KR20090068646A - Ｈｌａ-ｇ 유전자 및 ｄａｆ 유전자를 발현하는 형질전환복제 돼지 및 그의 제조 방법 - Google Patents
Ｈｌａ-ｇ 유전자 및 ｄａｆ 유전자를 발현하는 형질전환복제 돼지 및 그의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 HLA-G 유전자 및 DAF 유전자를 발현하는 형질전환 복제 돼지 및 그의 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 1) HLA-G 복제 돼지로부터 체세포를 분리하는 단계; 2) DAF 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조한 후 단계 1의 체세포에 도입시키는 단계; 3) 상기 발현벡터가 도입된 체세포를 선별한 후 배양하는 단계; 4) 모돈으로부터 채취한 난자의 핵을 제거하고 상기 체세포와 융합시키는 단계; 및 5) 상기 융합된 복제란을 대리모돈에 이식하고 자돈을 출산하는 단계를 포함하는 HLA-G 유전자 및 DAF 유전자를 발현하는 형질전환 복제돼지 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조 방법에 의한 HLA-G 유전자 및 DAF 유전자를 발현하는 형질전환 복제돼지는 초급성 및 자연살해 세포(natural killer cell, NK cell)의 세포성 면역 거부반응을 억제함으로, 핵이식을 통한 HLA-G 유전자 및 DAF 유전자를 발현하는 돼지 생산 등 세포이용 치료 분야 및 이종 장기 이식 분야의 연구에 유용하게 사용할 수 있다.
HLA-G, DAF
Description
본 발명은 HLA-G 유전자 및 DAF 유전자를 발현하는 형질전환 복제돼지 및 그의 제조 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 비 고전적(nonclassical) MHC classI 분자로서 NK 세포의 활성을 저해시키고 표적 세포의 용해를 막아주는 HLA-G 유전자 및 보체 반응 조절 단백질로서 보체반응(complement cascade)을 억제시켜 표적 세포의 괴사를 막는 DAF 유전자를 돼지의 체세포에 주입하여 초급성 및 자연 살해 세포의 면역거부 반응을 억제시키는 형질전환 복제돼지 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
돼지의 장기는 생리적으로 사람과 상당히 흡사하여 사람에게 이식하기 위해 많은 노력을 하고 있다. 그러나 돼지의 장기를 사람에게 이식 시 일어나는 거부반응이 이종이식에 큰 걸림돌이었다. 이러한 문제는 최근 거부반응에 관여하는 돼지 유전자를 제거함(Lai et al., Science, 295: 1089-1092, 2002; Dai et al., Nat. Biotechnol., 20: 251-255, 2002)과 동시에 면역거부반응에 관여하는 세포들을 억제시킴으로써 이종이식은 한층 실현 가능성이 높아졌다.
이종간의 장기이식에서 기술적으로 가장 커다란 문제로 지적되고 있는 것이 이식되는 조직 표면 항원에 대하여 나타나는 초급성 거부반응이다. 인간의 장기를 이식할 때 나타나는 급성 및 만성 거부반응은 면역억제제의 사용으로 문제를 해결할 수 있으나 초급성 거부반응은 반응의 속도가 너무 빨라서(수분 이내) 아무런 조치를 취할 수 없는 상태이다. 또한 초급성 거부반응 외에 인간 면역 세포 중 자연살해 세포(Natural Killer, NK) 세포는 조직 표면 항원에 대해 비자기(non-self)로 인식하여 세포 용해를 일으킨다. 하지만 초급성 거부 반응 및 자연 살해 세포를 불활성화시키는 유전자로 형질전환 돼지를 만든다면 이를 극복 할 수 있을 것이며, 이러한 형질전환 돼지를 만들기 위해 사용될 수 있는 유전자가 DAF와 HLA-G이다. 지금까지의 연구결과에서 알려진 바에 의하면, 돼지의 세포주에 DAF와 HLA-G를 발현시키면 보체 및 인간 자연 살해 세포에 의한 독성이 저해되는 것으로 알려져 왔다.
현재 초급성 및 세포성 거부반응을 일으키는 원인을 밝히기 위한 연구들이 많이 진행되었고, 이런 거부반응은 보체반응(complement activation)과 인간면역세포에의해 개시된다는 것이 알려졌으며, 보체반응은 보체억제 물질인 MCP, DAF, CD59로 억제되며, 인간면역세포 중 자연살해 세포에 의한 반응은 HLA-G1에 의하여 억제될 수 있다고 보고되었다. 따라서 사람의 보체억제 물질과 인간면역세포를 억제하는 유전자를 발현하는 형질전환 동물을 개발하면 초급성 거부 반응 및 세포성 면역거부반응을 막을 수 있는 형질전환 동물을 생산할 수 있을 것이다.
자연살해 세포는 내재 면역(innate immunity)에서 중요한 역할을 한다. 특히 가장 우선적인 역할은 선택적으로 종양세포, 몸속에 침입한 박테리아, 바이러스 등의 감염에 의해 주요 조직적합성 복합체 제 1 항원(Major Histocompatibility Complex, MHC class I)의 기능이 감소된 체내의 세포를 공격하는 것이다. 또한, 자연살해 세포는 골수를 이식할 때 거부반응을 일으키기도 한다. 자연살해 세포의 활성과 불활성은 특이적인 억제 수용체(specific inhibitory receptor) 또는 활성 수용체(activating receptor)가 표적 세포의 리간드와 결합함으로써 이루어진다. 즉, 자연살해 세포의 세포독성은 MIC, ULBP 등의 활성 신호(activating signal)와 MHC class I 및 비(non) MHC class I의 억제 신호(inhibitory signal)에 의해서 조절된다. 자연살해 세포를 불활성화(inactivation)시키는 특이적인 억제 수용체(specific inhibitory receptor)에는 자연살해 세포 면역글로블린 유사 수용체(the killer cell Ig-like receptor, KIR) 및 LIR1/ILT2, CD94/NKG2A가 있다. 이 수용체들은 non MHC class I 및 MHC class I 분자들과 결합하여 자연살해 세포를 불활성 시킨다(Lewis et al ., Annu . Rev . Immunol ., 16: 359-93, 1998).
