CN111011309A - 一种化疗药物致大鼠口腔溃疡模型建立方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种化疗药物致大鼠口腔溃疡模型建立方法及其应用，具体涉及口腔溃疡模型领域，包括以下操作步骤：S1、实验动物及试剂的准备；S2、动物分组；S3、采用甲氨蝶呤、顺铂注射液、紫杉醇注射液、注射用硫酸长春新碱和注射用盐酸多柔比星等五种化疗药诱导大鼠口腔溃疡模型建立；S4、造模观察；S5、采用统计学分析，得到化疗药物致大鼠口腔溃疡模型为：顺铂、紫杉醇致大鼠口腔溃疡模型。本发明化疗药顺铂，紫杉醇致大鼠口腔溃疡模型，可用于观察药物对化疗药诱导的口腔溃疡疗效评价，操作简单，溃疡形成稳定，可重复性强，是一个理想的模型。
Description
技术领域
本发明实施例涉及口腔溃疡模型领域，具体涉及一种化疗药物致大鼠口腔溃疡模型建立方法及其应用。
背景技术
口腔粘膜炎指口腔的炎性和溃疡性反应，是肿瘤患者放化疗常见的并发症之一，临床常表现为口腔异常疼痛，尤其在进食、说话等刺激后更明显，极大影响了患者的正常进食、语言交流以及睡眠，造成生活质量急剧下降，甚者阻碍其进一步治疗。目前对于此类并发症的治疗多以含漱液，生理盐水，锡类散等为主，但疗效不佳。因此，寻找新的治疗药物具有重要意义。
动物模型作为新药临床前药效评价重要的一部分，在整个新药研发中起到不可或缺的作用。目前口腔溃疡动物模型的制备方法主要有化学烧灼法、创伤法、氧自由基法、细菌感染诱导法等，化疗法诱导的口腔溃疡模型鲜有报道和运用，有文献提及，甲氨蝶呤诱导的口腔溃疡，在口腔溃疡的发生部位、药物种类、给药剂量及途径等方面还要进一步摸索。
发明内容
为此，本发明实施例提供一种化疗药物致大鼠口腔溃疡模型建立方法及其应用，通过选用甲氨蝶呤，顺铂，紫杉醇，阿霉素几种常用的化疗药物通过黏膜局部注射进行口腔溃疡模型摸索，通过观察和统计学分析，得到化疗药顺铂，紫杉醇致大鼠口腔溃疡模型，可用于观察药物对化疗药诱导的口腔溃疡疗效评价，操作简单，溃疡形成稳定，可重复性强，是一个理想的模型，以解决现有技术中存在的问题。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：一种化疗药物致大鼠口腔溃疡模型建立方法，包括以下操作步骤：
S1、实验动物及试剂的准备：选取SPF级SD雄性大鼠42只，每只重量200-220g；试剂准备顺铂注射液、紫杉醇注射液、注射用硫酸长春新碱、注射用盐酸多柔比星和甲氨蝶呤；
S2、动物分组：将SD大鼠随机分为正常组、甲氨蝶呤组、顺铂模型组、紫杉醇模型组、长春新碱模型组及阿霉素模型组，每组7只；
S3、化疗药诱导大鼠口腔溃疡模型建立：甲氨蝶呤组、顺铂模型组、紫杉醇模型组、长春新碱模型组及阿霉素模型组中，分别在大鼠右侧口腔颊膜黏膜内注射相应浓度的甲氨蝶呤、顺铂注射液、紫杉醇注射液、注射用硫酸长春新碱和注射用盐酸多柔比星等五种化疗药物，正常组注射生理盐水，注射体积为50ul/只，各组动物造模当天注射一次，造模后连续观察7d；
S4、造模观察：造模开始后，对各组中大鼠的体重进行观察，造模后对各组中大鼠的摄食量以及溃疡情况进行观察；
S5、采用统计学分析：采用SPSS13.0软件对步骤S4中的观察结果进行统计学分析，得到实验结果，并根据实验结果得到化疗药物致大鼠口腔溃疡模型为：顺铂、紫杉醇致大鼠口腔溃疡模型。
进一步地，步骤S1中所述的SPF级SD大鼠在恒温、恒湿、12h明暗交替条件下饲养，恒温温度为22-26℃，恒湿湿度为40%-60%。
