KR101147409B1 - 세포성 면역 억제를 위한 인간 ＦａｓＬ 단백질을 발현하는 형질전환 돼지 클론 체세포주 및 이를 이용한 형질전환 복제돼지 - Google Patents
세포성 면역 억제를 위한 인간 ＦａｓＬ 단백질을 발현하는 형질전환 돼지 클론 체세포주 및 이를 이용한 형질전환 복제돼지 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인간 면역유전자인 인간 FasL(human Fas Ligand, hFasL) 유전자를 조직 및 세포에서 발현하는 형질전환 복제돼지 클론 체세포주 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 1) 돼지 태아로부터 체세포를 분리하는 단계; 2) hFasL 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조한 후 상기 분리한 체세포에 도입시키는 단계; 및 3) 상기 발현벡터가 도입된 체세포를 선별한 후 배양하는 단계를 포함하는 인간 FasL 단백질을 발현하는 형질전환 돼지 클론 체세포주의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 돼지 클론 체세포주에 관한 것이다. 본 발명의 돼지 클론 체세포주는 막 결합 형태(membrane-bound form)의 hFasL를 발현함으로써 CTL 및 자연살해 세포에 의한 세포독성을 감소시킴으로써, CTL 및 자연살해 세포에 의한 면역거부반응을 최소화함으로써, 이종장기이식 연구 및 이의 산업적 이용에 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 인간 면역유전자인 인간 FasL(human Fas Ligand, hFasL) 단백질을 발현하는 돼지 클론 체세포주 및 이를 이용하여 제조한 형질전환 복제돼지에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 hFasL 유전자를 형질전환 기법으로 돼지의 체세포에 주입하여 hFasL 단백질을 발현함으로써 이종 간 세포 및 조직이식에서 발생할 수 있는 CTL 및 자연살해 세포의 거부반응을 감소시킨 돼지 클론 체세포주, 및 상기 돼지 클론 체세포주를 체세포 복제방법으로 제조한 세포내 인간 FasL 단백질을 발현하는 형질전환 복제돼지에 관한 것이다.
최근 알파-1,3-갈락토실전이효소 유전자 녹아웃(α-1,3-galactosyltransferase gene-knockout) 돼지의 생산은 자연항체 유래의 초급성 거부반응을 해결할 수 있는 좋은 계기를 마련해 주었다. 그러나, 인간의 CD8+ T 림프구(CTL) 및 자연살해 세포에 의한 거부반응이 이종장기이식에 의해서 이식된 장기 및 세포의 생존을 저해하는 주요한 면역학적 장벽으로 대두되고 있다. 실제 치료를 목적으로 하는 장기이식에서 이식 장기의 내피세포(Endothelial cells, EC)에 존재하는 비-자기 클래스 Ⅰ 분자(non-self classⅠ molecules)(HLA -A,-B,-C)가 CD8+ T 림프구(CTL)에 의해 직접적으로 감지되는 것이 급성 거부반응의 주요한 요인으로 여겨진다. 또한, 이미 많은 연구에서 밝혀졌듯이 인간의 CD8+ T 림프구(CTL)는 돼지의 내피세포(EC)의 classⅠ MHC(SLA-Ⅰ)을 직접적으로 인식하기 때문에 CTL은 돼지와 인간사이의 이종장기이식에서 주요한 문제가 되고 있다.
자연살해 세포는 인간의 MHC의 부재로 인해 돼지 세포를 비-자기(non-self)로 인지하여 거부반응을 일으키며, ADCC에 의해서도 돼지세포를 공격한다. 자연살해 세포는 내재 면역(innate immunity) 및 적응면역(adaptive immunity)에서 중요한 역할을 한다. 특히 가장 우선적인 역할은 선택적으로 종양세포, 몸속에 침입한 박테리아, 바이러스 등의 감염에 의해 주요 조직적합성 복합체 제 1항원(Major Histocompatibility Complex, MHC class I)의 기능이 감소된 체내의 세포를 공격하는 것이다. 또한, 자연살해 세포는 골수를 이식할 때 거부반응을 일으키기도 한다. 자연살해 세포의 활성과 불활성은 특이적인 억제 수용체(specific inhibitory receptor) 또는 활성 수용체(activating receptor)가 표적 세포의 리간드와 결합함으로써 이루어진다. 즉, 자연살해 세포의 세포독성은 MIC, ULBP 등의 활성 신호(activating signal)와 MHC class I 및 비(non) MHC class I의 억제 신호(inhibitory signal)에 의해서 조절된다. CTL 및 자연살해 세포가 표적세포(target cell)을 용해시킬 때 두 가지 중요한 용해기작이 존재한다. 즉, 표적세포에 발현하는 Fas 수용체(CD95)와 Fas 리간드(FasL, CD178)의 상호작용에 의한 접촉 의존적 경로(contact-dependent pathway)와 수용성의 퍼포린(perforin)과 그랜자임 B(granzyme B)의 방출과 관련된 과립 방출 경로(granule exocytosis pathway)가 있다. 일반적으로 접촉 의존적 경로(contact-dependent pathway)는 Fas 리간드가 Fas 수용체에 결합하여 수용체에 존재하는 죽음 도메인(death domain)을 통한 신호전달(signal transduction)을 거쳐 표적세포에 세포사멸을 유도하는 것이다. 그리고 과립 방출 경로는 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)가 표적세포와 결합하여 활성화 되면 표적세포 내의 퍼포린과 그랜자임이 방출되고, 이때 퍼포린이 표적세포의 표면에 구멍을 형성하면 이곳을 통하여 그랜자임이 들어가 세포사멸을 일으키는 것을 말한다.
CTL 및 자연살해 세포에 의한 대표적인 표적세포 용해 작용은 Fas와 FasL의 상호작용에 의한 세포사멸 경로(apoptotic pathway)에 의하여 이루어진다. 대부분의 CTL 및 자연살해 세포는 내부적으로 FasL를 발현하고 표적세포에 결합한 후 세포표면으로 FasL를 전위시킨다. Fas의 세포질 부위(cytoplasmic region)에는 죽음 도메인(death domain)이 존재하며, 리간드와 반응하여 Fas 관련 죽음 도메인(Fas-associated death domain, FADD)이라고 하는 어댑터 단백질(adaptor protein)의 결합부위를 형성한다. FADD는 죽음 효과기 도메인(death effector domain)을 통하여 프로 캐스파제 8(pro-caspase 8)과 결합한다. 프로 캐스파제 8은 자가 촉매 활성(autocatalytic activation)을 거쳐 캐스파제 8(FLICE)로 되며, 이것은 효과기 캐스파제 3, 6, 7을 분할하고 활성화한다. 이렇게 활성화된 효과기 캐스파제들은 다양한 세포내 단백질 기질을 분할함으로써 세포사멸성 세포 죽음을 일으킨다. 또한, 활성화된 캐스파제 8은 소위 Bid라는 작은 세포질 단백질(small cytosolic protein)을 분할하여 Bid가 미토콘드리아에 결합한 후 세포질로 사이토크롬(cytohrome) c를 방출하도록 한다. 방출된 사이토크롬 c는 ATP존재 하에서 세포사멸 활성 인자 1(apoptosis activating factor 1, Apaf-1)과 결합체를 형성한 후 프로 캐스파제 9과 결합하여 자가 촉매 활성을 증진시킨다. 캐스파제 9는 캐스파제 8과 마찬가지로 효과기 캐스파제들을 분할하고 활성화시킴으로써 세포사멸 세포 죽음을 유도하는 것이다.
