CN111118062A - Polβ过表达质粒、细胞模型及其在抗卵巢衰老药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Polβ过表达质粒、细胞模型及其在抗卵巢衰老药物中的应用。Polβ过表达质粒导入细胞或者将Polβ基因导入卵细胞中，可显著提高卵细胞抵御外界不良刺激，可以在制备抗卵巢衰老试剂或者药物中应用。

Description

Polβ过表达质粒、细胞模型及其在抗卵巢衰老药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一种Polβ过表达质粒、细胞模型及在抗卵巢衰老药物中的应用。

背景技术

研究表明，对于年龄介于30至35岁之间的女性，ART的怀孕率为50％。对于年龄在35到40岁之间的女性，怀孕率仅为30％。Belloc等人的一项研究。可以看出，ART目前并未完全代偿由年龄相关的生殖能力下降引起的不育症。

高龄导致的女性生殖能力下降以及胎儿染色体异常的增加是目前困扰女性生殖健康的最大挑战。女性生育能力下降与卵细胞质量的下降以及卵巢中卵泡数量的下降密切相关。在女婴刚出生时，其卵巢中卵细胞数量接近100万枚左右，但是在女性一生中，仅仅只有约500枚卵细胞排出，这只占卵泡池0.1％，而剩下的约99.9％卵细胞是白白损耗掉，并且这种损耗的机制不明。卵泡池损耗从女婴约1-3岁开始直到女性约51-52岁卵巢储备耗竭为止，是一种非线性的加速过程。如果我们能找到在女性生殖后期卵泡池加速耗竭的原因，然后靶向治疗，就能实现改善高龄女性生殖能力以及推迟更年期的目的。数字建模计算得出，如果能让卵泡池耗竭减速，更年期能够被推迟到约71岁。

在哺乳动物卵细胞中，同源重组修复在保护卵细胞的数量和质量方面起着重要作用。已有大量的研究表明，GV期卵细胞中DNA双链断裂修复缺陷是高龄导致卵巢储备耗竭的原因。DNA双链断裂(DSBs)是最严重的并且破坏遗传信息的完整性。由DNA损伤介导的毛细血管扩张性共济失调(ATM)通过同源重组机制调节DSB修复。BRCA1和BRCA2是ATM DSBrepair家族基因中重要的成员。BRCA1蛋白与RAD51蛋白协同作用，并在同源重组修复中起关键作用。同时，它也是与CHK2协同调控有丝分裂进程的蛋白。删除BRCA1将导致基因组不稳定，触发P53介导的细胞周期检查点。高龄中，参与DSB repair的BRCA1与ATM途径中其他关键基因表达量较年轻少。如果DNA损伤不能被修复，细胞将会通过凋亡和衰老而被淘汰，退出细胞周期，从而避免非常严重的突变影响。

同源重组修复在保护卵巢内卵细胞的数量和质量上起着重要作用。已有大量的研究表明，GV(Germinal Vesicle)期卵细胞中DNA双链断裂修复(Double Strand BreaksRepair,DSBR)缺陷是高龄导致卵巢储备耗竭的原因。同源重组发生在初级卵母细胞第一次减速分裂细线期，终止于双线期。此后卵细胞在卵巢中停留数十年，直至接受激素刺激，获得受精能力。在这漫长的数十年中，卵细胞要经历来自体内和体外的不良环境刺激。修复DNA损伤的能力对于维持卵巢中卵细胞数量是至关重要的。因此，如果卵细胞不能应对DNA损伤，它将导致胚胎染色体异常并将缺陷遗传给下一代。不同于先前大量研究聚焦在DNADSBR参与卵巢储备维持上，休眠期的卵细胞已处于双线期，此时已完成同源重组。此外，也有研究报道碱基切除修复(Base Excision Repair,BER)缺陷参与年龄相关的疾病发生。

人类首次从兔骨髓中纯化获得Polβ，其特征为小分子量DNA聚合酶，这为Polβ的系统研究拉开了帷幕。在哺乳动物中存在至少14种DNA聚合酶，根据它们的序列可变性将其分为A-，B-，RT-，X-和Y-五个家族。Polβ是在X家族中发现的第一种DNA聚合酶，该家族还包括Polλ、Polμ和末端转移酶(TdT)。Polβ蛋白是一个大小为39KD由335个氨基酸组成的聚合酶，具有5’-dRP裂合酶和聚合酶两个主要活力，它不具有核酸外切酶活性，并且在脊椎动物的整个生命过程中表达。Polβ具有小的分子量，被认为是细胞中最简单的DNA聚合酶。此外，Polβ可通过大肠杆菌表达纯化得到大量重组蛋白，这些特点使得它成为研究核苷酸转移酶及裂合酶反应机制的理想模型。

人编码的Polβ基因位于8号染色体的P11区域，基因ID：5423，全长33kb，包括14个外显子。Polβ蛋白是单体蛋白，包括两个大结构域：氨基末端是N-末端裂解酶结构域(8KD，含有约90个氨基酸)和羧基末端，C-末端聚合酶结构域(31KD，它含有约250个氨基酸)，两者通过疏水铰链区连接。聚合酶结构域根据分工不同又被划分为：D subdomain、Csubdomain、N subdomain三个小的亚结构域，分别负责DNA聚合过程中与双链DNA的结合，催化脱氧核苷酸的转运和与正确的脱氧核苷酸的结合。N端的裂合酶结构域除了具有5’-dRP裂合酶活力外，还具有单链DNA结合的活力。核酸结合研究表明纯化的裂合酶结构域与ssDNA的结合能力几乎等同于完整的Polβ，但是与dsDNA结合能力很弱。相反，聚合酶结构域具有强的dsDNA结合能力。与完整的Polβ相比，通过分离和纯化的聚合酶结构域降低了催化的DNA聚合的效率。

Polβ发挥聚合酶活力时按照一种有序的方式将脱氧核苷酸添加到DNA底物中。首先，Polβ通过D亚结构域结合到DNA底物上，它倾向于与含有3’-OH和5’-磷酸盐的小切口DNA链结合。然后Polβ的N亚结构域会与早期的脱氧核苷酸结合，按照“Watson-Crick”碱基配对原则，根据模板链上的碱基类型选择相应的dNTP结合。一旦与正确的dNTP结合，Polβ-DNA-dNTP的三元复合物就会发生相应构象改变，例如亚域移动，蛋白质侧链的重排和DNA结构的变化。这种构象的改变使底物调整到亲核攻击新dNTP的最佳状态，接着由活性中心高度保守的三个天冬氨酸进行标准的“two-metal-ion”催化，dNTPs向DNA底物的催化聚合和无机焦磷酸盐(PPi)的释放完成了脱氧核苷酸的转运。随后，复合物的构象会发生第二次改变，这有利于PPi释放以及延伸的DNA+1产物的释放或者有利于下一轮脱氧核苷酸的插入。

