CN115152696A - 一种建立大鼠卵巢早衰模型的方法及应用 - Google Patents
一种建立大鼠卵巢早衰模型的方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及一种建立大鼠卵巢早衰模型的方法及应用,包括如下步骤:取健康大鼠,对其腹部区域进行剃毛暴露操作区域,在操作区域涂抹耦合剂;将超声探头置于操作区域,在超声引导下获取大鼠卵巢脏器;在超声实时引导下将穿刺针针头刺入大鼠卵巢脏器;使用注射针将带有荧光染料的化疗药物通过穿刺针注入大鼠卵巢脏器内;取出注射针,使用生理盐水冲洗穿刺针内药物,术后饲养。本申请利用超声可视化、便捷的优点,在超声引导下可直接获得卵巢脏器位置,结合穿刺技术直接将化疗药物注入卵巢脏器内,仅需要单次给药,对全身其他脏器的不良反应较少,机体耐受性强,造模成功率高,具有大鼠死亡率低、建模周期短、操作简单、效率高等优点。
Description
技术领域
本申请涉及动物模型技术领域,特别涉及一种建立大鼠卵巢早衰模型的方法及应用。
背景技术
卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)是一种异质性疾病,具有多病因发病机制,包括染色体、遗传、酶、感染和医源性原因。2015年12月欧洲人类生殖与胚胎学会(ESHRE)起草“POI处理指南,POI诊断标准:(1)年龄<40岁。(2)月经稀发或停经至少4个月及以上。(3)两次(间隔>4周)血FSH>25mIU/mL。卵巢早衰是年轻女性各种恶性疾病细胞毒性化疗的重要后遗症,化疗药物(如环磷酰胺、雷公藤多甙、白消安)构建的卵巢早衰动物模型是各项卵巢早衰研究中必不可少的技术之一。
相关技术中,较为通用的卵巢早衰化疗药物造模方法是在整个造模周期中,通过连续静脉、腹腔注射或者灌胃给药半个月甚至2个月,造模时间久,且由于利用的是全身给药造成卵巢损伤副作用构建卵巢早衰模型,化疗药物归巢并迁移到卵巢组织的特性效果有限,需要加大注射剂量,增加了全身其他脏器严重不良反应(如肝损伤,膀胱出血,肠梗阻等)的风险,动物存活率小,常由于其他脏器损伤而死亡。因此,目前现有的卵巢早衰造模方法存在周期长,不良反应大,动物死亡率高,成本大,成功率低等问题。
发明内容
本申请实施例提供一种建立大鼠卵巢早衰模型的方法及应用,以解决相关技术中动物卵巢早衰造模方法存在周期长、不良反应大、动物死亡率高、成本大、成功率低的问题。
第一方面,本申请提供了一种建立大鼠卵巢早衰模型的方法,包括如下步骤:
取健康大鼠,对其腹部区域进行剃毛暴露操作区域,在操作区域涂抹耦合剂;
将超声探头置于所述操作区域,在超声引导下获取大鼠卵巢脏器;
在超声实时引导下将穿刺针针头刺入大鼠卵巢脏器;
使用注射针将带有荧光染料的化疗药物通过所述穿刺针注入大鼠卵巢脏器内;
取出注射针,使用生理盐水冲洗所述穿刺针内药物,术后饲养,得到大鼠卵巢早衰模型。
一些实施例中,所述“对其腹部区域进行剃毛暴露操作区域”之前还包括:
对大鼠禁食5~6h,使用1.5%~2%的戊巴比妥钠溶液按0.2ml/100g~0.25ml/100g注射麻醉大鼠。
一些实施例中,大鼠卵巢脏器的超声探测呈不规则、扁椭圆形,0.5~1cm的液性暗区。
一些实施例中,所述大鼠为6~7周龄的Wistar雌性大鼠。
一些实施例中,所述化疗药物包括环磷酰胺溶液;
所述环磷酰胺溶液的浓度为9μg/μL~10μg/μL,注射量为40μL~50μL。
