KR101767695B1 - 개선된 인간 긴 펜트락신 3 발현 시스템 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본원 발명은 유효 프로모터의 조절 하에 인간 긴 펜트락신 PTX3 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 염기 서열 및 선택 표지를 코딩하는 뉴클레오티드 염기 서열을 포함하는 진핵 세포 발현 벡터, 상기 벡터에 의해 코딩된 단백질을 발현할 수 있는 재조합 인간 세포 및 상기 인간 긴 펜트락신 PTX3 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

개선된 인간 긴 펜트락신 3 발현 시스템 및 그의 용도{IMPROVED HUMAN LONG PENTRAXIN 3 EXPRESSION SYSTEM AND USES THEREOF}

본원 발명은 인간 펜트락신 3 (hPTX3) 단백질을 높은 수준으로 발현할 수 있는 인간 유래 세포계, 그 방법 및 사용된 물질에 관한 것이다.

인간 긴 펜트락신 3인 PTX3 또는 hPTX3 (유전자 은행 (GeneBank) 기탁 번호 BD 131701)은 이황화 결합에 의해 결합된 8개의 서브 유닛으로 구성된 다량체 구조의 당단백질이다.

본원 발명의 본 발명자는 일찍이 HEK293F 인간 세포주 내에서 PTX3를 생산하는 발현 시스템을 고안해왔다. 상기 시스템은, PTX3가 인간 유비퀴틴 C 프로모터 서열의 조절 하에 있는 네오마이신 내성 유전자(neomycin resistance gene)를 함유하는 플라스미드를 기반으로 한다. 이러한 시스템은 비-인간 기원의 세포주에 의한 PTX3의 내인성 생산으로부터 유래된 키메릭 (chimeric) PTX3의 잠재적인 형성을 방지한다. 클론에서 분리된 가장 우수한 생산자인 2Fl2는, 상기 얻어진 것들 중 선택되었다. 20 mg/L의 PTX3이 생산되었으나, 이는 상업적 생산 수요를 충족시키지 못하였다.

PTX3의 발현량을 증가시키려는 목적으로, 본원 발명의 본 발명자는 PTX3 유전자가 CMV 프로모터에 의해 조절되도록 플라스미드를 설계하였다. 상기 플라스미드는 클론 2Fl2를 발현하는 상기 PTX3을 재형질 주입 (re-transfection)하기 위하여 사용되었다. 상기 새롭게 분리된 트렌스펙토마 (transfectomas)에서 검출된 생산량은 기대치보다 높은 약 80 mg/L에 해당하였다.

발명의 상세한 설명

하기의 단계를 포함하는 실험 전략을 이용하여 인간 PTX3의 발현 정도가 높은 인간 기원 클론을 얻었다:

a) CMV 프로모터의 조절 하에 있는 인간 PTX3을 담지하는 플라스미드 발현 카세트를 설계하는 단계;

b) 클론 G418 내성체를 발현하는 PTX3의 재형질 주입으로부터 기원한 안정성있는 트랜스펙토마를 선별하기 위하여, 상기 플라스미드에 히그로마이신 (hygromycin) 내성 카세트를 삽입하는 단계;

c) 재조합된 단백질의 동일성 및 발현량을 확인하는 단계;

d) 상기 재조합된 hPTX3의 생화학적 특성을 분석하는 단계.

PCT/EP2009/050937의 내용은 본원에 참조로서 통합되어 있다.

본원 발명의 목적은 유효 프로모터의 조절 하에 인간 긴 펜트락신 PTX3을 코딩하는 뉴클레오티드 염기 서열 및 SEQ ID 1 서열을 필수적으로 포함하는 선택 표지 (selectable marker)를 코딩하는 뉴클레오티드 염기 서열을 포함하는, 진핵 세포 발현 벡터를 제공하는 것이다.

상기 벡터는 우선적으로 숙주 세포를 형질 전환시키기 위해 사용될 수 있으며, 상기 숙주 세포는 바람직하게는 상기 인간 긴 펜트락신 PTX3 단백질을 이미 발현할 수 있는 재조합 인간 세포일 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 재조합된 인간 세포는 ECACC에 제08011001번으로 기탁된 재조합 293F/PTX3/2F12 클론일 수 있다. 특정 양태에서, 상기 벡터는 선형화된 것일 수 있다.

본원 발명의 또 다른 목적은, 전술한 상기 벡터에 의해 코딩된 인간 긴 펜트락신 PTX3 단백질을 발현할 수 있는 재조합 세포를 제공하는 것이며, 바람직하게는 재조합 HEK293F 세포주일 수 있고, 보다 바람직하게는 건강 보호국 (Health Protection Agency), 비상 사태 대비 및 대응을 위한 미생물 보존 센터 (Culture Collections Centre For Emergency Preparedness and Response, 솔즈베리, UK) 즉, ECACC에 2009년 7월 29일자로 제09072902번으로 기탁된 재조합 MS24PTX 클론일 수 있다.

본원 발명의 또 다른 양태는, 전술한 인간 긴 펜트락신 PTX3 단백질의 생산을 위한 재조합 세포의 용도이다.

본원 발명의 또 다른 목적은, 하기의 단계를 포함하는 재조합된 인간 긴 펜트락신 PTX3 단백질을 생산하는 방법이다:

a) 재조합된 인간 긴 펜트락신 PTX3 단백질을 이미 발현할 수 있는 재조합 인간 세포에, 인간 긴 펜트락신 유전자가 CMV 프로모터의 조절 하에 있는 선별 플라스미드를 형질주입하는 단계;

b) 상기 형질 주입된 재조합 인간 세포를 선별 및 배양하는 단계;

c) 상기 형질 주입된 재조합 인간 세포의 배양 배지로부터 인간 긴 펜트락신 PTX3 단백질을 정제하는 단계.

바람직하게는 재조합된 인간 긴 펜트락신 PTX3 단백질을 발현하는 상기 재조합 인간 세포는, 재조합 HEK293F 세포주일 수 있으며, 보다 바람직하게는 ECACC에 제08011001번으로 기탁된 재조합 293F/PTX3/2F12 클론일 수 있다.

바람직한 양태에서, 상기 정제 단계는 하기의 단계 중 적어도 1개를 포함할 수 있다: 음이온-교환 크로마토그래피, 수산화 인회석 (hydroxyapatite) 크로마토그래피 또는 크기 배제 (size exclusion) 크로마토그래피.

본원 발명의 또 다른 목적은, 하기의 단계를 포함하는 재조합된 인간 긴 펜트락신 PTX3 단백질을 생산하는 방법이다:

a) 인간 세포에, SEQ ID 1 서열을 필수적으로 포함하는 제1 벡터 및 SEQ ID 2 서열을 필수적으로 포함하는 제2 벡터를 동시적으로 또는 순차적으로 공동형질주입(co-transfecting)하는 단계;

b) 상기 이중 형질 주입된 세포를 선별 및 배양하는 단계;

c) 상기 이중 형질 주입된 세포의 배양 배지로부터 상기 인간 긴 펜트락신 PTX3 단백질을 정제하는 단계.

