓，气管，输尿管，尿道，下丘脑，垂体，幽门，肾上腺，卵巢，输卵管，子宫，阴道，乳腺，睾丸，精囊，阴茎，淋巴，淋巴结和淋巴管。
为了研究各种遗传修饰对人类对猪组织移植物的反应的影响，在某些情况下，产生转基因猪是有利的，在该转基因猪中，对基因组进行了遗传修饰以降低pCD37，pCD81，以及其他异种反应性抗原或免疫相关分子的表达或完全敲除其表达。例如，可以使用CRISPR/Cas系统对遗传修饰的猪细胞(例如，LSEC，肝细胞，成纤维细胞)进行遗传修饰，以与非遗传修饰的配对动物相比选择性地减少一种或多种主要组织相容性复合物(MHC)分子(例如，MHC I分子和/或MHC II分子)的表达。在一些情况下，对猪细胞进行工程改造，以遗传修饰(例如突变)或调节(例如增加、减少)诸如pGGTA1、pCMAH、pB4GalNT2、人(h)CD46、hCD55、人血栓调节蛋白、CD46(膜辅因子蛋白)、CD55(衰减加速因子)、CD59(保护素或反应性裂解的膜抑制剂)、人H转移酶(例如用于表达0血型抗原)、内切β-半乳糖苷酶C(例如用于减少Gal抗原表达)、α1，3-半乳糖基转移酶、胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)、β1，4-N-乙酰半乳糖胺基转移酶(β4GalNT2)(例如β4GalNT2敲除)、CIITA-DN(例如II类MHC反式激活子敲低，导致II类猪白细胞抗原敲低)、I类MHC敲除(MHC-IKO)、HLA-E/人β2-微球蛋白(例如抑制人自然杀伤细胞的细胞毒性)、人FAS配体(CD95L)、人N-乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶III(GnT-III)基因、猪CTLA4-Ig(细胞毒性T淋巴细胞抗原4或CD152)、人TRAIL(肿瘤坏死因子-α相关凋亡诱导配体)、血管性血友病因子(vWF)、人组织因子途径抑制剂(TFPI)、人内皮蛋白C受体(EPCR)、人外核苷三磷酸二磷酸水解酶-1(CD39)、人肿瘤坏死因子-α诱导蛋白3(A20)、人血红素加氧酶-1(HO-1)、人CD47(与SIRP-α的物种特异性相互作用抑制吞噬作用)、猪去唾液酸糖蛋白受体1(ASGR1)(例如减少血小板吞噬作用)、人信号调节蛋白-α(SIRPα)(例如通过“自我”识别来减少血小板、吞噬作用)、人IL-6R(例如，减少炎症)，人白细胞抗原G(HLA-G)(例如诱导耐受)之类的基因的表达。
如本文所用，术语“合成”和“工程改造”可互换使用，是指由人手工创建或修饰的非天然存在的材料(例如，其基因组中具有一种或预定的工程改造的遗传修饰的遗传修饰的动物)，或者用这类材料衍生的非天然存在的材料(例如，从此类遗传修饰的动物获得的组织或器官)。在一些情况下，用于生产本公开的转基因动物的细胞是猪细胞，其包含一种或多种合成或基因工程改造的核酸(例如，相对于在其天然存在的对应序列中存在的序列，包含至少一种人工创建的插入、缺失、倒置或取代的核酸)。包含一种或多种合成或工程改造的核酸的细胞被视为工程改造或遗传修饰的细胞。如本文所用，术语“工程改造的组织”是指工程改造/遗传修饰的细胞的聚集体。
当基因产物的总表达减少，产生大小改变的基因产物或当基因产物表现出改变的功能时，基因产物的表达就会减少。因此，如果基因表达野生型量的产物，但是产物具有改变的酶活性，改变的大小，改变的细胞定位模式，改变的受体-配体结合或其他改变的活性，则认为该基因产物的表达降低。表达可以通过本领域已知的任何手段进行分析，包括但不限于RT-PCR，Western印迹，Northern印迹，微阵列分析，免疫沉淀，放射学分析，多肽纯化，分光光度分析，丙烯酰胺凝胶的考马斯染色，ELISA，二维凝胶电泳，原位杂交，化学发光，银染，酶法测定，丽春红S染色，多重RT-PCR，免疫组织化学测定，放射免疫测定，比色分析，免疫放射测定，正电子发射断层扫描，荧光测定，荧光激活细胞分选染色透化细胞，放射免疫吸附测定，实时PCR，杂交测定，夹心免疫测定，流式细胞术，SAGE，差异扩增或电子分析。参见，例如，Ausubel等编，(2002)《新编分子生物学方案》(Current Protocols in MolecularBiology)，Wiley-Interscience，纽约，纽约州；Coligan等，(2002)，《新编蛋白质科学方案》(Current Protocols in Protein Science)，Wiley-Interscience，纽约，纽约州；本文通过引用全文并入。