또한, 자연살해 세포는 이종 장기이식 거부반응에도 중요한 역할을 하고 있다. 사람과 돼지간의 이종이식 시에 자연살해 세포는 돼지의 세포에 빠르게 이종개체 내에 발생하는(xenogeneic) 세포독성을 일으킨다. 이는 HLA class I의 결핍과 돼지 백혈구 제 1항원(swine leukocyte Antigen, SLA class I)이 자연살해 세포 억제 수용체에 양성 신호로 전달되기 때문이다. 그 결과 자연살해 세포는 표적세포를 공격하고 전-염증 싸이토카인(pre-inflammatory cytokine)을 분비하며 표적세포의 기능을 상실시킨다. 그러므로 자연살해 세포의 활성과 이종개체 내에 발생하는 세포독성을 억제시키는 것은 이종이식 시에 발생하는 거부반응을 줄일 수 있는 훌륭한 접근 방법이라 하겠다.
HLA-G는 비-고전적(non-classical) MHC class I 분자로서 인간의 6번 염색체에 위치한 HLA-A의 말단 부위에 위치하고, HLA-A2의 염기서열과 상당히 일치한다. 또한, HLA-G는 HLA-B 및 C와도 유사하며 8개의 엑손(exon)을 포함하고 있다. 엑손 1은 펩티드 시그널(peptide signal), 엑손 2는 α1-도메인, 엑손 3은 α2-도메인,엑손 4는 α3-도메인, 엑손 5는 막횡단(transmembrane) 부위, 엑손 5-7은 세포질 꼬리(cytoplasmic tail) 부위, 그리고 엑손 8은 비번역 부위(untranslated region)를 코딩한다. HLA-G는 mRNA 스플라이싱(splicing)에 의해서 G1, G2, G3, G4의 동형(isoform)과 2개의 가용성 형태(soluble form)인 G5, G6이 있으며, 여기서 가장 큰 HLA-G1은 엑손 1-8번에 모두 위치해 있다(Juan et al ., Journal of Immunology, 158: 5735-5743, 1997). 이런 HLA-G의 여러 동형 중에서 HLA-G1이 자연살해 세포 의 억제 수용체인 KIR, CD94/NKG2A, LIR1/ILT2와 결합하여 자연살해 세포를 불활성 시키는 것으로 알려져 있다(Schneider et al ., scand . J. Immunol., 54: 70-75, 2001; Nathalie et al ., Proc . Natl . Acad . sci . USA., 94; 11520-11525, 1997).
한편, HLA-G 이외에 HLA-C를 이용하여 자연살해 세포를 불활성시킬 수 있으나, HLA-C는 다형의 대립형질(polymorphic allele)이고 혈관을 연장시키는 이종이식(vascularizd xenograft)시 HLA-C의 발현으로 T 세포에 의한 세포독성의 보고가 있다. 반대로 HLA-G는 최소한의 다형의 분자(minimally polymorphic molecule)로서 임신기간 중 태반과 양막에서 특이적으로 발현하는 것이 특징이고 발현된 HLA-G는 태아를 자연살해 세포로부터 보호하는 기능과 T 세포의 면역반응을 초래하지 않는 것으로 알려져 있다. 따라서 HLA-G는 이종이식시 발생하는 자연살해 세포에 의한 면역거부 반응을 억제하는데 좋은 유전자로 선택되어 있고 많은 연구결과가 보고되고 있다(Sasaki et al ,. Trasnplantation , 67: 31-37, 1999; Miyagawa et al . Transpl Immunol ., 11: 146-53, 2003).
한편, 보체 반응 기작(complement cascade)은 병원체 표면(pathogen surface)의 분자를 보체 분자가 결합하고 외부 물질임을 인식하고 활성화되어 세포들을 파괴하는 기작이다. 보체 반응 기작은 이종 이식에서 중요한 작용을 하고 있는데, 특히 사람 대 돼지의 이종이식에서 보체 반응의 활성은 이종 세포 표면의 항원에 수용체의 항체의 결합에 의해 개시되고 파괴하는 기작을 수행한다. 보체 반 응 활성에 의하여 일어나는 반응을 초급성 거부반응(hyperacute rejection)이라 부르는데, 이는 출혈과 혈전, 최종적으로 이종장기의 괴사를 일으키는 반응을 말한다. 활성화된 보체 반응 분자들은, 또한 다른 숙주세포에 결합하여 의도하지 않은 이런 파괴 기작을 수행할 수 있는데, 이를 막기 위해 숙주세포들은 보체 반응 조절 단백질(complement regulatory protein)의 연속적인 작용이 일어남으로서 보체반응 기작을 저해한다. 이 보체 반응 조절 단백질은 붕괴 촉진 분자(decay-accelerating factor;CD55,DAF), 막 보조인자 단백질(membrane cofactor protein; CD46,MCP), 프로텍틴(protectin; CD59)등이 있다. 여기서 막 보조인자 단백질(MCP)과 붕괴 촉진 분자(DAF)는 보체 반응 기작(complement cascade)중 C3, C5 전환 효소 양(convertase level)을 조절하여 보체 반응 기작을 저해하고, 프로텍틴(CD59)은 C9의 중합 반응(polymerization)을 막음으로서 막 공격 복합체(membrane attack complex)의 형성을 억제한다. 따라서 이 보체 조절 단백질(CRP)은 보체 반응 연계 손상(complement-mediated injury)이나 활성화된 보체(activated complement)에 의한 세포파괴에서 숙주세포를 보호하는 중요한 기능을 하고 있다. 이와 같은 보체 조절 단백질의 기능을 이용하여 이종 장기이식에 적용 할 수 있는데, 이는 보체 조절 단백질중에 초급성 거부반응을 가장 효율적으로 억제한다고 알려진 붕괴 촉진 분자(DAF)를 이용하는 전략이다. 이 방법은 인간의 붕괴 촉진 유전자(human DAF gene)를 넣은 형질전환 돼지를 만들어 붕괴 촉진 유전자(human DAF gene)가 발현하도록 만들어, 이종 이식 시 일어나는 초급성 거부반응을 저해한다는 계획이다.
