CN102549160B - 改善的人长五聚环蛋白3表达系统及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含在有效启动子控制下的编码人长五聚环蛋白PTX3的核苷酸序列和编码可选择标记的核苷酸序列的真核表达载体、能够提供由该载体编码的蛋白质表达的重组人细胞和用于生产人长五聚环蛋白PTX3的方法。

Description

改善的人长五聚环蛋白3表达系统及其用途
技术领域
本发明涉及能够表达高水平人五聚环蛋白3(hPTX3)的源自人的细胞系统、所用的方法和材料。
背景技术
人长五聚环蛋白3，PTX3或hPTX3(GeneBank登录号BD131701)，是一种由二硫键连接的8个亚基组成的多聚体糖蛋白。
本发明的作者已经设计了用于在HEK293F人细胞系中生产PTX3的表达系统。该系统基于含有新霉素抗性基因的质粒，其中PTX3基因在人遍在蛋白C启动子序列的控制下。此系统避免了源自非人源细胞系内源产生PTX3的嵌合PTX3的潜在形成。在所获得的那些生产克隆当中选出最佳的生产分离克隆，名为2F12。获得了约20mg/L PTX3的产量，这对商业生产需要而言是不够的。
为增加PTX3表达水平，本发明的作者已经构建其中PTX3基因在CMV启动子控制下的质粒。该质粒用来再转染表达PTX3的克隆2F12。在新的分离转染瘤(transfectoma)中检测到的生产率水平高于预期，约80mg/L。
发明描述
使用实验策略获得表达高水平人PTX3的人源克隆，所述实验策略包括以下步骤：
a)构建携带在CMV启动子控制下的人PTX3的质粒表达盒；
b)在所述质粒中插入潮霉素抗性盒，以选择稳定的转染瘤，所述转染瘤源自G418抗性的PTX3表达克隆的再转染；
c)验证表达的重组蛋白的身份(identity)和水平；
d)生物化学表征重组hPTX3。
PCT/EP2009/050937的内容因而通过引用的方式并入。
本发明的目的是基本上具有SEQ ID 1的序列的真核表达载体，其包含在有效启动子控制下的编码人长五聚环蛋白PTX3的核苷酸序列和编码可选择标记的核苷酸序列。
该载体优选地用来转化宿主细胞，优选地其中宿主细胞是已经能够表达人长五聚环蛋白PTX3的重组人细胞，更优选地其中重组人细胞是在ECACC以编号08011001保藏的重组293F/PTX3/2F12克隆。在具体的方面，该载体被线性化。
本发明的另一个目的是能够表达由如上所公开的载体编码的人长五聚环蛋白PTX3的重组细胞，优选地该重组细胞是重组HEK293F细胞系，更优选地，它是在英国索利兹伯里健康保护署应急准备和响应培养物保藏中心(Health Protection Agency，Culture Collections Centre ForEmergency Preparedness and Response Salisbury UK)以编号09072902保藏的重组MS24PTX克隆。
本发明的另一个方面是如上文所公开的重组细胞用于生产人长五聚环蛋白PTX3的用途。
本发明的另一个目的是用于生产重组人长五聚环蛋白PTX3的方法，其包括：
a)用其中人长五聚环蛋白基因在CMV启动子控制下的可选择质粒转染已经表达重组人长五聚环蛋白PTX3的重组人细胞；
b)选择并且培育转染的重组人细胞；
c)从转染的重组人细胞的培养基纯化人长五聚环蛋白PTX3。
优选地，表达重组人长五聚环蛋白PTX3的重组人细胞是重组HEK293F细胞系，更优选地，它是在ECACC以编号08011001保藏的重组293F/PTX3/2F12克隆。
在优选的实施方式中，纯化步骤包括以下步骤的至少一者：阴离子交换层析、羟基磷灰石层析或尺寸排阻层析。
本发明的另一个目的是用于生产重组人长五聚环蛋白PTX3的方法，其包括：
a)用基本上具有SEQ ID 1的序列的第一载体和用基本上具有SEQID 2的序列的第二载体同时或依次地共转染人细胞；
b)选择并且培育双重转染的细胞；
b)从双重转染的细胞的培养基纯化人长五聚环蛋白PTX3。
本发明的另一个目的是用于生产重组人长五聚环蛋白PTX3的方法，包括培育重组MS24PTX克隆并且从培养基纯化人长五聚环蛋白PTX3的步骤。
现在将具体参考以下附图，借助非限制性实施例说明本发明。
图1：pSASSI-hPTX3图谱和主要特征。
图2：(A)MS24PTX克隆和(B)293F/PTX3/2F12克隆在转瓶中的生长、存活率和生产率。
图3：通过梯度4-15％的SDS-PAGE(A)和尺寸排阻层析法(B)表征从MS24PTX克隆纯化的重组人PTX3。
图4：hPTX3克隆293F/PTX3/2F12和hPTX3克隆MS24PTX的FGF2结合能力。
图5：pSC1-hPTX3图谱和主要特征。
实施例
实施例1：克隆293F/PTX3/2F12
质粒pSC1-PTX3的构建
1.pSG/Ub的构建
1.1人遍在蛋白C启动子序列的制备