可以直接或间接分析表达。间接表达分析可以包括但不限于分析被酶催化的产物的水平以评估酶的表达。参见，例如，Ausubel等编，(2013)，(2013)《新编分子生物学方案》(Current Protocols in Molecular Biology)，Wiley-Interscience，纽约，纽约州；Coligan等，(2013)，《新编蛋白质科学方案》(Current Protocols in Protein Science)，Wiley-Interscience，纽约，纽约州。
如本文所用，“与……相比”旨在涵盖将某物与相似但不同的事物进行比较，例如将从基因敲除猪的实验获得的数据点与从野生型猪的相似实验获得的数据点进行比较。词“比较”旨在涵盖检查字符，质量，值，数量或比率，以便发现被比较对象之间的相似之处或不同之处。比较可能会显示正在比较中的显著差异。“显著差异”是指在多个组中获得的结果，例如第一等分试样和第二等分试样的结果在统计学上的显著差异。通常，统计显著性通过统计显著性检验进行评估，例如但不限于斯氏t检验，卡方检验，单尾t检验，双尾t检验，方差分析，邓尼特事后检验，费舍尔检验和z检验。两种结果之间的显著差异可能是p＜0.1，p＜0.05，p＜0.04，p＜0.03，p＜0.02或p＜0.01或更大的结果。
如本文所用，“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，并且通常是指DNA或RNA的聚合物，其可以是单链或双链的，合成或从天然来源获得(例如分离和/或纯化)的，其可以包含天然、非天然或改变的核苷酸，并且可以包含天然、非天然或改变的核苷酸间连接(例如氨基磷酸酯连接或硫代磷酸酯连接)来代替在未修饰的寡核苷酸的核苷酸之间存在的磷酸二酯。在一些实施方式中，核酸不包含任何插入、缺失、倒置和/或取代。然而，如本文所述，在一些情况下，对于核酸而言，包含一个或多个插入、缺失、倒置和/或取代可能是合适的。
核酸可以采用任何合适的方法获得，包括Maniatis等人，分子克隆：实验室手册，冷泉港，纽约，第280-281页(1982)中描述的那些。在一些方面，如美国专利申请公开号US2002/0190663中所述获得核酸。通常将从生物样品中获得的核酸片段化以产生合适的片段进行分析。
本发明的核酸和/或其它部分可以被分离。如本文所用，“分离”是指与通常与之相关联的至少一些成分分开，无论它是天然来源的还是全部或部分合成的。本发明的核酸和/或其它部分可以被纯化。如本文所用，“纯化”是指与大多数其它化合物或实体分开。化合物或部分可以被部分纯化或基本上纯化。纯度可以用通过重量测量得到的重量来表示，并且可以使用各种分析技术来确定，例如但不限于质谱、HPLC等。
在另一方面，本文提供了改善人对象中排斥相关症状的方法。在某些情况下，该方法包括将具有降低水平的pCD37抗原和降低水平的pCD81抗原的猪移植材料移植到有需要的人对象中，其中与来自野生型猪的猪移植材料被移植到人对象时相比，排斥相关症状得到改善。当接受者的身体不接受移植的组织，器官，细胞或其他生物材料时，就会发生移植排斥。在移植排斥中，接受者的免疫系统会攻击移植的材料。存在多种类型的移植排斥，并且可能分别发生或一起发生。排斥过程包括但不限于超急性排斥(HAR)，急性体液异种移植排斥反应(AHXR)，血小板减少，急性体液排斥，超急性血管排斥，抗体介导的排斥以及移植物抗宿主病。“超急性排斥”是指移植后的材料或组织在移植后最初的24小时内发生或开始的排斥，涉及一种或多种排斥机制。排斥包括但不限于“超急性排斥”，“体液排斥”，“急性体液排斥”，“细胞排斥”和“抗体介导的排斥”。急性体液异种移植反应(AHXR)的病理特征包括但不限于：移植后几天内发生的急性抗体介导的排斥，移植后数周内的血栓性微血管病(TMA)的发展，微血管血管病，预先形成的非Gal IgM和IgG结合，补体激活，微血管血栓形成和消耗性血小板减少症。