除了具有重要的聚合酶活性外，Polβ还具有dRP聚合酶活性。哺乳动物细胞在修复烷化或氧化碱基过程中，BER途径的中间产物中5-dRP结构的切除主要依赖Polβ裂合酶活力。研究表明裂合酶活力相比聚合酶活力效率更高，但是发挥作用的时间滞后于后者。位于裂合酶结构域的第72位赖氨酸，对dRP裂合酶的活力十分重要，如果该位点发生突变，会严重降低dRP裂合酶的活力。晶体学结构分析表明Polβ在发挥作用时，N端裂合酶结构域会与N-亚结构域结合，Polβ会形成一个圆环形结构。这种构象对裂合酶活力发挥作用很重要，因为这使它靠近了脱氧核苷酸的结合区域，实际上它可以限制脱氧核苷酸穿过酶的活性中心。

虽然到目前为止，绝大多数研究所涉及到Polβ的功能都是关于它在BER途径的聚合酶作用，但越来越多的证据表明，Polβ在尚未阐明的细胞中具有其他重要作用。Polβ敲除小鼠是胚胎致死的，表明Polβ在胚胎发育中起重要作用。更重要的是，MEF Polβ^-/-细胞对DNA损伤试剂高度敏感，这为Polβ在细胞中的广泛作用提供了直接证据。这些结果表明Polβ的功能和调节对于维持生物体的正常活动是重要的。

发明内容

发明目的：本发明提供了Polβ过表达质粒、细胞模型及在抗卵巢衰老药物中的应用。

技术方案：本发明第一方面提供了一种Polβ过表达质粒，所述过表达质粒包含表达Polβ基因的核酸序列。

进一步地，本发明中所述的含有表达Polβ基因的过表达质粒采用的质粒为真核表达质粒，该真核表达质粒可以为pEX系列质粒。

最优选地，所述的表达质粒选择pEX-1表达载体。

为了验证Polβ与卵巢衰老的功能，本发明中所用到的试验材料为表达小鼠Polβ的质粒载体，所表达的目的基因片段如SEQ ID NO.1。

本发明第二方面提供了过表达质粒在制备治疗卵巢衰老药物或制剂中的应用。

本发明第三方面提供了一种细胞模型，所述细胞模型中包含上述Polβ过表达质粒。

本发明第四方面提供了细胞模型的制备方法，包含以下步骤：将Polβ过表达质粒注射于细胞中。

进一步地，所述细胞为卵细胞或者胚胎干细胞。

当制备的细胞模型用于治疗人类卵巢衰老的药物或者制剂时，该卵细胞为人类卵细胞，胚胎干细胞为人类胚胎干细胞，所述人类胚胎干细胞可以为市售的任一种人类胚胎干细胞。

本发明第五方面提供了上述细胞模型在制备治疗卵巢衰老药物或制剂中的应用。

本发明第六方面提供了一种抗卵巢衰老药物或制剂，包含上述的Polβ过表达质粒，或包含上述的细胞模型。

有益效果：本发明发现DNA聚合酶β参与BER通路，参与卵巢储备的维持并发挥重要作用，本发明通过Polβ过表达质粒，用于维持BER效率，可减缓卵巢帅衰老，可以用于制备抗卵巢衰老药物或制剂。

附图说明

图1为年龄对小鼠卵细胞BER的影响，从图中可看出，年龄导致的小鼠卵细胞BER效率下降，散点图代表年轻卵细胞内8-OHdG与高龄卵细胞内的比值，高龄小鼠卵细胞8-OHdG含量较年轻组显著增加；

图2为年轻与高龄小鼠卵细胞先用于WB来调齐内参，剩余卵细胞裂解液用于进行体外BER实验的实验结果，图中显示高龄小鼠SP-BER与LP-BER均较年轻小鼠修复效率低，提示年龄影响卵细胞BER的修复效率；

图3为年龄对小鼠BER关键基因蛋白表达量的影响，结果显示高龄组卵细胞较年轻组卵细胞在FEN1、APE1、Polβ上蛋白含量减少；

图4为年龄对小鼠BER关键基因转录水平的影响，结果显示高龄导致小鼠BER关键基因转录水平下降；

图5为5-氟尿嘧啶对卵细胞的影响，5-FU作为碱基类似物，会错误的掺入到DNA复制过程中造成DNA损伤，5-FU造成的损伤需要BER特异性修复。我们选取两组年轻小鼠，一组注射5-FU；另一组未药物处理，结果显示5-FU可引起卵细胞凋亡；

图6为通过QPCR来鉴定Polβ敲降小鼠造模成功，其中，A显示Polβ敲降小鼠mRNA水平较WT小鼠显著降低，B显示Polβ敲降小鼠卵细胞成熟率显著低于WT，C显示Polβ敲降小鼠在5日龄与4月龄卵巢储备较WT显著降低，D显示Polβ敲降小鼠产仔数显著低于WT小鼠；

图7为Polβknockin小鼠卵巢储备及生殖能力影响结果，其中，A为Polβ^R137Q/R137Q小鼠与WT小鼠mRNA水平，发现Polβknockin不会影响卵细胞Polβ表达水平；B显示了Polβ^R137Q/R137Q小鼠卵细胞Ap sites显著高于WT；C显示了Polβ突变小鼠卵细胞凋亡比例增加；D显示了Polβ突变会影响小鼠卵细胞成熟；E显示了Polβ突变会导致小鼠产仔数减少；

图8为小鼠卵细胞中分别注射FEN1、APE1和Polβ小分子RNA干扰序列后暴露在双氧水中的影响；年轻小鼠卵细胞中导入siAPE1、siFEN1、siPolβ干扰相应基因，然后经250mM双氧水处理，结果显示敲降BER各基因均会导致卵细胞凋亡增加和存活率下降；

图9为鼠卵细胞放入H₂O₂中处理结果，其中，A为Polβ敲降小鼠卵细胞应对氧化损伤的能力显著降低；B为在高龄小鼠卵细胞注射含Polβ基因质粒，发现卵细胞抵御外界不良环境能力增强；C为卵细胞在双氧水中的存活率；D为过表达Polβ的卵细胞与未过表的卵细胞在APE1，FEN1，XRCC1，LigaseⅠ，LigaseⅢα，PCNA和RAD51相关蛋白的差异，结果显示LigaseⅠ，LigaseⅢα和RAD51存在显著差异，其他基因未出现显著变化；