通过用PCR扩增，从pUB/Bsd质粒(Invtrogen，目录号V512-20)取得人遍在蛋白C启动子。作为克隆策略的一部分，在两个末端引入限制性核酸内切酶的识别序列。在上游扩增引物中构造BsaAI位点并且在下游引物中构造EcoRI位点。扩增的区域对应于pUB/Bsd序列中的第1941至3161位核苷酸。
寡核苷酸设计如下：
5’p UbC：长度：26聚物(SEQ ID 3)ATATCACGTG ATC TGG CCTCCG CGC C
3’p UbC：长度：23聚物(SEQ ID 4)GGAATTC GGT CCG GTC TAACAA A
扩增的方案如下：1ng/μl质粒DNA，2mM MgCl2，0.2mMdNTP，400nM每种引物，1×供应的缓冲液和0.04u/ml的Taq DNA聚合酶(Sigma Genosys)；温度曲线(temperature profile)：3分钟94℃，30次(30秒94℃，30秒46℃，2分钟72℃)，5分钟72℃，在4℃冷却直至进一步使用。
扩增产物(1238bp)通过二氧化硅膜离心柱(NucleoSpin，Machery-Nagel GmbH&Co.)纯化，在pGEM-T-Easy载体(Promega目录号A1360)中连接，并且转化至大肠杆菌宿主菌株HB2151(PharmaciaBiotech)中。通过在补充有50mg/l氨苄青霉素的LB培养基上培育选择转化体。
通过用StuI加SacI酶的限制性分析检查从氨苄青霉素抗性菌落分离的质粒DNA(预期～3650和600bp片段)。
显示正确限制图谱的质粒通过完整插入物的序列分析进一步检查并且随后用EcoRI(Sigma-Genosys)和BsaAI(New England Biolabs)限制酶消化。
借助琼脂糖凝胶分离和在二氧化硅膜离心柱上洗脱来纯化人遍在蛋白C启动子。
1.2载体片段pSG5的制备
质粒pSG5(4076bp，Stratagene)用限制酶EcoRI(Sigma-Genosys)和BsaAI(New England Biolabs)切割；所得的片段长1432和2644bp。将含有pSG5的主链的2644bp片段制备并且借助琼脂糖凝胶电泳加二氧化硅膜离心柱纯化。
1.3pSG/Ub的制备
使用T4DNA连接酶(Promega)，将步骤1.1和1.2中制备的DNA片段连接并且转化于HB2151大肠杆菌细胞中。通过在补充有50mg/l氨苄青霉素的LB培养基上培育选择转化体。
通过用EcoRI加SacII酶的限制性分析检查从氨苄青霉素抗性菌落分离的质粒DNA(预期：2670和1192bp片段)。具有预期限制图谱的质粒DNA命名为pSG/Ub。
2.pSC1的构建
2.1新霉素抗性盒(NeoR)的制备
通过PCR扩增从pcDNA3质粒(5446bp，Invitrogen)取得新霉素抗性盒(NeoR)。作为克隆策略的一部分，在两个末端引入限制性核酸内切酶AflIII的识别序列。扩增的区域对应于pcDNA3序列中的第1788至3252位核苷酸并且包括SV40启动子和复制起点、新霉素抗性ORF、和SV40多腺苷酸化信号。
寡核苷酸设计如下：
5’NeoR(SEQ ID 5)ATATACATG TCC CCA GGC AGG CAG AA
3’NeoR(SEQ ID 6)ATATACAT GTAT ACA GAC ATG ATA AG
扩增的方案如下：1ng/μl质粒DNA，2mM MgCl2，0.2mMdNTP，400nM每种引物，1×供应的缓冲液和0.04u/μl的Taq DNA聚合酶(Sigma Genosys)；温度曲线：3分钟94℃，30次(30秒94℃，30秒46℃，2分钟72℃)，5分钟72℃，在4℃冷却直至进一步使用。
扩增产物(1484bp)通过二氧化硅膜离心柱纯化，在pGEM-T-Easy载体(Promega目录号A1360)中连接，并且转化至大肠杆菌宿主菌株HB2151中。通过在补充有50mg/l氨苄青霉素的LB培养基上培育选择转化体。
通过用SmaI加SacI酶的限制性分析检查从氨苄青霉素抗性菌落分离的质粒DNA(预期～1200和3300bp片段)。
显示正确限制图谱的质粒通过完整插入物的序列分析进一步检查并且随后用AflIII(New England Biolabs)限制酶消化。
借助琼脂糖凝胶分离和在二氧化硅膜离心柱上洗脱来纯化NeoR盒(1471bp)。
2.2载体片段pSG/Ub的制备
在步骤1.3中制备的质粒pSG/Ub通过AflIII消化作用线性化并且在二氧化硅膜离心柱上纯化。
2.3pSC1的制备
使用T4DNA连接酶(Promega)，将步骤2.1和2.2中制备的DNA片段连接并且转化于M109大肠杆菌菌株(New England Biolabs)中。通过在补充有50mg/l氨苄青霉素的LB培养基上培育选择转化体。
如先前所述，通过采用5’NeoR和3’NeoR寡核苷酸的PCR扩增初步分析抗生素抗性菌落，通过限制性分析检查纯化的质粒。为此目的，使用SmaI(NeoR序列内部的第602位)和SacII(UbC序列内部的第4142位)酶。具有预期限制图谱(3540和1793bp片段)的质粒DNA命名为pSC1。
3.pSC1-PTX3的构建
3.1hPTX3编码序列的制备