一些实施例中,所述“取出注射针,使用生理盐水冲洗所述穿刺针内药物,术后饲养,”包括:
取出注射针,使用生理盐水冲洗所述穿刺针内药物,取1-2只大鼠12h内处死,利用活体成像仪观察卵巢荧光强度,其余大鼠术后饲养。
一些实施例中,所述“术后饲养”期间,对大鼠进行为期两周的阴道涂片,观测动情周期变化。
一些实施例中,阴道涂片处理周期结束后处死大鼠,取卵巢进行HE染色。
一些实施例中,还包括:
记录大鼠注射化疗药物前后的卵巢直径。
第二方面,本申请还提供了上述建立大鼠卵巢早衰模型的方法的应用,应用于卵巢早衰的研究,所述研究包括医药作用机制和/或临床疗效评价和/或新药开发。
本申请提供的技术方案带来的有益效果包括:本申请利用超声具有可视,便捷的优势,在超声引导下可直接获得卵巢脏器位置,结合穿刺技术直接将化疗药物注入卵巢脏器内,利用化疗药物对卵巢造成功能损伤,由此构建大鼠卵巢早衰模型,本申请方法仅需要单次给药,相比于现有静脉注射、腹腔注射或者灌胃的给药方式,卵巢内直接给药对全身其他脏器的不良反应较少,机体耐受性强,造模成功率高,可以有效避免全身给与化疗药物造成的多器官损伤、死亡高、周期长、操作繁琐、效率较低等问题,对于研究化疗药物构建卵巢早衰模型切实可行。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例建立大鼠卵巢早衰模型的方法流程图;
图2为本申请实施例B组大鼠穿刺前卵巢超声成像;
图3为本申请实施例B组大鼠注射化疗药物后卵巢超声成像;
图4为本申请实施例B组大鼠注射化疗药物后卵巢的活体成像图;
图5为本申请实施例A组大鼠动情周期示意图,其中P、E、M、D依次为:发情前期,发情期,发情后期,发情间期;
图6为本申请实施例B组大鼠动情周期示意图,其中P、E、M、D依次为:发情前期,发情期,发情后期,发情间期;
图7为本申请实施例C组大鼠动情周期示意图,其中P、E、M、D依次为:发情前期,发情期,发情后期,发情间期;
图8为本申请实施例A组大鼠卵巢组织的HE染色图;
图9为本申请实施例B组大鼠卵巢组织的HE染色图;
图10为本申请实施例穿刺针刺入大鼠卵巢实质时的超声成像。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本申请实施例中的附图,对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本申请的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本申请保护的范围。
第一方面,本申请实施例提供了一种建立大鼠卵巢早衰模型的方法,包括如下步骤:
101:取健康大鼠,对其腹部区域进行剃毛暴露操作区域,在操作区域涂抹耦合剂;
102:将超声探头置于所述操作区域,在超声引导下获取大鼠卵巢脏器;
103:在超声实时引导下将穿刺针针头刺入大鼠卵巢脏器;
104:使用注射针将带有荧光染料的化疗药物通过所述穿刺针注入大鼠卵巢脏器内;
105:取出注射针,使用生理盐水冲洗所述穿刺针内药物,术后饲养,得到大鼠卵巢早衰模型。