图10为不同年龄小鼠的卵细胞Polβ表达量及活性，其中，A为小鼠血清AMH含量，显示年轻组Polβknockdown和knockin小鼠血清AMH水平均显著低于年轻组WT小鼠；而高龄组小鼠血清AMH水平处于两种转基因小鼠之间；B为5种转基因动物卵巢组织caspase3免疫荧光检测卵细胞凋亡情况；

图11为本发明中polβ过表达质粒图谱。

具体实施方式

一、实验材料及实验方法

1.1实验动物

从南京大学模式动物所购买不同年龄阶段的SPF级的C57BL/6J雌性小鼠，选取年龄组分别为年轻组6-8周龄；高龄组超过8个月，饲养于南京师范大学生命科学学院的SPF动物房。

1.2实验仪器

630-670nm酶标仪

培养箱

微量离心机

FEN1(Abclonal,A0129)

APE1(Abcam,13B8E5C2)

Polβ(Abclonal,A1681)

StepOnePlus Real-Time PCR

定点诱变试剂盒(Takara)

1.3实验方法与步骤

1.3.1卵细胞免疫荧光

①将每个卵细胞置于4％PFA中，并在室温下固定30分钟；

②将卵细胞在室温下移至透膜溶液中20分钟(在湿盒中)；

③Blocking Buffer室温封闭1h；

④一抗孵育：鼠APE1抗体(1:200)、兔Polβ抗体(1:200)、鼠FEN1抗体(1:200)稀释在Blocking Buffer中，置于湿盒中，4℃过夜；

⑤Washing Buffer清洗，5min×3次；

⑥二抗：IgG/FITC兔二抗和IgG/FITC鼠二抗，以1:100稀释于Blocking Buffer中，室温1h；

⑦Washing Buffer清洗，5min×3次；

⑧PI染核：室温下5min；

⑨Washing Buffer清洗，1min×3次；

⑩将10枚左右卵细胞密封在含有DABCO的抗荧光猝灭剂中，并通过激光共聚焦显微镜观察。

1.3.2组织/细胞基因组DNA提取试剂盒

1)组织破碎:液氮研磨法，将组织直接放入研钵中，加入少量液氮，快速研磨，软化组织，加入少量液氮。再研磨，按5-10mg/1ml加入KBL1，转入离心管，13000rpm常温离心2min.

2)裂解细胞：卵细胞可直接收集、裂解，按照5×106细胞/1ml比例加入KBL1进行裂解。

3)将上清液或裂解物转移至吸附柱并在室温下以13000rpm离心30秒以使裂解物完全流过柱。离开吸附柱，丢弃收集管中的滤液，然后将吸附柱放回收集管中。

4)加入700μLBufferKW，室温13000rpm离心30秒，弃去收集管中的滤液，保留柱子。

5)重复用700μL70％乙醇洗涤柱子，室温12000rpm离心1min。

6)丢弃从收集管收集的滤液，将空柱放回2ml收集管中，并在室温下以13000rpm离心2分钟以干燥柱基质中的残余液体。

7)将柱置于新的1.5ml离心管上，加入50μLKE，置于65℃下5-10分钟，以13000rpm离心1分钟以洗脱DNA。

8)DNA可以在4℃下保存，如果长期保存，可以在-20℃冷冻保存。

1.3.3体内8-OHdG BER分析

使用一个生物素标记的包含8-OHdG的寡核苷酸DNA底物进行LP-BER分析。底物DNA转染到目标细胞中，继续培养4小时以便损伤位点修复完成。裂解细胞并使用链霉抗生物素蛋白珠捕获生物素标记的底物DNA。最后用竞争8-OHdG ELISA法检测8-OHdG的损伤修复情况。

1.3.4体外重建BER实验

1)底物退火：取Polβ-U或者Polβ-F底物的两条链进行退火得到U或者F的退火底物分别作为SP-BER和LP-BER底物。

2)BER反应体系：

U或者F的退火底物 0.4μL

dA/G/TTP(各2.5mM) 0.1μL

[α-32P]-dCTP 0.1μL

所需相关蛋白

2×BER Reaction Buffer 10μL

ddH₂O定容至20μL

将混合物在37℃反应30分钟，然后在20μL，2×上样缓冲液和沸水浴中反应5分钟，以获得电泳样品。后面变性胶电泳及放射自显影。

1.3.5细胞总RNA的提取

1)取出卵细胞，用PBS洗涤两次，转移到EP管中，加入20μL Trizol裂解细胞。置于冰上30分钟，将细胞裂解液转移到不含Rnase的1.5ml离心管中。

2)向EP管中加入100μL氯仿，用摇动器涡旋振荡，在冰上静置10分钟。将EP管转移至预冷却的4℃离心机中，以12,000rpm离心15分钟。可以观察到，管中的液体被分成三层，最上面的液体被转移到没有Rnase的新的1.5ml EP管中。

3)向管中加入250μL异丙醇，缓慢倒置并混合，置于冰上静置10分钟。将EP管转移至预冷却的4℃离心机中，以12000rpm离心10分钟。弃去上清，底部白色沉淀即为RNA。

4)向管中加入500μL75％乙醇溶液(用DEPC水形成)并用手弹起底部沉淀物。在预冷却的4℃离心机中以7500rpm离心10分钟，弃去上清液并重复洗涤。

5)将白色沉淀室温干燥10min，加入20-30μL DEPC水，溶解RNA。测定RNA的浓度及纯度，立即放入-80℃保存。

1.3.6荧光定量PCR(Real-time PCR)

将提取的总RNA逆转录为cDNA，系统如下表所示：

逆转录反应体系

试剂名称 使用量

RNA 1μg

5×RTmix 2μL

加DEPC水至10μL

使用良好的系统，使用PCR仪进行扩增，具体反应步骤：

37℃(15min)85℃(5s)4℃(∞)

逆转录后，将其保存在-20℃下以备后用。

1.3.7实时定量PCR检测细胞mRNA的相对表达

1)引物的设计

本文中所需要的PCR引物(见表1)，根据Genbank上记载的APE1、Polβ、FEN1基因的全序列，IDT(Integrated DNA Technologies)设计引物，在NCBI上的Primer Blast进行同源性分析，确定引物的特异性。