通过BamHI(Roche Applied Science)消化从pSG5-PTX3(WO99/32516“含有长五聚环蛋白PTX3的药物组合物(Pharmaceuticalcompositions containing the long pentraxin PTX3)”)取得hPTX3(GeneBank登录号BD 131701)序列。通过琼脂糖凝胶电泳和二氧化硅膜离心柱纯化人PTX3片段(1463bp)。
3.2载体片段pSC1的制备
pSC1载体通过BamHI消化作用线性化并且在二氧化硅膜离心柱上纯化。
3.3pSC1-PTX3的构建和验证
使用T4DNA连接酶(Roche Applied Science)，将步骤3.2和3.3中制备的DNA片段连接并且转化于JM109大肠杆菌菌株中。转化体通过在补充有50mg/l氨苄青霉素的LB培养基上培育进行选择，并且通过PCR用两条与PTX3序列互补的寡核苷酸初步进行筛选。
所述寡核苷酸序列是：
5’PTX(SEQ ID 7)GTGAGAACTCGGATGATTATGAT
3’PTX(SEQ ID 8)TGAAACATACTGAGCTCCTCCAT
在10μl终体积中，用于扩增的试剂是：1μl煮沸的菌落(50ml水中的1个菌落)，2mM MgCl2，0.2mM dNTP，320nM每种引物，0.06％甲酰胺，1×供应的缓冲液和0.08u/μl的Taq DNA聚合酶(SigmaGenosys)；温度曲线：3分钟96℃，30次(30秒94℃，30秒58℃，2分钟72℃)，5分钟72℃，在4℃冷却直至进一步使用。
从PCR筛选为阳性的菌落中纯化的质粒用SalI限制酶(RocheApplied Science)消化以检查hPTX3插入物的方向。对具有预期限制图谱(6619和177bp)的质粒在编码UbC启动子、NeoR盒、和hPTX3的区域中测序，并且将所述质粒确定为pSC1-PTX3。
新质粒(pSC1-PTX3)随后与在遍在蛋白启动子控制下的PTX3cDNA序列和在SV40启动子控制下的新霉素抗性基因构建在一起；图1中描述了全部其他特征和质粒图谱。
pSC1-PTX3的完整序列如下(SEQ ID 2)。pSC1-hPTX3序列从第一个EcoRI位点表述(图5)。下划线标出源自含有PTX3cDNA的pSG5的序列。起始密码子(ATG)和终止密码子以粗体表示。
pSC1-PTX3(SEQ ID 2)
AATTCGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCCGGCTCAAACTCAGCTCACTTGAGAGTCTCCTCCCGCCAGCTGTGGAA
Figure BPA00001499046700071
ACTCGGATGATTATGATCTCATGTATGTGAATTTGGACAACGAAATAGACAATGGACTCCATCCCACTGAGGACCCC
ACGCCGTGCGACTGCGGTCAGGAGCACTCGGAATGGGACAAGCTCTTCATCATGCTGGAGAACTCGCAGATGAGAGA
GCGCATGCTGCTGCAAGCCACGGACGACGTCCTGCGGGGCGAGCTGCAGAGGCTGCGGGAGGAGCTGGGCCGGCTCG
CGGAAAGCCTGGCGAGGCCGTGCGCGCCGGGGGCTCCCGCAGAGGCCAGGCTGACCAGTGCTCTGGACGAGCTGCTG
CAGGCGACCCGCGACGCGGGCCGCAGGCTGGCGCGTATGGAGGGCGCGGAGGCGCAGCGCCCAGAGGAGGCGGGGCG
CGCCCTGGCCGCGGTGCTAGAGGAGCTGCGGCAGACGCGAGCCGACCTGCACGCGGTGCAGGGCTGGGCTGCCCGGA
GCTGGCTGCCGGCAGGTTGTGAAACAGCTATTTTATTCCCAATGCGTTCCAAGAAGATTTTTGGAAGCGTGCATCCA
GTGAGACCAATGAGGCTTGAGTCTTTTAGTGCCTGCATTTGGGTCAAAGCCACAGATGTATTAAACAAAACCATCCT
GTTTTCCTATGGCACAAAGAGGAATCCATATGAAATCCAGCTGTATCTCAGCTACCAATCCATAGTGTTTGTGGTGG
GTGGAGAGGAGAACAAACTGGTTGCTGAAGCCATGGTTTCCCTGGGAAGGTGGACCCACCTGTGCGGCACCTGGAAT
TCAGAGGAAGGGCTCACATCCTTGTGGGTAAATGGTGAACTGGCGGCTACCACTGTTGAGATGGCCACAGGTCACAT
TGTTCCTGAGGGAGGAATCCTGCAGATTGGCCAAGAAAAGAATGGCTGCTGTGTGGGTGGTGGCTTTGATGAAACAT
TAGCCTTCTCTGGGAGACTCACAGGCTTCAATATCTGGGATAGTGTTCTTAGCAATGAAGAGATAAGAGAGACCGGA