本申请利用超声具有可视,便捷的优势,在超声引导下可直接获得卵巢脏器位置,结合穿刺技术直接将化疗药物注入卵巢脏器内,利用化疗药物对卵巢造成功能损伤,由此构建大鼠卵巢早衰模型,本申请方法仅需要单次给药,相比于现有静脉注射、腹腔注射或者灌胃的给药方式,卵巢内直接给药对全身其他脏器的不良反应较少,机体耐受性强,造模成功率高,可以有效避免全身给与化疗药物造成的多器官损伤、死亡高、周期长、操作繁琐、效率较低等问题,对于研究化疗药物构建卵巢早衰模型切实可行。
在一些实施例中,所述“对其腹部区域进行剃毛暴露操作区域”之前还包括:
对大鼠禁食5~6h,使用1.5%~2%的戊巴比妥钠溶液按0.2ml/100g~0.25ml/100g注射麻醉大鼠。
对大鼠禁食5~6h,避免因大鼠进食而导致腹腔气体增加,影响超声影像质量,对大鼠进行麻醉,避免因大鼠肢体移动而造成超声和穿刺困难,具体的,麻醉药物包括但不限于上述戊巴比妥钠溶液,也可采用本技术领域常用麻醉药物,在此不做特别的限定。
在一些实施例中,大鼠卵巢脏器的超声探测呈不规则、扁椭圆形,0.5~1cm的液性暗区。
具体的,使用超声探测大鼠卵巢脏器位置可采用本技术领域常规手段获得,大鼠卵巢脏器的超声强度一般呈低回声,并可见0.5~1cm液性暗区,其毗邻肾脏,血流较为丰富。
在一些实施例中,所述大鼠为6~7周龄的Wistar雌性大鼠。
进一步的,所述大鼠的体重位于200g左右。
在一些实施例中,所述化疗药物包括环磷酰胺溶液;
所述环磷酰胺溶液的浓度为9μg/μL~10μg/μL,注射量为40μL~50μL。
所述化疗药物容易引发永久性卵巢损伤,继而导致卵巢衰竭,进一步的,所述化疗药物还可以采用本技术领域常用化疗药物,例如:雷公藤多甙、白消安等。
所述环磷酰胺溶液的浓度和注射量在上述范围内,是发明人根据本申请卵巢内直接注射给药的方式,通过大量实验得出的结果,上述范围内的环磷酰胺溶液给药量能够在确保造成大鼠卵巢早衰的前提下尽量减小对其他脏器的不良副作用,提高大鼠存活率,从而提高造模成功率,降低生产成本。
在一些实施例中,所述“取出注射针,使用生理盐水冲洗所述穿刺针内药物,术后饲养,”包括:
取出注射针,使用生理盐水冲洗所述穿刺针内药物,取1-2只大鼠12h内处死,利用活体成像仪观察卵巢荧光强度,其余大鼠术后饲养。
进一步,优选所述生理盐水的用量为50μL,所述生理盐水用于将穿刺针内的残留药物冲至大鼠卵巢内,提高建模成功率。
在一些实施例中,所述“术后饲养”期间,对大鼠进行为期两周的阴道涂片,观测动情周期变化。
具体的,所述阴道涂片是指对大鼠阴道脱落细胞进行涂片观测,可采用本技术领域常规技术手段获得,进一步的,优选每天对大鼠进行阴道涂片,为期两周,以观测注射化疗药物后大鼠的动期周期变化,用于判断是否成功造成大鼠卵巢损伤。
进一步的,所述阴道涂片检测的判断标准可采用本技术领域常规标准,例如:
正常大鼠发情周期为4~5d。
发情前期:涂片撇圆形有核上皮细胞占绝大多数,白细胞和角化上皮细胞很少。
发情期:涂片角化上皮细胞占多大多数,由散在增至集白细胞和有核上皮细胞很少。
发情后期:涂片中片状角化上皮细胞,有核上皮细胞和白细胞3种都有,无太大差异。
发情间期:涂片白细胞占绝大多数,有核上皮细胞和角化上皮细胞很少。
在一些实施例中,阴道涂片处理周期结束后处死大鼠,取卵巢进行HE染色。
将所获卵巢进行HE染色用于观察大鼠卵巢形态超微结构,染色结果为细胞核呈蓝色,细胞浆、肌肉、结缔组织、红细胞和嗜伊红颗粒呈不同程度的红色,钙盐和各种微生物染成蓝色或蓝紫色。
在一些实施例中,还包括:
记录大鼠注射化疗药物前后的卵巢直径。
根据所述卵巢直径变化可判断是否有效将药物注入卵巢实质内部。