进一步地，步骤S3中所述的甲氨蝶呤组内，在大鼠右侧口腔颊膜黏膜内注射的甲氨蝶呤浓度为5mg/ml，顺铂模型组内，在大鼠右侧口腔颊膜黏膜内注射的顺铂注射液浓度为5mg/ml，紫杉醇模型组内，在大鼠右侧口腔颊膜黏膜内注射的紫杉醇注射液浓度为6mg/ml，长春新碱模型组内，在大鼠右侧口腔颊膜黏膜内注射的注射用硫酸长春新碱浓度为1mg/ml，阿霉素模型组内，在大鼠右侧口腔颊膜黏膜内注射的注射用盐酸多柔比星浓度为8mg/ml。
进一步地，步骤S4中所述的对各组中大鼠的体重进行观察的具体方法为：造模开始后，每2d记录一次动物体重，观察动物的一般情况及体重变化。
进一步地，步骤S4中所述的对各组中大鼠的摄食量进行观察的具体方法为：造模后禁食24h，造模次日每组定量给予食物，记录每笼动物的摄食量，并计算平均每只动物每日摄食量。
进一步地，步骤S4中所述的对各组中大鼠的溃疡情况进行观察的具体方法为：造模后24h，肉眼观察并记录溃疡形成情况，包括溃疡的出现率、溃疡外形及大小，黏膜组织病理学观察，黏膜局部细胞因子的表达，观察记录溃疡愈合情况及愈合时间，愈合标准为黏膜上皮完全愈合，用镊子轻碰不会出现出血情况。
进一步地，步骤S5中所述的统计学分析的公式为：
计量数据以
表示，比较采用T检验，P<0.05表明差异具有显著性；式中，A为实际频数，T为理论频数，∑为求和符号。
本发明还包括一种化疗药物致大鼠口腔溃疡模型的应用，该化疗药物顺铂、紫杉醇致大鼠口腔溃疡模型，可用于观察药物对化疗药诱导的口腔溃疡疗效评价。
本发明实施例具有如下优点：
1、本发明选用甲氨蝶呤，顺铂，紫杉醇，阿霉素几种常用的化疗药物通过黏膜局部注射进行口腔溃疡模型摸索，通过观察和统计学分析，结果表明，顺铂和紫杉醇注射液组动物出现了明显溃疡，溃疡中央凹陷，边缘红肿，表面有化脓迹象，形状基本为规则圆形，相比免疫法诱导的口腔溃疡模型出现的溃疡出现部位，大小不均一和固定，本模型更便于观察；本模型在造模1wk后还能见到明显溃疡，愈合时间为10-14d，与化学损伤法诱导的溃疡愈合期6-9d相比，时间窗更长，更有利于观察药物的治疗效果；另外，本发明选用摄食量作为间接反应疼痛的指标，也观察到造模后各组动物摄食量明显减轻，以造模第3d，4d为明显，随后逐渐恢复，也便于观察；
2、本模型所观察到的局部炎症细胞因子如IL-1β表达升高，EGFR表达降低，也与化疗药所导致的口腔溃疡的临床病理变化一致，符合临床病理改变；
3、本发明化疗药顺铂，紫杉醇致大鼠口腔溃疡模型，可用于观察药物对化疗药诱导的口腔溃疡疗效评价，操作简单，溃疡形成稳定，可重复性强，是一个理想的模型。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引申获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
图1为本发明提供的各组大鼠造模后体重变化示意图；
图2为本发明提供的各组大鼠造模后摄食量变化示意图；
图3为本发明提供的各组大鼠造模后溃疡形成情况示意图；
图4为本发明提供的各组大鼠造模后黏膜组织病理学变化示意图；
图5为本发明提供的各组大鼠造模后黏膜局部细胞因子mRNA表达示意图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
该实施例的一种化疗药物致大鼠口腔溃疡模型建立方法，包括以下操作步骤：