GGAGCAGAGTCTTGTCACATCCGGGGGAATATTGTTGGGTGGGGAGTCACAGAGATCCAGCCACATGGAGGAGCTCA
Figure BPA00001499046700072
AAGGTCTGAAAACTCAGTGCATAATAGGAACACTTGAGACTAATGAAAGAGAGAGTTGAGACCAATCTTTATTTGTA
CTGGCCAAATACTGAATAAACAGTTGAAGGAAAGACATTGGAAAAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGGG
CCCGGGGATCCAGATCTTATTAAAGCAGAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCA
CAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCAT
GTCTGGTCGACTCTAGACTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGT
ATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTCCCCAGGCA
GGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAG
AAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTC
CGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCC
TCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTAT
ATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTT
CTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTG
TTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGA
CGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGG
GAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTA
TCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACA
TCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGC
TCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGAT
GCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGA
CCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCG
TGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGA
CTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTAT
GAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTT
CTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATA
AAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACATGTG
AGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTG
ACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCC
CCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGG
AAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTG
TGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACAC
GACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTT
GAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCG
GAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAG
ATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAA
CTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTT
TTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCA
GCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACC
ATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAG
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AGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTC
GTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAG
CGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCA
CTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTG
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TTTTTTGTTAGACCGGACCG
人细胞系(HEK293F)已经因其以悬浮方式并在无血清和蛋白质的培养基中生长的能力而选择(Florian M Wurm“在培育的哺乳动物细胞中产生重组蛋白治疗药(Production of recombinant proteintherapeutics in cultivated mammalian cells)”Nature Biotechnology22(11)：1393-1398，2004，Yan SC等人，“表征和新颖纯化来自3种哺乳动物细胞系的重组人蛋白C(Characterization and novel purification ofrecombinant human  protein C from three mammalian cell lines)”Biotechnology(N.Y.)1990年7月，8(7)：655-61.“细胞系用于产生流感病毒疫苗的用途：对技术、制造、和管理动因的评价”疫苗研究倡议(“Use of cell lines for the production of influenza virus vaccines：anappraisal of technical，manufacturing，and regulatory considerations”Initiative for Vaccine Research)，世界卫生组织，瑞士日内瓦(2007年4月10日)。为转染HEK293F，pSC1-PTX3质粒以(PvuI消化的)线性形式或以环状形式使用。用线性化的质粒获得最佳转染率；基于生产率和生长能力进行克隆选择。在几轮亚克隆后，选出2F12克隆。
表达hPTX3的人克隆2F1已经根据布达佩斯条约在2008年1月10日以保藏号08011001保藏在ECACC(欧洲细胞培养保藏中心(European Collection of Cell Cultures)，英国健康保护署，PortonDown，威尔特郡SP40JG，英国)。下文描述实验细节。
3.4从pSC1-PTX3产生的重组293F-细胞
转染和亚克隆
在转染当日，将106个细胞/ml 293F(Invitrogen目录号R790-07)以28ml的Freestyle培养基终体积接种在125ml转瓶中。随后允许pSC1/PTX3质粒根据制造商的方案吸附于293fectin试剂(GIBCO/Invitrogen)。
简而言之，在两个独立的管中，将30μg环状或PvuI线性化的pSC1-PTX3稀释于1ml的Optimem(GIBCO/Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中，并且将40μl的293fectin(Invitrogen)用Optimem稀释至1ml。两种溶液在室温孵育5分钟，随后混合(终体积2ml)并且在相同条件孵育30分钟。将DNA/脂质混合物添加至细胞并且在搅拌(120转/分钟)下于37℃，5％CO2孵育。在培育36小时后，将培养基更换成选择培养基(200ml Freestyle培养基+500μg/ml的G418)，并且将转染的细胞以200μl/孔铺种于10块96孔平板中。在15日后，通过ELISA确定最高生产细胞汇集物，并且将它们在24孔、6孔和T25瓶中扩增。
获得的重组细胞汇集物以每孔1个细胞在96孔平板中，于50％新鲜培养基和50％条件培养基内亚克隆。
实施例2：克隆MS24PTX
质粒pSASSI-hPTX3的构建
1.pCEPlightΔ的构建
