KR101437590B1 - 사람 ｃｄ７３ 발현 벡터, 이를 포함하는 세포주 및 형질전환 복제동물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 사람 CD73 발현 벡터, 이를 포함하는 세포주 및 형질전환 복제동물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 새로운 면역거부반응 조절기술의 개발로 고부가가치의 장기이식용 미니돼지의 생산에 기여할 수 있으며, 새로운 장기 이식용 형질전환 복제 돼지의 생산으로 이종 장기 이식의 실용화를 촉진할 수 있다.
Description
본 발명은 사람 CD73 발현 벡터, 이를 포함하는 세포주 및 형질전환 복제동물에 관한 것이다.
21세기의 생명공학은 인간복지를 최종목표로 식량, 환경, 건강 문제에 새로운 해결책의 가능성을 제시하고 있으며, 최근에 줄기세포의 이용기술은 난치병 치료의 새로운 장으로 떠오르고 있다. 이전까지는 인간의 난치병 치료를 위해 장기이식이나 유전자 치료 등이 제시되었으나, 면역거부와 공급 장기 부족, 벡터개발이나 질환유전자에 대한 지식부족으로 효율적인 실용화가 미진하였다.
돼지의 장기는 생리적으로 사람과 상당히 흡사하여 사람에게 이식하기 위해 많은 노력을 하고 있다. 그러나 돼지의 장기를 사람에게 이식 시 일어나는 거부반응이 이종이식에 큰 걸림돌이었다. 이러한 문제는 최근 거부반응에 관여하는 돼지 유전자를 제거함(Lai et al., Science, 295: 1089-1092, 2002; Dai et al., Nat. Biotechnol., 20: 251-255, 2002)과 동시에 면역거부반응에 관여하는 세포들 및 단백질 발현을 억제함으로써 이종이식은 한층 실현 가능성이 커졌다.
이 분야의 관련 기술로는 미국 공개특허 2007-0264269에 장기 이식 면역 부작용을 방지하기 위해 CD73을 발현하는 세포를 포함하는 약학적 조성물이 공개되어 있다.
이러한 기술적 배경 하에서 본 발명자들은 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 목적은 미니돼지의 혈관내부세포에서 사람 CD73 유전자를 발현하는 벡터, 이를 포함하는 세포주 및 형질전환 복제동물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 복제동물을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 미니돼지 혈관내부세포(endothelial cell) 특이적 프로모터, CD73 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터가 제공될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 미니돼지 혈관내부세포(endothelial cell) 특이적 프로모터는 ICAM-2 유전자의 프로모터일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 CD73 유전자는 사람의 CD73 유전자일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 발현벡터를 포유동물 수정란에 주입하여 얻은 형질전환 수정란이 제공될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 포유동물 수정란은 돼지 수정란일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 형질전환 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 얻은 형질전환 동물이 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 1) 돼지로부터 체세포를 분리하는 단계; 2) 제1항의 발현벡터를 제조한 후 상기 체세포에 도입시키는 단계; 3) 단계 2)의 발현 벡터가 도입된 클론 체세포를 선별한 후 배양하는 단계; 4) 모돈으로부터 채취한 난자의 핵을 제거하고 단계 3)의 클론 체세포와 융합시키는 단계; 및 5) 상기 융합된 복제란을 대리모돈에 이식하고 자돈을 출산하는 단계를 포함하는 형질전환 돼지의 제조 방법이 제공될 수 있다.
본 발명에 따르면, 새로운 면역거부반응 조절기술의 개발로 고부가가치의 장기이식용 미니돼지의 생산에 기여할 수 있으며, 새로운 장기 이식용 형질전환 복제 돼지의 생산으로 이종 장기 이식의 실용화를 촉진할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 벡터가 이식시 면역거부반응을 조절하는 원리를 나타낸 모식도이다.
도 2에는 pCMV-hCD73 벡터의 모식도가 나타나 있다.
도 3에는 pEF1-hCD73 벡터의 제작 과정에 대한 모식도가 나타나 있다.
도 4는 NIH 미니돼지 ICAM2 프로모터의 합성 및 염기서열 분석결과를 나타낸다.
도 5는 pICAM2-CD73 벡터 제작 과정의 모식도이다.
도 6은 사람 CD73 단백질 발현의 확인 결과이다.
도 7은 사람 CD73 단백질 세포 표면에서의 발현 결과를 나타낸다.
도 8은 PCR을 이용한 pCMV/pICAM-hCD73 벡터가 도입된 세포주의 검증 결과이다.