본원 발명의 또 다른 목적은, 상기 재조합된 MS24PTX 클론을 배양하는 단계 및 상기 배양 배지로부터 상기 인간 긴 펜트락신 PTX3 단백질을 정제하는 단계를 포함하는, 재조합된 인간 긴 펜트락신 PTX3 단백질을 생산하는 방법이다.

이하, 비제한적인 실시예를 통하여, 특히 하기의 도면을 참조하여 본원 발명을 설명한다.

도 1: pSASSI-hPTX3 지도 및 주요 특징.
도 2: 스피너 플라스크 (Spinner Flask)내에서 MS24PTX 클론 (A) 및 293F/PTX3/2F12 클론 (B)의 생장, 생존도 및 생산성.
도 3: MS24PTX 클론으로부터 정제된 재조합 인간 PTX3의, 농도 구배 4-15% SDS-PAGE (A) 및 크기 배제 크로마토그래피 (B)에 의한 특성 분석.
도 4: hPTX3 클론 293F/PTX3/2F12 및 hPTX3 클론 MS24PTX의 FGF2 결합력.
도 5: pSCl-hPTX3 지도 및 주요 특징.

실시예

실시예 1: 클론 293F/ PTX3 /2F12

플라스미드 pSCl - PTX3 의 설계

1. pSG/Ub의 설계

1.1 인간 유비퀴틴 C 프로모터 서열의 제조

PCR 증폭에 의해 pUB/Bsd 플라스미드 (인트로젠, Cat. n. V512-20)로부터 인간 유비퀴틴 C 프로모터를 얻었다. 클로닝 전략의 일환으로, 제한 효소를 인식하는 서열을 양 말단에 도입하였다. 증폭 프라이머의 상부에 BsaAI 부위를 끼워 넣고 상기 프라이머의 하부에 EcoRI 부위를 끼워 넣었다. 상기 증폭된 지역은 pUB/Bsd 서열의 뉴클레오티드 1941 내지 3161에 대응하였다.

올리고뉴클레오티드를 하기와 같이 설계하였다:

5'p UbC: 길이: 26 mer (SEQ ID 3) ATATCACGTG ATC TGG CCT CCG CGC C

3'p UbC: 길이: 23 mer (SEQ ID 4) GGAATTC GGT CCG GTC TAA CAA A

증폭하기 위한 프로토콜은 다음과 같다: 1 ng/㎕의 플라스미드 DNA, 2 mM MgCl₂, 0.2 mM dNTPs, 각 프라이머 40O nM, 1X 보충 버퍼 및 0.04 u/ml의 Taq DNA 중합효소 (시그마 제노시스); 온도 특성: 3분 94℃, 30회 (30초 94℃, 30초. 46℃, 2분 72℃), 5분 72℃, 다음 사용 시까지 4℃에서 냉각.

상기 증폭 산물 (1238 bp)을 실리카 멤브레인 스핀 칼럼 (뉴클레오스핀, Machery-Nagel GmbH & Co.)에 의해 정제하고, pGEM-T-Easy 벡터 (프로메가 Cat. n. A1360)에 라이게이션 (ligation)하고, E.coli 숙주 균주 HB2151 (파마시아 바이오테크)에 형질 전환시켰다. 50 mg/l 앰피실린이 공급된 LB 배지에 배양하여 형질 전환체를 선별하였다.

StuⅠ 및 SacI 효소 (예상치 ~ 3650 및 600 bp 단편)로 제한 분석 (restriction analysis)하여 앰피실린 내성 콜로니로부터 분리된 플라스미드 DNA를 확인하였다.

전체 삽입 부위의 서열 분석에 의해 올바른 제한 패턴을 보여주는 플라스미드를 추가로 확인하였고, 후속적으로 EcoRI (시그마-제노시스) 및 BsaAI (뉴 잉글랜드 바이오랩스) 제한 효소로 분해하였다.

아가로스 겔 분리 및 실리카 멤브레인 스핀 칼럼상의 용리를 통하여 인간 유비퀴틴 C 프로모터를 정제하였다.

1.2 벡터 단편 pSG5의 제조

플라스미드 pSG5 (4076 bp, 스트라타진)를 상기 제한 효소 EcoRI (시그마-제노시스) 및 BsaAI (뉴 잉글랜드 바이오랩스)으로 절단하였다; 상기 결과 생성된 단편의 길이는 1432 및 2644 bp였다. pSG5 골격을 함유하는 상기 2644 bp 단편을 아가로스 겔 전기영동 및 실리카 멤브레인 스핀 칼럼을 통해 정제하였다.

1.3 pSG/Ub의 제조

단계 1.1 및 1.2에서 제조된 DNA 단편들을 T4 DNA 리가아제 (프로메가)를 이용하여 라이게이션하였고, HB2151 E. coli 세포에 형질 전환시켰다. 50 mg/l 앰피실린이 공급된 LB 배지에 배양하여 형질 전환체를 선별하였다.

EcoRI 및 SacⅡ 효소 (예상치: 2670 및 1192 bp 단편)로 제한 분석하여 앰피실린 내성 콜로니로부터 분리된 플라스미드 DNA를 확인하였다. 예상된 제한 패턴을 갖는 플라스미드 DNA를 pSG/Ub로 설계하였다.

2. pSCl의 설계

2.1 네오마이신 내성 카세트 (NeoR)의 제조

PCR을 통해 증폭하여, pcDNA3 플라스미드 (5446 bp, 인비트로젠)로부터 네오마이신 내성 카세트 (NeoR)를 얻었다. 클로닝 전략의 일환으로, 제한 효소 AflⅢ 인식 서열을 양 말단에 도입하였다. 상기 증폭된 지역은 pcDNA3 서열내의 뉴클레오티드 1788 내지 3252에 대응되었고, SV40 프로모터 및 복제 기점 (origin of replication), 네오마이신 내성 ORF, 및 SV40 poliA 신호를 포함하였다.

상기 올리고뉴클레오티드를 하기와 같이 설계하였다:

5'NeoR (SEQ ID 5) ATATACATG TCC CCA GGC AGG CAG AA

3'NeoR (SEQ ID 6) ATATACAT GTAT ACA GAC ATG ATA AG

증폭하기 위한 프로토콜은 다음과 같다: 1 ng/㎕의 플라스미드 DNA, 2 mM MgCl₂, 0.2 mM dNTPs, 각 프라이머 40O nM, 1X 보충 버퍼 및 0.04 u/㎕의 Taq DNA 중합효소 (시그마 제노시스); 온도 특성: 3분 94℃, 30회 (30초 94℃, 30초 46℃, 2분 72℃), 5분 72℃, 다음 사용 시까지 4℃에서 냉각.

상기 증폭 산물 (1484 bp)을 실리카 멤브레인 스핀 칼럼에 의해 정제하고, pGEM-T-Easy 벡터 (프로메가 Cat. n. A1360)에 라이게이션하고, E.coli 숙주 균주 HB2151에 형질 전환시켰다.