其中事先克隆了抗体轻链且丢失一部分多克隆位点和BamHI限制位点的pCEP4质粒(Invitrogen目录号V044-50用限制酶EcoRV和ClaI(Roche Applied Science)切割；所述消化导致获得不存在允许染色体外复制的Epstein-Barr病毒复制起点(oriP)和核抗原(由EBNA-1基因编码)的质粒。所得的片段长6910bp和4281bp。将含有pCEP的主链的6910bp片段借助琼脂糖凝胶电泳加二氧化硅膜离心柱纯化。由于ClaI产生粘末端，因此使用T4DNA聚合酶(Roche Applied Science)按以下方案补平所述片段：150ng的ClaI/EcoRV纯化的片段(38μl)，5μl的10x T4DNA聚合酶缓冲液，4μl的dNTP混合物2.5mM，3μl的T4DNA聚合酶(1U/μl)。在37℃，15分钟后，将该反应在70℃持续5分钟终止，随后置于冰上。将片段在二氧化硅膜离心柱上纯化，并且使用T4DNA连接酶(Promega)，在室温自身连接过夜。TOP10感受态细胞(Invitrogen)用连接混合物转化，并且通过在补充有100mg/L氨苄青霉素的LB平板上培育而选择转化体。
从氨苄青霉素抗性菌落分离的质粒DNA命名为pCEPlightΔ。
2.制备含有潮霉素抗性和CMV启动子的载体片段
通过PCR扩增pCEPlightΔ从该质粒中取得潮霉素抗性盒连同细胞巨化病毒(CMV)立即早期增强子/启动子。作为克隆策略的一部分，在与CMV启动子3’末端退火的寡核苷酸中引入限制性核酸内切酶BamHI的识别序列。
约5500bp的扩增区域包括CMV启动子、在TK启动子控制下的潮霉素基因，连同TK多腺苷酸化信号。
寡核苷酸设计如下：
寡CMV(SEQ ID 9)5’GAGAACTGTAACGTTGGATCCAGCTGG3’
寡H(SEQ ID 10)5’GTGTACAAAGGATCCAGACATGATAAG 3’
扩增的方案如下：2ng的pCEPlightΔ，200nM每种引物，0.2mMdNTP，1×供应的缓冲液，1.5μl DMSO，0.5μl Taq DNA聚合酶(Phusion)，终体积50μl；温度曲线：1分钟98℃，35次(10秒98℃，30秒55℃，3分钟72℃)，10分钟72℃，在4℃冷却直至进一步使用。
通过琼脂糖凝胶电泳加二氧化硅膜离心柱纯化扩增产物(～5500bp)。使纯化的片段自身连接并且用来转化TOP10感受态细胞(Invitrogen)。通过限制性分析和序列分析检查从氨苄青霉素抗性菌落分离的质粒DNA，并且命名为pCEPΔBam。
3.hPTX3基因的制备
通过BamHI(Roche Applied Science)消化作用从如上所示的pSC1-PTX3中取得hPTX3(GeneBank登录号BD 131701)序列。通过琼脂糖凝胶电泳和二氧化硅膜离心柱纯化人PTX3片段(1463bp)。
4.pCEPΔBam-hPTX3的制备
pCEPΔBam载体通过BamHI消化作用线性化并且在二氧化硅膜离心柱上纯化。使用T4DNA连接酶(Roche Applied Science)，将线性化的pCEPΔBam和步骤3中制备的与hPTX3基因相对应的DNA片段连接并且用来转化TOP10大肠杆菌菌株。转化体通过在补充有100mg/l氨苄青霉素的LB培养基上培育进行选择，并且通过限制性分析初步筛选以评定PTX3片段的方向。
5.SV40多腺苷酸化信号的制备
通过PCR扩增pCEPlightΔ质粒从该质粒中取得SV40多腺苷酸化信号。作为克隆策略的一部分，在两个末端分别引入限制性核酸内切酶HindIII和XhoI的识别序列。
寡核苷酸设计如下：
PCEPSVH(SEQ ID 11)5’AAGCTTAGACATGATAAGATACATTG 3’
PCEPSVX(SEQ ID 12)5’CTCGAGAGTCGACCGGTCATGGCTGC3’
扩增的方案如下：1ng的pCEPlightΔ，200nM每种引物，0.2mMdNTP，1×供应的缓冲液，2μl MgCl250mM，0.5μl TaqDNA聚合酶(Invitrogen)，终体积50μl；温度曲线：1分钟94℃，30次(30秒94℃，1分钟55℃，1分钟72℃)，15分钟72℃，在4℃冷却直至进一步使用。
通过琼脂糖凝胶电泳加二氧化硅膜离心柱纯化扩增产物(～420bp)。
6.pSASSI-hPTX3的制备
与SV40多腺苷酸化信号相对应的纯化片段和pCEPΔBam-hPTX3用HindIII/XhoI限制酶消化并且使用T4DNA连接酶(Promega)连接。连接混合物用来转化TOP10感受态细胞(Invitrogen)，并且通过在含有100mg/L氨苄青霉素的LB平板上培育而选择转化体。
通过限制性分析和序列分析检查从氨苄青霉素抗性菌落分离的质粒DNA，并且将质粒命名为pSASSI-hPTX3。
pSASSI-HPTX3的完整序列如下(SEQ ID 1)。pSASSI-hPTX3序列从BamHI位点开始表述(图1)。hPTX3的序列以小写字母表示。起始密码子(atg)和终止密码子(taa)以粗体表示。
pSASSI-HPTX3(SEQ ID 1).