도 9는 pICAM-hCD73 유전자가 삽입된 형질전환 복제돼지의 생산 결과이다.
도 10은 ICAM 프로모터에 의해 돼지 혈관내피세포에서CD73 이 특이적으로 발현함을 나타내는 결과이다.
도 2에는 pCMV-hCD73 벡터의 모식도가 나타나 있다.
도 3에는 pEF1-hCD73 벡터의 제작 과정에 대한 모식도가 나타나 있다.
도 4는 NIH 미니돼지 ICAM2 프로모터의 합성 및 염기서열 분석결과를 나타낸다.
도 5는 pICAM2-CD73 벡터 제작 과정의 모식도이다.
도 6은 사람 CD73 단백질 발현의 확인 결과이다.
도 7은 사람 CD73 단백질 세포 표면에서의 발현 결과를 나타낸다.
도 8은 PCR을 이용한 pCMV/pICAM-hCD73 벡터가 도입된 세포주의 검증 결과이다.
도 9는 pICAM-hCD73 유전자가 삽입된 형질전환 복제돼지의 생산 결과이다.
도 10은 ICAM 프로모터에 의해 돼지 혈관내피세포에서CD73 이 특이적으로 발현함을 나타내는 결과이다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 미니돼지 혈관내부세포(endothelial cell) 특이적 프로모터, CD73 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터가 제공될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 미니돼지 혈관내부세포(endothelial cell) 특이적 프로모터는 ICAM-2 유전자의 프로모터일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 CD73 유전자는 사람의 CD73 유전자일 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 발현벡터를 포유동물 수정란에 주입하여 얻은 형질전환 수정란이 제공될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 포유동물 수정란은 돼지 수정란일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 형질전환 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 얻은 형질전환 동물이 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 1) 돼지로부터 체세포를 분리하는 단계; 2) 제1항의 발현벡터를 제조한 후 상기 체세포에 도입시키는 단계; 3) 단계 2)의 발현 벡터가 도입된 클론 체세포를 선별한 후 배양하는 단계; 4) 모돈으로부터 채취한 난자의 핵을 제거하고 단계 3)의 클론 체세포와 융합시키는 단계; 및 5) 상기 융합된 복제란을 대리모돈에 이식하고 자돈을 출산하는 단계를 포함하는 형질전환 돼지의 제조 방법이 제공될 수 있다.
이종장기 이식 시 면역거부반응은 초급성, 급성 체액성, 급성 혈관성, 세포성, 만성으로 순차적으로 발생한다.
사람과 일부 원숭이(바분과 같은 old world monkey), 침팬지와 같은 영장류는 Galactose 항원을 갖고 있지 않으며, 대신 이 항원에 대한 자연 항체가 존재한다. 그래서 돼지의 장기를 이식하면 Galactose(Gal)에 대한 항체 반응으로 수분 내에 이식된 장기를 괴사시키는 초급성 면역거부 반응이 발생한다.
이와 같은 초급성 면역거부반응을 제어할 수 있도록 생산된 돼지가 지노이다.
초급성 면역거부반응은 Gal 항원을 합성하는 갈락토실트랜스퍼라제(galactosyltransferase) 유전자(Gal-T)의 기능을 제거(Gal-T KO)한 돼지의 장기를 이용하면 해결할 수 있다. 급성 체액성 면역거부반응을 극복할 수 있도록 생산된 돼지가 믿음이이다.
돼지에는 Gal 이외에 미량으로 존재하는 알려지지 않은 항원들이 존재하는 것으로 알려져 있는데, 이 항원에 대한 항체가 생성되어 급성 체액성 면역거부반응이 발생한다. 이식된 장기에 항체가 직접 공격하는 것은 아니고 항원-항체 반응이 일어나면 보체 단백질이 활성화되어 공격하게 된다. 동물에는 보체 단백질의 활성화를 억제시킬 수 있는 방어 기전이 존재하는데, 이것들이 DAF(CD55), MCP(CD46), CD59등과 같은 보체 조절 단백질이다. 그러므로 보체 조절단백질이 과발현하면 완벽하지는 않지만 초급성과 급성혈관성을 크게 억제시킬 수 있다.
믿음이와 같은 Gal-T KO/MCP 또는 DAF 과발현 돼지의 장기를 이식하여도 이식된 장기는 수일 내에 혈액 응고와 출혈이 발생하여 괴사한다고 보고된 바 있다.
