CN106062196B - Cmp-乙酰神经氨酸羟化酶打靶载体、载体转导的异种移植用转基因动物及其制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种CMP‑乙酰神经氨酸羟化酶的打靶载体、一种载体转导的异种移植用转基因动物及其制造方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种CMP-乙酰神经氨酸羟化酶的打靶载体、引入该载体的用于异种移植的转基因动物及其制造方法。
背景技术
根据(韩国)国立脏器移植管理中心(Korean Network for Organ Sharing,KNOS),在韩国每年通常有约20,000位患者等待进行器官移植,但是据报道,捐赠器官的实际数量甚至少于器官移植所需的10%。而在美国,器官移植的等待名单上的患者数量每16分钟增加一位,同时每天在等待名单上有11位患者如果不接受所需的器官移植就将面临死亡。在此方面,生命科学技术的发展就成为异种移植技术发展的背景。
动物遗传学的持续发展使得能产生商业上可用的转基因动物,所述转基因动物经由特定基因的去除或插入对其每一个基因都进行功能验证。产生转基因动物的方法的实例包括:使用显微注射或病毒感染的随机基因操作法,和使用胚胎干细胞或体细胞的打靶特定基因的基因打靶方法。
显微注射法是将外源DNA插入到受精卵原核中的常规方法,已经广泛用于制造转基因动物(Harbers et al.,Nature,293(5833):540-2,1981;Hammer et al.,Nature,315(6021):680-683,1985;van Berkel et al.,Nat.Biotechnol.,20(5):484-487,2002;Damak et al.,Biotechnology(NY),14(2):185-186,1996)。但是,来源于受精卵(其中经由显微注射插入了外源DNA)的存活的转基因卵母细胞的效率非常低,仅达到2%至3%(Clarket al.,Transgenic Res.,9:263-275,2000),并且不能调节外源基因要被插入的位置或去除其中特定的内源基因。
病毒感染法也广泛用于操作动物基因(Soriano et al.,Genes Dev.,1(4):366-375,1987;Hirata et al.,Cloning Stem Cells,6(1):31-36,2004)。在病毒感染法中,通过病毒载体引入要被插入的基因作为动物基因,因此这种方法比显微注射法更有效,但是这种方法仍然不能将外源基因插入到特定位置或去除其中的特定内源基因。此外,要插入的基因的最大尺寸被限制为7kb,因此病毒所表达的蛋白成为一个问题(Wei et al.,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.,37:119-141,1997;Yanez et al.,Gene Ther.,5(2):149-159,1998)。
为了克服上述问题,可使用能去除或插入特定基因的基因打靶技术。基因打靶技术首先用在使用小鼠胚胎干细胞进行基因功能的研究中。通过同源重组将小鼠胚胎干细胞(其中打靶了特定基因)插入到处于胚泡期的胚胎中,能产生对特定基因进行了基因操作的存活的卵母细胞。通过对小鼠胚胎干细胞采用基因打靶方法,产生了其中大量特定基因中靶的小鼠胚胎干细胞(Brandon et al.,Curr.Biol.,5(6):625-634,1995;Capecchi etal.,Science,244(4910):1288-1292,1989;Thompson et al.,Cell,56(2):313-321,1989;Hamanaka et al.,Hum.Mol.Genet.,9(3):353-361,2000;Thomas et al.,Cell,51(3):503-512,1987;te Riele et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89(11):5182-5132,1992;Mansour et al.,Nature,336(6197):348-352,1988;Luo et al.,Oncogene,20(3):320-328,2001)。当基因打靶方法应用于家畜时,可使用动物生物反应器,或通过去除参与免疫排斥应答的特定基因或过表达特定位置上的基因,产生能用于异种移植的疾病模型动物,并且预期这些疾病模型动物将在工业方面带来巨大的经济效益。