50 mg/l 앰피실린이 공급된 LB 배지에 배양하여 형질 전환체를 선별하였다.

SmaI alc SacI 효소 (예상치 ~ 1200 및 3300 bp 단편)로 제한 분석하여 앰피실린 내성 콜로니로부터 분리된 플라스미드 DNA를 확인하였다.

전체 삽입 부위의 서열 분석에 의해 올바른 제한 패턴을 보여주는 플라스미드를 추가로 확인하였고, 후속적으로 AflⅢ (뉴 잉글랜드 바이오랩스) 제한 효소로 분해하였다.

아가로스 겔 분리 및 실리카 멤브레인 스핀 칼럼상의 용리를 통하여 NeoR 카세트 (1471 bp)를 정제하였다.

2.2 벡터 단편 pSG/Ub의 제조

단계 1.3에서 제조된 플라스미드 pSG/Ub를 AflⅢ 분해에 의해 선형화하고, 실리카 멤브레인 스핀 칼럼상에 정제하였다.

2.3 pSCl의 제조

단계 2.1 및 2.2에서 제조된 DNA 단편들을 T4 DNA 리가아제 (프로메가)를 이용하여 라이게이션하고 JM109 E. coli 균주 (뉴 잉글랜드 바이오랩스)에 형질 전환시켰다. 50 mg/l 앰피실린이 공급된 LB 배지에 배양하여 형질 전환체를 선별하였다.

전술한 바와 같이, 항생제 내성 콜로니를 5'NeoR 및 3'NeoR 올리고뉴클레오티드로 PCR 증폭하여 예비적으로 분석하고, 그 다음, 제한 분석에 의해 정제된 플라스미드를 확인하였다. 상기의 목적을 달성하기 위하여, SmaI (602 위치, NeoR 내부 서열) 및 SacⅡ (4142 위치, UbC 내부 서열) 효소를 사용하였다. 예상된 제한 패턴 (3540 및 1793 bp 단편)을 갖는 플라스미드 DNA를 pSCl로 설계하였다.

3. pSCl-PTX3의 설계

3.1 hPTX3 코딩 서열의 제조

pSG5-PTX3 (WO 99/32516, "긴 펜트락신 PTX3을 함유하는 약제학적 조성물")으로부터 BamHI (로슈 응용 과학) 분해에 의해 hPTX3 (유전자 은행, 기탁 번호 BD 131701) 서열을 얻었다. 아가로스 겔 전기 영동 및 실리카 멤브레인 스핀 칼럼에 의해 인간 PTX3 단편 (1463 bp)을 정제하였다.

3.2 벡터 단편 pSCl의 제조

BamHI 분해에 의해 pSCl 벡터를 선형화하고, 실리카 멤브레인 스핀 칼럼상에 정제하였다.

3.3 pSCl-PTX3의 설계 및 확인

단계 3.2 및 3.3에서 제조된 DNA 단편들을 T4 DNA 리가아제 (로슈 응용 과학)를 이용하여 라이게이션하고, JM109 E. coli 균주에 형질 전환시켰다. 50 mg/l 앰피실린이 공급된 LB 배지에 배양하여 형질 전환체를 선별하였고, PTX3 서열에 상보적인 2개의 올리고뉴클레오티드로 PCR을 수행하여 예비적으로 스크리닝하였다.

상기 올리고뉴클레오티드 서열은 아래와 같다:

5'PTX (SEQ ID 7) GTGAGAACTCGGATGATTATGAT

3'PTX (SEQ ID 8) TGAAACATACTGAGCTCCTCCAT

10 ㎕의 최종 부피 내에서, 증폭 시약은 다음과 같다: 1 ㎕의 가열된 (boiled) 콜로니 (50 ml의 물 중 1 콜로니), 2 mM MgC1₂, 0.2 mM dNTPs, 각 프라이머 32O nM, 0.06% 포름아미드, 1X 보충 버퍼 및 0.08 u/㎕의 Taq DNA 중합 효소 (시그마 제노시스); 온도 특성: 3분 96℃, 30회 (30초 94℃, 30초 58℃, 2분 72℃), 5분 72℃, 다음 사용시까지 4℃에서 냉각.

PCR 스크리닝에 양성인 콜로니로부터 정제된 플라스미드를 SalI 제한 효소 (로슈 응용 과학)로 분해하여 hPTX3의 삽입 위치를 확인하였다. 예상된 제한 패턴 (6619 및 177 bp)을 가진 플라스미드를 UbC 프로모터, NeoR 카세트 및 hPTX3을 코딩하는 영역에 배열하였고, 이는 pSCl-PTX3로 확인되었다.

그 다음, 상기 새로운 플라스미드 (pSCl-PTX3)에 유비퀴틴 프로모터 조절 하부에 위치한 PTX3 cDNA 서열 및 SV40 프로모터 조절 하의 네오마이신 내성 유전자를 조립하였다; 다른 모든 특성 및 플라스미드 맵은 도 1에 나타내었다.

pSCl-PTX3의 전체 서열은 하기와 같다 (SEQ ID 2). 상기 pSCl-hPTX3 서열은 제1 EcoRI 부위로부터 시작하는 것으로 나타내었다 (도 5). PTX3 cDNA을 함유하는 pSG5로부터 유래된 서열은 밑줄로 표시하였다. 시작 코톤 (ATG) 및 종결 코돈은 굵게 표시하였다.

pSCl-PTX3 (SEQ ID 2)

현탁액 내에서, 그리고 세럼 및 단백질이 없는 배지 내에서의 생장 능력에 따라 인간 세포주 (HEK293F)를 선택하였다 (Florian M Wurm "배양된 포유동물 세포내의 재조합 단백질 치료제의 생산(Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells)", 네이처 바이오테크롤로지 22 (11): 1393-1398, 2004, Yan SC 등, "3 가지 포유동물 세포주로부터 재조합된 인간 단백질 C의 특성화 및 신규 정제(Characterization and novel purification of recombinant human protein C from three mammalian cell lines)", 바이오테크놀로지 (N.Y.), 1990, 7. 8 (7): 655-61. "인플루엔자 바이러스 백신의 생산을 위한 세포주의 용도: 기술, 제조 및 조절 고려 사항의 평가(Use of cell lines for the production of influenza virus vaccines: an appraisal of technical, manufacturing, and regulatory considerations)", Initiative for Vaccine Research, 세계 보건 기구, 제노바, 스위스 (2007, 4. 10.)). HEK293F에 형질 주입하기 위하여, pSCl-PTX3 플라스미드를 선형 (분해된 PvuI) 또는 원형으로 사용하였다. 가장 우수한 형질 주입 수득율은 선형 플라스미드를 사용한 경우에 얻을 수 있었다; 클론 선별은 생산성 및 생장 능력을 기반으로 하여 이루어졌다. 여러 차례의 서브 클로닝 후, 2Fl2 클론을 선별하였다.

hPTX3을 발현하는 인간 클론 2Fl2는, 부다페스트 조약의 조항에 준거하여, 2008년 1월 10일에 ECACC (European Collection of Cell Cultures, 건강 보호국, Porton Down, Wiltshire SP4 OJG, UK)에 기탁 번호 제08011001번으로 기탁되었다. 상기 실험적인 세부 사항은 후술하도록 한다.