在某些实施方式中，本文所述的转基因猪的猪器官，组织或细胞的异种移植导致选自细胞排斥反应相关症状，体液排斥反应相关症状，超急性排斥(HAR)相关症状，急性体液异种反应排斥相关症状和急性血管排斥反应相关症状的一种或多种排斥相关症状的改善，其中与将野生型猪组织移植到人时相比，一种或多种排斥相关症状得到改善。通过“改善”，“变好”，“缓解”，“增强”和“帮助”，旨在促进或取得期望的进展。还可以预见，改善排斥相关症状可以包括减少，减轻或减低不良症状。还认识到，可以改善异种排斥相关症状，同时改变另一种排斥相关症状。
在解释本公开时，应以与上下文一致的尽可能广泛的方式解释所有术语。应当理解，在本公开中描述的本发明的某些改变对于本领域技术人员而言是常规优化的问题，并且可以在不脱离本发明的精神或所附权利要求书的范围的情况下实施。
因此，为了更容易理解本文提供的组合物和方法，定义了某些术语：
术语“包括”的变体应被解释为以非排他性方式指代要素、组件或步骤，因此所引用的要素、组件或步骤可以与未明确引用的其它要素、组件或步骤组合。称之为“包含”某些元件的实施方式也被认为是“基本上由(这些元件)组成”和“由(这些元件)组成”。
术语“约”和“大约”通常是指在给定的测量性质或精度下所测得的量的可接受误差程度。典型的示例性误差程度在给定值或值范围的10％之内，优选在5％之内。或者，并且特别是在生物系统中，术语“约”和“大约”可以表示在给定值的一个数量级内的值，优选在给定值的5倍之内，更优选在给定值的2倍之内。除非另有说明，否则本文给出的数量是近似的，这意味着当没有明确说明时，可以推断出术语“约”或“大约”。
除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。在本说明书和所附权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指示物，除非上下文中有明显的表示。除非另有说明，否则本文中对“或”的任何引用旨在涵盖“和/或”。
本发明组合物和方法的各种示例性实施方式在下面的非限制性实施例中描述。实施例仅提供用于说明目的，并非旨在以任何方式限制本发明的范围。实际上，本发明所示和描述以外的各种变化通过以上描述以及以下的实施例对本领域技术人员显而易见，所述变化也包括在所附权利要求书的范围之内。
实施例
实施例1-猪异种反应性非Gal抗原
方法
基于所有可用的同种型，根据NCBI GenBank中相应的DNA序列合成全长pCD37和pCD81 cDNA。
CD37基因的扩增：按照PWO Superyield DNA聚合酶试剂盒使用1％DMSO处理，在94℃变性2分钟，然后进行40个循环的：在94℃变性15秒，在60.6℃退火30秒，并在72℃延伸50秒来进行PCR。第五步是在40个循环后在7℃下延伸7分钟，完成后，热循环仪将PCR产物保持在16℃。使用猪脾细胞cDNA和两种不同的引物。第一个由纯X5同种型混合物组成，正向序列为5′-ATG GGC CTT GCC CTC CTG G-3′(SEQ ID NO：1)，反向序列为5′-CTA GCG GTA CCGAGC CCG-3′(SEQ ID NO：2)，其在电泳后会产生643bp的条带。第二个引物使用反向X5同种型引物和正向X2同种型引物，序列为5′-ATG TCG GCC CAG GCC AGC-3′(SEQ ID NO：3)，混合物在琼脂糖凝胶电泳后会产生848bp的条带。一旦获得条带，就使用
Figure BDA0002610680280000131
凝胶提取试剂盒(250)纯化条带中的PCR产物。纯化后，根据提交指南将样品送入Genwiz进行测序。
克隆和转化细菌：用于测序的
Figure BDA0002610680280000132
TOPO PCR克隆试剂盒用于克隆纯化的PCR产物，并根据其方案使用Zeroblunt TOPO载体。反应完成后，将其转移到化学感受态大肠杆菌的试管中，细菌在其中经受热休克以诱导菌落转化。回收后，将转化的细菌以2种不同浓度铺板在氨苄青霉素处理过的平板上；同时取50μL铺板到一块板上，将剩余的混合物离心下来以形成细胞沉淀，然后去除150μL上清液以产生50μL更高浓度的溶液以铺板在第二块板上。将板在37℃下孵育过夜。
培养转化的细菌：使用300μL移液管吸头从板上刮下一些细菌菌落，然后将其在3mL SOC/Amp+培养基的锥形管中混合。对每块板进行此操作，然后将管在250rpm和37℃的温度下振摇7小时。
测序：裂解细菌培养物，并使用