인간의 FasL는 체내에서 두 가지 형태로 존재하게 된다. 즉, 막 결합 형태(membrane-bound form) 및 수용성 형태(soluble form)로 존재하며, 수용성 형태는 막 결합 형태가 메탈로프로테아제(metalloproteinase)라는 효소에 의하여 아미노산 서열중 129번째 라이신(lysine) 부분이 잘리게 되어 생성된다. 이러한 수용성 형태는 정상적인 면역반응을 저해하는 요소로 알려지고 있다.
돼지는 인간과 해부학적 그리고 생리학적으로 유사하기 때문에 생명공학연구분야에서 매우 유용한 종으로 여겨지고 있다. 특히, 미니돼지는 작은 체구와 잘 정립된 유전학적 배경 등으로 인해 광범위하게 이용되고 있다. 최근 돼지를 이용하여 활발한 연구를 진행 중 인 분야는 바이오 이종장기이식 분야이다. 최근 체세포 복제방법을 통해서 많은 형질전환 복제 돼지가 생산되고 있다. 미니돼지는 체구가 인간과 비슷하기 때문에 이종장기 이식을 위한 형질전환복제돼지 생산을 위한 체세포복제에서 공여세포로 활용되고 있다. 하지만 그 효율은 매우 낮은 실정이다. 따라서 공여세포와 난자 사이 종의 차이가 미니돼지의 복제에 영향을 줄 것으로 생각되었다. 그 이유는 미니돼지와 일반식용돼지에서 자궁의 크기 및 생시체중에서 큰 차이를 보이기 때문이다. 그러므로 복제란의 대리모로 사용하기 위한 정확한 종을 선택하는 것이 형질전환복제미니돼지 생산에 매우 중요한 요인이 될 수 있다.
이에, 본 발명자들은 CTL 및 자연살해 세포에 의한 표적세포 용해기작을 역으로 이용하여 돼지의 조직 및 세포에서 인간 FasL를 발현시킨다면 CTL 및 자연살해 세포에 존재하는 Fas 수용체와 결합하고 신호 전달(signal transduction)을 통하여 CTL 및 자연살해 세포의 세포사멸(apoptosis)를 유도하면 CTL 및 자연살해 세포에 의한 거부반응을 감소시킬 수 있을 것으로 판단하여, 인간 FasL 유전자를 형질전환 기법으로 돼지의 체세포에 주입하여 인간 FasL 단백질을 발현하는 형질전환 복제돼지 클론 체세포주 및 이를 이용한 형질전환 복제미니돼지를 제조하였고, 상기 형질전환 복제돼지 유래 체세포가 발현한 인간 FasL 단백질이 CTL 및 자연살해 세포의 세포독성을 감소시키는 것을 확인함으로써, 췌도 세포, 각막(cornea) 등의 이종 간 세포 및 조직이식에서 발생할 수 있는 CTL 및 자연살해 세포의 거부반응을 감소시킬 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 인간 FasL(human Fas Ligand, hFasL) 단백질을 발현하는 돼지 클론 체세포주 및 이의 제조 방법, 및 인간 FasL 유전자를 발현하는 형질전환 복제돼지 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 FasL(human Fas Ligand, hFasL) 유전자 발현 카세트를 포함하는 형질전환 돼지 클론 체세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 돼지 태아로부터 체세포를 분리하는 단계;
2) 인간 FasL 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조한 후 상기 체세포에 도입시키는 단계; 및
3) 상기 발현벡터가 도입된 체세포를 선별한 후 배양하는 단계를 포함하는 인간 FasL 단백질을 발현하는 형질전환 돼지 클론 체세포주의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 인간 FasL 유전자를 세포 및 조직에서 발현하는 형질전환 복제돼지를 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 돼지 태아로부터 체세포를 분리하는 단계;
2) hFasL 유전자 발현벡터를 제조한 후, 단계 1)의 체세포에 도입시키는 단계;
3) 발현벡터가 도입된 체세포를 선별한 후 배양하여 클론 체세포를 제조하는 단계;
4) 모돈으로부터 채취한 난자의 핵을 제거하고, 단계 3)의 클론 체세포와 융합시키는 단계; 및
5) 융합된 복제란을 대리 모돈에 이식하고 자돈을 출산하는 단계를 포함하는, hFasL 유전자를 발현하는 형질전환 복제돼지의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 인간 FasL 단백질을 발현하는 형질전환 복제돼지 유래 체세포주는 인간 FasL 단백질을 발현하여 CTL 및 자연살해 세포에 의한 세포독성을 감소시켜, 상기 형질전환 복제돼지를 이용한 이종간 세포 및 조직 이식에서 발생할 수 있는 인간의 면역세포에 의한 면역거부반응을 감소시킬 수 있다.
도 1은 야생형 인간 FasL 유전자 컨스트럭트(FasL), 상기 FasL 유전자의 세포질 부위(cytoplasm region)를 제거한 유전자 컨스트럭트(CytoFasL), 및 상기 CytoFasL 유전자에서 메탈로프로테나제의 활성 부위를 제거한 유전자 컨스트럭트(mFasL)의 개요도를 나타내는 그림이다:
CYT: 세포질 부위(cytoplasm region);
TM: 막통과 부위(transmembrane region);
EXT: 세포외 부위(extracellular region); 및
EKQI: 인간 FasL의 절단 부위(cleavage site).
도 2는 인간 FasL 유전자 컨스트럭트에서, 세포질 부위를 제거하기 위한 재조합 PCR을 위한 프라이머 결합 부위를 나타내는 그림이다:
① T7 프로모터 프라이머;
② Fas-DA1 프라이머;
③ Fas-DS1 프라이머; 및
④ Fas-R2 프라이머.