在产生基因中靶的动物中,认为使用胚胎干细胞的必需的。然而,尽管在包括猪和牛的家畜中已经报道了与胚胎干细胞类似的细胞系(Doetschman et al.,Dev.Biol.,127(1):224-227,1988;Stice et al.,Biol.Reprod.,54(1):100-110,1996;Sukoyan et al.,Mol.Reprod.Dev.,36(2):148-158,1993;Iannaccone et al.,Dev.Biol.,163(1):288-292,1994;Pain et al.,Development,122(8):2339-2348,1996;Thomson et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,92(17):7844-7848,1995;Wheeler et al.,Reprod.Fertil.Dev.,6(5):563-568,1994),在家畜中使用它们的干细胞仍然受到限制。实际上,按照作为核供体细胞的一般体细胞可用于基因打靶的建议,产生转基因家畜已成为可能(Brophy et al.,Nat.Biotechnol.,21(2):157-162,2003;Cibelli et al.,Science,280(5367):1256-1258,1998;Campbell et al.,Nature,380(6569):64-66,1996;AkiraOnishi et al.,Science,289;1188-1190,2000Denning et al.,Cloning Stem Cells,3(4):221-231,2001;McCreath et al.,Nature,405(6790):1066-1069,2000)。
同时,小型猪被认为是异种移植的最佳供应源,因为小型猪在器官大小和生理特征上与人的器官类似并且考虑到其繁殖力,从而能供应大量器官。
猪器官移植的成功在于,是否能克服一系列免疫排斥应答(超急性免疫排斥应答、急性血管性免疫排斥应答、细胞介导的免疫排斥应答和慢性免疫排斥应答)。据报道,可通过去除参与α-1,3-半乳糖基转移酶抗原决定簇合成的基因并且过表达人补体调节基因,来克服在移植之后几分钟内出现的超急性免疫排斥应答。
具体地,英国PPL有限公司于2002年首先产生了其中异种去除了α-1,3-半乳糖基转移酶(下文称为“GT”)的体细胞克隆猪(Yifan Dai et al.,Nat.Biotechnology,20:251-255,2002)。GT基因是引起急性免疫排斥应答的基因,当去除该基因时,可开发出其中消除了体内排斥应答的用于异种移植的疾病模型动物。
在2003年,上述公司成功实现了其中去除了GT基因的体细胞的复制(KR专利申请公开号10-2009-0056922),从而在生产用于器官移植的疾病模型动物,以解决目前缺乏移植器官的供应问题中实现了标志性进展(Carol J.Phelps,Science,299:411-414,2003)。在2005年,将来源于其中去除了GT基因的克隆猪的器官移植到猴子中,作为结果报道了在移植之后,存活下来的猴子维持了2至6个月,而且没有出现急性免疫排斥应答(KenjiKuwaki et al.,Nature Medicine,11(1):29-31,2005)。但是,也有报道指出,即使去除了GT基因,在器官移植过程中,由于异种抗原通过不同途径激活人补体基因,也可能出现严重的排斥应答(Tanemura,M.et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,235:359-364,1997;Komoda,H.et al.,Xenotransplantation,11:237-246,2004)。为了解决不利影响,使用了如下一种方法,该方法生产了在去除了GT基因的同时能过表达人补体抑制基因(如CD59、衰变加速因子(下文称为“DAF”)和膜辅助蛋白(下文称为“MCP”))的克隆猪(YoichiTakahagi,Molecular Reproduction and Development 71:331-338,2005Cozzi,Eb etal.,Transplant Proc.,26:1402-1403,1994;Fodor,W.L.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11153-11157,1994;Adams,D.H.et al.,Xenotransplantation,8:36-40,2001)。
同时,报道了存在于除人之外的大多数哺乳动物中的N-羟乙酰神经氨酸(下文称为“Neu5Gc”)抗原决定簇,在异种移植过程中也能引起免疫排斥应答(WO20061133356A;PamTangvoranuntakul,Proc.Natl.Acad.Soc.USA100:12045-12050,2003;BarbaraBighignoli,BMC genetics,8:27,2007)。Neu5Gc通过CMAH从N-乙酰神经氨酸(下文称为“Neu5Ac”)转化而来。