혈관 내부에는 혈액응고 억제 단백질이 존재하며, 이 단백질의 조절에 의해 혈액이 응고하지 않고 흐르게 된다. CD73, CD39, TFPI등이 대표적인 혈액 응고 억제 조절 단백질이다.
일반 돼지의 장기가 사람에게 이식될 경우 혈액 내의 ATP (Adenosine Tree Phosphate)가 아데노신(adenosine)으로 분해되지 않아 혈소판이 활성화되어 이식된 장기의 혈관 내 혈액을 응고시킨다.
인간의 CD73 유전자가 도입된 형질전환 돼지의 장기가 이식되었을 경우에는 CD73 유전자가 혈액 내 ATP를 아데노신으로 변환시켜 혈소판 활성화를 억제함에 의해 혈액응고를 방지할 수 있게 된다.
실시예
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
1. 사람
CD73
cDNA
클로닝
한국생명공학연구원 21c Frontier human gene bank에서 CD73 cDNA 클론(clone ID: hMU001092)을 구입하였다. 이 클론으로부터 제한효소 NotI이 첨가된 프라이머 5'-atgcggccgctttcgcacccagttcac-3' 와 XhoI이 첨가된 프라이머 5'-aatctctcgagctattggtataaaacaaag-3'로 Ex TaqTM Hot start version (Takara, Japan)을 사용하여 PCR 방법으로 증폭한 후 pGEM-T easy vector (Promega, USA)에 삽입하여 염기서열을 구입한 클론의 염기서열과 비교하여 동일하다는 것을 확인하였다.
2.
pCMV
-
hCD73
벡터 제작
CD73 유전자가 형질전환 돼지의 모든 조직에서 발현되도록 조절하기 위해 CMV (cytomegalovirus) 프로모터가 존재하는 pcDNA3.1/Hygro 벡터의 NotI과 XhoI 위치에 CD73 cDNA를 삽입하였고 pCMV-hCD73 벡터라 명명하였다. 도 2에는 상기 벡터의 모식도가 나타나 있다.
3.
pEF1
-
hCD73
벡터 제작
EF-1(elongation factor-1 alpha)도 모든 조직에서 발현되는 유전자로서, 특히 사람 EF-1 프로모터는 빈번하게 형질전환 동물에 사용되고 있다. 사람 EF-1 프로모터의 조절에 의해 CD73 유전자가 형질전환 돼지의 모든 조직에서 발현되도록 하기 위해 pCMV-hCD73의 벡터를 제한효소 NheI과 KpnI으로 절단 한 후, pBudCE4.1 벡터(Invitrogen, USA)를 역시 제한효소 NheI과 KpnI으로 절단하여 절취한 사람 EF-1 프로모터 부분을 삽입하였다(pCMV/EF1-hCD73). CMV 프로모터를 제거하기 위하여 CMV/EF-1-hCD73 벡터를 Nhe I으로 절단한 후 klenow fragment 효소를 사용하여 blunt 말단으로 만들었다. 그리고 나서 Nru I으로 다시 절단 한 후 CMV 프로모터를 제거하고 연결하여 pEF1-hCD73 벡터를 완성하였으며, pEF1-hCD73 벡터 제작 과정에 대한 모식도를 도 3에 나타내었다.
4. 돼지
혈관내부세포
특이적
ICAM2
프로모터의
클로닝
및
pICAM2
-
CD73
벡터 제작
NIH 미니돼지의 귀 조직에서 genomic DNA를 추출하였고, 이를 주형으로 하여 PCR 방법으로 돼지의 혈관 세포에서 특이적으로 발현하는 ICAM2 유전자의 프로모터를 합성하였다. PCR은 교정기능(proofreading)이 있는 Takara사의 PrimeSTAR HS 디엔에 중합효소를 사용하였고, 프라미어는 Nru I이 삽입된 5'-TATCGCGATCTAGAAACACACTGCAAGTCC-3' 와 Hind III가 삽입된 5'-ATAAGCTT AGGAAAGAGCCGAGGACCGCCT-3'를 사용하였다(도 4). pCMV-hCD73를 Nru I과 Hind III로 절단하여 CMV 프로모터를 제거한 후 돼지 ICAM2 프로모터를 삽입하여 pICAM2-CD73 발현 벡터를 완성하였다(도 5).
ICAM2 프로모터를 삽입하기 위해 증폭된 상기 ICAM2 프로모터의 염기서열은 서열번호 1 에 나타나있다.