이에, 본 발명자들은 돼지 장기 이식 시 발생하는 초급성 및 자연살해 세포의 세포성 면역 거부 반응을 억제할 수 있는 HLA-G 유전자 및 DAF 유전자를 발현하는 형질전환 복제돼지를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 HLA-G 유전자 및 DAF 유전자를 발현하는 형질전환 복제 돼지의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 복제 돼지를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) HLA-G 복제 돼지로부터 체세포를 분리하는 단계;
2) DAF 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조한 후 단계 1)의 체세포에 도입시키는 단계; 및
3) 상기 발현벡터가 도입된 체세포를 선별하는 단계를 포함하는 인간 백혈구 항원 G(human leukocyte antigen-G, HLA-G) 유전자 및 붕괴 촉진 유전자(decay-accelerating factor, DAF) 유전자를 발현하는 형질전환 돼지 클론 체세포주의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 형질전환 복제 돼지를 제조하기 위한 클론 세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 상기 형질전환 돼지 클론 체세포주를 배양하는 단계;
2) 모돈으로부터 채취한 난자의 핵을 제거하고 상기 클론 체세포와 융합시키 는 단계; 및
3) 상기 융합된 복제란을 대리 모돈에 이식하고 자돈을 출산하는 단계를 포함하는 HLA-G 유전자 및 DAF 유전자를 발현하는 형질전환 복제 돼지의 제조 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 복제 돼지를 제공한다.
본 발명의 제조 방법에 의한 HLA-G 유전자 및 DAF 유전자를 발현하는 형질전환 복제돼지는 초급성 및 자연살해 세포(natural killer cell, NK cell)의 세포성 면역 거부반응을 억제함으로, 핵이식을 통한 HLA-G 유전자 및 DAF 유전자를 발현하는 돼지 생산 등 세포이용 치료 분야 및 이종 장기 이식 분야의 연구에 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
1) HLA-G 복제 돼지로부터 체세포를 분리하는 단계;
2) DAF 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조한 후 단계 1)의 체세포에 도입시 키는 단계; 및
3) 상기 발현벡터가 도입된 체세포를 선별하는 단계를 포함하는 인간 백혈구 항원 G(human leukocyte antigen-G, HLA-G) 유전자 및 붕괴 촉진 유전자(decay-accelerating factor, DAF) 유전자를 발현하는 형질전환 돼지 클론 체세포주의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, "클론 세포주"는 유전체에 도입된 벡터의 위치가 동일한 세포주를 가리킨다.
아울러, "복제란"은 전기적 자극에 의하여 난자와 체세포가 융합된 단계를 가리킨다.
상기 단계 1에 있어서, HLA-G 복제 돼지는 본 발명의 출원인이 출원한 대한민국 특허출원 제 84409/2005호에 개시되어 있는 복제돼지를 사용하나, HLA-G 유전자로 형질전환된 복제돼지는 어느 것이든 사용할 수 있다. 체세포를 분리하기 위한 방법으로는 종래에 사용되는 일반적인 방법이 본 발명에 동일하게 적용될 수 있으며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 면도날을 이용하여 돼지의 귀를 잘게 자른 후 트립신을 처리하여 계대 배양함으로써 체세포를 분리하였다.
단계 2에 있어서, DAF 유전자는 서열번호 4로 기재되는 것이 바람직하나, 반드시 여기에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 DAF 유전자를 포함하는 발현벡터는 돼지 세포에서 발현시킬 수 있는 공지된 모든 발현벡터를 제한 없이 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 DAF 유전자를 포함하는 발현벡터로서 pCX-EGFP-BSD 벡터를 사용하였다.
단계 3에 있어서, 단계 2의 발현벡터가 도입된 체세포는 선별마커가 도입된 발현벡터를 사용함으로써 용이하게 선별할 수 있다. 선별마커로는 항생제 내성 유전자가 사용될 수 있다. 상기 항생제 내성유전자에는 bsdr, neor, pacr, bsrr, hphr 등이 사용될 수 있으나, 반드시 여기에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 bsdr를 사용하여 세포 배양액에 블라스티사이딘(blasticidin)을 처리해서 DAF 유전자를 포함하는 발현벡터가 도입된 체세포를 선별하였다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 형질전환 복제 돼지를 제조하기 위한 클론 세포주를 제공한다.
본 발명에서는 상기와 같은 방법으로 돼지 체세포에 DAF 유전자를 효율적으로 주입하여 DAF 단백질을 발현하는 형질전환 돼지 클론 체세포주를 선별하고, 이를 핵이 제거된 돼지 난자에 이식하여 HLA-G 유전자 및 DAF 유전자를 발현하는 형질전환 돼지 세포주를 제조하였으며, 이를 2007년 11월 1일자로 한국 세포주 연구재단에 기탁하였다(KCLRF-BP-00173).
클론 체세포주는 유전체에 주입된 발현 벡터의 위치가 동일하다는 특징이 있다. 발현 벡터가 도입된 클론 체세포주를 만들지 않으면 유전자는 도입되어 있지만 유전자의 삽입부위가 각각의 체세포마다 다르게 된다. 유전자가 염색체의 어느 부위에 삽입되었는지 여부에 따라서 세포마다 단백질 발현 양상이 조금씩 다를 수 있기 때문에, 이러한 세포를 이용하여 돼지를 생산하게 되면 도입된 유전자의 발현 양상이 개체에 따라 조금씩 다르게 나타나게 된다(Park, KW et al ., Anim . Biotech., 2001, 12:173-181).