Figure BDA0002610680280000141
Spin Miniprep试剂盒提取质粒环，用30μL EB从旋转柱膜上洗脱质粒环。根据提交指南将样品送入Genwiz测序。
将FLAG标签分别添加到pCD37和pCD81的C末端。将pCD37和pCD81 cDNA克隆到具有CMV启动子的表达载体中。用pCD37/pCD81 cDNA转染人HEK293T细胞，并通过流式细胞术确定人IgG/IgM结合。此外，用pCD37和pCD81 cDNA转染了猪野生型胎儿成纤维细胞(WT-FF)和猪GalKO胎儿成纤维细胞(GalKO-FF)用于过表达，并使用3种不同的人血清样品通过流式细胞术评估了人IgG的结合。
结果
使用抗FLAG抗体通过Western印迹证实了人HEK293T细胞中pCD37和pCD81的表达(图2)。与仅对照HEK293T细胞相比，pCD37和pCD81 cDNA转染的HEK293T细胞分别表现出多40％和20％的人IgG结合，以及多60％和35％的人IgM结合(图4)。转染pCD37和pCD81 cDNA后，在野生型胎儿成纤维细胞(WT-FF)和猪GalKO胎儿成纤维细胞(GalKO-FF)中都观察到了相似的结果。与仅WT-FF细胞相比，WT-FF-pCD37和WT-FF-pCD81细胞分别显示出平均分别多30％和14％的人IgG结合(图6)。通过使用GalKO-FF细胞降低与WT细胞的高背景结合，通过平均荧光强度(MFI)测量，人IgG结合显著降低(图7)。尽管总体上IgG结合力较低，但正如预期的那样，与仅GalKO-FF细胞相比，人IgG与GalKO-FF-pCD37和GalKO-FF-pCD81的结合分别平均分别增加了41％和26％。
在确认pCD37和pCD81为新型异种反应性非Gal抗原后，克隆了pCD37基因的不同同种型。一个示例如图8所示。
使用CRISPR/Cas技术，创建了猪基因组中pCD37基因的突变(图9)。
在敲除pCD37的Gal-KO/CMAH-KO/B4GalNT2-KO背景上创建了四基因敲除猪细胞系。已经产生了多个不同的四基因敲除克隆(Gal-KO/CMAH-KO/B4GalNT2-KO/pCD37-KO)，并使用100％PRA人血清测试了其与人IgG的结合(图10)。
讨论
我们在文献中首次鉴定出猪(p)四跨膜蛋白pCD37和pCD81是异种反应性非Gal抗原。与pCD37和pCD81转染的人HEK293T细胞和猪FF(WT和GalKO)结合的人抗体增加证明四跨膜蛋白pCD37和pCD81是新型异种反应性抗原。我们还首次报道创建了从猪基因组中执行pCD37基因敲除的四基因敲除猪细胞系(Gal-KO/CMAH-KO/B4GalNT2-KO/pCD37-KO)。数据还表明，相对于WT猪细胞，pCD37和pCD81对于减少人免疫球蛋白与GalKO细胞的结合非常重要。
序列表
<110> B·艾克瑟（Ekser, Burcin III）
<120> 猪异种抗原的鉴定
<130> 144578.00274
<150> 62/623,571
<151> 2018-01-30
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> X5正向引物
<400> 1
atgggccttg ccctcctgg 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向X5引物
<400> 2
ctagcggtac cgagcccg 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向X2引物
<400> 3
atgtcggccc aggccagc 18
<210> 4
<211> 642
<212> DNA
<213> 家猪（Sus domesticus）
<400> 4
atgggccttg ccctcctggg ctgtgtgggg gccctgaagg agttccgctg cctgctgggc 60
ctgtattttg gggcactgct gctcctgttt gccacgcaga tcaccctggg aatcctcatc 120
tccacgcagc gagtccagct ggtgcggaaa gtgaaggaca tcgtgctgaa gaccatccag 180