도 3은 인간 FasL 유전자 컨스트럭트에서, 메탈로프로테나제의 활성 부위를 제거하기 위한 재조합 PCR을 위한 프라이머 결합 부위를 나타내는 그림이다:
① T7 프로모터 프라이머;
② Fas-DA4 프라이머;
③ Fas-DS4 프라이머; 및
④ Fas-R2 프라이머.
도 4는 인간 FasL 유전자를 pcDNATM3.1/myc-His(-) B 벡터에 삽입한 형질전환 벡터(transgenic vector)의 구조를 나타내는 그림이다.
도 5는 야생형 인간 FasL 유전자, 상기 FasL 유전자의 세포질 부위를 제거한 cytoFasL 유전자, 및 상기 cytoFasL 유전자의 메탈로프로테나제의 활성 부위를 제거한 mFasL 유전자의 염기서열을 나타내는 그림이다.
도 6은 야생형 인간 FasL, cytoFasL 및 mFasL 단백질의 아미노산 서열을 나타내는 그림이다.
도 7은 하이그로마이신(Hygromycin)을 이용하여 14일간 선별한 형질전환 세포들에서 인간 FasL 유전자 삽입 여부 확인을 위해, PCR 분석한 결과를 나타내는 그림이다.
도 8은 형질전환 세포들에서 FasL(W1-1) 또는 mFasL(F3-140 또는 F4-41)의 발현 정도를 보기 위해, FACS 분석한 결과를 나타내는 그림이다.
도 9는 형질전환 세포들에서 FasL(W1-1) 또는 mFasL(F3-140 또는 F4-41)의 발현 정도를 보기 위해, 면역조직화학법을 이용하여 세포 표면에 FasL 발현을 분석한 결과를 나타내는 그림이다.
도 10은 mFasL 발현 세포(F4-41)에서 염색체상에 형질전환 유전자가 삽입되었는지 확인하기 위해, 로다민 표지된 프로브를 이용한 FISH 분석한 형광 사진(A) 및 염색체의 핵형(karyotype)(B)을 나타내는 그림이다.
도 11은 생산된 복제미니돼지에 형질전환 유전자가 삽입되었는지 확인하기 위해, 게놈 DNA를 분리하여 mFasL에 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 PCR 분석한 결과를 나타내는 그림이다.
도 12는 생산된 형질전환 복제미니돼지(A), 및 상기 형질전환 복제미니돼지 유래 체세포로부터 mFasL 유전자를 확인하기 위해 FISH 분석한 결과(B)를 나타내는 그림이다.
도 13은 생산된 형질전환 복제미니돼지 유래 귀세포를 이용하여 마우스 항-인간 FasL로 염색하여 FACS 분석한 결과를 나타내는 그림이다.
도 14는 생산된 형질전환 복제미니돼지 유래 귀세포에서 인간 CD8+ CTL를 이용한 CTL 분석을 수행한 결과를 나타내는 그림이다.
도 15는 생산된 형질전환 복제미니돼지 유래 귀세포에서 인간 NK 세포를 이용한 NK 세포독성 분석을 수행한 결과를 나타내는 그림이다.
CYT: 세포질 부위(cytoplasm region);
TM: 막통과 부위(transmembrane region);
EXT: 세포외 부위(extracellular region); 및
EKQI: 인간 FasL의 절단 부위(cleavage site).
도 2는 인간 FasL 유전자 컨스트럭트에서, 세포질 부위를 제거하기 위한 재조합 PCR을 위한 프라이머 결합 부위를 나타내는 그림이다:
① T7 프로모터 프라이머;
② Fas-DA1 프라이머;
③ Fas-DS1 프라이머; 및
④ Fas-R2 프라이머.
도 3은 인간 FasL 유전자 컨스트럭트에서, 메탈로프로테나제의 활성 부위를 제거하기 위한 재조합 PCR을 위한 프라이머 결합 부위를 나타내는 그림이다:
① T7 프로모터 프라이머;
② Fas-DA4 프라이머;
③ Fas-DS4 프라이머; 및
④ Fas-R2 프라이머.
도 4는 인간 FasL 유전자를 pcDNATM3.1/myc-His(-) B 벡터에 삽입한 형질전환 벡터(transgenic vector)의 구조를 나타내는 그림이다.
도 5는 야생형 인간 FasL 유전자, 상기 FasL 유전자의 세포질 부위를 제거한 cytoFasL 유전자, 및 상기 cytoFasL 유전자의 메탈로프로테나제의 활성 부위를 제거한 mFasL 유전자의 염기서열을 나타내는 그림이다.
도 6은 야생형 인간 FasL, cytoFasL 및 mFasL 단백질의 아미노산 서열을 나타내는 그림이다.
도 7은 하이그로마이신(Hygromycin)을 이용하여 14일간 선별한 형질전환 세포들에서 인간 FasL 유전자 삽입 여부 확인을 위해, PCR 분석한 결과를 나타내는 그림이다.
도 8은 형질전환 세포들에서 FasL(W1-1) 또는 mFasL(F3-140 또는 F4-41)의 발현 정도를 보기 위해, FACS 분석한 결과를 나타내는 그림이다.
도 9는 형질전환 세포들에서 FasL(W1-1) 또는 mFasL(F3-140 또는 F4-41)의 발현 정도를 보기 위해, 면역조직화학법을 이용하여 세포 표면에 FasL 발현을 분석한 결과를 나타내는 그림이다.
도 10은 mFasL 발현 세포(F4-41)에서 염색체상에 형질전환 유전자가 삽입되었는지 확인하기 위해, 로다민 표지된 프로브를 이용한 FISH 분석한 형광 사진(A) 및 염색체의 핵형(karyotype)(B)을 나타내는 그림이다.
도 11은 생산된 복제미니돼지에 형질전환 유전자가 삽입되었는지 확인하기 위해, 게놈 DNA를 분리하여 mFasL에 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 PCR 분석한 결과를 나타내는 그림이다.
도 12는 생산된 형질전환 복제미니돼지(A), 및 상기 형질전환 복제미니돼지 유래 체세포로부터 mFasL 유전자를 확인하기 위해 FISH 분석한 결과(B)를 나타내는 그림이다.
도 13은 생산된 형질전환 복제미니돼지 유래 귀세포를 이용하여 마우스 항-인간 FasL로 염색하여 FACS 분석한 결과를 나타내는 그림이다.
도 14는 생산된 형질전환 복제미니돼지 유래 귀세포에서 인간 CD8+ CTL를 이용한 CTL 분석을 수행한 결과를 나타내는 그림이다.