补体是由参与免疫应答的蛋白组成的蛋白复合物(C1-C9),并且它们具有:补体结合活性,其中补体在形成抗原-抗体复合物时与细菌的细胞膜结合,从而产生孔洞;和,调理素作用,其中补体与抗原-抗体复合物结合并且促进吞噬作用。已经发现了多种调节补体活性的蛋白,这些调节蛋白通过防止补体激活或促进被激活的补体的裂解来调节补体。存在于宿主细胞的细胞膜上的DAF可防止C2和C4b之间的结合,MCP促进C4b的裂解并且防止宿主细胞中的补体的激活,从而防止补体的激活并且防止宿主细胞被补体破坏。存在于宿主细胞表面上的CD59可防止C7、C8和C5b6之间的结合,从而防止膜攻击复合物的形成。
除了调节补体活性的基因之外,还报道了通过过表达在异种移植过程中出现的人CD39基因,可抑制血栓形成(US20080003212A,Karren,M.D.,The Journal of ClinicalInvestigation,113:1440-1446,2004)。
根据之前的报道,外源基因在它正常表达的位置之外的其它位置上表达,可能引起胚胎发育障碍,并且对神经系统是致命的,其中神经系统主要在胚胎发育后期和出生之后早期进行发育(Gao et al.,Neurochem.Res.,24(9):1181-1188,1999)。
KR专利申请公开号10-2009-0104328作为相关文件,涉及表达CD70的神经干细胞及其在防止移植中的免疫应答中的应用,并且记载了一种对移植的器官、组织或细胞的免疫应答有抑制作用的组合物,该组合物包括表达CD70的神经干细胞的细胞,以及一种使用该组合物抑制个体的免疫应答的方法。
KR专利申请公开号10-2001-0034847作为另一相关文件,涉及结合分子,所述结合分子来源于不触发补体介导的裂解的免疫球蛋白,其中所述结合分子作为重组多肽的结合分子包含(i)可与靶分子结合的结合结构域和(ii)效应结构域,该效应结构域包括与整个或部分人免疫球蛋白的重链的恒定结构域具有基本同质的氨基酸序列,特征在于,所述结合分子可与靶分子结合,并且没有严重的补体依赖性裂解或靶点的细胞介导的破坏,并且更优选其中的所述效应结构域可与FcRn和/或FcγRIIb特异性结合。通常,上述结合分子是基于来源于人免疫球蛋白重链CH2结构域的两个或多个结构域的嵌合结构域。在示例性实施方式中,对结构域233-236和结构域327-331进行改正,超出的残基使得分子是零异型的(null allotypic)。结合结构域可从适于上述应用的任意供应源诱导成上述分子,例如抗体、酶、激素、受体、细胞因子或抗原、配体和粘附分子。此外,还公开了核酸、宿主细胞、生产方法和材料,例如公开了防止B细胞活化、乳腺细胞脱粒和吞噬作用,或防止第二结合分子与靶分子结合的应用。
发明内容
[技术问题]
由于上述必要性而设计了本发明,本发明的目标是提供一种用于异种抗原决定簇(CMAH)合成基因的敲除载体。
本发明的另一目标是使用与常规打靶载体相比,具有较高效率和准确性的载体,提供一种转基因的体细胞系。
本发明的又一目标是提供一种由转基因的体细胞系进行核移植而制造的非人的克隆动物。
本发明的再一目标是提供一种生产移植用异种器官的方法,该方法消除了免疫排斥,并且包括饲养非人的克隆动物,然后收获器官。
[技术方案]
为了实现上述目标,本发明提供了一种CMP-乙酰神经氨酸羟化酶的打靶载体,该打靶载体以相继顺序包括CMP-乙酰神经氨酸羟化酶的5’臂、PGKneopolyA和CMP-乙酰神经氨酸羟化酶的3’臂。
在本发明的示例性实施方式中,CMP-乙酰神经氨酸羟化酶的5’臂优选包括SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列,但并不限于此。
在本发明的另一示例性实施方式中,PGKneopolyA优选包括SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列,但并不限于此。
在本发明的又一示例性实施方式中,CMP-乙酰神经氨酸羟化酶的3’臂优选包括SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列,但并不限于此。
在本发明的又一示例性实施方式中,CMP-乙酰神经氨酸羟化酶的打靶载体优选包括图4所示的限制酶切图谱,但并不限于此。
此外,本发明提供了一种制造CMP-乙酰神经氨酸羟化酶的敲除细胞的方法,该方法包括将本发明的CMP-乙酰神经氨酸羟化酶的打靶载体和锌指核酸酶的载体转染到细胞中。
在本发明的示例性实施方式中,锌指核酸酶的载体优选包括图1所示的限制酶切图谱,但并不限于此。