3.4 pSC1 -PTX3으로부터 생성된 재조합 293F-세포

형질 주입 및 서브 클로닝

형질 주입을 실시한 당일, 최종 자유형 (Freestyle) 배지 부피가 28 ml인 125 ml 스피너 플라스크에 10⁶ 세포/ml 293F (인비트로젠 cat n°R790-07)를 접종하였다. 그 다음, 제조자의 프로토콜에 따라 상기 pSCl/PTX3 플라스미드를 293 펙틴 시약 (GIBCO/인비트로젠)에 흡착시켰다.

간단히 설명하여, 2개의 분리형 튜브에, 30 μg의 원형 pSCl-PTX3 또는 선형화된 PvuI을 1 ml의 옵티멤 (Optimem; GIBCO/인비트로젠, 칼스배드, CA, USA)에 희석하고, 40 ㎕의 293 펙틴 (인비트로젠)을 1 ml의 옵티멤에 희석하였다. 상기 두 가지 용액을 실온에서 5분 동안 인큐베이션한 다음, 이들을 혼합하고 (최종 부피 2 ml), 상기와 동일한 조건에서 30분 동안 인큐베이션하였다. DNA/지질 혼합물을 세포에 첨가하고 37℃, 5% CO₂에서 교반 (120 rpm)하면서 인큐베이션하였다. 36시간 동안 배양한 후, 상기 배지를 선별 배지 (200 ml 자유형 배지 + 500 μg/ml의 G418)로 교체하고, 상기 형질 주입된 세포들을 10개의 96 웰 플레이트에 200 ㎕/웰로 평판 배양에 하였다. 15일 후, ELISA를 이용하여 가장 생산성이 높은 생산자 세포-집단 (cell-pools)을 선정하고 24 웰, 6 웰 및 T25 플라스크에서 확대 배양하였다.

얻어진 재조합 세포-집단을 새 배지 50% 및 조건 배지 50%인 96 웰 플레이트에서 웰당 세포 1개로 서브 클로닝하였다.

실시예 2: 클론 MS24PTX

플라스미드 pSASSI - hPTX3 의 설계

1. pCEPlightΔ의 설계

내부에 다중 클로닝 부위 및 BamHI 내성 부위를 소실하고, 항체 가벼운 사슬 (antibody light chain)이 미리 클로닝된 pCEP4 플라스미드 (인비트로젠 cat. n. V044-50)를 제한 효소 EcoRV 및 ClaI (로슈 응용 과학)로 절단하였다; 상기 분해로 염색체 외 복제를 허용하는 엡스타인-바-바이러스 (Epstein-Barr-Virus) 복제 기점 (oriP) 및 핵항원 (EBNA-I 유전자에 의해 코딩된)이 없는 플라스미드를 얻었다. 상기 결과 생성된 단편들의 길이는 6910 및 4281 bp였다. pCEP 골격을 함유하는 상기 6910 bp 단편은, 아가로스 겔 전기 영동 및 실리카 멤브레인 스핀 칼럼을 통하여 정제되었다. ClaI은 접착성 말단을 생성하기 때문에, 상기 단편은 다음의 프로토콜에 따라 T4 DNA 중합 효소 (로슈 응용 과학)를 사용하여 채워진다: 150 ng의 정제된 ClaI/EcoRV 단편 (38 ㎕), 5 ㎕의 10x T4 DNA 중합 효소 버퍼, 4 ㎕의 dNTP 혼합물 2.5 mM, 3 ㎕의 T4 DNA 중합 효소 (lU/㎕). 37℃에서 15분 후, 70℃에서 5분 동안 상기 반응을 정지한 다음, 얼음상에 놓았다. 상기 단편을 실리카 멤브레인 스핀 칼럼상에 정제하고 T4 DNA 리가아제 (프로메가)를 사용하여 실온에서 밤새 자가 라이게이션을 수행하였다. 충분한 TOP10 세포들을 상기 라이게이션 혼합물로 형질 전환시키고, 및 100 mg/L 앰피실린이 공급된 LB 플레이트상에 배양하여 형질 전환체를 선별하였다.

앰피실린 내성 콜로니로부터 분리된 플라스미드 DNA를, pCEPlightΔ로 설계하였다.

2. 히그로마이신 내성 및 CMV 프로모터를 함유하는 벡터 단편의 제조

히그로마이신 내성 카세트와 거대 세포 바이러스 (cytomegalovirus, CMV) 중간체 초기 인핸서/프로모터를 함께 PCR에 의해 증폭된 pCEPlightΔ로부터 얻었다. 클로닝 전략의 일환으로, 제한 효소 BamHI의 인식 서열을 상기 CMV 프로모터의 3' 말단을 어닐링 (annealing)하는 올리고뉴클레오티드에 도입하였다.

약 5500 bp의 상기 증폭된 영역은, CMV 프로모터, TK polyA 신호와 함께 TK 프로모터의 조절 하에 있는 히그로마이신 유전자를 포함하였다.

상기 올리고뉴클레오티드는 하기와 같이 설계되었다:

올리고 CMV (SEQ ID 9) 5'GAGAACTGTAACGTTGGATCCAGCTGG 3'

올리고 H (SEQ ID 10) 5'GTGTACAAAGGATCCAGACATGATAAG 3'

증폭을 위한 프로토콜은 다음과 같다: 2 ng의 pCEPlightΔ, 각 프라이머 20O nM, 0.2 mM dNTPs, 1X 보충 버퍼, 1.5 ㎕ DMSO, 0.5 ㎕ Taq DNA 중합 효소 (Phusion), 최종 부피 50 ㎕; 온도 특성: 1분 98℃, 35회 (10초 98℃, 30초 55℃, 3분 72℃), 10분 72℃, 다음 사용시까지 4℃에서 냉각.

상기 증폭 산물 (~5500 bp)을 아가로스 겔 전기 영동 및 실리카 멤브레인 스핀 칼럼을 통하여 정제하였다. 정제된 단편을 자가 라이게이션시키고, 충분한 TOPlO 세포 (인비트로젠)를 형질 전환하는 용도로 사용하였다. 앰피실린 내성 콜로니로부터 분리된 플라스미드 DNA를, 제한 및 서열 분석을 통해 확인하였고, 이를 pCEPΔBam으로 설계하였다.

3. hPTX3 유전자의 제조

hPTX3 (유전자 은행 기탁 번호 BD 131701) 서열을 전술한 바에 따라 BamHI (로슈 응용 과학) 분해에 의해 pSCl-PTX3으로부터 얻었다. 인간 PTX3 단편 (1463 bp)을 아가로스 겔 전기 영동 및 실리카 멤브레인 스핀 칼럼을 통해 정제하였다.