aactaccgcg tccacccaga ggagacagcg gccgaggaga gttgggacta cgtgcagttt 240
cagctgcgct gctgcggctg gaactctcct cgggattggt tccgtatccc caccctgagg 300
agcaacgagt cggacgtgca cctcgtgccc tgctcctgct ataactcatc cgcgaccaac 360
gactctgcaa tcttcgatac gttctacttg tcccagttca gccggcccag accacaggcg 420
cagtccggac acaatgcaga catttgcgtg gtccctgcaa acagccacat ctacagagag 480
ggctgcgagg ggagcctcaa caactggttg cacaacaacc tcatctctat agtgggcatt 540
tgtctcggcg tcggtctact cgagctcagc ttcatgacgc tgtccatgtt cctgtgcaga 600
aacctggacc atgtctacga ccggcttgct cggtaccgct ag 642

Claims (12)

1.一种转基因猪，其基因组包含遗传修饰，所述遗传修饰导致破坏的猪CD37(pCD37)基因和破坏的猪CD81(pCD81)基因中的一个或多个，与野生型猪相比，无可检测水平的pCD37和pCD81蛋白之一或二者，并且与当将来自野生型猪的组织移植到人中时相比，当将来自所述转基因猪的组织移植到人中时，排斥相关症状得到改善。
2.如权利要求1所述的转基因猪，其基因组还包含一些遗传修饰，这些修饰导致相对于缺少对基因组的所述修饰的猪细胞而言功能性α(1，3)-半乳糖基转移酶(αGT)，胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β1，4N-乙酰半乳糖胺基转移酶(B4GalNT2)的任何表达缺失，与缺乏所述遗传修饰的猪相比，转基因猪表现出降低的αGal抗原，Neu5GC抗原和B4GalNT2抗原水平。
3.如权利要求1所述的转基因猪，其中，与来自野生型猪的细胞相比，所述转基因猪的细胞与人免疫球蛋白的结合减少。
4.从如权利要求1所述的转基因猪获得的猪器官、组织或细胞。
5.如权利要求4所述的猪器官、组织或细胞，其中，所述猪器官、组织或细胞选自皮肤，心脏，肝脏，肾脏，肺，胰腺，甲状腺和小肠或其部分。
6.一种遗传修饰的猪细胞，其中所述遗传修饰包含对猪细胞的基因组的修饰，其导致以下一种或多种：(i)缺乏功能性pCD37的任何表达(pCD37KO)和(ii)缺乏功能性pCD81的任何表达(pCD81KO)，其中相对于缺乏所述遗传修饰的猪细胞，所述遗传修饰的猪细胞与人免疫球蛋白的结合减少。
7.如权利要求6所述的遗传修饰的猪细胞，进一步包含对所述猪细胞的基因组的修饰，其导致相对于缺少对基因组的所述修饰的猪细胞，功能性α(1，3)-半乳糖基转移酶(αGT)，胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β1，4N-乙酰半乳糖胺基转移酶(B4GalNT2)的任何表达的缺失，其中经修饰的猪细胞与缺乏所述遗传修饰的猪细胞相比显示出降低的αGal抗原水平，降低的Neu5GC抗原水平和降低的B4GalNT2抗原水平。
8.一种源自如权利要求6或7所述的遗传修饰的猪细胞的转基因猪。
9.从如权利要求8所述的遗传修饰的猪获得的猪器官、组织或细胞。
10.如权利要求9所述的猪器官、组织或细胞，其中，所述猪器官、组织或细胞选自皮肤，心脏，肝脏，肾脏，肺，胰腺，甲状腺和小肠或其成分。
11.一种改善人对象中排斥相关症状的方法，所述方法包括将具有降低的pCD37抗原水平和降低的pCD81抗原水平的猪移植材料移植到需要移植的人对象中，其中与将来自野生型猪的猪移植材料移植到人对象中相比，排斥相关症状得到改善。
12.如权利要求11所述的方法，其中，所述排斥相关症状选自细胞排斥反应相关症状，体液排斥反应相关症状，超急性排斥相关症状，急性体液异种移植反应排斥相关症状和急性血管排斥反应相关症状。
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