此外,本发明提供了由本发明的方法制造的CMP-乙酰神经氨酸羟化酶的敲除细胞。
本发明的上述敲除细胞于2013年7月2日被保藏在位于韩国大田广域市34141,儒城区鱼隐洞的韩国生物科学和生物技术研究院基础设施部,保藏编号为KCTC 12439BP。
此外,本发明提供了一种通过CMP-乙酰神经氨酸羟化酶的敲除细胞进行核移植,制造除人之外的动物的方法。
此外,本发明提供了一种生产移植用异种器官的方法,该方法消除了免疫排斥,并且包括饲养非人的克隆动物,然后摘除器官。
如本文所使用的,术语“基因打靶载体”指能去除靶基因或将靶基因插入到特定基因位置中的载体,并且该载体包含与打靶的特定基因同源的核苷酸序列,以进行同源重组。
如本文所使用的,术语“同源”指在对应于第一结构域或第二结构域的基因的核酸序列的同一性程度,并且具有至少90%的同一性,优选具有95%或更高的同一性。
如本文所使用的,术语“抗原决定簇”指在异种移植时,被受体的免疫系统识别为抗原的区域,并且是N-羟乙酰神经氨酸(下文称为“Neu5Gc”),其中N-羟乙酰神经氨酸是细胞表面聚糖。另外“抗原决定簇合成基因”指编码生物合成抗原决定簇的酶的基因,并且该酶是参与Neu5Gc生物合成的CMP-乙酰神经氨酸羟化酶(下文称为“CMAH”)。
如本文所使用的,术语“选择性标记物”用于选择经基因打靶载体转染的细胞,指呈现可选择性表型(诸如药物抗性、营养需要、对细胞毒性剂的抗性和表面蛋白的表达)的标记物,并且指能通过在经选择性试剂处理的环境下,仅使表达特定标记物的那些细胞存活下来,以进行阳性选择的标记物。另外,“选择性标记物基因”指编码阳性选择性标记物的基因,例如新霉素磷酸转移酶(下文称为“neo”)用于通过呈现抗生素抗性,以便真核细胞能在添加有抗生素(新霉素)的培养基中存活下来,以选择在真核细胞中有稳定转染的细胞。
术语“转化”指将DNA引入到宿主细胞中,并且使得DNA能作为染色体外因子或染色体整合子进行复制。转化包括能将任意给定的核酸分子引入到有机体、细胞、组织或器官中的任意方法,并且可使用本领域已知的适用于宿主细胞的任意标准方法来进行转化。为了将使用质粒或非质粒裸DNA转化真核细胞与细胞性肿瘤发生的转化区分开,常常将上述转化称为“转染”,在本发明中,他们具有相同的含义。
如本文所使用的,术语“锌指核酸酶(ZFN)”指由锌指DNA结合结构域与DNA-剪切结构域融合,所产生的人工限制酶。可对锌指结构域进行操作以靶向DNA序列,这样使锌指核酸酶靶向复杂基因组内的期望DNA序列。可用于准确改变高级物种的基因组。
在本发明中使用了“DNA剪切结构域”,例如源自II型限制酶FokI的非特异性剪切结构域通常用作ZFN剪切结构域。这一剪切结构域应进行二聚化以剪切DNA,因此需要一对ZFN来靶向非回文DNA结构域。标准的ZFN能使剪切结构域与每一锌指结构域的C末端融合。为了使两个剪切结构域与剪切DNA发生二聚化,两个单独的ZFN应与它们的C末端相距有限的距离,并且在相对端与DNA结合。必要的是,锌指结构域和剪切结构域之间最常使用接头序列,以使与每一结合结构域的5'边缘以5bp至7bp的距离分离开。
采用一些其它的蛋白工程技术,以改进在ZFN中使用的核酸酶结构域的活性和特异性。为了产生具有改进的剪切活性的FokI变体,采用了定向进化。为仅使预期的异种二聚体种类活化,以通过改变二聚化的接触表面来改进FokI的剪切特异性,而采用了基于结构的设计。
各ZFN的DNA结合结构域都具有3至6个锌指重复,并且能识别9bp至18bp的距离。如果锌指结构域对它们预期的靶区域具有完全的特异性,则理论上,即使能识别18bp完整长度的一对3-锌指ZNF也能靶定哺乳动物基因组中的单一座位。
为了能与期望序列结合,开发了对Cys2His2锌指进行操作的多种策略。这些策略包括模块化组装,以及采用噬菌体展示或细胞选择系统的选择策略。
产生新的锌指阵列的最简单方法是,将具有已知特异性的小的锌指“模块”连接起来。最常用的模块组装方法包括:为了制备能识别9bp的靶区域的3-指阵列,将能分别识别3bp DNA序列的三个分离的锌指连接起来。或者,使用1-指或2-指模块来制备具有6个或更多个单独锌指的锌指阵列的方法。
可使用多种选择方法,来产生能靶向期望序列的锌指阵列。在选择尝试的早期,使用了噬菌体展示技术,从来自很多库的部分随机锌指阵列中,选择与给定DNA靶点结合的蛋白。在最近的尝试中,使用了酵母单杂交系统、细菌单杂交系统和双杂交系统,以及哺乳动物细胞。选择新锌指阵列的更有希望的方法是使用细菌双杂交系统,并将这一方法称为“OPEN”。该系统在将预先选择的要进行选择以结合的库中的各个锌指分别与给定的三联体结合之后,使用第二轮选择以获得能与期望的9-bp序列结合的3-指阵列。该系统由Zinc-Finger Consortium(锌指财团)开发出来,作为经操作的锌指阵列的商业来源的替代物。