4. pCEPΔBam-hPTX3의 제조

상기 pCEPΔBam 벡터를 BamHI 분해에 의해 선형화시키고 실리카 멤브레인 스핀 칼럼상에서 정제하였다. 선형화된 pCEPΔBam 및 단계 3에서 제조된 hPTX3에 대응하는 DNA 단편을 T4 DNA 리가아제 (로슈 응용 과학)를 사용하여 라이게이션하고 TOPlO E. coli 균주를 형질 전환하는 용도로 사용하였다. 100 mg/L 앰피실린이 공급된 LB 배지에 배양하여 형질 전환체를 선별하고 PTX3 단편의 위치를 확인하기 위하여 제한 분석을 예비적으로 스크리닝하였다.

5. SV40 폴리아데닐화 신호의 제조

SV40 polyA 신호를 PCR에 의해 증폭된 pCEPΔlight 플라스미드로 부터 얻었다. 클로닝 전략의 일환으로, 제한 효소 HindⅢ 및 XhoI의 인식 서열을 단편 말단에 각각 도입하였다.

상기 올리고뉴클레오티드를 하기와 같이 설계하였다:

PCEPSVH (SEQ ID 11) 5'AAGCTTAGACATGATAAGATACTTG 3'

PCEPSVX (SEQ ID 12) 5'CTCGAGAGTCGACCGGTCATGGCTGC 3'

증폭하기 위한 프로토콜은 다음과 같다: 1 ng의 pCEPlightΔ, 각 프라이머 20O nM, 0.2 mM dNTPs, 1X 보충 버퍼, 2 ㎕ MgC1₂ 5O mM, 0.5 ㎕ Taq DNA 중합 효소 (인비트로젠), 최종 부피 50 ㎕; 온도 특성: 1분 94℃, 30회 (30초 94℃, 1분 55℃, 1분 72℃), 15분 72℃, 다음 사용 시까지 4℃에서 냉각.

상기 증폭 산물 (~420 bp)을 아가로스 겔 전기 영동 및 실리카 멤브레인 스핀 칼럼을 통하여 정제하였다.

6. pSASSI-hPTX3의 제조

SV40 polyA 신호 및 pCEPΔBam-hPTX3에 대응하는 정제된 단편을 HindⅢ/XhoI 제한 효소로 분해하고, T4 DNA 리가아제 (프로메가)를 사용하여 라이게이션시켰다. 라이게이션 혼합물을 충분한 TOPlO 세포 (인비트로젠)를 형질 전환시키는 용도로 사용하고 100 mg/L의 앰피실린을 함유하는 LB 플레이트상에 배양하여 형질 전환체를 선별하였다.

앰피실린 내성 콜로니로부터 분리된 플라스미드 DNA를, 제한 및 서열 분석에 의해 확인하고 상기 플라스미드를 pSASSI-hPTX3로 설계하였다.

pSASSI-HPTX3의 전체 서열은 다음과 같다 (SEQ ID 1). 상기 pSASSI-hPTX3 서열은 BamHI 부위 (도 1)로부터 시작되는 것으로 나타내었다. 상기 hPTX3의 서열은 소문자로 나타내었다. 시작 코돈 (atg) 및 종결 코돈 (taa)은 굵게 표시하였다.

pSASSI-HPTX3 (SEQ ID 1)

실시예 3

pSASSI - hPTX3 형질 주입에 의해 생성된 재조합 MS24PTX 클론

1. 형질 주입 및 서브 클로닝

형질 주입을 실시한 당일, 최종 자유형 배지 부피가 28 ml인 125 ml 스피너 플라스크에 10⁶ 세포/ml 293F/PTX3/2F12를 접종하였다. 그 다음, 제조자의 프로토콜에 따라 상기 pSASSI-hPTX3 플라스미드를 293 펙틴 시약 (GIBCO/인비트로젠)에 흡착시켰다.

간단히 말하여, 선형화된 30 μg의 pSASSI-hPTX3 NruI을 1 ml의 옵티멤 (GIBCO/인비트로젠, 칼스배드, CA, USA)으로 희석하고 40 ㎕의 293 펙틴 (인비트로젠)을 1 ml의 옵티멤으로 희석하였다. 상기 양자의 용액을 실온에서 5분 동안 인큐베이션한 다음, 이들을 혼합하고 (최종 부피 2 ml) 상기와 동일한 조건에서 30분 동안 인큐베이션하였다. DNA/지질 혼합물을 세포에 첨가하고 37℃, 5% CO₂에서 교반 (120rpm)하면서 인큐베이션하였다. 36시간 동안 배양한 후, 상기 배지를 선별 배지 (200 ml 자유형 배지 + 200 μg/ml의 히그로마이신)로 교체하고, 상기 형질 주입된 세포들을 200 ㎕/웰로 10개의 96 웰에 평판 배양하였다. 15일 후, ELIS를 통하여 생산성이 가장 높은 생산자 세포-집단을 선정하였고, 이를 24 웰, 6 웰 및 T25 플라스크에 확장 배양하였다.

얻어진 재조합 세포-집단을 새 배지 50% 및 조건 배지 50%인 96 웰 플레이트에서 웰당 세포 1개로 서브 클로닝하였다.

2. 재조합 hPTX3의 ELISA 검출

정제된 PTX3 또는 상기 배양 상등액에 분비된 PTX3을 샌드위치 ELISA를 이용하여 적정하였다. PTX3을 검출하기 위하여, 96-웰 눙크 맥시솔브 미세적정판 (Nunc Maxisorb microtiter plate; Nunc, 로스킬레, 덴마크)를, pH 9.6의 탄산 나트륨 버퍼 15 mM 중 랫트 단일 클론 항체 MNB4 항-인간 PTX3 (알렉시스™ 바이오케미칼스, 라우센, 스위스) 700 ng/ml로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 웰을 PBS 및 0.05% 트윈-20 (PBS-Tw, 세정 용액)으로 세정하고 5% 건조 밀크를 함유하는 PBS-Tw 300 ㎕로, 실온에서 2시간 동안 블로킹하였다.

세포 상등액 또는 정제된 재조합 인간 PTX3을 상기 웰에 첨가하고, 세정 용액 및 1% BSA에 희석하였다. 정량화를 위하여, 0 내지 100 ng/ml의 범위에서, CHO 세포로부터 정제된 재조합 인간 PTX3으로 표준 곡선을 만들었다. 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 비오틴-복합 다중 클론성 (biotin-conjugated polyclonal) 토끼 항-PTX3 항체를 이용하여, 결합된 PTX3을 검출하고, 겨자무 과산화효소 (horseradish peroxidase; 시그마-알드리치, USA)에 콘주게이션된 스트렙트아비딘 (streptavidin)과 함께 인큐베이션하였다. 마지막으로, 발색 현상 (color development)을 위해 2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤티아졸린-6-설폰산) (시그마 케미칼 Co. USA)을 첨가하고, 마이크로플레이트 리더 모델 3550 EIA (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 405 nm에서의 흡광도를 평가하였다.

