RU2013143210A

RU2013143210A - Плазмида для экспрессии рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (фсг) человека, плазмида для экспрессии рекомбинантной бета-субъединицы фсг человека, моноклональная линия клеток млекопитающего-продуцент фсг человека и способ получения указанного гормона

Info

Publication number: RU2013143210A
Application number: RU2013143210/10A
Authority: RU
Inventors: Иван Иванович Воробьев; Надежда Александровна Орлова; Сергей Владимирович Ковнир; Юлия Александровна ХОДАК
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "АйВиФарма" (ООО "АйВиФарма")
Priority date: 2013-09-24
Filing date: 2013-09-24
Publication date: 2015-03-27
Also published as: RU2560596C2

Abstract

1. Плазмида для экспрессии рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) человека, в следующей последовательности по существу содержащая область начала репликации плазмиды pUC, открытую рамку считывания бета-лактамазы (bla) и прокариотический промотер гена bla; участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR), функциональный промотор и первый интрон гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 5′ нетранслируемой областью этого гена; последовательность Козак; открытую рамку считывания, кодирующую альфа-субъединицу ФСГ человека с блоком стоп-кодонов; внутренний сайт связывания рибосом (IRES) вируса энцефаломиокардита (EMCV); открытую рамку считывания, кодирующую бета-субъединицу ФСГ человека с блоком стоп-кодонов; аттенюированный внутренний сайт связывания рибосом (IRES) вируса энцефаломиокардита (EMCV); открытую рамку считывания дегидрофолатредуктазы (DHFR), экспрессирующуюся в составе трицистронной мРНК вместе с геном, кодирующим альфа- и бета-субъединицы ФСГ человека; и функциональный терминатор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 3′ нетранслируемой областью этого гена.2. Плазмида по п.1, отличающаяся тем, что открытые рамки считывания, кодирующие альфа- и бета-субъединицы ФСГ человека, кодируют альфа- и бета-субъединицы ФСГ человека, последовательность аминокислот которых приведены в SEQ ID NO:2 и 3, соответственно.3. Плазмида по п.1, отличающаяся тем, что участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR) представляет собой фрагмент конкатемера терминального повтора EBVTR.4. Плазмида по п.1, отличающаяся тем, что используют открытую рамку

Claims

1. Плазмида для экспрессии рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) человека, в следующей последовательности по существу содержащая область начала репликации плазмиды pUC, открытую рамку считывания бета-лактамазы (bla) и прокариотический промотер гена bla; участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR), функциональный промотор и первый интрон гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 5′ нетранслируемой областью этого гена; последовательность Козак; открытую рамку считывания, кодирующую альфа-субъединицу ФСГ человека с блоком стоп-кодонов; внутренний сайт связывания рибосом (IRES) вируса энцефаломиокардита (EMCV); открытую рамку считывания, кодирующую бета-субъединицу ФСГ человека с блоком стоп-кодонов; аттенюированный внутренний сайт связывания рибосом (IRES) вируса энцефаломиокардита (EMCV); открытую рамку считывания дегидрофолатредуктазы (DHFR), экспрессирующуюся в составе трицистронной мРНК вместе с геном, кодирующим альфа- и бета-субъединицы ФСГ человека; и функциональный терминатор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 3′ нетранслируемой областью этого гена.

2. Плазмида по п.1, отличающаяся тем, что открытые рамки считывания, кодирующие альфа- и бета-субъединицы ФСГ человека, кодируют альфа- и бета-субъединицы ФСГ человека, последовательность аминокислот которых приведены в SEQ ID NO:2 и 3, соответственно.

3. Плазмида по п.1, отличающаяся тем, что участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR) представляет собой фрагмент конкатемера терминального повтора EBVTR.

4. Плазмида по п.1, отличающаяся тем, что используют открытую рамку считывания дегидрофолатредуктазы (DHFR) мыши.

5. Плазмида по п.1, отличающаяся тем, что указанной плазмидой является плазмида p1.1-FSH-AIB, представленная в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1.

6. Плазмида для экспрессии бета-субъединицы рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) человека, в следующей последовательности по существу содержащая область начала репликации плазмиды pUC, открытую рамку считывания бета-лактамазы (bla) и прокариотический промотер гена bla; участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR); функциональный промотор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 5′ нетранслируемой областью этого гена; последовательность Козак; открытую рамку считывания гена, кодирующего бета-субъединицу ФСГ человека с блоком стоп-кодонов; функциональный терминатор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 3′ нетранслируемой областью этого гена; промотор вируса SV40; ген устойчивости к гигромицину; и функциональный терминатор вируса SV40.

7. Плазмида по п.6, отличающаяся тем, что ген ФСГ человека кодирует полипептид ФСГ человека, последовательность аминокислот альфа- и бета-субъединиц которого приведена в SEQ ID NO:2 и 3, соответственно.

8. Плазмида по п.6, отличающаяся тем, что участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR) представляет собой фрагмент конкатемера терминального повтора EBVTR.

9. Плазмида по п.6, отличающаяся тем, что указанной плазмидой является p1.2-Hygro FSH-B-chain, представленная в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:4.

10. Моноклональная линия клеток млекопитающего - продуцент рекомбинантного ФСГ человека, трансформированная плазмидой по пп.1-5.

11. Моноклональная линия клеток по п.10, отличающаяся тем, что клетками млекопитающего являются клетки яичника китайского хомячка.

12. Моноклональная линия клеток по п.10, дополнительно трансформированная плазмидой по пп.6-9.

13. Моноклональная линия клеток по п.12, отличающаяся тем, что клетками млекопитающего являются клетки яичника китайского хомячка.

14. Моноклональная линия клеток по п.13, отличающаяся тем, указанной линией клеток является линия клеток яичника китайского хомячка C-P1.3-FSH-G4, депонированная во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ Н-140.

15. Способ получения рекомбинантного ФСГ человека, включающий следующие стадии:

- культивирование в питательной среде клеток линии по п.10 или 12; и

- выделение полученного рекомбинантного белка из культуральной жидкости.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что культивируют клетки линии яичника китайского хомячка C-P1.3-FSH-G4, депонированные во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) под регистрационным номером ВКПМ Н-140.

17. Способ по п.15, отличающийся тем, что питательная среда для культивирования является бессывороточной.