도 15는 생산된 형질전환 복제미니돼지 유래 귀세포에서 인간 NK 세포를 이용한 NK 세포독성 분석을 수행한 결과를 나타내는 그림이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 인간 FasL(human Fas Ligand, hFasL) 유전자 발현 카세트를 포함하는 형질전환 돼지 클론 체세포주를 제공한다.
클론 체세포주는 유전체에 주입된 발현 벡터의 위치가 동일하다는 특징이 있다. 발현 벡터가 도입된 클론 체세포주를 만들지 않으면 유전자는 도입되어 있지만 유전자의 삽입부위가 각각의 체세포마다 다르게 된다. 유전자가 염색체의 어느 부위에 삽입되었는지 여부에 따라서 세포마다 단백질 발현 양상이 조금씩 다를 수 있기 때문에, 이러한 세포를 이용하여 돼지를 생산하게 되면 단백질의 발현양상이 개체에 따라 조금씩 다르게 나타나게 된다. 본 발명에서는 상기와 같은 방법의 문제점을 해결하여 클론 체세포주를 제조하였다. 이러한 기술은 체세포복제를 이용한 형질전환 동물의 생산효율을 증대시킬 것으로 기대된다. 즉, 유용단백질 유전자를 체세포의 게놈에 삽입시킨 후 유전자가 삽입된 부위에 따라 몇 종류의 서로 다른 클론 세포주를 만들 수 있을 것이다. 유전자가 게놈의 어느 부위에 삽입되는가에 따라 그 발현율에 차이를 보일 수 있기 때문에 상기 세포주를 이용하여 복제동물을 생산한 후 단백질의 발현 양상을 검사하여 발현율이 좋은 개체를 선별할 수 있다.
상기 인간 FasL 유전자는 인간 FasL 전장 염기서열에서 세포질 부위(cytoplasm region) 및 메탈로프로테나제(metalloproteinase)의 활성 부위(active site)를 제거한 염기서열을 갖는 것이 바람직하며, 서열번호 12로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
이종장기이식에서 발생하는 세포성거부반응에 주로 작용하는 면역세포는 자연살해 세포와 CD8+ T 림프구(CTL) 등이 있다. 특히 CD8+ CTL의 돼지세포에 대한 세포독성은 매우 강력하게 나타나며 이러한 세포독성은 Fas/FasL의 반응에 의한 세포사멸(apoptosis)로 나타난다.
본 발명자들은 이러한 CTL 및 자연살해 세포에 의한 이종간 세포독성반응을 억제하기 위하여, 체내에서 메탈로프로테나제에 의해 수용성(soluble) 형태로 되는 것을 막기 위하여 막-결합 형태(membrane-bound form)의 인간 FasL(mFasL)를 제작하였다. 제작된 mFasL 유전자를 미니돼지의 태아섬유아세포(fetal fibroblasts)에 형질전환하여 형질전환세포주를 확립하였다. 상기 형질전환 돼지 클론 체세포주는 한국세포주연구재단의 지원을 받는 한국세포주은행(KCLB)에 수탁번호 KCLRF-BP-00194로 기탁하였다(2008. 11. 5).
본 발명자들은 돼지의 체세포에 인간 FasL 유전자를 최초로 형질전환하였다. 돼지의 조직 및 세포에서 인간 FasL를 발현시켜 CTL 및 자연살해 세포의 세포독성을 감소시키는 것을 확인함으로써, CTL 및 자연살해 세포에 의한 면역반응을 최소화할 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 본 발명은
1) 돼지 태아로부터 체세포를 분리하는 단계;
2) hFasL 유전자 발현벡터를 제조한 후, 단계 1)의 체세포에 도입시키는 단계; 및
3) 발현벡터가 도입된 체세포를 선별한 후 배양하는 단계를 포함하는, hFasL 단백질을 발현하는 형질전환 돼지 클론 체세포주의 제조 방법을 제공한다.
상기 제조 방법에 있어서, 단계 1)의 돼지는 미니돼지 또는 일반식용돼지인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 돼지 태아는 임신 20 내지 50일령의 태아를 사용하는 것이 바람직하며, 30 내지 40일령의 태아를 사용하는 것이 더욱 바람직하며, 35일령의 태아를 사용하는 것이 가장 바람직하다. 체세포를 분리하기 위한 방법으로는 종래에 사용되는 일반적인 방법이 본 발명에 동일하게 적용될 수 있으며, 바람직하게는 면도날을 이용하여 돼지 태아를 잘게 자른 후 트립신을 처리하여 계대 배양함으로써 체세포를 분리할 수 있다.
상기 제조 방법에 있어서, 단계 2)의 hFasL 유전자는 세포질 부위 및 메탈로프로테나제의 활성 부위를 제거한 막-결합 형태의 FasL(mFasL) 유전자인 것이 바람직하며, 서열번호 12로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 mFasL 유전자를 포함하는 발현벡터는 돼지 세포에서 발현시킬 수 있는 공지된 모든 발현벡터를 사용할 수 있으며, pcDNA3.1 myc/his(-B) 벡터를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 제조 방법에 있어서, 단계 3)의 발현벡터가 도입된 체세포는 선별 마커가 도입된 발현벡터를 사용함으로써 용이하게 선별할 수 있다. 선별 마커로는 항생제 내성 유전자가 사용될 수 있다. 상기 항생제 내성유전자에는 neor, pacr, bsrr, hphr 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명자들은 돼지의 태아섬유아세포(fetal fibroblasts)에 인간 FasL를 형질전환방법을 통하여 인간 FasL를 발현하는 형질전환 체세포주를 제조함으로써, 인간 FasL에 의해 CTL 및 자연살해 세포에 의한 세포독성을 감소시켜 이종 간 이식된 돼지의 장기 또는 세포가 인간의 면역반응으로부터 보호할 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 본 발명은 인간 FasL 단백질을 발현하는 형질전환 돼지 클론 체세포주로부터 체세포 복제방법을 이용하여 제조한, 형질전환 복제돼지를 제공한다.
상기 형질전환 복제돼지는 막-결합 형태의 인간 FasL 단백질(mFasL)을 발현하는 형질전환 돼지 클론 체세포주로부터 체세포 복제방법을 이용하여 제조한, 세포 및 조직에서 mFasL 단백질을 발현하는 형질전환 복제돼지를 제공한다.
