RU2013122048A

RU2013122048A - Экспрессионный плазмидный вектор для моноцистронной экспрессии рекомбинантных белков в клетках млекопитающих, линия клеток млекопитающих - продуцентов рекомбинантного белка, способ получения рекомбинантного белка

Info

Publication number: RU2013122048A
Application number: RU2013122048/10A
Authority: RU
Inventors: Надежда Александровна Орлова; Сергей Владимирович Ковнир; Иван Иванович Воробьев
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "Лаборатория медицинской биотехнологии" (ООО "ЛМБТ")
Priority date: 2013-05-14
Filing date: 2013-05-14
Publication date: 2014-11-20
Also published as: RU2552170C2

Abstract

1. Экспрессионный плазмидный вектор для моноцистронной гетерологичной экспрессии рекомбинантных белков и высокочастотной интеграции экспрессионной кассеты в клетках млекопитающих, в следующей последовательности, по существу, содержащий область начала репликации плазмиды pUC с функциональным геном устойчивости к ампициллину; участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR); функциональный промотор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 5' нетранслируемой областью этого гена; участок для клонирования открытой рамки считывания рекомбинантного белка (полилинкер); функциональный терминатор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 3' нетранслируемой областью этого гена; промотор, функционирующий в клетках млекопитающих; ген устойчивости к антибиотику; и функциональный терминатор гена устойчивости к антибиотику.2. Экспрессионный плазмидный вектор по п.1, отличающийся тем, что участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR) представляет собой фрагмент конкатемера терминального повтора EBVTR.3. Экспрессионный плазмидный вектор по п.1, отличающийся тем, что в качестве гена устойчивости к антибиотику используют ген устойчивости к гигромицину, неомицину или зеоцину.4. Экспрессионный плазмидный вектор по п.1, отличающийся тем, что указанный вектор выбран из группы, содержащей векторы p1.2-Hygro, p1.2-Neo, p1.2-Zeo, представленные в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:2, 3, 4, соответственно.5. Экспрессионный плазмидный вектор по п.1, отличающийся тем, что в качестве функциональных промотора и терминатора ген устойчивости к антибиотику ис�

Claims

1. Экспрессионный плазмидный вектор для моноцистронной гетерологичной экспрессии рекомбинантных белков и высокочастотной интеграции экспрессионной кассеты в клетках млекопитающих, в следующей последовательности, по существу, содержащий область начала репликации плазмиды pUC с функциональным геном устойчивости к ампициллину; участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR); функциональный промотор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 5' нетранслируемой областью этого гена; участок для клонирования открытой рамки считывания рекомбинантного белка (полилинкер); функциональный терминатор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 3' нетранслируемой областью этого гена; промотор, функционирующий в клетках млекопитающих; ген устойчивости к антибиотику; и функциональный терминатор гена устойчивости к антибиотику.

2. Экспрессионный плазмидный вектор по п.1, отличающийся тем, что участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR) представляет собой фрагмент конкатемера терминального повтора EBVTR.

3. Экспрессионный плазмидный вектор по п.1, отличающийся тем, что в качестве гена устойчивости к антибиотику используют ген устойчивости к гигромицину, неомицину или зеоцину.

4. Экспрессионный плазмидный вектор по п.1, отличающийся тем, что указанный вектор выбран из группы, содержащей векторы p1.2-Hygro, p1.2-Neo, p1.2-Zeo, представленные в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:2, 3, 4, соответственно.

5. Экспрессионный плазмидный вектор по п.1, отличающийся тем, что в качестве функциональных промотора и терминатора ген устойчивости к антибиотику используют промотор и терминатор вируса SV40.

6. Экспрессионный плазмидный вектор по п.1, отличающийся тем, что указанный вектор дополнительно содержит консенсусную последовательность Козак.

7. Экспрессионный плазмидный вектор по п.1, содержащий вставку с открытой рамкой считывания гена, кодирующего рекомбинантный белок.

8. Линия клеток млекопитающего - продуцентов рекомбинантного белка, трансфицированная экспрессионным вектором по п.7.

9. Линия клеток млекопитающего по п.8, отличающаяся тем, что указанные клетки являются со-продуцентами второго рекомбинантного белка.

10. Линия клеток млекопитающего по п.9, отличающаяся тем, что один из рекомбинантных белков является ферментом посттрансляционной модификации другого рекомбинантного белка, либо указанные рекомбинантные белки являются цепями гетеромультимерного рекомбинантного белка.

11. Линия клеток млекопитающего по пп.8-10, отличающаяся тем, что клетки выбраны из группы, содержащей клетки эпителия яичника китайского хомячка (СНО) DG-44, клетки человека HEK-293.

12. Способ получения рекомбинантного белка, включающий следующие стадии:

- культивирование в питательной среде клеток млекопитающих по пп.8-10; и

- выделение полученного рекомбинантного белка из культуральной жидкости.

13. Способ по п.13, отличающийся тем, что культивируют клетки эпителия яичника китайского хомячка СНО DG44 или клетки человека HEK-293, трансфицированные экспрессионным вектором, выбранного из группы, содержащей векторы p1.2-Hygro, p1.2-Neo, p1.2-Zeo, содержащим вставку с открытой рамкой считывания гена, кодирующего рекомбинантный белок.