S1、实验动物及试剂的准备：选取SPF级SD雄性大鼠42只，每只重量200-220g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司（合格证号：43004700064531），购进动物在恒温（22-26℃）恒湿（40%-60%），12h明暗交替条件下饲养，所有操作都符合江西中医药大学实验动物伦理学要求；试剂准备顺铂注射液（江苏豪森药业集团有限公司，批号190201）、紫杉醇注射液（北京双鹭药业股份有限公司，批号20190101）、注射用硫酸长春新碱（深圳万乐药业有限公司，批号1403V2）、注射用盐酸多柔比星（瀚晖制药有限公司，批号19006111）和甲氨蝶呤；Trizol， ambion,批号204212；逆转录试剂盒，Thermo scientific，批号00621709；SyberGreen 染料，applied biosystems,批号0075497；本发明中用到的引物序列根据NCBI设计，由深圳华大基因股份有限公司合成，各引物序列如下：
Gene Name Sense (5`-3`) Anti-scense (5`-3`)
β-actin CTCTGTGTGGATTGGTGGCT GCTCAGTAACAGTCCGCCT
IL-1β AGCTTCAGGAAGGCAGTGTC ATCCCACGAGTCACAGAGGA
TNF-α CTGTGCCTCAGCCTCTTCTC ACTGATGAGAGGGAGCCCAT
IL-6 TCCATCTGCCCTTCAGGAAC TGAAGTCTCCTCTCCGGACTT
IL-10 CGACGCTGTCATCGATTTCT TAGATGCCGGGTGGTTCAAT
EGFR CCACCAAGACAGGCGACG TCAGACTGAGTCCCACGGTC
TGF-β1 GTGGCTGAACCAAGGAGACG AGGTGTTGAGCCCTTTCCAG
S2、动物分组：将SD大鼠随机分为正常组、甲氨蝶呤组、顺铂模型组、紫杉醇模型组、长春新碱模型组及阿霉素模型组，每组7只；
S3、化疗药诱导大鼠口腔溃疡模型建立：甲氨蝶呤组内，在大鼠右侧口腔颊膜黏膜内注射的甲氨蝶呤浓度为5mg/ml，顺铂模型组内，在大鼠右侧口腔颊膜黏膜内注射的顺铂注射液浓度为5mg/ml，紫杉醇模型组内，在大鼠右侧口腔颊膜黏膜内注射的紫杉醇注射液浓度为6mg/ml，长春新碱模型组内，在大鼠右侧口腔颊膜黏膜内注射的注射用硫酸长春新碱浓度为1mg/ml，阿霉素模型组内，在大鼠右侧口腔颊膜黏膜内注射的注射用盐酸多柔比星浓度为8mg/ml，正常组注射生理盐水，注射体积为50ul/只，各组动物造模当天注射一次，造模后连续观察7d；
S4、造模观察：
体重观察：造模开始后，每2d记录一次动物体重，观察动物的一般情况及体重变化；
摄食量观察：造模后禁食24h，造模次日每组定量给予食物，记录每笼动物的摄食量，并计算平均每只动物每日摄食量；
溃疡肉眼观察：肉眼观察并记录溃疡形成情况，包括溃疡的出现率、溃疡外形及大小，观察记录溃疡愈合情况及愈合时间，愈合标准为黏膜上皮完全愈合，用镊子轻碰不会出现出血情况；
溃疡组织病理学观察：造模后第7天,各组动物随机选取3只，剪取大鼠右侧口腔颊膜黏膜造模部位组织放入10%中性缓冲福尔马林溶液中固定，常规石蜡包埋，切片，HE染色，显微镜下观察口腔黏膜组织病理学变化并拍照。
溃疡局部细胞因子mRNA表达：造模后第7天,各组选取3只动物，剪取大鼠右侧口腔颊膜黏膜造模部位组织，剔除黏膜下多余肌肉等组织，留取黏膜，放置液氮速冻后，剪碎，加入trizol匀浆，提取RNA，经逆转录成cDNA后，采用Q-PCR技术检测组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、EGFR、TGF-βmRNA表达情况。
S5、采用统计学分析：采用SPSS13.0软件对步骤S4中的观察结果进行统计学分析，统计学分析的公式为：
计量数据以
表示，比较采用T检验，P<0.05表明差异具有显著性；式中，A为实际频数，T为理论频数，∑为求和符号。