第二方面,本申请实施例还提供了上述建立大鼠卵巢早衰模型的方法的应用,应用于卵巢早衰的研究,所述研究包括医药作用机制和/或临床疗效评价和/或新药开发。
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
1.材料与方法
1.1实验动物
健康雌性Wistar大鼠40只,体重200g左右。
1.2主要药物与试剂
2%的戊巴比妥钠、环磷酰胺、罗丹明、生理盐水。
1.3主要耗材与设备
剃毛刀、7号/22G穿刺针、1mL注射器、超声仪Voluson E10、超声探头11L、活体成像仪。
1.4方法
1.41实验前准备:
利用生理盐水配置浓度为0.02mol/L的罗丹明溶液,然后加入环磷酰胺分别配置成环磷酰胺浓度为9μg/μL的化疗药物溶液a、环磷酰胺浓度为3μg/μL的化疗药物溶液b、环磷酰胺浓度为18μg/μL的化疗药物溶液c,避光4℃保存;大鼠禁食5h(不禁水)。
1.42分组及大鼠卵巢早衰模型的建立:
将上述大鼠随机分成A、B、C、D四组,其中A组为对照组,B、C、D组为实验组,每组10只。
使用2%的戊巴比妥钠按0.2ml/100g腹腔注射于每只大鼠,大鼠仰卧位固定,对大鼠腹部区域进行剃毛和消毒,充分暴露操作区域,在操作区域涂抹耦合剂;
将低频超声探头置于操作区域,基于超声影像信息获取卵巢位置,记录卵巢穿刺前的长短径;
超声引导下,将7号/22G穿刺针刺入卵巢脏器内,针头到达一侧卵巢实质内,保持穿刺针位置不动,使用1mL注射器将表1各药物通过穿刺针注入大鼠卵巢内,分组及给药量如表1所示:
表1
组别 | 注射药物 | 注射量 |
A组 | 生理盐水 | 50μL |
B组 | 环磷酰胺浓度为9μg/μL的化疗药物溶液a | 50μL |
C组 | 环磷酰胺浓度为3μg/μL的化疗药物溶液b | 50μL |
D组 | 环磷酰胺浓度为18μg/μL的化疗药物溶液c | 50μL |
取出注射器,向穿刺针内注射50μL生理盐水,取出穿刺针,记录卵巢穿刺后的长短径;
使用同样步骤对实验组大鼠另一侧卵巢注射所述化疗药物溶液,对对照组大鼠另一侧卵巢注射生理盐水;
注射结束10h,从B组中随机取1只大鼠处死,解剖取卵巢使用活体成像仪观察卵巢荧光强度;
注射结束,正常饲养,期间每天对A组、B组、C组和D组大鼠进行阴道涂片,观测动期周期变化,观测周期为2周,其中A组、B组、C组和D组大鼠术后饲养过程中的死亡率分别为0%、0%、0%、20%;
动期周期变化观测结束,将A组、B组、C组和D组大鼠处死,取卵巢进行HE染色观察卵巢微观形态。
2.结果分析
根据图2卵巢穿刺前图像和图3卵巢注射药物后图像可以看出卵巢直径明显变大,说明本申请实施例提供的方法,基于超声引导,可准确定位卵巢实质并成功将药物注射入卵巢内;
根据图4中B组大鼠注射化疗药物溶液后的活体成像,大鼠卵巢出现荧光信号,说明本申请实施例提供的方法,基于超声引导,可准确定位卵巢实质并成功将药物注射入卵巢内,并稳定存在于卵巢内。
根据图5中A组大鼠动情周期变化图及图6中B组大鼠动情周期变化图可以看出,A组大鼠动情周期基本正常,B组大鼠随着术后时间的延长出现动情周期延长、紊乱现象。
根据图8中A组大鼠卵巢微观形态图像和图9中B组大鼠卵巢微观形态图像可以看出,A组大鼠可见较多初级卵泡、次级卵泡以及窦状卵泡,卵泡间质界限明显,B组大鼠可见总卵泡数、次级和窦状卵泡数明显减少,闭锁卵泡增多、卵巢间质出现纤维化,卵巢实质明显坏死,功能损伤。