본 발명에서는 상기와 같은 방법의 문제점을 해결하여 클론 체세포주를 제조하였다. 이러한 기술은 체세포복제를 이용한 형질전환 동물의 생산효율을 증대시킬 것으로 기대된다. 즉, 유용단백질 유전자를 체세포의 게놈에 삽입시킨 후 유전자가 삽입된 부위에 따라 몇 종류의 서로 다른 클론 세포주를 만들 수 있을 것이다. 유전자가 게놈의 어느 부위에 삽입되는가에 따라 그 발현율에 차이를 보일 수 있기 때문에 상기 세포주를 이용하여 복제동물을 생산한 후 단백질의 발현 양상을 검사하여 발현율이 좋은 개체를 선별할 수 있다.
이종이식시 발생하는 거부반응을 줄이기에는 많은 난관이 있지만 본 발명의 세포주를 이용하여 제작된 형질전환 복제돼지는 세포이용 치료 분야와 이종장기 이식 시 발생하는 거부반응을 억제하는데 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 상기 형질전환 돼지 클론 체세포주를 배양하는 단계;
2) 모돈으로부터 채취한 난자의 핵을 제거하고 상기 클론 체세포와 융합시키는 단계; 및
3) 상기 융합된 복제란을 대리 모돈에 이식하고 자돈을 출산하는 단계를 포함하는 HLA-G 유전자 및 DAF 유전자를 발현하는 형질전환 복제 돼지의 제조 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 형질전환 복제 돼지를 제공한다.
본 발명자들은 상기와 같은 방법으로 HLA-G 돼지 체세포에 보체 반응을 억제하는 DAF 유전자를 주입하여 DAF 유전자를 발현하는 형질전환 복제돼지를 제작하였다.
따라서, 본 발명에 의하여 상기와 같은 방법으로 제조된 형질전환 복제 돼지는 HLA-G 유전자 및 DAF 유전자가 발현되기 때문에, 자연 살해 세포의 활성을 저해시키고 표적 세포의 용해를 막아줄 뿐만 아니라 보체 반응을 억제시켜 표적 세포의 괴사를 막음으로서 세포이용 치료 분야 및 이종 장기 이식 분야의 연구에 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1>
HLA
-G 복제 돼지 체세포의 분리
자돈 HLA-G 복제 돼지(대한민국 특허출원 제 84409/2005호)의 귀를 이각기를 사용하여 이각한 후에 이를 깨끗하게 소독하고 면도날로 잘게 자른 후, 조직에 트립신-EDTA(Gibco. Inc., USA)이 첨가된 DMEM 배지(BioWhittaker, USA)에서 30분간 39℃, 5% CO2 세포배양기에서 배양하였다. 그 후 상층액을 원심분리(1,500 rpm, 4분)한 후, 10% FBS(Fetal bovine serum, Hyclone, USA)이 포함된 DMEM 배지에서 배양하고 세포가 90% 포화상태(confluency)에 이르면 트립신을 처리하여 계대 배양하였으며, 이들 중 일부는 핵 이식에 이용하고 나머지는 동결보존하였다.
<실시예 2> HLA-G 및 DAF 유전자 발현 벡터 제조
인간 융모막암종 세포주인 JEG-3(KCLB, KOREA)을 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 배양한 후 트리졸 시약(Invitrogen, USA)을 사용하여 RNA를 분리하였다. AMV 역전사 효소(Invitrogen, USA)를 이용하여 cDNA를 만들고, BamH I/Hind III 인식부위를 부가한 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 서열번호 1로 기재되는 HLA-G 유전자를 얻었다. HLA-G 유전자를 얻기 위한 PCR 반응에 사용된 프라이머는 서열번호 2로 기재되는 HLA-G 정방향 프라이머(5'-ATGGATCCGGATGGTGGTCATGGCGCCC-3') 및 서열번호 3으로 기재되는 역방향 프라이머(5'-ACTAAGCTTAGCCTGAGAGTAGCTCCCTCCTT-3')를 사용하였다. PCR 조건은 95℃에서 4분 동안 예비변성시킨 후, 95℃에서 1분, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초 동안 30회 반복 수행하고 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켰다(도 1). 도 1의 A는 JEG-3 세포의 HLA-G 유전자의 PCR 생성물을 보여주는 전기영동 사진이고, 도 1의 B는 GAPDH 유전자의 PCR 생성물을 보여주는 전기영동 사진으로서, 나타난 바와 같이 JEG-3 세포에서 HLA-G 유전자를 확인할 수 있었다.
또한 자궁경부암 세포주인 HeLa cDNA library cDNA(BD, USA)를 주형으로 이용하여 EcoR I 인식부위를 첨가한 프라이머를 사용한 PCR을 통해 서열번호 4로 기재되는 DAF 유전자를 얻었다. PCR에 사용된 프라이머는 서열번호 5로 기재되는 DAF 정방향 프라이머(5'-TAGAATTCCGTAGCTGCGACTCGGCGGAG-3') 및 서열번호 6으로 기재되는 DAF 역방향 프라이머(5'-TAGAATTCTTGACATTCCTAACACATCTT-3')을 사용하였다. PCR 분석조건은 95℃에서 4분 동안 예비변성시킨 후, 95℃에서 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 1분 동안 30회 반복 수행하고 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켰다(도 2). 도 2는 DAF 유전자의 PCR 생성물을 보여주는 전기영동 사진으로서, 나타난 바와 같이 HeLa cDNA library cDNA 세포에서 DAF 유전자를 확인할 수 있었다.