상기 형질전환 복제돼지 제조방법은 종래에 사용되는 일반적인 체세포 복제 방법이 본 발명에 동일하게 적용될 수 있으며, 상기 체세포 복제 방법은 바람직하게는 난자의 채취 및 미세 조작하는 단계; 미세조작된 난자와 핵이식란을 이용하여 세포융합 및 활성화시키는 단계; 융합된 복제란을 배양하는 단계; 및 배양된 복제란을 대리모에게 이식하는 단계를 포함하는 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명자들은 형질전환 공여세포와 형질전환 복제돼지의 귀세포를 이용하여 세포독성실험을 실시한 결과, 일반 미니돼지의 세포와 비교할 때 형질전환 공여세포 및 형질전환 복제돼지의 귀세포에서 CD8+ CTL과 자연살해 세포에 의한 세포독성이 정상세포에 비해 현저하게 낮게 나타남을 확인하였다. 즉, 형질전환 복제돼지 클론 체세포가 발현한 인간 FasL 단백질이 CTL 및 자연살해 세포의 세포독성을 감소시켜 이종 간 세포 및 조직이식에서 발생할 수 있는 CTL 및 자연살해 세포 등의 인간 면역세포에 의한 면역거부반응을 해소할 수 있음을 알 수 있다.
따라서, 막-결합 형태의 인간 FasL 유전자를 세포 및 조직에서 발현하는 형질전환복제돼지의 장기를 이종장기이식에 사용한다면 이식장기의 생존율을 크게 향상시킬 수 있음을 알 수 있다.
아울러, 본 발명은
1) 돼지 태아로부터 체세포를 분리하는 단계;
2) hFasL 유전자 발현벡터를 제조한 후, 단계 1)의 체세포에 도입시키는 단계;
3) 발현벡터가 도입된 체세포를 선별한 후 배양하여 클론 체세포를 제조하는 단계;
4) 모돈으로부터 채취한 난자의 핵을 제거하고, 단계 3)의 클론 체세포와 융합시키는 단계; 및
5) 융합된 복제란을 대리 모돈에 이식하고 자돈을 출산하는 단계를 포함하는, hFasL 유전자를 발현하는 형질전환 복제돼지의 제조 방법을 제공한다.
상기 제조 방법에 있어서, 단계 1)의 돼지는 미니돼지 또는 일반식용돼지인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 돼지 태아는 임신 20 내지 50일령의 태아를 사용하는 것이 바람직하며, 30 내지 40일령의 태아를 사용하는 것이 더욱 바람직하며, 35일령의 태아를 사용하는 것이 가장 바람직하다. 체세포를 분리하기 위한 방법으로는 종래에 사용되는 일반적인 방법이 본 발명에 동일하게 적용될 수 있으며, 바람직하게는 면도날을 이용하여 돼지 태아를 잘게 자른 후 트립신을 처리하여 계대 배양함으로써 체세포를 분리할 수 있다.
상기 제조 방법에 있어서, 단계 2)의 hFasL 유전자는 세포질 부위 및 메탈로프로테나제의 활성 부위를 제거한 막-결합 형태의 FasL(mFasL) 유전자인 것이 바람직하며, 서열번호 12로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 mFasL 유전자를 포함하는 발현벡터는 돼지 세포에서 발현시킬 수 있는 공지된 모든 발현벡터를 사용할 수 있으며, pcDNA3.1 myc/his(-B) 벡터를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 제조 방법에 있어서, 단계 3)의 클론 체세포는 hFasL 단백질을 발현하는 체세포인 것이 바람직하며, 수탁번호: KCLRF-BP-00194로 기재되는 클론 체세포인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 미니돼지 체세포의 준비
임신 35일령 미니돼지 태아를 면도날로 잘게 자른 후 세포를 트립신(trysin)-EDTA(Gibco. Inc)가 첨가된 DMEM(bio-whittaka. Inc)에서 5분간 배양하였다. 상층액을 원심분리(1000 rpm, 5분)한 후 10% FBS가 포함된 DMEM에서 배양하고 세포가 90% 포화상태(confluency)에 이르면 트립신을 처리하여 계대 배양하였으며, 일부는 핵이식에 이용하고 나머지는 동결보존 하였다.
<실시예 2> 인간 FasL(Fas ligand) 유전자 발현 벡터 제작
FasL 유전자를 이용하여 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte, CTL) 및 자연살해 세포의 반응을 억제하는 작용을 유도하기 위해서, FasL 유전자의 세포질 부위(cytoplasm region)를 제거하였다. 또한, 메탈로프로테나제(metalloproteinase)에 의하여 단백질 분해(proteolysis)가 일어나 막(membrane)에서 분리되어 가용성 형태(soluble type)가 되므로, 이런 현상을 억제하기 위해서, 메탈로프로테나제의 활성 부위(active site)를 제거하였다(도 1).
<2-1> 야생형 FasL 유전자 클로닝 및 벡터의 제작
100 ㎜ dish에서 TRIZOL(Gibco, 15596-018)을 이용하여 인간 JEG-3 세포주로부터 전체 RNA를 추출하였고, Cloned AMV Reverse Transcriptase(Cat. No.: 12328-019, Invitrogen) Kit를 이용하여 cDNA를 제조하였다. 인간 FasL 유전자 클로닝을 위한 주형(template) DNA는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 FasL 전장 서열(Genebank accession number: NM_000639)을 이용하였다. FasL cDNA를 클로닝하기 위해, FAS-F1(CCT CTA CAG GAC TGA GAA GAA G; 서열번호: 2)와 FAS-R1(CAA CAT TCT CGG TGC CTG TAA C; 서열번호: 3)의 프라이머를 이용하였다. 이때, PCR 조건은 94℃에서 5분 동안 예비변성시킨 후, 94℃에서 1분, 56℃에서 1분, 72℃에서 1분 동안 35회 반복 수행하고, 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시킨 후, 4℃에서 방치시켰다. PCR 산물을 아가로오즈 젤에서 추출하여 T 벡터(Promega, USA)에 클로닝 및 서열분석(sequencing)을 통하여 FasL cDNA 유전자를 분석한 결과, 846 bp의 정상 FasL cDNA를 확인하였고(도 5), 281개의 아미노산을 가지는 것을 확인하였다(도 6).