表1本发明所需DNA引物及底物

2)荧光定量PCR

采用荧光定量PCR方法检测APE1、Polβ、FEN1的mRNA的表达水平，以使用来自Novartis的SYBR RPremix Ex TaqTM试剂盒，βactin基因作为内参。

荧光定量PCR反应体系

加双蒸水至20μL

实时荧光定量PCR反应程序：

将不同处理组的CT值与内部参考基因βactin的CT值进行比较，并计算基因的相对表达水平。

1.3.8小鼠配种实验

每只雄鼠与2只6～8周龄C57BL/6J雌鼠配种。每天下午18：00时，每只雄鼠被关进1～2只C57BL/6J雌鼠笼内。第二天上午09：00时检查配种雌鼠阴道栓。见栓雌鼠代表配种成功。配种成功的雄鼠须休息两天后继续与雌鼠合笼。每只雄鼠累计成功配种3只雌鼠，则退出实验。见栓雌鼠单笼饲养做好记录和标记，当日记为0.5dpc(days post coitum)，次日为1.5dpc，以此类推，直至分娩期(18.5dpc)。记录分娩仔鼠数量、日期和窝数。

1.3.9转基因技术获得PolβR137Q knockin小鼠(购自南京大学模式动物所)

克隆一段6.7kb长DNA片段(载有Polβ基因)，在载体之间插入neo抗性基因，并将HSV-tk基因作为负选择系统基因嵌入载体5'长臂的下游区域，使用定点诱变试剂盒和技术将Polβ第137位编码精氨酸的基因突变为编码谷氨酰胺的基因。通过电穿孔将特异性转基因片段转染到C57BL/6J胚胎干细胞中(赛业生物，MUBES-01001),并挑选具有neo抗性的细胞克隆。对这些细胞进行扩增(PCR)，以验证目的基因是否已经重组到基因组DNA中。将含有两个独立突变基因的胚胎干细胞显微注射到C57BL/6J的囊胚中。结果WT个体基因型不含neo抗性基因序列，而转基因小鼠基因含有neo抗性标记基因。因此PCR出来的产物突变的R137Q基因比WT要多出一段序列，R137Q基因片段稍微比WT片段位置高，大多数新生小鼠是Polβ^+/R137Q杂合体。第一代PolβR137QKnockin小鼠与杂合子交配，并选择Knockin纯合子交配。那么子代全部都是PolβR137Q Knockin纯合子。以PolβcDNA为模板，以5’AGCAAGCAGCTACAATGCAA3’和5’AGGTGTGTACAATGTTGACTTGG3’为引物，进行PCR测序以确定小鼠是否是纯合的PolβR137Q突变体。

1.3.10 CRISPR/Cas9技术获得Polβknockout小鼠(该小鼠购自南京大学模式动物所)

①CRISPR/Cas9sgRNA识别位点设计与产生

根据文献报道的方法，使用在线CRISPR/Cas9基因编辑sgRNA识别位点设计软件，要编辑的靶基因是针对CRISPR/Cas9基因编辑系统的靶sgRNA设计的。

首先，在UCSC Genome Bioinformatics数据库中搜索待编辑的靶基因的DNA序列，并保存序列。通过生物信息学分析靶基因的DNA序列，选择适合于基因编辑的DNA序列区域，并选择相应的基因序列。

其次，将选定的DNA序列导入CRISPR/Cas9基因编辑sgRNA识别位点在线设计软件。按照软件的要求，每次输入的DNA序列的长度不得大于249bp，同时根据软件提示的内容填入项目名称等相关信息，并在参数选择时选择相对应参数，如unique genomic region(23-500nt)/mouse(mm9)，并提交。

最后，对软件计算后反馈回的靶位点信息进行分析比较，选择出合适的可用于CRISPR/Cas9基因编辑操作的sgRNA序列及其靶位点信息。在分析目标位点信息时，有必要考虑sgRNA位点序列的特异性，以及可能的相关因子，例如脱靶位点。同时，还应记录所选sgRNA打靶序列，可能造成脱靶效应的基因信息及其序列，根据基因信息和序列，设计基因检测引物，用于小鼠基因编辑后，潜在脱靶基因的脱靶效应检测。

当在线设计软件中选择sgRNA序列时，从序列的5'末端到3'末端除去两个碱基序列。当编辑CRISPR/Cas9基因时，它用于增强sgRNA的特异性并降低脱靶的机会。通过限制性内切核酸酶BbsI在缩短的sgRNA序列的5'末端切割T3-sgRNA质粒产生的限制性内切核酸酶序列，5’-aggg。同时，通过碱基互补原则，获取sgRNA序列的互补序列，并在其5’末端加入酶切序列5’-aggg。将设计完成的序列提交至基因合成公司，利用化学合成的方法获取打靶用sgRNA的ssDNA。

把合成后打靶用sgRNA的单链DNA稀释成浓度为100μmol/l的溶液，通过退火、5’末端磷酸化等操作，形成带有粘性末端sgRNA序列的双链DNA。其反应体系及反应程序如下：

②连接产物的转化和阳性克隆菌落的鉴定

(1)从-80℃冰箱中取出50μLDH5α感受态细胞，并在冰上缓慢解冻10分钟。

(2)将5μL连接产物(质粒-pEX-1(pGCMV/MCS/EGFP/Neo))加入DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟。

(3)将上述混合物在42℃水浴中热活化90秒，然后快速转移到冰浴中并放置3分钟。

(4)加入100μL预热(37℃)LB无抗生素的培养基，将混合物在37℃温育，以200rpm振荡1小时。

(5)将菌液涂于含有抗生素(如：氨苄青霉素50μg/ml；壮观霉素50μg/ml；在室温下将用四环素50μg/ml)和X-gal和IPTG处理的LB板表面施加到溶液中直至液体完全被吸收。

(6)倒置平板并标记，在37℃培养箱中孵育过夜。

(7)观察阳性克隆菌斑的大小，并在合适时进行阳性克隆的鉴定，用10μL枪头挑取生长较好的克隆，将细胞置于含有抗生素的LB液体培养基中，清楚地标记细胞并置于37℃培养箱中进行培养。同时将挑过克隆的10μL枪头放入PCR反应体系当中，然后用移液器反复吹打几次，并进行PCR扩增，对菌落进行阳性鉴定。