将对本发明进行详细描述。
本发明人成功制备了插入有G418(Neo)基因的体细胞系,以便能有效选择敲除了CMAH基因的体细胞,同时去除了参与Neu5Gc抗原决定簇合成的CMAH基因。
在本发明中制备的打靶载体和用于转化的细胞系,经由对参与免疫排斥应答的基因的表达进行复杂调节,而有效生产用于进行异种移植的克隆猪。
在本发明中使用的载体是新颖的技术,这一技术能产生具有去除锌指蛋白的核酸酶功能的Fox1蛋白,其中所述锌指蛋白可识别在体细胞的决定簇基因和在决定簇内的基因的序列。
与传统的打靶载体相比,在本发明中使用的载体具有改进的效率和准确性。
此外,由载体打靶的CMAH基因优选是源自包括牛、绵羊、山羊、猪、马、兔、狗、猴等的哺乳动物的CMAH基因,更优选是源自猪的CMAH基因,并且最优选是源自小型猪的CMAH基因,但并不限于此。
此外,本发明的载体包括阳性选择性标记物基因。
对于阳性选择性标记物基因,可使用新霉素磷酸转移酶(Neo)、潮霉素磷酸转移酶(Hyg)、组氨醇脱氢酶(hisD)、嘌呤霉素(Puro)、鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Gpt)等,优选使用Neo,但并不限于此。
当本发明的基因打靶载体被靶向进入宿主细胞中时,在宿主细胞基因组上的合成内源性抗原决定簇的基因与打靶载体之间发生同源重组,使核苷酸序列进行置换。
另一方面,本发明涉及一种引入了上述打靶载体的转化体。
转化方法可包括能将任意给定的核酸分子引入到有机体、细胞、组织或器官中的任意方法,并且可使用本领域已知的适用于宿主细胞的任意标准方法来进行转化。上述方法可包括电穿孔、磷酸钙(CaPO4)沉淀法、氯化钙(CaCl2)沉淀法、显微注射、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法、乙酸锂-DMSO法等,但该方法并不限于此。
此外,本发明提供了一种非人的克隆动物,该非人的克隆动物经由用于转化的体细胞系进行核移植来制备。
上述非人的克隆动物可以是具有与人的大小类似的哺乳动物,诸如绵羊、山羊、猪、狗等,优选猪,其中最优选小型猪。
可使用本领域已知的方法进行用于制备克隆动物的核移植,优选是在US 6,781,030B、US 6,603,059B、US 6,235,969B、US 7,355,094B、US 7,071,372B、KR 862298B、KR500412B、KR 807644B、JP 4153878B、US 6,700,037B、US 7,291,764B、US 6,258,998B、US6,548,741B、WO 03/089632A、US 7,371,922B等中描述的方法,并且对于猪,优选使用在KR500412B、KR807644、JP4153878B、US6,700,037B、KR专利申请公开号10-2009-0056922、US7,291,764B、US6,258,998B、US6,548,741B、WO03/089632A和US 7,371,922B中描述的方法。这些专利文件通过引用并入本文中。
此外,本发明提供了一种产生移植用异种器官的方法,该方法包括在饲养了非人的克隆动物之后,摘除移植所需的器官。在考虑了接受主体的性别、年龄、体重、身高等情况下,调节饲养期,并且在饲养了供体克隆动物之后,可通过常规外科手术摘除器官,并且可将摘除的器官立即移植到接受主体内,或快速储存在冰箱中。
作为异种移植的最佳供应源,小型猪因为在器官大小和生理特征上与人的相似并且由于它们的繁殖力,而认为可使用小型猪来供应大量器官。对此,应首先生产可控制免疫排斥应答的小型猪。猪移植的成功依赖于,是否能克服一系列免疫排斥应答(超急性免疫排斥应答、急性血管性免疫排斥应答、细胞介导的免疫排斥应答和慢性免疫排斥应答)。
根据之前的报道,GT基因是在异种移植过程中引起急性免疫排斥应答的源基因,当去除该基因时,可开发出其中去除了生物排斥应答的异种移植用疾病模型动物。在2005年,将来源于其中去除了GT基因的克隆猪的器官移植到猴子中,作为结果报道了在移植之后,存活下来的猴子维持了2至6个月,而且没有出现急性免疫排斥应答(Kenji Kuwaki etal.,Nature Medicine,11(1):29-31,2005)。但是,也有报道指出,即使去除了GT基因,在器官移植过程中,由于异种抗原通过不同途径激活人补体基因,也可能出现严重的排斥应答(Tanemura,M.et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,235:359-364,1997;Komoda,H.etal.,Xenotransplantation,11:237-246,2004)。