실시예 4

클론 293F/ PTX3 /2F12와 MS24PTX 의 생장, 생존도 및 생산성 비교

1 리터 스피너 플라스크내의 자유형 293 배지 500 ml에, 상기 두 개의 클론으로부터 유래된 세포를 1,000,000 세포/ml (생존도 ≥ 90%)의 밀도로 접종하였다. 세포가 사멸하기 시작할 때까지 약 1주일 동안 생장, 생존도 및 생산성을 모니터하였다.

상기와 동일한 접종 및 생장 조건에서 MS24PTX (패널 A) 및 293F/PTX3/2F12 (패널 B) 클론의 생장, 생존도 및 생산성을 도 2에 나타내었다. 도 2에서 나타낸 바와 같이, PTX3가 CMV 프로모터(MS24PTX 클론)의 조절 하에 있는 새로운 플라스미드를 갖는 클론 293F/PTX3/2F12를 발현하는 PTX3의 재형질 주입으로, 약 4배 증가된 PTX3 생산성을 얻을 수 있었다.

실시예 5

MS24PTX 클론으로부터 재조합 인간 PTX3 의 정제

스피너 플라스크에서 배양된 MS24PTX 클론으로부터 얻은 배양 상등액을 Q-세파로스TM 패스트 플로우 (Fast Flow) (GE 헬스케어, UK) 충진관에 로딩하였다. 비선형 농도 구배를 이용하여 잔여 물질을 용리시켰다. 상기 분획 함유-PTX3을 세라믹 수산화 인회석 (BioRad, Hercules, CA, USA) 충진관에 직접 적용하였다. 상기 잔여 물질을 인산염 농도를 증가시켜 비선형 방식으로 용리하였다. 상기 분획 함유-PTX3을 농축시키고, 한외여과막 (ultrafiltrationmembrane) (펠리컨-바이오맥스 100, 밀리포어) 상에서 버퍼를 교체한 다음, 바이오셉 (Biosep) SEC S4000 (페노메넥스) 및 SDS-PAGE 상의 크기 배제 크로마토그래피에 의해 특성화하였다 (도 3).

실시예 6

h- PTX3 의 FGF2 에의 결합

상기 정제된 재조합 hPTX3의 FGF2에의 결합을 ELISA 시스템에서 평가하였다. PBS 중 2 μg/ml의 FGF2 (칼바이오켐)로 96-웰 플레이트 (팔콘(Falcon) 3912)를 코팅하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. PBS 및 0.1% 트리톤 X-100 (PBS-Tr, 세정 용액)으로 웰을 세정하고 3% BSA (PBS-B 블로킹 및 희석 용액)를 함유하는 PBS-Tr 200 ㎕로 실온에서 2시간 동안 블로킹하였다. 세정 후, 100 ㎕의 시료를 첨가하여 결합이 이루어졌고, 0 내지 120 ng/ml 범위의 PTX3 농도에서 PBS-B에 희석시키고, 상기 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세정 후, 100 ㎕/웰의 100 ng/ml 토끼 항-PTX3 다중 클론성 항체와 함께 인큐베이션하고 (37℃에서 1시간), 다시 세정하고 염소 항-토끼 IgG로 표지된 겨자무 과산화효소 100 ㎕ (PBS-B 중 1 : 1000)와 함께 인큐베이션하였다 (37℃에서 1시간). 세정 후, 100 ㎕의 발색성 기질 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB) (시그마-알드리치)을 첨가하고 10 내지 15분 후, 100 ㎕의 HCl 1M을 첨가하여 상기 반응을 정지시키고, 마이크로플레이트 리더 모델 3550 EIA (바이오-라드(Bio-Rad), 허큘러스, CA, USA)을 사용하여 흡광도를 측정하였다 (도 4).