<2-2> 세포질 부위를 제거한 돌연변이형 FasL(cytoFasL) 유전자 클로닝 및 벡터의 제작
T7 프로모터(promoter)(TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG; 서열번호: 4)와 Fas-DA1(TTC CCT CTC TTC TTC AGG GGG TAA TTG AAG GGC TGC TGC A; 서열번호: 5), 그리고 Fas-DS1(TGC AGC AGC CCT TCA ATT ACC CCC TGA AGA AGA GAG GGA A; 서열번호: 6)와 FAS-R2(TTA GAG CTT ATA TAA GCC GAA AA; 서열번호: 7) 프라이머를 이용하여 각각 PCR을 실시(도 2)한 후, PCR 산물을 겔 용리(gel elution)하여 1 : 1로 혼합하였다. 그런 다음, 이것을 T7 프로모터와 FAS-R2 프라이머를 이용하여 다시 재조합(Recombinant) PCR을 실시하여 PCR 산물을 T 벡터에 클로닝한 후 서열분석을 실시한 결과, 4개의 클론(clone)에서 정상적으로 세포질 부위가 제거된 660 bp 크기의 cyto FasL cDNA를 확인하였고(도 5), 219개의 아미노산을 가지는 것을 확인하였다(도 6).
<2-3> 메탈로프로테나제의 활성 부위를 제거한 돌연변이형 FasL(mFasL)유전자 클로닝 및 벡터의 제작
T7 프로모터와 Fas-DA4(TTT TCA GGG GGT GGA CTG GGC TCC TTC TGT AGG TGG AAG; 서열번호: 8), 그리고 Fas-DS4(CTT CCA CCT ACA GAA GGA GCC CAG TCC ACC CCC TGA AAA; 서열번호: 9)와 FAS-R2 프라이머를 이용하여 각각 PCR을 실시(도 3)한 후, PCR 산물을 겔 용리(gel elution)하여 1 : 1로 혼합하였다. 그런 다음, 이것을 T7 프로모터와 FAS-R2 프라이머를 이용하여 다시 재조합(Recombinant) PCR을 실시하여 PCR 산물을 T 벡터에 클로닝한 후 서열분석을 실시한 결과, 세포질 부위 및 메탈로 프로티나아제 활성부위가 제거된 594 bp 크기의 막 결합 형태(membrane-bound form)의 mFasL cDNA를 확인하였고(도 5), 197개의 아미노산을 가지는 것을 확인하였다(도 6).
<2-4> 돌연변이형 FasL를 이용한 발현 벡터의 제작
효율적인 인간 FasL 유전자의 발현 및 항생제 선별을 위하여, pcDNATM3.1/myc-His(-) B(Cat No. V855-20, Invitrogen)을 이용하여 유전자 이식 베터(transgenic vector)를 구성하였다(도 4).
<실시예 3> 인간 FasL 발현 클론 세포주 제작 및 단백질 발현 확인
<3-1> 인간 FasL 발현 클론 세포주의 제작
인간 FasL 발현을 위해 제작된 클로닝된 pcDNA3.1 myc/his(-B)-normal FasL 또는 pcDNA3.1 myc/his(-B)-mFasL 벡터를 각각 ScaI으로 잘라 선형화하였다. 이렇게 준비된 DNA를 돼지 체세포 내에 주입하기 위하여 형질전환 시약(LipofectamineTM 2000, Invitrogen)을 사용하였다. 트랜스펙션을 실시한 후 하이그로마이신(Hygromycin)(200 ㎍/mL)을 이용하여 14일간 선별(selection)을 실시하였다.
<3-2> PCR 분석에 의한 유전자 삽입 확인
선별된 체세포 중 일부는 게놈 DNA를 분리하여 FasL 유전자의 유무를 확인하였다. 상기 체세포에 프로테이나제(Proteinase) K(Gibco. Inc)를 처리하여 단백질을 분해시킨 후 페놀로 단백질을 변성시켜 게놈 DNA를 분리하였다. 이때 프라이머는 정방향 프라이머(5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3'; 서열번호: 10)와 역방향 프라이머 (5'-CCT CGG CCT CTG CAT AAA TA-3'; 서열번호: 11)을 사용하였으며, PCR 조건은 94℃, 5 분과 94℃, 1 분, 56℃ 1 분, 72℃ 1 분 35 회, 및 72℃ 10 분, 4℃이었다.
그 결과, 도 7에서 보는 바와 같이, 상기 PCR 방법을 아가로스 젤 전기영동으로 FasL 유전자 밴드를 확인함으로써 FasL 유전자가 존재함을 나타내었다(도 7).
<3-3> FACS 및 면역조직화학법을 통한 단백질 발현 확인
형질전환시킨 세포의 표면에 FasL를 발현하는지 확인하기 위하여, 형광 활성세포 선별법(fluorescence-activated cellsorting, FACS) 및 면역조직화학법(Immunocytochemistry)을 수행하였다. 구체적으로, 선별된 세포를 PE-anti-human FasL(4H9, Pharmingen)로 염색하여 FACS를 실시하였다. 또한, 선별된 세포를 약 1×105의 수로 커버슬립(coverslip)에 올리고 3.7%(w/v) 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정하였다. 세포를 1차 항체(primary antibody)와 함께 밤새(overnight) 배양하고 2차 항체(secondary antibody)와 함께 1시간 30분 배양 한 후 공초점 현미경(confocal microscope)에서 관찰하였다.
그 결과, 도 8 및 도 9에서 보는 바와 같이, mFasL가 형질전환된 2개(F4-41, F3-140), 그리고 야생형의 FasL가 형질전환된 W1-1을 포함한 3가지 세포주에서 단백질 발현을 확인하였다(도 8 및 도 9).
<3-4> 공여세포의 선발
FACS와 면역조직화학법에 의하여 단백질 발현이 확인된 세포주를 이용하여 형광직접염색법(FISH)를 실시하였다.
그 결과, 도 10에서 보는 바와 같이, mFasL 유전자가 형질전환된 F4-41 세포주에서 염색체상에 형질전환 유전자가 삽입됨을 확인하였다. 그 위치는 염색체 3p17에 위치함을 확인하였다(도 10). 나머지 2종류의 세포주는 정상 세포와 혼합된 형태로 확인되어 공여세포로 사용하지 않았다. 선별된 공여세포(F4-41)를 이하 핵이식란 제조 및 이식에 이용하였다.
<실시예 4> 체세포 복제 방법을 이용한 mFasL 형질전환 복제돼지 생산
<4-1> 배양액의 준비
성숙 배양액은 TCM199(31100035; Gibco, Grand Island, NY)에 0.1% 폴리비닐알콜(polyvinylalcohol), 3.05 mM D-글루코스, 0.91 mM 소듐 피루베이트(sodium pyruvate), 0.57 mM 시스테인(cysteine), 0.5 g/ml LH(Sigma Chemical Co, St. Louis, MO), 0.5 g/ml FSH(Sigma), 10 ng/ml 내피 성장 인자(epidermal growth factor, Sigma), 75 g/ml 페니실린 G, 및 50 g/ml 스트렙토마이신을 첨가했다.