根据上述实验和统计得到以下实验结果：
a、造模后各组动物体重的变化：
由图1可以看出，各造模组动物在造模后，体重增长不明显，在造模第3天至第6天，增长明显比正常组缓慢，与正常组相比，体重明显减轻（P<0.05），造模第7天开始体重有所增长，除顺铂组外，其余各组体重与正常组没有明显差异；图1中，各组大鼠造模后体重变化（
，n=7）。
b、造模后各组动物摄食量的变化：
由图2可以看出，与正常组比，各组动物在造模后摄食量减少，以造模第3天摄食量最低，然后逐渐恢复，其中在造模第3天和第4天，各造模组和正常组相比，摄食量明显减少（P<0.01）,造模第5天，顺铂组和阿霉素组及造模第6天,顺铂组动物摄食量与正常组相比明显减少，差异具有统计学意义（P<0.05）。至造模第7天,各造模组动物摄食量基本恢复，和正常组动物摄食量相当。图2中，各组大鼠造模后摄食量变化（
，n=3）。
c、造模后各组动物口腔溃疡形成情况：
与正常组比，模型组各组动物口腔造模侧均出现肿胀，刺激疼痛反应强烈，其中以阿霉素最为明显。顺铂组与紫杉醇组动物造模侧黏膜出现明显的溃疡面，表现为溃疡中央凹陷，边缘红肿，表面有化脓迹象，形状基本为规则圆形，溃疡愈合时间为10-14d。而长春新碱组与阿霉素组动物造模侧除了明显肿胀，并未见黏膜溃疡形成，具体见图3；图3中：A对照组；B顺铂组；C 长春新碱组；D紫杉醇组；E阿霉素组；F甲氨蝶呤组。
d、造模后各组动物口腔黏膜组织病理学变化情况：
从黏膜组织HE染色看，正常组黏膜层上皮细胞排列整齐，黏膜完整；顺铂组和紫杉醇组黏膜上皮细胞层（如箭头所示）明显的脱落，缺损，但无明显炎性细胞浸润。甲氨蝶呤组、阿霉素组和长春新碱组黏膜上皮层结构完整，仅可见黏膜下导管腔扩张等，具体见图4。
e、局部炎症及相关细胞因子表达比较情况：
从炎性因子表达来看，造模7天后，与对照组比较，紫杉醇组、顺铂组、阿霉素组的IL-1βmRNA表达显著升高；与对照组比较，紫杉醇组IL-6mRNA表达显著升高，甲氨蝶呤组的IL-6mRNA表达明显降低，差异有显著性；紫杉醇组IL-10mRNA表达显著升高，阿霉素组、甲氨蝶呤组、长春新碱组IL-10mRNA表达有降低趋势；甲氨蝶呤组、长春新碱组在TNF-αmRNA与对照组比较，显著性下降。顺铂组、长春新碱组、紫杉醇组在EGFR mRNA表达有显著降低；紫杉醇组在TGF-βmRNA表达上与对照组比较显著性升高，其他组在与对照比较无显著性差异。具体情况见图5。
由上述实验结果可知：得到化疗药物致大鼠口腔溃疡模型为：顺铂、紫杉醇致大鼠口腔溃疡模型。顺铂和紫杉醇注射液导致的大鼠口腔溃疡模型，溃疡中央凹陷，边缘红肿，表面有化脓迹象，形状基本为规则圆形，相比免疫法诱导的口腔溃疡模型出现的溃疡出现部位，大小不均一和固定，本发明更便于观察；本发明在造模1wk后还能见到明显溃疡，愈合时间为10-14d，与化学损伤法诱导的溃疡愈合期6-9d相比，时间窗更长，更有利于观察药物的治疗效果。
本发明选用摄食量作为间接反应疼痛的指标，也观察到造模后各组动物摄食量明显减轻，以造模第3d，4d为明显，随后逐渐恢复，也便于观察。
本发明所观察到的局部炎症细胞因子如IL-1β表达升高，EGFR表达降低，也与化疗药所导致的口腔溃疡的临床病理变化一致，符合临床病理改变。
值得一提的是，阿霉素和甲氨蝶呤组动物并没有出现口腔溃疡，仅可见黏膜水肿，尤其是甲氨蝶呤，作为临床上最能引起口腔黏膜炎的化疗药物，在本次实验及课题组前期模型摸索（不同给药途径，给药剂量和给药疗程）中均未发现有口腔溃疡的出现，考虑为种属差异所致。