HLA-G 유전자를 포함하는 벡터로는 pcDNA 3.1(Invitrogen, USA)을 사용하였다(도 3). pcDNA 3.1 벡터를 BamH I와 Hind III 제한효소로 절단한 후 이 위치에 T4 DNA 라이게이즈(Roche, USA)를 이용하여 HLA-G 유전자를 접합시켜 HLA-G 유전자를 발현하는 pcDNA3.1-HLA-G 벡터를 제조하였다. 그런 다음 pcDNA3.1-HLA-G 벡터를 BamH I와 Hind III 제한효소로 절단하여 전기영동으로 HLA-G 유전자의 삽입을 확인하였고(도 4의 a), Sca I 제한효소로 절단한 단일가닥 pcDNA3.1-HLA-G 벡터를 전기영동으로 확인하였다(도 4의 b).
DAF 유전자를 포함하는 벡터로는 pCX-EGFP(Tojo, JAPAN)에 EcoR I 제한효소로 절단한 후 제거시키고 BSD 유전자를 삽입한 pCX-BSD 벡터를 사용하였다. pCX-BSD 벡터를 EcoR I 제한효소로 절단한 후 T4 DNA 라이게이즈(Roche, USA)를 이용하 여 DAF 유전자를 접합시켜 DAF 유전자를 발현하는 pCX-DAF-BSD 벡터를 제조하였다(도 5). 완성된 벡터를 EcoRI 제한효소로 절단하여 전기영동으로 DAF 유전자의 접합 유무를 확인하였다(도 6).
<실시예 3> HLA-G 유전자 및 DAF 유전자를 발현하는 클론 세포주의 제조
상기에서 제조된 pCX-DAF-BSD 벡터에 Sca I 부위를 절단하여 선형화시키고(도 7), 페놀 추출법으로 DNA를 분리하였다. 준비된 DNA를 상기 실시예 1에서 분리한 DAF 복제 돼지 귀세포 내로 주입하기 위하여 지질 매개법(LipofectamineTM 2000, Invitrogen, USA)을 수행하였다. 48시간 동안 세포를 배양한 후 BSD(Blasticidin, Sigma, USA)를 첨가하여 형질전환된 체세포를 선별하였으며, 이때 처리된 BSD의 농도는 여러 가지로 수행하여 4 ㎍/㎖로 최적의 농도를 결정하였다. 클론 세포주는 형질감염된 세포를 2주 동안 4 ㎍/㎖의 농도로 BSD를 처리하여 형성된 콜로니를 수득하였다.
<
실시예
4> 클론
체세포주에서
HLA
-G 유전자 및
DAF
유전자의 도입 확인
상기 실시예 3에서 선택된 돼지 체세포 콜로니 일부를 PCR 튜브에 넣고 용해 완충액을 넣고 끓인 후 PCR 분석을 통하여 상기 발현 벡터가 도입된 양성 세포(positive cell)를 선별하였다(도 8). HLA-G 유전자 확인을 위한 PCR 반응시 사용된 프라이머는 상기 실시예 2에서와 같이 서열번호 2 및 서열번호 3으로 기재되 는 프라이머이다. 또한, DAF 프라이머는 실시예 2에서와 같이 서열번호 5 및 서열번호 6으로 기재되는 프라이머를 사용하였다. PCR 분석조건은 HLA-G는 95℃에서 4 분 동안 예비변성시킨 후, 95℃에서 1분, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초 동안 30 회 반복 수행하고 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시키고, DAF는 95℃에서 4분간 예비변성시킨 후, 95℃에서 1분, 60℃에서 1분, 72℃에서 1분 동안 30회 반복 수행하고 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켰다(도 9).
<
실시예
5> 클론
체세포주에서
HLA
-G 단백질 및
DAF
단백질의 발현 확인
<5-1>
FACS
분석에 의한
HLA
-G 단백질 및
DAF
단백질 발현 확인
상기 실시예 5에서 PCR 분석을 통해 양성으로 선별된 세포를 60 mm 세포배양 접시에서 배양하여 수득한 후, 하기와 같이 FACS(fluorescence activated cell sorting) 분석을 수행하였다. 항체 염색을 실시 후 고정용액(1% formaldehyde가 포함이 된 인산완충용액)에서 고정한 후 FACS 분석을 실시하였다. FACS 분석에 사용된 HLA-G 1차 항체는 항-HLA-Gab7758(MEM/G-9, abcam, UK) 항체이며 아이소타입 대조군 항체로는 마우스 IgG1-ab9404(abcam, UK) 2차 항체로 이들 항체로 염색한 후, FITC가 접합된 항-IgGab5874(abcam, UK) 항체를 처리하여 염색한 후 FACS로 분석하였다. 또한, FACS 분석에 사용된 DAF 1차 항체는 항-DAFIA10(BD , USA) 항체이고, 아이소타입 대조군 항체로는 IgG1-ab9404(abcam, UK) 항체로 염색한 후, FITC가 접합된 항-IgGab5874(abcam, UK) 항체를 처리하여 염색한 후 FACS로 분석하였다(도 10).
<5-2> 면역조직 화학적 염색법에 의한
HLA
-G 단백질 및
DAF
단백질 발현 확인
HLA-G 및 DAF의 발현 유무를 단백질 상에서 확인하기 위해 상기 실시예 4에서 PCR 분석을 통해 양성으로 선별된 클론 체세포주를 챔버 슬라이드에 5일간 배양하여 FACS에서 선별된 양성 시료와 음성 대조군 세포주인 미니돼지 체세포주(PWG, mini pig somatic cell line)를 함께 고정 용액(95% 에탄올)에 고정시킨 후, 1:100으로 희석한 항-HLA-G4H84(Santacruz, USA) 항체와 항-DAF-IA10(BD, USA) 항체를 사용하였고 염색을 실시하였다. 그 결과 도 11에서 보는 바와 같이, 세포질에서 갈색 빛이 뚜렷이 나타나는 것을 확인하였다.