同时,报道了存在于除人之外的大多数哺乳动物中的N-羟乙酰神经氨酸(下文称为“Neu5Gc”)抗原决定簇,在异种移植过程中也可能引起免疫排斥应答(WO20061133356A;Pam Tangvoranuntakul,Proc.Natl.Acad.Soc.USA100:12045-12050,2003;Barbara Bighignoli,BMC genetics,8:27,2007)。N-乙酰神经氨酸(下文称为“Neu5Ac”)通过CMAH被转化成Neu5Gc。因此,可以调节其中去除了CMAH基因的猪以及其中去除了GalT的猪的急性免疫排斥应答,可开发并且在异种移植过程中利用器官移植用疾病模型动物。根据之前的报道(Basnet NB et al.,Xenotransplantation,17:440-448,2010;Lutz AJ et al,Xenotransplantation,20:27-35,2013),当检验双敲除小鼠(GalT和CMAH)和双敲除猪(GalT和CMAH)的外周血单核细胞(PBMC)或胸腺细胞与人血清内的天然异种反应性抗体的结合能力时,证明了与对照猪和GalT敲除的相比,双敲除小鼠和双敲除猪示出结合能力降低。这些结果表明,可控制由异种抗原引起的急性免疫排斥应答。根据之前的报道(Kavaler et al.,FASEB J,25:1887-1893,2011),证明了在肥胖的CMAH敲除小鼠中,胰腺β细胞功能损伤降低了胰腺的大小和分泌胰岛素的细胞的数量。
相应的,在本发明的猪的情况中,可用作肥胖和糖尿病的模型。此外,根据之前的报道(Chandrasekharan et al.,Sci Transl Med.,28:42-54),CMAH敲除小鼠可用作人的杜兴氏肌肉营养不良症的实验模型。根据这些报道,本发明的猪可用作肌肉营养不良症的模型。
【本发明的有益效果】
如在本发明中可看到的,在本发明中,在体细胞系中插入了G418(Neo)基因,以便可选择具有CMAH基因敲除的体细胞,同时去除了参与Neu5Gc抗原决定簇合成的CMAH基因,本发明制备的打靶载体和移植用细胞系可用于通过对参与免疫排斥应答的基因表达进行复杂调节,而有效产生异种移植用克隆猪。
此外,为了去除猪的CMAH蛋白表达,制备本发明的载体,以便通过同源重组,并且与使用锌指核酸酶(ZFN)的CMAH打靶载体一起,制备了要插入到基因组中的包括NEO选择因子的供体DNA;证明了本发明的载体具有比传统打靶载体显著高的打靶效率;使用ZFN和供体DNA能选择多个CMAH打靶体细胞;并且,通过受精卵移植产生CMAH基因中靶的小型猪。
附图说明
图1是ZFN质粒的图谱。
图2是ZFN活性的柱状图。
图3是例示了通过ZFN打靶正向&反向质粒对猪的CMAH外显子8进行ZFN打靶的示意图。
图4是供体DNA(CMAH neo打靶载体)图谱的示意图。
图5是示出CMAH打靶载体序列的图像,其中,黄色表示5',白色表示PGK-neo-多聚腺苷酸(PolyA),灰色表示3'臂,并且不包括pBSK序列(将DNA插入到pBSK的XbaI-KpnI位点中)。
图6是示出猪中的CMAH敲除体细胞的筛选策略的示意图。
图7是示出通过CMAH neo载体进行转染的结果图。
图8是示出用于证明CMAH敲除猪的转染的引物组合的位置的示意图。
图9是示出分析存在由核置换产生的CMAH敲除猪的转染的PCR结果的图。
图10示出由核置换产生的CMAH敲除猪的图。
图11示出CMAH在由核置换产生的CMAH敲除猪中建立的体细胞系中表达的结果。
图12示出在CMAH敲除小鼠模型和人血清之间的免疫识别应答的图。
图13示出随着CMAH敲除小鼠模型的衰老而出现听力损失的图。
具体实施方式
下面,将参照非限制性实施例详细描述本发明。但是,在本文中公开的示例性实施方式仅用于例示的目的,而不应构成对本发明范围的限制。
实施例1:ZFN质粒的构建
本发明的构建体包括T7启动子,以便本发明的构建体可以是CMV驱动的,并且可用于体外转录反应。所有的ZFN在N末端都有三个FLAG。使用限制酶Xho I和Xba I在紧邻终止密码子之后的位置进行剪切,从而使用于mRNA合成的模板线性化。
实施例2:ZFN活性的测量
通过进行酵母MEL-1报告基因分析(Doyon et al.,N at Biotechnol,2008,26(6):702),来测量ZFN活性。在诱导之前(0h,蓝色条柱)和在ZFN表达诱导之后(6h,红色条柱),测量ZFN的剪切活性。MEL-1水平与ZFN活性具有正相关,其中ZFN活性在期望的靶区域产生双链剪切。在诱导之后(6h),与阳性对照的ZFN相比,示出>50%信号的ZFN被认为对基因组编辑实验是有用的(那些在未诱导状态(0h)下就示出活性的ZFN甚至可能是优异的)。
实施例3:供体DNA的制备