(8)将鉴定后的阳性菌落进行扩增繁殖。将阳性菌落保留的细菌溶液吸入含有抗生素的LB培养基中，并在37℃培养箱中培养过夜。

(9)将阳性菌落送至测序公司检测基因序列。

(10)将序列检测后确定为阳性菌的菌株用15％的甘油进行保存，甘油菌置于-80℃中保存。

③体外转录

在该研究中，使用Ambion的T3体外转录试剂盒(AM1348)进行体外转录实验。采用Ambion公司的加尾试剂盒(AM1350)对转录产物进行3’端加尾处理。实验具体反应体系及反应条件如下：

将管的底部混合并离心以使混合物落到管的底部。置于37℃反应1h。由于转录的sgRNA片段长度较短，而体外转录反应的限速步骤是聚合酶识别转录序列中的启动子位点，故在对sgRNA进行转录时应延长转录反应时间，反应4-6h。

为了增加转录后RNA的稳定性，提高RNA在显微注射于受精卵后，能够在细胞质中高效翻译成蛋白并发挥相应的功能，需要对体外转录产生的RNA产物进行加尾处理(sgRNA在实验中起到导向RNA的作用，故不能对体外转录产生的sgRNA进行加尾处理，转录产生的sgRNA直接进行纯化提取步骤)。

将反应体系置于37℃反应1h，其能在RNA3’末端加入具有50-200个腺嘌呤核苷酸的尾巴，成为含有腺嘌呤核苷酸尾的最终RNA。反应后，向系统中加入1μL TurboDnase，并在37℃下继续孵育15分钟以除去转录的DNA模板。

向反应体系中加入20μL的LiCl，轻轻混合，在-20℃下静置45分钟。然后，将其在4℃以12,000rpm离心15分钟以沉淀RNA，弃去上清液，留下白色RNA沉淀。用1ml70％的乙醇对白色沉淀进行洗涤。4℃，12000rpm离心，弃上清。室温干燥10min。加入20μL TE溶液，溶解沉淀。产物置于-80℃中保存。

④T7EⅠ核酸内切酶(T7EndonucleaseⅠ)法检测基因突变

利用T7EⅠ核酸内切酶能够识别及切割不完全配对的DNA的特性，可将其用于基因突变的检测。

首先，PCR扩增出带有突变位点的DNA片段。突变位点通常位于编辑CRISPR/Cas9基因的位置。PCR扩增产物长度最好控制在500bp左右，且点突变最好不应位于产物序列的中央，以免切割后产生两个大小相等的条带。PCR产物纯化后用于后续实验。

其次，将纯化后的DNA产物加入至T7EI反应体系中，并进行加热变性、程序化退火复性处理。反应体系：加热变性、程序化退火复性程序：95℃，5min；95℃-85℃，以2℃/s的速率降温；85℃-25℃，以0.1℃/s的速率降温，-20℃保存产物。

再次，将加热变性、程序化退火复性处理后的产物进行T7EI酶切处理。向19μL的反应体系中加入1μL T7EI，在37℃水浴中孵育20min。加入1.5μL0.25M EDTA终止酶切反应。

最后，通过琼脂糖凝胶电泳检测消化产物浓度为2％，并分析检测结果。

⑤小鼠受精卵显微注射和胚胎移植

使用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除或基因敲入(Knock-in)的基因修饰小鼠，需要将体外转录出的Cas9mRNA或蛋白质以及sgRNA通过显微注射的方法注入小鼠的受精卵中。小鼠受精卵显微注射和胚胎移植手术程序

(1)小鼠受精卵的获取

选取4-7周龄的健康雌性小鼠(本研究中所用小鼠为C57BL/6J)，根据以下程序进行激素诱导的超排卵。每日13:00左右小鼠腹腔注射10IU的PMSG，46-48小时后腹腔注射10IU的HCG，并与雄性小鼠按照雌雄比为1:1的情况进行合笼饲养。在共笼饲养20-22小时后，测试具有激素超数排卵的雌性小鼠的阴道栓剂，并且处死具有阴道栓剂的雌性小鼠以获得受精卵。

通过颈椎脱臼处死阴道栓剂的小鼠，打开腹腔，将输卵管放入M2溶液。在体视显微镜下，找到输卵管的壶腹部。用镊子轻轻撕开输卵管的壶腹部，从输卵管中释放聚集的胚胎。在室温下用0.1％透明质酸酶消化附聚的受精卵2分钟。将包裹在胚胎周围的颗粒细胞分离，收集暴露的受精卵。将收集到的胚胎用M2培养液和体外培养液KSOM洗净，并移入由KSOM做成的微滴中进行培养，用于显微注射操作。培养体系：20μL KSOM-AA(Millipore MR-121-D)微滴，覆矿物油(35mm培养皿覆盖2.5mL MineralOil)，在37℃，5％CO₂下，在每个液滴中培养10个受精卵，并且培养过程没有改变。

(2)小鼠1-cell阶段受精卵显微注射

a显微注射针制作

用SUTTER公司的P-97拉针仪拉制SUTTER有芯玻璃电极(BF-100-78-10，长10cm，外径1.0mm，内径0.78mm)。拉针参数:P＝300，Heat316，Pull55，Velocity50，Time80。

注射针使用前在锻针仪上对前端进行打弯处理，打湾角度为20～25°。首先，从供体母鼠中获取1-细胞阶段的胚胎，在体外由显微注射系统将Cas9mRNA以及sgRNA注入胚胎的细胞质当中。其次，注射的胚胎在体外培养，发育成2细胞或桑椹胚、囊胚阶段。最后，通过输卵管移植将2细胞胚胎转移到受体母亲的输卵管中。通过子宫移植将桑椹胚和囊胚移植到受体母体的子宫中。

b显微注射用固定针制作

国内无芯玻璃管(长10厘米，外径1.0毫米，内径0.75毫米)由酒精灯的外部火焰加热。徒手拉制成末端直径为100～150μm的玻璃针胚，然后再锻针仪(Narishigi Co.)上进行断口、缩口、打弯等处理。将玻璃管前端缩小成内径为15～25μm的断口，打弯角度同注射针。

c显微注射

从-80℃中取出sgRNA和mRNA并按照10ng/μL的比例进行混合，将注射针倒置放入盛有RNA的eppendorf管中，以便使注射针的针尖充满RNA注射液。将拉制好的固定针和充满液体的注射针装载在显微操作仪上，并调整好显微注射时两针之间的角度，以及与显微操作液(M2液)微滴间的角度，准备进行显微注射操作。