Figure BPA00001499046700141
Figure BPA00001499046700151
Figure BPA00001499046700161
实施例3
通过pSASSI-hPTX3转染产生的重组MS24PTX克隆
1.转染和亚克隆
在转染当日，将106个细胞/ml 293F/PTX3/2F12以28ml的Freestyle培养基终体积接种在125ml转瓶中。随后允许pSASSI-hPTX3质粒根据制造商的方案吸附于293fectin试剂(GIBCO/Invitrogen)。
简而言之，将30μg的NruI线性化的pSASSI-hPTX3稀释于1ml的Optimem(GIBCO/Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中，并且将40μl的293fectin(Invitrogen)用Optimem稀释至1ml。两种溶液在室温孵育5分钟，随后混合(终体积2ml)并且在相同条件孵育30分钟。将DNA/脂质混合物添加至细胞并且在搅拌(120转/分钟)下于37℃，5％CO2孵育。在培育36小时后，将培养基更换成选择培养基(200mlFreestyle培养基+200μg/ml的潮霉素)，并且将转染的细胞以200μl/孔铺种于10块96孔平板中。在15日后，通过ELISA确定最高生产细胞汇集物，并且将它们在24孔、6孔和T25瓶中扩增。
获得的重组细胞汇集物以每孔1个细胞在96孔平板中，于50％新鲜培养基和50％条件培养基内亚克隆。
2.重组hPTX3的ELISA检测
使用夹心ELISA滴定纯化的PTX3或分泌于培养上清液中的PTX3。为检测PTX3，将96-孔Nunc Maxisorb微量滴定平板(Nunc，Roskilde，丹麦)用15mM碳酸钠缓冲液，pH 9.6中的700ng/ml大鼠单克隆抗体MNB4抗人PTX3(AlexisTM Biochemicals，Lausen，瑞士)在4℃包被过夜。孔用PBS加0.05％Tween-20(PBS-Tw洗涤液)洗涤并且用300μl的含有5％脱脂乳的PBS-Tw在室温封闭2小时。
将稀释于洗涤液加1％BSA中的细胞上清液或纯化的重组人PTX3添加至诸孔。产生用于定量的量程0至100ng/ml的标准曲线，所述标准曲线用来自CHO细胞的纯化的重组人PTX3产生。在37℃孵育1小时后，使用生物素缀合的多克隆兔抗PTX3抗体，随后与缀合至辣根过氧化物酶的链霉抗生物素蛋白(Sigma-Aldrich，USA)一起孵育，检测结合的PTX3。最后，添加2.2’-联氮基-双3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(Sigma Chemical Co.USA)用于显色，并且使用3550EIA型微量平板读板仪(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)评定405nm处的光密度。
实施例4
比较克隆293F/PTX3/2F12和MS24PTX的生长、存活率和生产率
源自这两种克隆的细胞以1,000,000个细胞/ml(存活率≥90％)的密度接种于1升转瓶中的500ml FreeStyle 293培养基中。监测生长、存活率和生产率约1周直至细胞开始死亡。
图2显示MS24PTX(图板A)和293F/PTX3/2F12(图板B)克隆在相同接种和培育条件下的生长、存活率和生产率。如图中所示，用其中PTX3在CMV启动子控制下的新质粒再转染表达PTX3的克隆293F/PTX3/2F12(MS24PTX克隆)时，我们能够获得PTX3生产率提高约4倍。
实施例5
纯化来自MS24PTX克隆的重组人PTX3
把来自转瓶中所培育的MS24PTX克隆中的培养上清液加载到Q-SepharoseTM Fast Flow(GE Healthcare，UK)装填柱上。使用非线性梯度洗脱留下的物质。将含有PTX3的级分直接施加至陶瓷羟基磷灰石(BioRad，Hercules，CA，USA)装填柱。以非线性方式通过增加磷酸盐浓度洗脱留下的物质。将含有PTX3的级分浓缩并且在超滤膜(Pellicon-Biomax 100，Millipore)上进行缓冲液交换，随后通过Biosep SECS4000(Phenomenex)上的尺寸排阻层析法和SDS-PAGE(图3)表征。
实施例6