<
실시예
6> 자연 살해 세포와
보체
작용 억제 확인
<6-1> 자연 살해 세포 억제 확인
선별된 양성 세포주가 실제로 자연 살해 세포를 억제시켜 세포 파괴작용을 저해시키는 것을 확인하기 위하여 세포독성 실험을 실시하였다. 양성 세포주, 정상 미니돼지 세포주를 표적세포로 사용하고, NK 92MI(ATCC. Inc) 세포주를 효과기 세포(effector cell)로 사용하여 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 12.5% 말 혈청(horse serum)( I nvitrogen Inc, USA), 12.5% FBS가 포함된 α-MEM 배지에서 계대 배양하여 일부는 동결시키고 일부는 자연살해 세포의 세포독성 분석에 사용하였다. E:T 비 율을 10:1로 하여 MTT assay 방법을 이용하여 5회 실시하고 분석하였다. 그 결과, 도 12a에서 보는 바와 같이 DAF-13과 DAF-93 클론 세포주가 자연 살해 세포의 세포 독성을 감소시켰다.
<6-2>
보체
작용 억제 확인
선별된 DAF 양성 세포주가 실제로 보체 반응을 억제시켜 세포 파괴작용을 저해 시키는 것을 확인하기 위하여 유산탈수소효소(lactate dehydrogenase, LDH) 세포독성 실험을 실시하였다. 세포파괴 체크는 CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Aassy kit(PROMEGA, USA)를 사용하여 세포 파괴 정도를 체크 하였다. 실험은 양성 세포주와 정상의 미니 돼지 세포주에 사람 혈청 50%를 처리하여 6시간 반응 후 세포 파괴정도를 CytoTox 96 kit를 사용하여 확인하였다. 그 결과, 도 11b에서 보는 바와 같이 DAF-22와 DAF-96 클론 세포주가 LDH 세포 독성을 감소시켰다.
상기 자연 살해 세포 및 LDH 세포 독성 분석을 실시하여 2개의 우수한 클론 세포주를 확보하였고, 이것을 이용해 하기 실시예와 같이 핵이식을 실시하였다. 이후 HLA-G 유전자 및 DAF 유전자 도입된 형질전환 돼지 클론 체세포주를 2007년 11월 1일자로 한국 세포주 연구재단에 기탁하였다(수탁번호 KCLRF-BP-00173).
<
실시예
7> 체세포 복제 방법을 이용한
HLA
-G 및
DAF
유전자를 갖는 형질전환 복제 돼지 생산
<7-1> 배양액
성숙 배양액은 TCM199(31100035; Gibco, Grand Island, NY, USA)에 0.1% 폴리비닐알콜(polyvinylalcohol), 3.05 mM D-글루코스(Sigma Chemical Co, St. Louis, MO, USA), 0.91 mM 소듐 피루베이트(sodium pyruvate, Sigma), 0.57 mM 시스테인(cysteine), 0.5 g/㎖ LH(Sigma), 0.5 g/㎖ FSH(Sigma), 10 ng/㎖ 내피 성장 인자(epidermal growth factor, Sigma), 75 g/㎖ 페니실린 G(Sigma) 및 50 g/㎖ 스트렙토마이신(Sigma, USA)을 첨가했다.
미세 조작용 배양액은 TCM199에 0.3% BSA와 7.5 g/㎖ 사이토칼라신(cytochalasin B, CB, Sigma, USA)을 첨가하였다. 활성화 배양액은 0.3 M 만니톨(Sigma, USA)에 1.0 mM CaCl2H2O, 0.1 mM MgCl26H2O, 0.5 mM HEPES를 첨가하였다. 복제란의 발생 배양액은 NCSU(North Carolina State University)-23 배지에 0.4 % BSA를 첨가하였다.
<7-2> 난자의 채취 및 미세 조작(
Micromanipulation
)
도축장에서 미경산돈의 난소를 채취하여 35-39℃, 0.9% 생리적 식염수에 넣어 실험실까지 운반하였다. 난자는 일회용 10 ml 주사기에 17-게이지(gauge) 바늘을 연결하여 직경 2-6 mm 난포에서 난포액을 흡입하여 채취하였다. 난자를 성숙배양액에서 세척하고 500 ㎕ 배양액이 들어있는 4-웰 플레이트에 50-60개 넣어 42-44 시간 배양하였다.
상기 난자를 미세조작용 배양액에서 5-10분간 배양한 후 체세포를 배양액에첨가한 다음, 직경 30 μm의 미세 유리관으로 난자의 제 1 극체와 그 주위의 세포질을 제거하고 이 유리관을 이용하여 체세포를 난자의 위란강에 주입시켰다.
<7-3> 세포융합 및 활성화
미세조작 후 간격이 1 mm 떨어진 플레티넘(platinum) 전기선 사이에 핵이식란을 위치시켰다. 세포융합 및 활성화는 2회의 DC 펄스 1.0-1.2 kV/cm, 30 μsec을 융합기(BTX Electro-Cell Manipulation 2001)로 공급하여 유도한 다음 0.5-1시간 후 융합률을 검사하였다.
<7-4>
복제란의
배양
융합된 복제란만을 골라 500 ㎕의 배양액이 들어있는 4-웰 플레이트에서 20-30개의 복제란을 6일간 배양하였다. 배양이 끝나면 5 ㎍/㎖ 비스벤지미드(bisbenzimide, Hoechst 33342)로 염색하여 형광현미경 하에서 복제란의 핵수를 검사하였다.