在同一天分离的受精卵体外培养1至2小时后开始显微注射。从培养箱中取出含有胚胎的培养皿，在倒置显微镜下选择适于显微注射操作的胚胎。并用M2液清洗两次，移入显微操作液中，进行胞质注射，将RNA液注射于细胞质中，并尽量减小对胚胎的损伤。将注射后的胚胎从显微注射操作液中移出，并在体视镜下观察显微注射后胚胎的状况，并将状况良好、存活的胚胎用KSOM液清洗两次，然后，将其转移到体外培养液KSOM的液滴中，并置于培养箱中进行培养。培养体系：20μL KSOM-AA(Millipore MR-121-D)微滴，覆矿物油(35mm培养皿覆盖2.5ml Mineral Oil)，37℃，5％CO2，100％湿度，每个液滴中有10个受精卵，培养过程不换液。

d胚胎移植

(1)输卵管结扎雄鼠的制备

挑选8周龄健康雄鼠，水合氯醛(4％)以0.20ml/20g麻醉后，腹腔开口并找到双侧输卵管，用烧热的镊子烫断输卵管，恢复睾丸和内脏，缝合腹膜，肌肉和皮肤，并对缝合伤口进行消毒。单笼饲养恢复两周后，试配种一周后作为假孕公鼠配种使用。

(2)假孕雌鼠准备

挑选6～8周龄健康C57BL/6J品系雌鼠，并按照雌雄1:1比例与输卵管结扎雄性合笼，第二天，检查雌性大鼠的阴道栓剂。选择具有明显阴道栓剂的雌性大鼠用作胚胎移植的雌性接受者。此时母鼠记为见栓0.5天。同时，雌性小鼠作为受体不应超重，否则会影响胚胎移植的效果。

(3)胚胎移植

使用输卵管胚胎移植法显微注射1细胞受精卵，将发育成2细胞胚胎通过输卵管伞转移到假孕雌性的输卵管壶腹中，该壶腹部观察栓剂0.5天。或者采用子宫内胚胎移植的方法，将显微注射完成体外培养后生长至桑葚胚或囊胚的胚胎，移植入受体小鼠的子宫中，观察3.5天或4.5天。输卵管胚胎移植具体操作如下:

观察0.5天的假孕雌性用水合氯醛(4％)以0.20ml/20g麻醉。将小鼠背部朝上放置在手术台上，用酒精对背部皮肤进行消毒处理，在背部中线中下部位置用剪刀剪开一长为1厘米的创口，用镊子对皮肤和肌肉进行钝性剥离，通过体壁寻找卵巢所在位置，用镊子夹起体壁，并剪开一创口，用镊子将脂肪垫固定在卵巢上并将其拖出体外。以保证卵巢和子宫不受到创伤。在高倍体视镜下观察输卵管的盘旋走向，以判断输卵管伞开口的位置，当位置确定后，用钟表镊子轻轻的撕开包裹在卵巢外的卵巢膜，使输卵管伞端暴露出来，并加以固定。

将培养的胚胎从培养箱中取出，在体视显微镜下观察胚胎的发育。培养至1.5天的小鼠胚胎发育至2-细胞阶段。从培养的胚胎中，选择已发育至2细胞期的胚胎并在M2体外操作溶液中洗涤两次。将其按照15枚/移植管将其吸入移液管中，准备用于移植。

将移植管插入输卵管开口，使其深入输卵管，但避免损坏输卵管。轻轻地将液体吹入输卵管，使胚胎进入输卵管。用镊子再次将脂肪垫夹在卵巢上，轻轻地将子宫和卵巢放回体内，缝合体壁和皮肤伤口。将术后小鼠置于较温暖的位置，直至它们自然被唤醒。移植后的雌鼠一般在假孕见栓后的第19天进行分娩。

在胚胎移植过程中，可采用单侧输卵管移植或双侧输卵管移植。通常在实验中使用的是双侧输卵管移植的方法。输卵管的每一侧通常移植10至15个胚胎，并且应移植总共20至30个胚胎。

此外，本发明中所提及的试剂、试验过程中的材料或处理试剂未提及部分均可通过市售所得，测试方法为现有文献可以查询的方法。

二、实验结果

实施例1：高龄对小鼠体内卵细胞BER的影响。

年龄对小鼠卵细胞BER的影响见图1。DNA氧化损伤是DNA受到ROS攻击造成的，8-OHdG是氧化损伤的中间产物，需要进行BER才能去除。图1结果显示随着年龄增加，8-OHdG被修复的效率下降，说明年龄会影响卵细胞内BER效率(图1，P＜0.05)

为了探究高龄导致卵细胞修复下降的原因。我们卵细胞提取物进行SP-和LP-BER测定。SP-和LP-BER反应体系分别包含U底物和F底物。反应体系同时也包含我们设计的U-DNA和F-DNA，首先UDG和APE1协同作用在DNA双链上产生切口，带有放射性同位素P32标记的游离dCTP被插入，以及一块插入的dATP\dGTP\dTTP一块产生长度为20-30个碱基未连接的中间产物，这段中间产物一直延伸，最终形成长度约41nt的修复完成产物。结果如图2所示，实验中我们观察到在年轻卵细胞中，含有尿嘧啶和四氢呋喃的损伤DNA被修复完成；而在高龄组卵细胞中却未被修复，尽管带有放射性游离的32P-dCTP也被加入到高龄组的卵细胞中进行SP-和LP-BER反应中。

实施例2：高龄对小鼠BER关键基因蛋白表达量的影响

从实施例1的结果可以看出，高龄组卵细胞BER修复效率下降很可能与BER关键蛋白表达量下降有关。为了寻找年龄导致卵细胞DNA损伤累积的潜在原因。我们对年轻与高龄卵细胞按照1.3.1的方法，进行免疫荧光实验，结果如图3所示，从图3的结果可以看出，高龄组较年轻组三个基因蛋白表达减少。

实施例3：高龄对小鼠BER关键基因转录水平的影响

我们采用1.3.7方法，荧光定量QPCR检测年轻组与高龄组卵细胞中关键蛋白表达量差异，结果如图4所示，结果显示高龄组中FEN1、APE1及Polβ(图4；P＜0.05；P＜0.01；P＜0.001)较年轻组显著下降。上述实验结果提示年龄导致卵细胞受损的潜在机制可能是年龄导致BER功能受损引起的。

实施例4：受损的BER对卵巢老化的影响

为了进一步证明DNA损伤与BER修复平衡对于维持卵巢储备的重要性，我们在小鼠腹腔内注射5-氟尿嘧啶(5-FU；一种结构类似于尿嘧啶和胸腺嘧啶)，特异性需要BER修复。通过使用5-FU来破坏DNA损伤与BER平衡，结果如图5所示，实验结果显示5-FU注射的卵巢中卵细胞巢中卵细胞Caspase3激活，5-FU会促进卵巢中卵细胞的凋亡。