SEQUENCE LISTING <110> TECNOGEN SpA SASSANO, Marica ESPOSITO, Adelaide RIVIECCIO, Vincenzo CASSANI, Giovanni <120> IMPROVED HUMAN LONG PENTRAXIN 3 EXPRESSION SYSTEM AND USES THEREOF <130> PCT 109660 <150> EP09 166 759.2 <151> 2009-07-29 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7469 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant plasmid pSASSI-HPTX3 <400> 1 ggatcccccg ggctgcagga attccggctc aaactcagct cacttgagag tctcctcccg 60 ccagctgtgg aaagaacttt gcgtctctcc agcaatgcat ctccttgcga ttctgttttg 120 tgctctctgg tctgcagtgt tggccgagaa ctcggatgat tatgatctca tgtatgtgaa 180 tttggacaac gaaatagaca atggactcca tcccactgag gaccccacgc cgtgcgactg 240 cggtcaggag cactcggaat gggacaagct cttcatcatg ctggagaact cgcagatgag 300 agagcgcatg ctgctgcaag ccacggacga cgtcctgcgg ggcgagctgc agaggctgcg 360 ggaggagctg ggccggctcg cggaaagcct ggcgaggccg tgcgcgccgg gggctcccgc 420 agaggccagg ctgaccagtg ctctggacga gctgctgcag gcgacccgcg acgcgggccg 480 caggctggcg cgtatggagg gcgcggaggc gcagcgccca gaggaggcgg ggcgcgccct 540 ggccgcggtg ctagaggagc tgcggcagac gcgagccgac ctgcacgcgg tgcagggctg 600 ggctgcccgg agctggctgc cggcaggttg tgaaacagct attttattcc caatgcgttc 660 caagaagatt tttggaagcg tgcatccagt gagaccaatg aggcttgagt cttttagtgc 720 ctgcatttgg gtcaaagcca cagatgtatt aaacaaaacc atcctgtttt cctatggcac 780 aaagaggaat ccatatgaaa tccagctgta tctcagctac caatccatag tgtttgtggt 840 gggtggagag gagaacaaac tggttgctga agccatggtt tccctgggaa ggtggaccca 900 cctgtgcggc acctggaatt cagaggaagg gctcacatcc ttgtgggtaa atggtgaact 960 ggcggctacc actgttgaga tggccacagg tcacattgtt cctgagggag gaatcctgca 1020 gattggccaa gaaaagaatg gctgctgtgt gggtggtggc tttgatgaaa cattagcctt 1080 ctctgggaga ctcacaggct tcaatatctg ggatagtgtt cttagcaatg aagagataag 1140 agagaccgga ggagcagagt cttgtcacat ccgggggaat attgttgggt ggggagtcac 1200 agagatccag ccacatggag gagctcagta tgtttcataa atgttgtgaa actccacttg 1260 aagccaaaga aagaaactca cacttaaaac acatgccagt tgggaaggtc tgaaaactca 1320 gtgcataata ggaacacttg agactaatga aagagagagt tgagaccaat ctttatttgt 1380 actggccaaa tactgaataa acagttgaag gaaagacatt ggaaaaagct tagacatgat 1440 aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa aatgctttat 1500 ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca ataaacaagt 1560 taacaacaac aattgcattc attttatgtt tcaggttcag ggggaggtgt gggaggtttt 1620 ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg tatggctgat tatgatccgg ctgcctcgcg 1680 cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct 1740 tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc 1800 gggtgtcggg gcgcagccat gaccggtcga ctctcgaggg ggggcccggg gatccaacgt 1860 tacagttctc cagtgcatgt aatcccttca gttggttggt acaacttgcc aactgggccc 1920 tgttccacat gtgacacggg gggggaccaa acacaaaggg gttctctgac tgtagttgac 1980 atccttataa atggatgtgc acatttgcca acactgagtg gctttcatcc tggagcagac 2040 tttgcagtct gtggactgca acacaacatt gcctttatgt gtaactcttg gctgaagctc 2100 ttacaccaat gctgggggac atgtacctcc caggggccca ggaagactac gggaggctac 2160 accaacgtca atcagagggg cctgtgtagc taccgataag cggaccctca agagggcatt 2220 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tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca 3960 gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac 4020 cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa 4080 ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc 4140 agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg 4200 tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc 4260 ctttttacgg ttcctggcct tttgctgcgc cgcgtgcggc tgctggagat ggcggacgcg 4320 atggatatgt tctgccaagg gttggtttgc gcattcacag ttctccgcaa gaattgattg 4380 gctccaattc ttggagtggt gaatccgtta gcgaggtgcc gccggcttcc attcaggtcg 4440 aggtggcccg gctccatgca ccgcgacgca acgcggggag gcagacaagg tatagggcgg 4500 cgcctacaat ccatgccaac ccgttccatg tgctcgccga ggcggcataa atcgccgtga 4560 cgatcagcgg tccagtgatc gaagttaggc tggtaagagc cgcgagcgat ccttgaagct 4620 gtccctgatg gtcgtcatct acctgcctgg acagcatggc ctgcaacgcg ggcatcccga 4680 tgccgccgga agcgagaaga atcataatgg ggaaggccat ccagcctcgc gtcgcgaacg 4740 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ttattttggg cgttgcgtgg ggtctggtcc acgactggac tgagcagaca gacccatggt 6480 ttttggatgg cctgggcatg gaccgcatgt actggcgcga cacgaacacc gggcgtctgt 6540 ggctgccaaa cacccccgac ccccaaaaac caccgcgcgg atttctggcg tgccaagcta 6600 gtcgaccaat tctcatgttt gacagcttat catcgcagat ccgggcaacg ttgttgccat 6660 tgctgcaggc gcagaactgg taggtatgga agatctatac attgaatcaa tattggcaat 6720 tagccatatt agtcattggt tatatagcat aaatcaatat tggctattgg ccattgcata 6780 cgttgtatct atatcataat atgtacattt atattggctc atgtccaata tgaccgccat 6840 gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 6900 gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 6960 ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 7020 ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 7080 atcaagtgta tcatatgcca agtccgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 7140 cctggcatta tgcccagtac atgaccttac gggactttcc tacttggcag tacatctacg 7200 tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacaccaat gggcgtggat 7260 agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 7320 tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa taaccccgcc ccgttgacgc 7380 aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctcgt ttagtgaacc 7440 gtcagatctc tagaagctgg gtaccagct 7469 <210> 2 <211> 6796 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant plasmid pSC1-PTX3 <400> 2 aattcggatc ccccgggctg caggaattcc ggctcaaact cagctcactt gagagtctcc 60 tcccgccagc tgtggaaaga actttgcgtc tctccagcaa tgcatctcct tgcgattctg 120 ttttgtgctc tctggtctgc agtgttggcc gagaactcgg atgattatga tctcatgtat 180 gtgaatttgg acaacgaaat agacaatgga ctccatccca ctgaggaccc cacgccgtgc 240 gactgcggtc aggagcactc ggaatgggac aagctcttca tcatgctgga gaactcgcag 300 atgagagagc gcatgctgct gcaagccacg gacgacgtcc tgcggggcga gctgcagagg 360 ctgcgggagg agctgggccg gctcgcggaa agcctggcga ggccgtgcgc gccgggggct 420 cccgcagagg ccaggctgac cagtgctctg gacgagctgc tgcaggcgac ccgcgacgcg 480 ggccgcaggc tggcgcgtat ggagggcgcg gaggcgcagc gcccagagga ggcggggcgc 540 gccctggccg cggtgctaga ggagctgcgg cagacgcgag ccgacctgca cgcggtgcag 600 ggctgggctg cccggagctg gctgccggca ggttgtgaaa cagctatttt attcccaatg 660 cgttccaaga agatttttgg aagcgtgcat ccagtgagac caatgaggct tgagtctttt 720 agtgcctgca tttgggtcaa agccacagat gtattaaaca aaaccatcct gttttcctat 780 ggcacaaaga ggaatccata tgaaatccag ctgtatctca gctaccaatc catagtgttt 840 gtggtgggtg gagaggagaa caaactggtt gctgaagcca tggtttccct gggaaggtgg 900 acccacctgt gcggcacctg gaattcagag gaagggctca catccttgtg ggtaaatggt 960 gaactggcgg ctaccactgt tgagatggcc acaggtcaca ttgttcctga gggaggaatc 1020 ctgcagattg gccaagaaaa gaatggctgc tgtgtgggtg gtggctttga tgaaacatta 1080 gccttctctg ggagactcac aggcttcaat atctgggata gtgttcttag caatgaagag 1140 ataagagaga ccggaggagc agagtcttgt cacatccggg ggaatattgt tgggtgggga 1200 gtcacagaga tccagccaca tggaggagct cagtatgttt cataaatgtt gtgaaactcc 1260 acttgaagcc aaagaaagaa actcacactt aaaacacatg ccagttggga aggtctgaaa 1320 actcagtgca taataggaac acttgagact aatgaaagag agagttgaga ccaatcttta 1380 tttgtactgg ccaaatactg aataaacagt tgaaggaaag acattggaaa aagcttatcg 1440 ataccgtcga cctcgagggg gggcccgggg atccagatct tattaaagca gaacttgttt 1500 attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca 1560 tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc 1620 tggtcgactc tagactcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 1680 ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 1740 gataacgcag gaaagaacat gtccccaggc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa 1800 ttagtcagca accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag 1860 catgcatctc aattagtcag caaccatagt cccgccccta actccgccca tcccgcccct 1920 aactccgccc agttccgccc attctccgcc ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc 1980 agaggccgag gccgcctctg cctctgagct attccagaag tagtgaggag gcttttttgg 2040 aggcctaggc ttttgcaaaa agctcccggg agcttgtata tccattttcg gatctgatca 2100 agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc 2160 ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc 2220 tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga 2280 cctgtccggt gccctgaatg aactgcagga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac 2340 gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct 2400 gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa 2460 agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc 2520 attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct 2580 tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc 2640 caggctcaag gcgcgcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg 2700 cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct 2760 gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct 2820 tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca 2880 gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga gcgggactct ggggttcgaa 2940 atgaccgacc aagcgacgcc caacctgcca tcacgagatt tcgattccac cgccgccttc 3000 tatgaaaggt tgggcttcgg aatcgttttc cgggacgccg gctggatgat cctccagcgc 3060 ggggatctca tgctggagtt cttcgcccac cccaacttgt ttattgcagc ttataatggt 3120 tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct 3180 agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctgtataca tgtgagcaaa 3240 aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 3300 ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 3360 aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 3420 gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc 3480 tcaatgctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg 3540 tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga 3600 gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag 3660 cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta 3720 cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag 3780 agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg 3840 caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac 3900 ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc 3960 aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag 4020 tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc 4080 agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac 4140 gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc 4200 accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg 4260 tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag 4320 tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc 4380 acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac 4440 atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag 4500 aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac 4560 tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg 4620 agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc 4680 gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact 4740 ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg 4800 atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa 4860 tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcttttt 4920 tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg 4980 tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga 5040 cgtctaagaa accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc 5100 cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg 5160 agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt 5220 cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac 5280 tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca 5340 tcaggaaatt gtaaacgtta atattttgtt aaaattcgcg ttaaattttt gttaaatcag 5400 ctcatttttt aaccaatagg ccgaaatcgg caaaatccct tataaatcaa aagaatagac 5460 cgagataggg ttgagtgttg ttccagtttg gaacaagagt ccactattaa agaacgtgga 5520 ctccaacgtc aaagggcgaa aaaccgtcta tcagggcgat ggcccactac gtgatctggc 5580 ctccgcgccg ggttttggcg ccccccgcgg gcgcccccct cctcacggcg agcgctgcca 5640 cgtcagacga agggcgcagc gagcgtcctg atccttccgc ccggacgctc aggacagcgg 5700 cccgctgctc ataagactcg gccttagaac cccagtatca gcagaaggac attttaggac 5760 gggacttggg tgactctagg gcactggttt tctttccaga gagcggaaca ggcgaggaaa 5820 agtagtccct tctcggcgat tctgcggagg gatctccgtg gggcggtgaa cgccgatgat 5880 tatataagga cgcgccgggt gtggcacagc tagttccgtc gcagccggga tttgggtcgc 5940 ggttcttgtt tgtggatcgc tgtgatcgtc acttggtgag tagcgggctg ctgggctggc 6000 cggggctttc gtggccgccg ggccgctcgg tgggacggaa gcgtgtggag agaccgccaa 6060 gggctgtagt ctgggtccgc gagcaaggtt gccctgaact gggggttggg gggagcgcag 6120 caaaatggcg gctgttcccg agtcttgaat ggaagacgct tgtgaggcgg gctgtgaggt 6180 cgttgaaaca aggtgggggg catggtgggc ggcaagaacc caaggtcttg aggccttcgc 6240 taatgcggga aagctcttat tcgggtgaga tgggctgggg caccatctgg ggaccctgac 6300 gtgaagtttg tcactgactg gagaactcgg tttgtcgtct gttgcggggg cggcagttat 6360 ggcggtgccg ttgggcagtg cacccgtacc tttgggagcg cgcgccctcg tcgtgtcgtg 6420 acgtcacccg ttctgttggc ttataatgca gggtggggcc acctgccggt aggtgtgcgg 6480 taggcttttc tccgtcgcag gacgcagggt tcgggcctag ggtaggctct cctgaatcga 6540 caggcgccgg acctctggtg aggggaggga taagtgaggc gtcagtttct ttggtcggtt 6600 ttatgtacct atcttcttaa gtagctgaag ctccggtttt gaactatgcg ctcggggttg 6660 gcgagtgtgt tttgtgaagt tttttaggca ccttttgaaa tgtaatcatt tgggtcaata 6720 tgtaattttc agtgttagac tagtaaattg tccgctaaat tctggccgtt tttggctttt 6780 ttgttagacc ggaccg 6796 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 3 atatcacgtg atctggcctc cgcgcc 26 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 4 ggaattcggt ccggtctaac aaa 23 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 5 atatacatgt ccccaggcag gcagaa 26 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 6 atatacatgt atacagacat gataag 26 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 7 gtgagaactc ggatgattat gat 23 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 8 tgaaacatac tgagctcctc cat 23 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 9 gagaactgta acgttggatc cagctgg 27 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 10 gtgtacaaag gatccagaca tgataag 27 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 11 aagcttagac atgataagat acattg 26 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 12 ctcgagagtc gaccggtcat ggctgc 26