CMAH 5'臂-PGKneopolyA-3'臂载体的构建
1)5'的PCR克隆
首先,使用芝加哥小型迷你猪的基因组DNA,以及包括XbaI限制酶切位点的正向引物(TCTAGACTCTCTATTTGGTGGCTCTGTTT,SEQ ID NO:4)和包括EcoRI限制酶切位点的反向引物(GAATTCAGGAGTTTCTTCCTTTCTGTTTT,SEQ ID NO:5),通过PCR扩增获得5'臂,然后连接到T-载体中。通过DNA测序,证明克隆的DNA是CMAH基因结构域。
2)3'的PCR克隆
使用芝加哥小型迷你猪的基因组DNA作为模板,以及包括XhoI限制酶切位点的正向引物(CTCGAGCCTACAACCCAGAATTTACTGCC,SEQ ID NO:6)和包括KpnI限制酶切位点的反向引物(GGTACCAACAGGGACCTGCCAAGAGGCCA,SEQ ID NO:3),通过PCR扩增获得3'臂,然后亚克隆到T-载体中。通过DNA测序,证明克隆的DNA是CMAH基因结构域。
3)CMAH的5'臂-PGKneopolyA-3'臂载体的构建
首先使用EcoRI和XhoI剪切pKJ2neo质粒以分离PGKneoPolyA片段(约2kb),并且将分离出的片段连接到经EcoRI和XhoI剪切的pBluscriptII(SK-)载体中,获得pBSK-PGKneoPolyA质粒,以进行CMAH 5'臂-PGKneopolyA-3'臂载体的构建。对于5’连接,使用XbaI和EcoRI剪切上面获得的5质粒(T-方便载体(T-easy vector))以获得789bp的片段,然后将该片段连接到经XbaI和EcoRI剪切的pBSK-PGKneoPolyA质粒中,从而构建出pBSK-5’臂-PGKneoPolyA质粒。最后,对于3’连接,使用XhoI和KpnI剪切上面获得的3质粒(T-方便载体)以获得763bp的片段,然后将该片段连接到经XhoI和KpnI剪切的pBSK-5’臂-PGKneoPolyA质粒中,从而构建出pBSK-5’臂-PGKneoPolyA-3’臂质粒。
实施例4:ZFN载体和用于转染和选择供体DNA的方法
经由如下所述的电穿孔,将基因打靶载体引入到小型猪的体细胞中。在电穿孔中,通过胰蛋白酶处理,以回收培养的细胞,悬浮回收的细胞以获得细胞数为5×106个细胞/0.4mL的液体培养物F10,然后与4.5μg线性供体DNA载体和各2.6μg的pZFN1DNA和pZFN2DNA混合,将细胞-载体混合物添加到4mm电转杯(gap cuvette)中。将电转杯安装在BTXElectro-cell manipulator(细胞电转仪,ECM 2001)上,以480V、4脉冲和1ms的条件进行电击。电击之后,将电转杯放置在冰上10分钟,然后转移到10mL液体培养基中并且悬浮在其中,并且以1250个细胞/孔的浓度接种到48孔板中。引入DNA之后24小时,使用300μg/mL的G418进行11天的选择程序。将由此形成的阳性克隆体细胞亚培养在24孔培养板中,以进行分析。当在3至4天内达到90%融合时,将上述亚培养的体细胞亚培养在12孔培养板中。此外,以3至4天的间隔,将细胞亚培养在6孔板、60mm培养皿和100mm培养皿中,然后冻干或在实验中使用。
实施例5:中靶细胞的PCR选择
如下所述,进行PCR分析,以选择敲除细胞。以从细胞中分离出来的100ng基因组DNA作为PCR模板,使用Neo3-1引物(GCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAAT,SEQ ID NO:8)和CMAH Sc AS3引物(AAGACTCCCACTTTAAAGGGTGGTGTGTAG,SEQ ID NO:9)作为引物,并且使用Takara Ex Taq扩增DNA。在以下条件下进行PCR:98℃2分钟进行一个循环;95℃30秒、68℃30秒、72℃2分钟进行40个循环;以及72℃15分钟进行1个循环。PCR之后,将扩增的DNA在0.8%琼脂糖凝胶中进行电泳,并且最终证明约2kb DNA条带的存在/不存在。
通过在528个48孔板中培养,CMAH neo载体转染的结果是5×106个细胞转染(CMAHneo载体,ZFN质粒),其中有78个单一克隆的传代,并且作为64个单一克隆的PCR分析结果,28个克隆在第一PCR中显示出阳性,最终有19个克隆在第二PCR中显示出阳性。
【表1】
本文中所使用的材料如下。
实施例6:体细胞的核置换
对于核置换,卵母细胞购自ART(麦迪逊,WI),体外成熟,摘除卵母细胞的核并且使用其中中靶的CMAH敲除(KO)([pBSK-5'臂-PGKneoPolyA-3’臂质粒]和pZFN1和pZFN2DNA[CMAH敲除]载体)的供体细胞进行移植,通过两次1.2kV/cm的DC脉冲电刺激进行融合。仅选择存活的融合的卵母细胞,并且移植到如表2所示的代孕母亲的输卵管中。