实施例5：Polβknockdown小鼠卵巢储备及生殖能力

我们选择Polβ半敲除的杂合小鼠(Polβ^+/-)作为研究对象。首先建立Polβ缺陷的小鼠模型，RT-QPCR比对Polβ^+/-与野生型的差异来筛选Polβ^+/-杂合型小鼠(Mice aged 6～8weeks，图6A，P＜0.001)。如图6所示，结果显示Polβ^+/-超促排卵获成熟卵细胞数量，以及产仔数也显著少于WT(图6B，P＜0.001；图6D，P＜0.01)。同时，在5日龄和4月龄小鼠卵巢中卵细胞数均显著低于同龄的WT小鼠(图6C，P＜0.01)。这些结果提示在年轻Polβ^+/-小鼠中受损的BER会导致卵巢老化的现象。

实施例6：Polβknockin小鼠卵巢储备及生殖能力

进一步地，我们对Polβknockin小鼠的卵巢储备及生殖能力进行研究，结果如图7所示，我们选择Polβ^R137Q/R137Q小鼠作为研究对象，检测了Polβ^R137Q/R137Q小鼠卵细胞Polβ表达量，如图7A所示，结果显示Polβ^R137Q/R137Q卵细胞与WT小鼠卵细胞Polβ表达量没有显著差异。

我们检测了Polβ^R137Q/R137Q Ap sites。结果显示Polβ^R137Q/R137Q小鼠Ap sites数显著多于WT小鼠(图7B；P＜0.05)。同时，Polβ^R137Q/R137Q小鼠排卵数与产仔数均显著低于WT小鼠((图7D和图7E，P＜0.05)。此外，Polβ^R137Q/R137Q小鼠卵细胞活化Caspase3荧光强度显著高于WT小鼠卵细胞。这些发现支持卵细胞中Polβ的失活，导致凋亡信号的激活。(图7C；P＜0.01)。

实施例7：年轻小鼠卵细胞敲降BER相关基因对卵细胞凋亡的影响

在我们接下来一系列实验中，我们实验结果表明相比于年轻卵细胞，高龄卵细胞在体外双氧水作用下，存活率显著降低，提示高龄卵细胞修复DNA损伤的能力显著降低。

为了进一步探究Polβ及其BER通路在保护卵细胞遗传稳定性及存活上发挥的作用，我们向年轻小鼠卵细胞中分别注射FEN1、APE1和Polβ小分子RNA干扰序列，然后将注射后的卵细胞暴露在双氧水中，年轻小鼠卵细胞敲降BER相关基因对卵细胞凋亡的影响结果见图8，从图8中可以看出，年轻小鼠卵细胞敲降BER相关基因导致卵细胞凋亡增加。相比于未敲降的卵细胞，三种siRNA注射后的卵细胞均表现出Caspase3激活，提示对BER关键蛋白干扰会导致卵细胞中凋亡信号通路的激活(图8A；P＜0.01；P＜0.01；P＜0.01)。同时，三种siRNA敲低卵细胞的存活率显著降低(图8B；P＜0.01；P＜0.01；P＜0.001，)；这些实验结果提示Polβ介导的BER通路在维持卵细胞存活上发挥关键作用。

实施例8：高龄小鼠卵细胞过表达Polβ基因减少卵细胞凋亡

之前实验结果显示Polβ^+/-小鼠卵巢功能下降以及受损的BER都会导致卵巢老化。我们设计了实验来证明Polβ缺陷小鼠与卵巢老化之间的关系。我们将同为年轻的WT小鼠卵细胞与Polβ^+/-小鼠卵细胞放入H₂O₂中处理，结果如图9，显示Polβ^+/-小鼠卵细胞存活率显著低于WT小鼠卵细胞。(图9A；P＜0.001).

将制备的Polβ过表达质粒质粒，该质粒的测序结果如SEQ ID NO.1所示(加粗部分为目的基因片段)：

接下来，为了检测是否过表达Polβ能延缓卵细胞遭受伤害，我们将注射Polβ质粒(pEX-1重组载体，如图11所示,表达的目的基因的载体序列如SEQ ID NO.1所示，来源吉玛制药技术有限公司)、注射空载及未注射的卵细胞同时放入H₂O₂中。然后检测它们的存活率。结果显示在高龄组卵细胞中过表达Polβ在一定程度上能抵御外界的不良刺激(图9B，P＜0.05)，同时我们注意到图9D显示高龄组卵细胞FEN1和APE1也减少，它们也参与BER进程中。我采用QPCR检测了过表达Polβ的卵细胞与未过表达的卵细胞在APE1、FEN1、XRCC1、LigaseⅠ、LigaseⅢα、PCNA和RAD51相关基因表达水平的差异。最终结果显示LigaseⅠ、LigaseⅢα和RAD51存在显著差异(图9D；P＜0.01P＜0.001；P＜0.001)，其他基因未出现显著变化。

所有这些结果显示，完整的DNA BER在保护卵细胞基因完整性以及存活上是至关重要的。此外，对Polβ功能恢复可以适当延缓卵细胞衰老。上述一系列结果一致反映Polβ在卵巢老化进程中扮演的重要作用，并且完整的BER在维持卵细胞数量与基因组稳定性上发挥不可或缺的重要作用。通过调控Polβ表达量来影响卵细胞存活，其他基因未出现显著变化。提示过表达Polβ并不会影响BER其他关键基因。

实施例9：高龄导致卵细胞Polβ表达量及活性下降呈现综合效应而非叠加效应

AMH是一种敏感的血清标志物，可预测原始卵泡储备和绝经年龄。我们检测了年轻组、高龄组、年轻Polβ^+/-组、年轻Polβ^R137Q/R137Q组小鼠血清AMH含量，从而比较四组小鼠中卵巢储备的差异，如图10所示。实验结果表明，尽管同为年轻小鼠，Polβ^+/-组AMH显著低于年轻组(图10A；P＜0.001)。此外，结合前面的实验结果，Polβ^R137Q/R137Q组在卵巢储备上也显著降低，我们假设年龄不仅影响Polβ表达量，也可能影响Polβ活性。为验证我们的推测，我们继续分析了年轻小鼠、高龄小鼠、年轻Polβ^+/-小鼠、年轻Polβ^R137Q/R137Q小鼠之间AMH差异。年轻的Polβ^+/-小鼠和年轻的Polβ^R137Q/R137Q小鼠比年轻WT小鼠更低的AMH水平(图10A；P＜0.05)，结果反映年轻Polβ^+/-小鼠与年轻的PolβR137Q/R137Q小鼠卵巢储备均下降，这也符合我们的假设,年龄不仅影响Polβ表达量，同时影响Polβ活性。