<7-5> 복제란 이식에 의한 형질전환 돼지 생산
상기에서 검사한 융합된 복제란은 500 ㎕의 배양액이 들어있는 4-웰 플레이트에서 1~2일간 배양한 후 같은 배양액 2 ㎖이 들어있는 동결튜브에 복제란을 넣고 39℃로 가온되어 있는 수정란 운송 장치(Embryo transfer kit, Minitube, USA)로 수정란 이식 장소까지 운송하였다. 복제란 이식을 위한 대리모는 발정이 시작된 개체를 선별하여 준비하였고, 대리모를 세척 후 펜토탈소듐(Pentothal Sodium, 중외제약) 0.5 g을 귀정맥에 투여하여 일시 마취시켰다. 마취된 대리모를 수술대에 고정한 후 5% 이소플로레인(Isoflurane)을 공급하여 흡입마취를 실시하였다. 마취된 대리모는 복중선을 따라 약 5 cm 가량 절개 후 자궁과 난소를 체외로 노출시켜 준비하였다. 이때 복제란을 카테타(Tom cat catheter, Monoject, USA))로 흡입하여 난관의 협부까지 밀어 넣어 복제란을 이식하였다. HLA-G/DAF 형질전환 복제돼지 생산을 위하여 13마리의 대리모에 총 3840개의 복제란을 이식하였다. 복제란 이식이 완료된 대리모는 30일 초음파를 이용하여 임신 검정을 실시하고 임신이 확인된 개체는 114일 후 분만을 유도하였다. 이중 3마리의 대리모가 임신하였고 정상적으로 8마리가 자연분만하였으나 7마리가 사산되고 1마리의 형질전환 자돈이 생존하였다(도 13).
태어난 복제 돼지의 단미를 통하여 확보된 조직을 프로테이나제 K(Gibco. Inc)로 처리하여 단백질을 분해시킨 후 페놀로 단백질을 변성시켜 게놈 DNA를 분리하였다. 분리된 게놈 DNA를 HLA-G의 경우 상기 서열번호 2 및 서열번호 3, 그리고 DAF의 경우 서열번호 5 및 서열번호 6으로 기재되는 프라이머들을 이용하여 형질전환 여부를 확인한 결과 3마리의 산자 모두 형질전환이 확인되었다(도 14).
도 1의 a는 JEG-3 세포에서 HLA-G 유전자의 PCR 산물을 보여주는 전기영동 사진이고, 도 1의 b는 GAPDH 유전자의 PCR 산물을 보여주는 전기영동 사진이다.
도 2는 DAF 유전자의 PCR 산물을 보여주는 전기영동 사진이다.
도 3은 pcDNA3.1 벡터의 개열지도를 보여주는 개략도이다.
도 4의 a는 pcDNA3.1-HLA-G 벡터를 BamH I과 Hind III 제한효소로 절단하여 HLA-G 유전자의 삽입을 보여주는 전기영동 사진이고, 도 3의 b는 Sca I 제한효소로 절단한 단일가닥 pcDNA3.1-HLA-G 벡터를 보여주는 전기영동 사진이다.
도 5는 pCX-DAF-BSD 벡터의 개열지도를 보여주는 개략도이다.
도 6은 pCX-DAF-BSD 벡터를 EcoRI 제한효소로 절단하여 전기영동으로 DAF 유전자의 접합 유무를 확인한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 7은 pCX-DAF-BSD 벡터에 Sca I 부위를 절단하여 선형화시킨 결과를 나타내는 전기영동사진이다.
도 8은 PCR 분석을 통하여 DAF 발현 벡터가 도입된 양성 세포를 선별한 결과를 나타낸 도면이다:
레인 1 : DAF-8 세포주;
레인 2 : DAF-13 세포주;
레인 3 : DAF-22 세포주;
레인 4 : DAF-92 세포주;
레인 5 : DAF-93 세포주; 및
레인 6 : DAF-96 세포주.
도 9는 PCR 분석을 통해 HLA-G 유전자 및 DAF 유전자의 도입을 확인한 결과이다.
도 10은 HLA-G/DAF 양성 클론 체세포에서 HLA-G 단백질 및 DAF 단백질의 발현을 확인하기 위한 FACS 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11은 HLA-G/DAF 양성 클론 체세포에서 HLA-G 단백질 및 DAF 단백질의 발현을 확인하기 위한 면역 조직 화학 염색법 분석을 나타내는 사진이다.
도 12의 a는 자연 살해 세포의 세포독성 분석 결과를 나타낸 그래프이고, 도 12의 b는 LDH 세포독성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 HLA-G 단백질 및 DAF 단백질을 발현하는 형질전환된 돼지 산자를 나타내는 사진이다.
도 14는 복제돼지 산자의 게놈 DNA에서 HLA-G 유전자 및 DAF를 확인하기 위한 PCR 분석 결과를 나타내는 DNA 전기영동 사진이다.
<110> MGenbio Inc.