미세 조작용 배양액은 TCM199에 0.3% BSA와 7.5 g/ml 사이토칼라신(cytochalasin B, CB)를 첨가하였다. 활성화 배양액은 0.3 M 만니톨에 1.0 mM CaCl2H2O, 0.1 mM MgCl26H2O, 0.5 mM HEPES를 첨가하였다. 복제란의 발생 배양액은 NCSU(North Carolina State University)-23 배지에 0.4 % BSA를 첨가하였다.
<4-2> 난자의 채취 및 미세 조작(Micromanipulation)
도축장에서 미경산돈의 난소를 채취하여 35 ~ 39℃, 0.9% 생리적 식염수에 넣어 실험실까지 운반하였다. 난자는 일회용 10-ml 주사기에 18-게이지(gauge) 바늘을 연결하여 직경 2 ~ 6 mm 난포에서 난포액을 흡입하여 채취하였다. 난자를 성숙배양액에서 세척하고 500 μl 배양액이 들어있는 4-웰 플레이트에 50 ~ 60개 넣어 42 ~ 44시간 배양하였다.
상기 난자를 미세조작용 배양액에서 5 ~ 10분간 배양한 후 체세포를 배양액에 첨가하였다. 직경 30 μm의 미세 유리관으로 난자의 제 1극체와 그 주위의 세포질을 제거하고 이 유리관을 이용하여 체세포를 난자의 위란강에 주입시켰다.
<4-3> 세포융합 및 활성화
미세조작 후 간격이 1 mm 떨어진 플레티넘(platinum) 전기선 사이에 핵이식란을 위치시켰다. 세포융합 및 활성화는 2회의 DC 펄스 1.0 ~ 1.2 kV/cm, 30 μsec을 융합기(BTX Electro-Cell Manipulation 2001)로 공급하여 유도한 다음 0.5 ~ 1시간 후 융합률을 검사하였다.
<4-4> 복제란의 배양
융합된 복제란만을 골라 500 μl의 배양액이 들어있는 4-웰 플레이트에서20 ~ 30개의 복제란을 6일간 배양하였다. 배양이 끝나면 5 μg/ml 비스벤지미드(bisbenzimide, Hoechst 33342)로 염색하여 형광현미경 하에서 복제란의 핵 수를 검사하였다.
<4-5> 핵이식란의 이식 및 형질전환 복제 미니돼지 생산
융합된 복제란은 500 ul의 배양액이 들어있는 4웰 플레이트에서 1 ~ 2일간 배양하였다. 이후 같은 배양액 2 ml이 들어있는 동결튜브에 복제란을 넣고 39℃로 가온되어있는 수정란 운송 장치(Embryo transfer kit)로 수정란 이식 장소까지 운송하였다. 복제란 이식을 위한 대리모는 발정이 시작된 개체를 선별하여 준비하였다. 형질전환 복제 미니돼지 생산효율 향상을 위하여 일반식용돼지와 미니돼지를 대리모로 이용하였다. 대리모는 세척 후 펜토탈소디움(Pentothal Sodium, 중외제약) 0.5g을 귀정맥에 투여하여 일시 마취시켰다. 마취된 대리모를 수술대에 보정 한 후 5% 이소플로레인(Isoflurane)을 공급하여 흡입마취를 실시하였다. 마취된 대리모는 복중선을 따라 약 5 cm 가량 절개 후 자궁과 난소를 체외로 노출시켜 준비하였다. 이때 복제란을 카테타(Tom cat catheter)에 흡입하고 난관의 협부까지 밀어 넣어 복제란을 이식하였다. 복제란 이식이 완료된 대리모는 30일 초음파를 이용하여 임신검정을 실시하고 임신이 확인된 개체는 114일 후 분만을 유도하였다. mFasL 형질전환 복제돼지 생산을 위하여, 미니돼지 대리모 16마리와 일반식용돼지 대리모 6마리를 이용하여 복제란을 이식하였다. 복제란 이식이 완료된 대리모는 30일째 초음파를 이용하여 임신 검정을 실시하고 임신이 확인된 개체는 114일 후 분만을 유도하여 형질전환 복제 돼지를 생산하였다.
일반식용돼지와 미니돼지를 각각 대리모로 이용한 경우, 그 효율을 비교한 결과, 임신율은 미니돼지에서 높았으나 분만율은 일반식용돼지에서 높게 나타났다. 일반식용돼지와 미니돼지 대리모 각 1두에서 각각 1마리의 형질전환 미니돼지가 생산되었다(표 1).
| 공여 세포 | 품종 | 수령받은 수 | 임신율(%) | 분만율(%) | 생산수(사산) |
| F4-41 | 미니돼지 | 14 | 5 (35) | 1 (7) | 1 |
| 일반식용돼지 | 6 | 1 (16) | 1 (16) | 1 (2) |
<실시예 5> mFasL 형질전환 복제돼지의 확인
<5-1> PCR을 이용한 형질전환 유전자 삽입 확인
태어난 복제돼지의 태반을 통하여 확보된 조직을 proteinase K(Gibco. Inc)로 처리하여 단백질을 분해시킨 후 페놀로 단백질을 변성시켜 게놈 DNA를 분리하였다. 분리된 게놈 DNA를 PCR 방법을 이용하여 형질전환 여부를 확인한 결과 마리의 산자 모두 형질전환이 확인하였다. 이때 프라이머는 정방향 프라이머(5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3'; 서열번호: 10)와 역방향 프라이머(5'-CCT CGG CCT CTG CAT AAA TA-3'; 서열번호: 11)을 사용하였다.
그 결과, 도 11에서 보는 바와 같이 2마리의 복제미니돼지가 형질전환 복제 미니돼지임을 확인하였다(도 11).
<5-2> 염색체상에 삽입된 형질전환유전자 확인
염색체상의 형질전환유전자를 확인하기 위하여, 형광염색직접법(FISH)를 통하여 확인하였다.
그 결과, 도 12에서 보는 바와 같이 공여세포와 동일한 위치에 유전자가 삽입되었음을 확인하였다(도 12).
또한, 형질전환 복제 미니돼지가 공여세포유래의 복제돼지인지 확인하기 위하여, 미세위성 분석(Microsatellite analysis)을 실시하였다. 구체적으로, 총 11개의 다형성 돼지 유전자좌(polymorphic porcine loci)(S0005, S0026, S0155, S0225, SW122, SW24, SW632, SW72, SW787, SW936, SW951)를 이용하여 Multiplex PCR 분석을 실시하였다.