上述结果显示，卵细胞中Polβ基因表达量与活性同时下降与年龄导致的卵巢储备下降密切相关。为了进一步验证这一结论，我们使用两种转基因动物杂交获得子代基因型来检测年龄导致Polβ表达量与活性下降之间的相关性。我们将Polβ^+/-和Polβ^R137Q/R137Q两种转基因动物杂交，获得5种基因型的子代(Polβ^+/+，Polβ^+/-，Polβ^+/R137Q，Polβ^R137Q/R137Q，Polβ^R137Q/-)。然后对各基因型子代卵巢进行Caspase3免疫组化。我们通过分析各基因型卵巢内卵细胞的荧光强度(图10B所示)，最终将得到的数据排序，依据荧光强度由低到高分别为Polβ^+/+＜Polβ^R137Q/R137Q＜Polβ^+/-＜Polβ^R137Q/-。结果符合Polβ^+/-小鼠和Polβ^R137Q/R137Q小鼠血清AMH含量不同。卵巢自然老化进程中，Polβ表达量与活性同时受影响，其结果最终均表现为卵巢储备下降。这些结果再次表明Polβ表达量下降以及活性下降均会导致卵巢老化。此外，实验结果表明，Polβ^R137Q/-基因型小鼠的卵细胞凋亡信号最强，但由于小鼠卵巢储备从出生到耗竭需要数月之久，提示高龄导致卵巢储备下降可能是由于Polβ表达量下降与活性下降彼此并存的综合效应而非Polβ^R137Q/-基因型表现出最为严重的叠加效应。上述实验结果再次有力证明Polβ在维持卵巢储备中发挥着关键作用。

我们也发现卵细胞中Polβ与BER通路中其他相关蛋白也随年龄增加而显著下降。通过使用QPCR鉴定得到Polβ缺陷小鼠，并进行了一系列围绕Polβ缺陷小鼠实验，我们发现DNA修复效率在卵巢储备维持上发挥重要作用。RNA干扰实验也表明BER通路对于卵细胞存活和遗传稳定性起关键作用。

从以上结果可以看出，随着年龄增长，减数分裂错误增加，同时染色体异常增多，导致卵巢储备和生育力下降，妊娠失败。由于BER相关基因在三十岁以后表达量快速下降，卵细胞储备和质量在后期同时也加速下降。故涉及DNA BER机制在端粒维持中发挥的重要作用。此外，随着年龄增长，导致BER下降的表观遗传现象可能会给卵巢衰老带来新的见解，同样，这可能会打开未治疗的新思路，通过增强DNA修复效率，来延缓卵巢老化的速率，推迟更年期到来。

从以上实验结果可以看出，将Polβ质粒(Polβ过表达质粒)注射到卵细胞同时放入H₂O₂中，在高龄组卵细胞中过表达Polβ在一定程度上能抵御外界的不良刺激，表明通过基因编辑技术(CRISPR/Cas9)将靶向Polβ基因的sgRNA导入细胞中，增加Polβ在高龄小鼠中的表达量，可以延缓卵巢的衰老，故靶向Polβ基因的sgRNA、或含有靶向Polβ基因的sgRNA的质粒可用于制备延缓人类卵巢衰老的试剂或者药物中。

序列表

<110> 南京师范大学

<120> Polβ过表达质粒、细胞模型及其在抗卵巢衰老药物中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1008

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagcaaac gcaaggcgcc gcaggagacc ctcaacggcg gcatcacgga catgctcgtg 60

gaactcgcaa actttgagaa gaacgtgagc caggcgatcc acaagtacaa tgcgtacaga 120

aaagcggcat ctgtgatagc caagtaccca cacaaaatca agagcggagc ggaagctaag 180

aaactgccag gagtaggaac aaaaattgct gaaaagattg atgaattttt agcaactgga 240

aaattgcgta aactggaaaa gattcgtcaa gatgatacaa gttcatccat caatttcctg 300

actcgagtta ctggcattgg accatctgct gcaaggaagt ttgtagatga aggaattaag 360

acattagaag atctcaggaa aaatgaagat aaactgaacc atcatcaacg aattgggctg 420

aaatatttcg aggactttga aaagagaatt cctcgtgagg aaatgctgca gatgcaggat 480

attgtactta atgaaattaa aaaagtggac tctgagtaca ttgctacagt ctgtggcagt 540

ttcagaagag gcgcagagtc gagtggagac atggatgtcc tgctgaccca cccaaacttc 600

acgtcagaat ccagcaaaca gccaaagttg ttacatcgtg ttgtggaaca gttacaaaaa 660

gtccatttca ttacagatac tctgtcaaag ggtgaaacaa agttcatggg tgtttgccag 720

cttcccagcg agaaggatgg aaaggaatat ccacacagga gaatcgatat caggttgatc 780

cccaaagatc agtactactg tggtgttctc tacttcactg ggagtgacat ctttaataag 840

aacatgagag cgcacgccct ggaaaagggc ttcacaatca atgagtacac catccgcccc 900

ctgggggtca ctggagtcgc tggggagccc cttcctgtgg acagtgagca ggacattttt 960

gattacatcc agtggcgcta ccgggagccc aaggatagaa gtgaatga 1008

Claims (8)

1.一种Polβ过表达质粒，其特征在于，所述过表达质粒包含表达Polβ基因的核酸序列。

2.根据权利要求1所述的过表达质粒，其特征在于，所述过表达质粒的载体质粒为真核表达质粒。

3.如权利要求1所述的过表达质粒在制备治疗卵巢衰老药物或制剂中的应用。

4.一种细胞模型，其特征在于，所述细胞模型中包含如权利要求1所述的过表达质粒。

5.根据权利要求4所述的细胞模型的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：将权利要求1所述的过表达质粒注射于细胞中。

6.根据权利要求5所述的细胞模型的制备方法，其特征在于，所述细胞为卵细胞或者胚胎干细胞。

7.如权利要求4或如权利要求5或6制备的细胞模型在制备治疗卵巢衰老药物或制剂中的应用。

8.一种抗卵巢衰老药物或制剂，其特征在于，包含如权利要求1或2所述的Polβ过表达质粒，或包含如权利要求4所述的细胞模型。

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