RU2013123459A

RU2013123459A - Плазмида для экспрессии рекомбинантного фактора свертываемости крови viii человека с делетированным в-доменом, моноклональная линия клеток млекопитающего - продуцент рекомбинантного фактора свертываемости крови viii человека с делетированным в-доменом и способ получения указанного фактора

Info

Publication number: RU2013123459A
Application number: RU2013123459/10A
Authority: RU
Inventors: Надежда Александровна Орлова; Сергей Владимирович Ковнир; Иван Иванович Воробьев; Андрей Иванович Воробьев
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ")
Priority date: 2013-05-22
Filing date: 2013-05-22
Publication date: 2014-11-27
Also published as: RU2561466C2

Abstract

1. Плазмида для экспрессии рекомбинантного фактора свертываемости крови VIII человека с делетированным В-доменом, в следующей последовательности по существу содержащая область начала репликации плазмиды pUC, открытую рамку считывания бета-лактамазы (bla) и прокариотический промотер гена bla; участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR), функциональный промотор и первый интрон гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 5′ нетранслируемой областью этого гена; открытую рамку считывания гена, кодирующего фактор свертываемости крови VIII человека с делетированным В-доменом; внутренний сайт связывания рибосом (IRES) вируса энцефаломиокардита (EMCV); открытую рамку считывания дегидрофолатредуктазы (DHFR), экспрессирующуюся в составе бицистронной мРНК вместе с геном, кодирующим фактор свертываемости крови VIII человека с делетированным В-доменом (IRES DHFR); и функциональный терминатор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 3' нетранслируемой областью этого гена.2. Плазмида по п.1, отличающаяся тем, что ген фактор свертываемости крови VIII человека кодирует полипептид фактора свертываемости крови VIII человека с делетированным B-доменом, последовательность аминокислот которого приведена в SEQ ID NO: 3.3. Плазмида по п.1, отличающаяся тем, что участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR) представляет собой фрагмент конкатемера терминального повтора EBVTR.4. Плазмида по п.1, отличающаяся тем, что используют открытую рамку считывания дегидрофолатредуктазы (DHFR) мыши.5. Плазмида по п.1, отличающаяся тем, что указанный вектор дополнительно содержит консенсусную по

Claims

1. Плазмида для экспрессии рекомбинантного фактора свертываемости крови VIII человека с делетированным В-доменом, в следующей последовательности по существу содержащая область начала репликации плазмиды pUC, открытую рамку считывания бета-лактамазы (bla) и прокариотический промотер гена bla; участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR), функциональный промотор и первый интрон гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 5′ нетранслируемой областью этого гена; открытую рамку считывания гена, кодирующего фактор свертываемости крови VIII человека с делетированным В-доменом; внутренний сайт связывания рибосом (IRES) вируса энцефаломиокардита (EMCV); открытую рамку считывания дегидрофолатредуктазы (DHFR), экспрессирующуюся в составе бицистронной мРНК вместе с геном, кодирующим фактор свертываемости крови VIII человека с делетированным В-доменом (IRES DHFR); и функциональный терминатор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 3' нетранслируемой областью этого гена.

2. Плазмида по п.1, отличающаяся тем, что ген фактор свертываемости крови VIII человека кодирует полипептид фактора свертываемости крови VIII человека с делетированным B-доменом, последовательность аминокислот которого приведена в SEQ ID NO: 3.

3. Плазмида по п.1, отличающаяся тем, что участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR) представляет собой фрагмент конкатемера терминального повтора EBVTR.

4. Плазмида по п.1, отличающаяся тем, что используют открытую рамку считывания дегидрофолатредуктазы (DHFR) мыши.

5. Плазмида по п.1, отличающаяся тем, что указанный вектор дополнительно содержит консенсусную последовательность Козак перед последовательностью, кодирующей открытую рамку считывания фактора свертываемости крови VIII человека с делецией В-домена.

6. Плазмида по п.1, отличающаяся тем, что указанным вектором является вектор p1.1-F8BDD, представленный в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO: 1.

7. Моноклональная линия клеток млекопитающего - продуцент рекомбинантного фактора свертываемости крови VIII человека с делетированным B-доменом, трансформированная плазмидой по пп.1-6.

8. Моноклональная линия клеток по п.7, отличающаяся тем, что клетками млекопитающего являются клетки яичника китайского хомячка.

9. Моноклональная линия клеток по п.8, отличающаяся тем, указанной линией клеток является линия клеток яичника китайского хомячка DG-P1.1-F8BDD-S3, депонированная в Российской Коллекции Культур Клеток позвоночных Института Цитологии РАН под регистрационным номером №РККК (П) 756Д.

10. Способ получения рекомбинантного фактора свертываемости крови VIII с делетированным В-доменом, включающий следующие стадии:

- культивирование в питательной среде клеток линии по п.7; и

- выделение полученного рекомбинантного белка из культуральной жидкости.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что культивируют клетки яичника китайского хомячка DG-P1.1-F8BDD-S3, депонированная в Российской Коллекции Культур Клеток позвоночных Института Цитологии РАН, регистрационный номер №РККК (П) 756Д.

12. Способ по п.10, отличающийся тем, что питательная среда для культивирования является бессывороточной.