【表2】
受体数量 | 供体细胞 | 转移的胚胎数 | 加热天数 | 注释 |
1 | 雄性ZFN C3 | 192 | 1 | 2活 |
2 | 雄性ZFN C3 | 239 | 0 | 9活2死胎 |
3 | 雌性A5 | 212 | 0 | - |
4 | 雌性A9 | 221 | 0 | 1活 |
5 | 雄性D11 | 205 | 1 | - |
6 | 雄性C5 | 238 | 1 | 3活 |
7 | 雌性H10 | 246 | 1 | - |
8 | 雄性B2 | 240 | 1 | 1具有畸形 |
9 | 雌性D1 | 257 | 1 | 2活 |
表2示出使用CMAH KO细胞进行核置换的结果,其中#1和#2表明ZFN转染且没有供体DNA,而#3至#9表明ZFN转染且具有供体DNA。
实施例7:其中打靶CMAH敲除载体的转基因猪的生产
在收集了由正常分娩产生的后代的耳组织之后,使用GenEluteTM哺乳动物基因组DNA小量制备试剂盒(GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep kit,Sigma-Aldrich)提取基因组DNA。为了进行基于提取的DNA的准确分析,使用左臂区域的引物、右臂区域的引物和同时包括左臂和右臂区域的引物的组合,进行PCR分析,从而证明存在基因引入。
右臂引物的组合
正向Neo 3-1:TCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATT,SEQ ID NO:10
反向ScAS3:AAGACTCCCACTTTAAAGGGTGGTGTGTAG,SEQ ID NO:11
左臂引物的组合
正向ScS5:CCCTTCCATCCCACCCGTCCTCATCCTTAC,SEQ ID NO:12
反向CMAHR:ACTCTCTGTTTTCAGGCTGCTTGTT,SEQ ID NO:13
右臂和左臂引物的组合
正向ScS5:CCCTTCCATCCCACCCGTCCTCATCCTTAC,SEQ ID NO:14
反向ScAS3:AAGACTCCCACTTTAAAGGGTGGTGTGTAG,SEQ ID NO:15
实施例8:对CMAH敲除猪中的CMAH表达的证明
为了证明CMAH敲除猪中存在CMAH的表达,建立来自异种和同种CMAH敲除猪的体细胞系。然后,使用RIPA蛋白提取(Thermo Scientific,USA)溶液,从细胞中提取蛋白并且进行蛋白印迹分析,从而证明在同种CMAH敲除猪中不表达CMAH蛋白,而与野生型猪的CMAH蛋白表达相比,CMAH蛋白表达在异种CMAH敲除猪中显著降低。结果示于图11中。
实施例9:在CMAH敲除小鼠模型与人血清之间的免疫识别应答
本发明人研究了CMAH敲除小鼠模型的胸腺细胞与人血清的天然异种反应性抗体的结合能力,发现与WT-和杂合子来源的细胞相比,纯合子来源的细胞与所有血型(A、B、O和AB)中的IgG之间的结合能力都降低,而与IgM的结合能力在A、O和AB血型中没有示出任何显著性(图12)。
实施例10:由于CMAH敲除小鼠模型的衰老而出现的听力损失
本发明人从CMAH敲除小鼠模型中分离出耳蜗并且进行组织学分析,结果在CMAH-/-衰老的耳蜗感觉上皮中发现异常(图13)。相应地,该模型可用作1)伴随衰老的听力损失模型和2)创伤愈合模型。
Claims (5)
1.一种制备CMP-乙酰神经氨酸羟化酶的敲除细胞的方法,包括:将锌指核酸酶的载体和CMP-乙酰神经氨酸羟化酶的打靶载体转染到细胞中,其中所述CMP-乙酰神经氨酸羟化酶的打靶载体以相继顺序包括CMP-乙酰神经氨酸羟化酶的5’臂、PGKneopolyA和CMP-乙酰神经氨酸羟化酶的3’臂,其中所述CMP-乙酰神经氨酸羟化酶的5’臂由SEQ ID NO:1中描述的核苷酸序列组成,其中所述PGKneopolyA由SEQ ID NO:2中描述的核苷酸序列组成,并且其中所述CMP-乙酰神经氨酸羟化酶的3’臂由SEQ ID NO:3中描述的核苷酸序列组成。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述锌指核酸酶的载体具有图1中所示的限制酶切图谱。
3.一种根据权利要求1或权利要求2所述的方法制备的CMP-乙酰神经氨酸羟化酶的敲除细胞。
4.根据权利要求3所述的敲除细胞,所述敲除细胞以保藏编号KCTC12439BP被保藏。
5.根据权利要求1所述的方法,其中,所述CMP-乙酰神经氨酸羟化酶的打靶载体具有图4中所示的限制酶切图谱。
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