그 결과, 표 2에서 보는 바와 같이 공여세포 유래의 복제 미니돼지임을 확인하였다(표 2).
| 마커 | 공여 세포 | 1st 대리모 | 1st 산자 | 2nd 대리모 | 2nd 산자 |
| S0005 | 222/246 | 222/246 | 222/246 | 236/242 | 222/246 |
| S0026 | 100/104 | 104/106 | 100/104 | 100/106 | 100/104 |
| S0155 | 165/167 | 163/165 | 165/167 | 165/165 | 165/167 |
| S0225 | 186/186 | 186/192 | 186/186 | 174/192 | 186/186 |
| SW122 | 120/120 | 120/120 | 120/120 | 122/128 | 120/120 |
| SW24 | 104/118 | 130/130 | 104/118 | 118/124 | 104/118 |
| SW632 | 168/168 | 168/176 | 168/168 | 178/178 | 168/168 |
| SW72 | 105/125 | 105/107 | 105/125 | 115/115 | 105/125 |
| SW787 | 150/164 | 152/158 | 150/164 | 162/166 | 150/164 |
| SW939 | 118/118 | 118/118 | 118/118 | 100/114 | 118/118 |
| SW951 | 129/139 | 129/139 | 129/139 | 127/131 | 129/139 |
또한, 생산된 복제미니돼지의 귀세포를 이용하여 FACS를 실시한 결과, 도 13에서 보는 바와 같이 mFasL 단백질이 발현됨을 확인하였다(도 13).
<실시예 6> 형질전환 복제돼지의 체세포 유래 FasL의 세포독성 억제 효과
<6-1> 시험관내(
In vitro
) 세포독성 분석
미니돼지의 태아섬유아세포를 인간의 CTL에 감작시키기 위하여 50 Gy로 감마선 조사(gamma-irradiation)를 실시하였다. 건강한 사람으로부터 혈액을 채취한 후 Ficoll을이용하여 림프구(lymphocyte)를 분리하였다. 분리된 림프구에서 CD8+ DynaBeads(Invitrogen) kit을 이용하여 CD8+ 림프구를 분리하였다. 상기 CD8+ 림프구를 감마선으로 조사된 미니돼지 태아섬유아세포에서 3일간 배양 후 인간 재조합 IL-2(50 U/ml)를 처리하고 14일간 배양하였다. 그런 다음, MTT 분석 방법을 이용하여 CTL 분석을 실시하였다. 표적 세포로는 일반 미니돼지 태아섬유아세포, 공여세포(F4-41), 선발된 세포주(W3-140), 및 형질전환된 돼지의 귀세포를 이용하였다. 효과기 세포(Effector cell, E) 및 표적 세포(Target cell, T)의 비율은 각각 5 : 1과 10 : 1에서 분석을 실시하였다.
그 결과, 도 14에서 보는 바와 같이 효과기 세포와 표적 세포의 비율이 5 : 1에서는 형질전환복제미니돼지의 귀세포가 일반미니돼지의 세포와 비교할 때 각각 38.4 ± 19.2%와 60.8 ± 11.3%였고, 10 : 1에서는 각각 31.2 ± 47.4%와 72.5 ± 31.9%으로 세포독성결과를 보였다(도 14).
<6-2> 자연살해세포 분석
선별된 양성 세포주가 실제로 자연 살해 세포를 억제시켜 세포 파괴작용을 저해시키는 것을 확인하기 위하여, 세포독성 실험을 실시하였다. 양성 세포주, 정상 미니돼지 세포주를 표적세포로 사용하고, NK 92MI(ATCC. Inc) 세포주를 효과기 세포(effector cell)로 사용하여 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 12.5% 말 혈청(horse serum) 12.5% FBS가 포함된 α-MEM 배지에서 계대 배양하여 일부는 동결시키고 일부는 자연살해 세포의 세포독성 분석에 사용하였다. E : T 비율을 10 : 1과 20 : 1로 하여 MTT 분석 방법을 이용하여 4회 실시하고 분석하였다.
그 결과, 도 15에서 보는 바와 같이 동일한 샘플을 이용하여 NK 분석을 10 : 1과 20 : 1에서 5시간과 6시간에 걸쳐 실시한 결과, CTL과 마찬가지로 공여세포와 형질전환돼지의 귀세포에서 세포독성이 낮게 나타남을 확인하였다(도 15). 특히 6시간 배양에서 효과기 세포와 표적 세포의 비율이 20 : 1에서는 형질전환복제미니돼지의 귀세포가 일반미니돼지의 세포와 비교할 때 각각 64.2 ± 9.3%와 40.8 ± 5.4%로 세포독성이 감소하는 것으로 확인되었다(도 15).
따라서, 막 결합 형태(membrane-bound form)의 FasL를 미니돼지의 세포에 과발현시 CTL 및 자연살해 세포에 의한 세포독성을 감소시킬 수 있음을 알 수 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 인간 FasL 단백질을 발현하는 형질전환 복제돼지 유래 체세포주는 인간 FasL 단백질을 발현하여 CTL 및 자연살해 세포에 의한 세포독성을 감소시켜, 인간의 면역세포에 의한 면역거부반응을 감소시킬 수 있으므로, 상기 형질전환 복제돼지를 이용한 이종장기이식 연구 및 이의 산업적 이용에 유용하게 사용할 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (11)
- 수탁번호 KCLRF-BP-00194로 기탁된, 인간 FasL(human Fas Ligand, hFasL) 유전자 발현벡터를 포함하는 형질전환 돼지 클론 체세포주.
- 제 1항에 있어서, hFasL 유전자는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 인간 FasL 전장 염기서열에서 세포질 부위(cytoplasm region) 및 메탈로프로테나제의 활성 부위(active site)를 제거한 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 형질전환 돼지 클론 체세포주.
- 제 1항에 있어서, hFasL 유전자는 서열번호 12로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 형질전환 돼지 클론 체세포주.
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- 제 1항의 형질전환 돼지 클론 체세포주로부터 체세포 복제방법을 이용하여 제조한, hFasL 유전자를 발현하는 형질전환 복제돼지.
- 1) 모돈으로부터 채취한 난자의 핵을 제거하고, 제 1항의 형질전환 돼지 클론 체세포주와 융합시키는 단계; 및
2) 융합된 복제란을 대리 모돈에 이식하고 자돈을 출산하는 단계를 포함하는, hFasL 유전자를 발현하는 형질전환 복제돼지의 제조 방법.
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| 논문 1 : XENOTRANSPLANTATION * |
| 논문 1 : XENOTRANSPLANTATION* |
| 논문 2 : TRANSPLANTATION * |
| 논문 3 : ACTA PHARMACOL SIN * |
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