도 4는 NIH 미니돼지 ICAM2 프로모터의 합성 및 염기서열 분석결과를 나타낸다.
도 5는 pICAM2-CD73 벡터 제작 과정의 모식도이다.
5.
CD73
발현 벡터로부터 사람
CD73
발현의 확인
사람 CD73 과발현 카세트가 구조적으로 정확하게 작동하는지를 알아보기 위하여 NIH 미니돼지의 귀 조직에서 분리한 섬유아세포에 pCMV-hCD73벡터와 pEF1-hCD73 벡터를 도입하였다. 벡터의 도입은 Amaxa Basic Nucleofector Kit를 사용한 nucleofection 방법으로 실시하였다. 48시간 후, 세포에서 M-per mammalian protein extract (Thermo Scientific, USA)용액으로 단백질을 추출하였고, 웨스턴 블롯 분석 방법으로 사람 CD73이 과발현 되는 것을 확인하였다(도 6). 또한 유세포 분석기(Flow cytometry)를 사용하여 사람 CD73은 세포 표면으로 발현되는 것을 확인하였다(도 7).
도 6은 사람 CD73 단백질 발현의 확인 결과이다.
도 7은 사람 CD73 단백질 세포 표면에서 발현의 확인 결과를 나타낸다. 녹색선은 pCMV-CD73을, 주황색선은 pICAM2-CD73을 발현하는 세포를 의미한다.
6.
CD73
과발현 벡터가 도입된 체세포주의 생산
pICAM-hCD73 벡터와 pCMV-hCD73 벡터를 NIH 미니돼지 귀조직에서 추출한 세포에 도입하였다. 벡터의 도입은 AmaxaBasicNucleofectorKit를 사용한 nucleofection (Lonza, Germany) 방법으로 실시하였다. 1x106 세포를 nucleofection 용액 100L에 부유시킨 후 2g 벡터를 첨가하여 U-023 프로그램을 사용하였다. 그 후, 1x104 세포를 48-well 접시의 각 well에 재 분주하였다. 유전자 도입 48시간 이후에 250μg/ml 농도의 hygromycin이 첨가된 배양액에서 선별하였다. 14일간의 선별과정을 거쳐 형성된 콜로니를 두 개의 12-well 배양 접시로 옮겨 1개는 유전자 분석을 위해 배양하였고, 나머지 1개는 동결 보존하였다. 벡터가 도입된 체세포주의 확인은 PCR 방법으로 분석하였다. pCMV-hCD73 벡터 삽입 분석을 위한 프라이머는 200F (5'-CTATTGACGTCAATGACGGTA-3')와 199R (5'-CAAAACCCGAATGTCCCAGTG CAA-3')가 사용되었고, pICAM-hCD73 벡터 삽입 분석을 위한 프라이머는 198F(5'-ACTTAGTCATGGTGACTGCATGCC-3) 와 199R(5'-CAAAACCCGAATGT CCCAGTGCAA-3')가 사용 되었다(도 8).
도 8은 PCR을 이용한 pCMV/pICAM-hCD73 벡터가 도입된 세포주의 검증 결과이다.
표 1과 같이 pCMV-hCD73 벡터가 삽입된 초기 섬유아세포주 37개의 콜로니와 pICAM-hCD73 벡터가 삽입된 콜로니 43개를 확보하였다.
표 1은 CD73 과발현 벡터가 삽입된 초기 섬유아세포주 생산 결과를 나타낸다.
| 벡터명 | 분리된 콜로니 수 | 분석된 콜로니 수 | PCR 양성 콜로니 |
| pCMV-hCD73 | 46 | 46 | 43 |
| pICAM-hCD73 | 53 | 53 | 37 |
7.
pICAM
-
hCD73
체세포의
핵치환
도살장에서 돼지의 난소를 실험실로 이송한 후 난소에서 난자를 흡입방법으로 채취하였다. 체외에서 난자를 배양하였고, 성숙된 난자를 선별하여 핵을 제거 한 후 pICAM-hCD73 체세포를 이식하였다. 1.2kV/cm에서 두 번의 DC pulse 전기 자극으로 핵이 제거된 난자와 이식한 세포의 융합을 실시하였고, 생존한 융합난자만을 선별하여 대리모에 이식하였다.