h-PTX3与FGF2的结合
在ELISA系统中评定纯化的重组hPTX3与FGF2的结合。96-孔平板(Falcon 3912)用PBS中的2μg/ml FGF2(Calbiochem)包被并且在4℃孵育过夜。孔用PBS加0.1％Triton X-100(PBS-Tr，洗涤液)洗涤并且用200μl的含有3％BSA的PBS-Tr(PBS-B封闭和稀释液)在室温封闭2小时。在洗涤后，添加在PBS-B中以0至120ng/ml的PTX3浓度稀释的100μl样品，并且将平板在37℃孵育1小时，进行结合。在洗涤后，平板与100μl/孔的100ng/ml兔抗PTX3多克隆抗体(在37℃，1小时)一起孵育，再次洗涤并且与100μl的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(PBS-B中1∶1000；37℃下1小时)一起孵育。在洗涤后，添加100μl的生色底物3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)(sigma-Aldrich)，并且在10-15分钟后，添加100μl的HCl 1M终止该反应，并且使用3550EIA型微量平板读数仪(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)测定吸光度(图4)。
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Figure BPA00001499046700201
仅用于国际局使用
Figure BPA00001499046700202
Figure IPA00001499046200021
Figure IPA00001499046200031
Figure IPA00001499046200041
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Figure IPA00001499046200081
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Figure IPA00001499046200141
Figure IPA00001499046200151

Claims (8)

1.一种由SEQ ID1的序列构成的真核表达载体用于转染重组人宿主细胞的用途，所述载体包含在有效启动子控制下的编码人长五聚环蛋白PTX3的核苷酸序列和编码可选择标记的核苷酸序列，所述重组人宿主细胞已经能够表达人长五聚环蛋白PTX3，其中所述重组人宿主细胞是在ECACC以编号08011001保藏的重组293F/PTX3/2F12克隆。
2.根据权利要求1所述的载体的用途，其中所述载体被线性化。
3.一种转染的重组人细胞，其是使用根据权利要求1所述的载体进一步转染的在ECACC以编号08011001保藏的重组293F/PTX3/2F12克隆，能够表达人长五聚环蛋白PTX3。
4.根据权利要求3所述的转染的重组人细胞，其是在英国索利兹伯里健康保护署应急准备和响应培养物保藏中心以编号09072902保藏的重组MS24PTX克隆。
5.根据权利要求3或4所述的转染的重组人细胞用于生产人长五聚环蛋白PTX3的用途。
6.一种用于生产人长五聚环蛋白PTX3的方法，所述方法包括：
a.用其中人长五聚环蛋白基因在CMV启动子控制下的质粒转染已经表达重组人长五聚环蛋白PTX3的重组人细胞；
b.选择并且培育转染的重组人细胞；
c.从所述转染的重组人细胞的培养基纯化所述人长五聚环蛋白PTX3，
其中所述已经表达重组人长五聚环蛋白PTX3的重组人细胞是在ECACC以编号08011001保藏的重组293F/PTX3/2F12克隆。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述转染的重组人细胞是在英国索利兹伯里健康保护署应急准备和响应培养物保藏中心以编号09072902保藏的重组MS24PTX克隆。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中纯化步骤包括以下步骤中的至少一者：阴离子交换层析、羟基磷灰石层析或尺寸排阻层析。
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