PARK, KWANG-WOOK
<120> Transgenic pig expressing HLA-G to inhibit activity of NK cell
and the method of producing thereof
<130> 7p-10-46
<160> 6
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 1017
<212> DNA
<213> Homo sapiens HLA-G
<400> 1
atggtggtca tggcgccccg aaccctcttc ctgctgctct cgggggccct gaccctgacc 60
gagacctggg cgggctccca ctccatgagg tatttcagcg ccgccgtgtc ccggcccggc 120
cgcggggagc cccgcttcat cgccatgggc tacgtggacg acacgcagtt cgtgcggttc 180
gacagcgact cggcgtgtcc gaggatggag ccgcgggcgc cgtgggtgga gcaggagggg 240
ccggagtatt gggaagagga gacacggaac accaaggccc acgcacagac tgacagaatg 300
aacctgcaga ccctgcgcgg ctactacaac cagagcgagg ccagttctca caccctccag 360
tggatgattg gctgcgacct ggggtccgac ggacgcctcc tccgcgggta tgaacagtat 420
gcctacgatg gcaaggatta cctcgccctg aacgaggacc tgcgctcctg gaccgcagcg 480
gacactgcgg ctcagatctc caagcgcaag tgtgaggcgg ccaatgtggc tgaacaaagg 540
agagcctacc tggagggcac gtgcgtggag tggctccaca gatacctgga gaacgggaag 600
gagatgctgc agcgcgcgga cccccccaag acacacgtga cccaccaccc tgtctttgac 660
tatgaggcca ccctgaggtg ctgggccctg ggcttctacc ctgcggagat catactgacc 720
tggcagcggg atggggagga ccagacccag gacgtggagc tcgtggagac caggcctgca 780
ggggatggaa ccttccagaa gtgggcagct gtggtggtgc cttctggaga ggagcagaga 840
tacacgtgcc atgtgcagca tgaggggctg ccggagcccc tcatgctgag atggaagcag 900
tcttccctgc ccaccatccc catcatgggt atcgttgctg gcctggttgt ccttgcagct 960
gtagtcactg gagctgcggt cgctgctgtg ctgtggagaa agaagagctc agattga 1017
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-G forward primer
<400> 2
atggatccgg atggtggtca tggcgccc 28
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HLA-G reverse primer
<400> 3
actaagctta gcctgagagt agctccctcc tt 32
<210> 4
<211> 1146
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DAF gene sequence
<400> 4
atgaccgtcg cgcggccgag cgtgcccgcg gcgctgcccc tcctcgggga gctgccccgg 60
ctgctgctgc tggtgctgtt gtgcctgccg gccgtgtggg gtgactgtgg ccttccccca 120
gatgtaccta atgcccagcc agctttggaa ggccgtacaa gttttcccga ggatactgta 180
ataacgtaca aatgtgaaga aagctttgtg aaaattcctg gcgagaagga ctcagtgatc 240
tgccttaagg gcagtcaatg gtcagatatt gaagagttct gcaatcgtag ctgcgaggtg 300
ccaacaaggc taaattctgc atccctcaaa cagccttata tcactcagaa ttattttcca 360
gtcggtactg ttgtggaata tgagtgccgt ccaggttaca gaagagaacc ttctctatca 420
ccaaaactaa cttgccttca gaatttaaaa tggtccacag cagtcgaatt ttgtaaaaag 480
aaatcatgcc ctaatccggg agaaatacga aatggtcaga ttgatgtacc aggtggcata 540
ttatttggtg caaccatctc cttctcatgt aacacagggt acaaattatt tggctcgact 600
tctagttttt gtcttatttc aggcagctct gtccagtgga gtgacccgtt gccagagtgc 660
agagaaattt attgtccagc accaccacaa attgacaatg gaataattca aggggaacgt 720
gaccattatg gatatagaca gtctgtaacg tatgcatgta ataaaggatt caccatgatt 780
ggagagcact ctatttattg tactgtgaat aatgatgaag gagagtggag tggcccacca 840
cctgaatgca gaggaaaatc tctaacttcc aaggtcccac caacagttca gaaacctacc 900
acagtaaatg ttccaactac agaagtctca ccaacttctc agaaaaccac cacaaaaacc 960
accacaccaa atgctcaagc aacacggagt acacctgttt ccaggacaac caagcatttt 1020
catgaaacaa ccccaaataa aggaagtgga accacttcag gtactacccg tcttctatct 1080
gggcacacgt gtttcacgtt gacaggtttg cttgggacgc tagtaaccat gggcttgctg 1140
acttag 1146
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DAF sense primer
<400> 5
tagaattccg tagctgcgac tcggcggag 29
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DAF antisense primer
<400> 6
tagaattctt gacattccta acacatctt 29
Claims (7)
1) HLA-G 복제 돼지로부터 체세포를 분리하는 단계;
2) DAF 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조한 후 단계 1의 체세포에 도입시키는 단계; 및
3) 상기 발현벡터가 도입된 체세포를 선별하는 단계를 포함하는 인간 백혈구 항원-G(human leukocyte antigen-G, HLA-G) 유전자 및 붕괴 촉진 분자(decay-accelerating factor, DAF) 유전자를 발현하는 형질전환 돼지 클론 체세포주의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 단계 2)의 발현벡터는 도 5의 개열지도로 표시되는 벡터 pCX-EGFP-BSD를 클로닝 벡터로 사용하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제 1항의 방법에 의해 제조되는 인간 백혈구 항원-G(human leukocyte antigen-G, HLA-G) 유전자 및 붕괴 촉진 분자(decay-accelerating factor, DAF) 유전자를 발현하는 형질전환 돼지 클론 체세포주.
제 3항에 있어서, HLA-G 유전자의 발현벡터는 도 3의 개열지도로 표시되는 벡터 pcDNA 3.1을 클로닝 벡터로 사용하는 것을 특징으로 하는 형질전환 돼지 클론 체세포주.
제 3항에 있어서, 상기 돼지 클론 체세포주는 수탁번호 KCLRF-BP-00173으로 기탁된 것을 특징으로 하는 형질전환 돼지 클론 체세포주.
1) 제 3항의 형질전환 돼지 클론 체세포주를 배양하는 단계;
2) 모돈으로부터 채취한 난자의 핵을 제거하고 상기 클론 체세포와 융합시키는 단계; 및
3) 상기 융합된 복제란을 대리 모돈에 이식하고 자돈을 출산하는 단계를 포함하는 HLA-G 유전자 및 DAF 유전자를 발현하는 형질전환 복제 돼지의 제조 방법.
제 6항의 방법에 의해 제조되는 인간 백혈구 항원-G(human leukocyte antigen-G, HLA-G) 유전자 및 붕괴 촉진 분자(decay-accelerating factor, DAF) 유전자를 발현하는 형질전환 복제 돼지.
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019517803A (ja) * | 2016-06-14 | 2019-06-27 | リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ | 疾患を処置するための遺伝子改変された細胞、組織、および臓器 |
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2007
- 2007-12-24 KR KR1020070136343A patent/KR20090068646A/ko not_active Application Discontinuation
Cited By (2)
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| JP2019517803A (ja) * | 2016-06-14 | 2019-06-27 | リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ | 疾患を処置するための遺伝子改変された細胞、組織、および臓器 |
| JP2022031487A (ja) * | 2016-06-14 | 2022-02-18 | リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ | 疾患を処置するための遺伝子改変された細胞、組織、および臓器 |
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