8.
pICAM
-
hCD73
형질전환 복제돼지의 생산
pICAM-hCD73 체세포 41번이 핵이식된 난자로부터 2마리의 건강한 자손을 생산하였다. 자손의 꼬리를 1cm 정도 채취 후 Maxwell DNA purification Kit (Promega)를 사용하여 genomic DNA를 추출하였다. 상기 DNA를 주형으로 프라이머 198F (5'-ACTTAGTCATGGTGACTGCATGCC-3')와 199R(CAAAACCCGAATGTCCCAGTG CAA-3')를 사용하여 PCR 분석을 실시하였다. 도 8과 같이 생산된 자손 2 마리 모두는 pICAM-hCD73 유전자가 삽입된 형질전환 돼지로 판명되었다.
도 9는 pICAM-hCD73 유전자가 삽입된 형질전환 복제돼지의 생산 결과이다.
도 10은 CD73에 특이적인 프로브를 이용하여 CD73 유전자가 돼지 혈관내피세포에서 ICAM 프로모터에 의해 특이적으로 발현되는지를 조사한 결과로서, 통상적으로 매우 높은 전사수준을 나타내는 CMV에 비해서는 낮으나, 혈관내피세포에서 특이적으로 발현됨 나타내고 있다.
본 발명에 따르면, 새로운 면역거부반응 조절기술의 개발로 고부가가치의 장기이식용 미니돼지의 생산에 기여할 수 있으며, 새로운 장기 이식용 형질전환 복제 돼지의 생산으로 이종 장기 이식의 실용화를 촉진할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION
<120> EXPRESSION VECTORS FOR HUMAN CD73 IN ENDOTHELIAL CELLS OF MINI
PIGS, CELL LINE AND TRANSGENIC ANIMAL CONTAINING THE SAME
<130> NPF20227
<160> 1
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 920
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
tcgcgatcta gaaacacact gcaagtcctc agccctaccc ccgccccccc cagatcaagg 60
ccccctgtct ggagtggggg tgcaccctaa gctagcccag gaagcctccc cgagttactt 120
ctgtctgcgc ctgctgggga ctatgctggg gctgctgggg actatgctga gtgcgtttcc 180
ctcaagttgt cttttttttt tttttttttt gtcttttgtc cttttatgga ggtccccaag 240
ctaggggtct aatcggagct gtagctgccg gcctacacca cagccacagc aacgccggat 300
ccttatccca ctgagcaagg ccagggatcg aacctcaacc tcatggttcc tagtcagatt 360
catttccgct gcgccatgat gggagtgccg ccctcaagtt gtcttgtatc agggagtcag 420
aggctggctg agattgaaag cggagtgtcc aggtttaagc agacttgtgc caggcagttg 480
actaaagcac cagcagttcc tgcccgggtt tctctgccca cttagtcatg gtgactgcat 540
gccctggccg ggtcctgact ttggatagtc ccttcccaga ggggaccctg acagtgtgtc 600
ccctgggatt tggggctccc cagatctggg gcttgtgggc atcactgtcc tccgtgcaca 660
tgcagcactg tcacatgtgt cccctgatgg gagcatgcca ggatgacaag gttatccctg 720
cttatcagct ctttcccagc ttcctctgcc tgttgcttat agacctgagc cctgggcgcc 780
acgtcttcct caaataatga gaggaagtgt ggtcatcggc acacagatgg ctgggggttc 840
cggattgcgg ctcccggcca ccactccctg acctgcgccc ccatctctcg ccaggcggtc 900
ctcggctctt tcctaagctt 920
Claims (7)
- 미니돼지 혈관내부세포(endothelial cell) 특이적인 서열번호 1로 표시되는 ICAM-2 유전자의 프로모터, 사람의 CD73 유전자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
- 삭제
- 삭제
- 제 1항의 발현벡터를 인간을 제외한 포유동물 수정란에 주입하여 얻은 형질전환 수정란.
- 제 4항에 있어서, 상기 포유동물 수정란은 돼지 수정란인 것을 특징으로 하는 형질전환 수정란.
- 제 4항의 형질전환 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 얻은 형질전환 동물.
- 1) 돼지로부터 체세포를 분리하는 단계; 2) 제1항의 발현벡터를 제조한 후 상기 체세포에 도입시키는 단계; 3) 단계 2)의 발현 벡터가 도입된 클론 체세포를 선별한 후 배양하는 단계; 4) 모돈으로부터 채취한 난자의 핵을 제거하고 단계 3)의 클론 체세포와 융합시키는 단계; 및 5) 상기 융합된 복제란을 대리모돈에 이식하고 자돈을 출산하는 단계를 포함하는 형질전환 돼지의 제조 방법.
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