根据图5中A组大鼠动情周期变化图及图7中C组大鼠动情周期变化图可以看出,C组大鼠由于化疗药物溶液的注射量过少,没有引起动情周期的过度紊乱,并未造成卵巢早衰程度的实质性损伤。
根据A组、B组、C组和D组大鼠术后饲养过程中出现的死亡率可以看出,D组大鼠由于化疗药物溶液的注射量过高,对身体其余脏器损害程度大,不利于大鼠的成活率,死亡率高。
综上,根据大鼠卵巢动情周期变化和卵巢微观状态可以得出本申请提供的方法对大鼠卵巢功能产生了实质损伤,能够有效建立化疗药物性大鼠卵巢功能早衰模型,进一步的,通过控制化疗药物的浓度和注射量,既能确保对大鼠卵巢造成引起卵巢早衰的损伤,同时可避免对其余脏器的副作用,从而提高大鼠存活率,该方法稳定可靠,对于治疗卵巢早衰的药物开发、临床研究等具有重要意义。
以上所述仅是本申请的具体实施方式,使本领域技术人员能够理解或实现本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本申请将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种建立大鼠卵巢早衰模型的方法,其特征在于,包括如下步骤:
取健康大鼠,对其腹部区域进行剃毛暴露操作区域,在操作区域涂抹耦合剂;
将超声探头置于所述操作区域,在超声引导下获取大鼠卵巢脏器;
在超声实时引导下将穿刺针针头刺入大鼠卵巢脏器;
使用注射针将带有荧光染料的化疗药物通过所述穿刺针注入大鼠卵巢脏器内;
取出注射针,使用生理盐水冲洗所述穿刺针内药物,术后饲养,得到大鼠卵巢早衰模型。
2.如权利要求1所述的建立大鼠卵巢早衰模型的方法,其特征在于,所述“对其腹部区域进行剃毛暴露操作区域”之前还包括:
对大鼠禁食5~6h,使用1.5%~2%的戊巴比妥钠溶液按0.2ml/100g~0.25ml/100g注射麻醉大鼠。
3.如权利要求1所述的建立大鼠卵巢早衰模型的方法,其特征在于,大鼠卵巢脏器的超声探测呈不规则、扁椭圆形,0.5~1cm的液性暗区。
4.如权利要求1所述的建立大鼠卵巢早衰模型的方法,其特征在于,所述大鼠为6~7周龄的Wistar雌性大鼠。
5.如权利要求1所述的建立大鼠卵巢早衰模型的方法,其特征在于,所述化疗药物包括环磷酰胺溶液;
所述环磷酰胺溶液的浓度为9μg/μL~10μg/μL,注射量为40μL~50μL。
6.如权利要求1所述的建立大鼠卵巢早衰模型的方法,其特征在于,所述“取出注射针,使用生理盐水冲洗所述穿刺针内药物,术后饲养,”包括:
取出注射针,使用生理盐水冲洗所述穿刺针内药物,取1-2只大鼠12h内处死,利用活体成像仪观察卵巢荧光强度,其余大鼠术后饲养。
7.如权利要求1所述的建立大鼠卵巢早衰模型的方法,其特征在于,所述“术后饲养”期间,对大鼠进行为期两周的阴道涂片,观测动情周期变化。
8.如权利要求7所述的建立大鼠卵巢早衰模型的方法,其特征在于,阴道涂片处理周期结束后处死大鼠,取卵巢进行HE染色。
9.如权利要求1所述的建立大鼠卵巢早衰模型的方法,其特征在于,还包括:
记录大鼠注射化疗药物前后的卵巢直径。
10.如权利要求1所述的建立大鼠卵巢早衰模型的方法的应用,其特征在于,应用于卵巢早衰的研究,所述研究包括医药作用机制和/或临床疗效评价和/或新药开发。
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