总之，化疗药顺铂、紫杉醇致大鼠口腔溃疡模型，可用于观察药物对化疗药诱导的口腔溃疡疗效评价，操作简单，溃疡形成稳定，可重复性强，是一个理想的模型。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种化疗药物致大鼠口腔溃疡模型建立方法，其特征在于：包括以下操作步骤：
S1、实验动物及试剂的准备：选取SPF级SD雄性大鼠42只，每只重量200-220g；试剂准备顺铂注射液、紫杉醇注射液、注射用硫酸长春新碱、注射用盐酸多柔比星和甲氨蝶呤；
S2、动物分组：将SD大鼠随机分为正常组、甲氨蝶呤组、顺铂模型组、紫杉醇模型组、长春新碱模型组及阿霉素模型组，每组7只；
S3、化疗药诱导大鼠口腔溃疡模型建立：甲氨蝶呤组、顺铂模型组、紫杉醇模型组、长春新碱模型组及阿霉素模型组中，分别在大鼠右侧口腔颊膜黏膜内注射相应浓度的甲氨蝶呤、顺铂注射液、紫杉醇注射液、注射用硫酸长春新碱和注射用盐酸多柔比星等五种化疗药物，正常组注射生理盐水，注射体积为50ul/只，各组动物造模当天注射一次，造模后连续观察7d；
S4、造模观察：造模开始后，对各组中大鼠的体重进行观察，造模后对各组中大鼠的摄食量以及溃疡情况进行观察；造模后对黏膜局部细胞因子表达情况进行观察；
S5、采用统计学分析：采用SPSS13.0软件对步骤S4中的观察结果进行统计学分析，得到实验结果，并根据实验结果得到化疗药物致大鼠口腔溃疡模型为：顺铂、紫杉醇致大鼠口腔溃疡模型。
2.根据权利要求1所述的一种化疗药物致大鼠口腔溃疡模型建立方法，其特征在于：步骤S1中所述的SPF级SD大鼠在恒温、恒湿、12h明暗交替条件下饲养，恒温温度为22-26℃，恒湿湿度为40%-60%。
3.根据权利要求1所述的一种化疗药物致大鼠口腔溃疡模型建立方法，其特征在于：步骤S3中所述的甲氨蝶呤组内，在大鼠右侧口腔颊膜黏膜内注射的甲氨蝶呤浓度为5mg/ml，顺铂模型组内，在大鼠右侧口腔颊膜黏膜内注射的顺铂注射液浓度为5mg/ml，紫杉醇模型组内，在大鼠右侧口腔颊膜黏膜内注射的紫杉醇注射液浓度为6mg/ml，长春新碱模型组内，在大鼠右侧口腔颊膜黏膜内注射的注射用硫酸长春新碱浓度为1mg/ml，阿霉素模型组内，在大鼠右侧口腔颊膜黏膜内注射的注射用盐酸多柔比星浓度为8mg/ml。
4.根据权利要求1所述的一种化疗药物致大鼠口腔溃疡模型建立方法，其特征在于：步骤S4中所述的对各组中大鼠的体重进行观察的具体方法为：造模开始后，每2d记录一次动物体重，观察动物的一般情况及体重变化。
5.根据权利要求1所述的一种化疗药物致大鼠口腔溃疡模型建立方法，其特征在于：步骤S4中所述的对各组中大鼠的摄食量进行观察的具体方法为：造模后禁食24h，造模次日每组定量给予食物，记录每笼动物的摄食量，并计算平均每只动物每日摄食量。
6.根据权利要求1所述的一种化疗药物致大鼠口腔溃疡模型建立方法，其特征在于：步骤S4中所述的对各组中大鼠的溃疡情况进行观察的具体方法为：造模后24h，肉眼观察并记录溃疡形成情况，包括溃疡的出现率、溃疡外形及大小，黏膜组织病理学观察，黏膜局部细胞因子的表达观察。
7.根据权利要求1所述的一种化疗药物致大鼠口腔溃疡模型建立方法，其特征在于：步骤S5中所述的统计学分析的公式为：
计量数据以
表示，比较采用T检验，P<0.05表明差异具有显著性；式中，A为实际频数，T为理论频数，∑为求和符号。
8.根据权利要求1-7任意一项所述的一种化疗药物致大鼠口腔溃疡模型建立方法，其特征在于：还包括化疗药物致大鼠口腔溃疡模型的应用，该化疗药物顺铂、紫杉醇致大鼠口腔溃疡模型，可用于观察药物对化疗药诱导的口腔溃疡疗效评价。
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