Claims (18)

1. 진핵 세포 발현 벡터로서, 유효 프로모터의 조절 하에 인간 긴 펜트락신(human long pentraxin) PTX3 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 선택 표지(selectable marker)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 서열번호 1의 서열을 필수적으로 가지며,
   상기 벡터는 인간 긴 펜트락신 PTX3 단백질을 이미 발현할 수 있는 재조합 인간 숙주 세포를 형질전환하기 위해 사용되고; 상기 재조합 인간 숙주 세포는 ECACC에 제08011001번으로 기탁된 재조합 293F/PTX3/2F12 클론인 진핵 세포 발현 벡터.
2. 제1항에 있어서, 벡터는 선형화되는 것인 벡터.
3. 제1항의 진핵 세포 발현 벡터를 사용하여 추가로 형질전환된 재조합 293F/PTX3/2F12 클론(수탁번호 ECACC 제08011001번)인, 인간 긴 펜트락신 PTX3 단백질을 발현할 수 있는 형질전환된 재조합 인간 세포.
4. 제3항에 있어서, ECACC에 제09072902번으로 기탁된 재조합 MS24PTX 클론인 형질전환된 재조합 인간 세포.
5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 인간 긴 펜트락신 PTX3 단백질을 생산하기 위해 사용되는 형질전환된 재조합 인간 세포.
6. 인간 긴 펜트락신 PTX3 단백질을 생산하는 방법으로서,
   a) 재조합 인간 긴 펜트락신 PTX3 단백질을 이미 발현하는 재조합 인간 세포에, 인간 긴 펜트락신 유전자가 CMV 프로모터의 조절 하에 있는 플라스미드를 형질주입하는 단계;
   b) 형질주입된 재조합 인간 세포를 선별 및 배양하는 단계; 및
   c) 형질주입된 재조합 인간 세포의 배양 배지로부터 인간 긴 펜트락신 PTX3 단백질을 정제하는 단계
   를 포함하고, 상기 재조합 인간 긴 펜트락신 PTX3 단백질을 이미 발현하는 재조합 인간 세포는 ECACC에 제08011001번으로 기탁된 재조합 293F/PTX3/2F12 클론인 방법.
7. 제6항에 있어서, 형질주입된 재조합 인간 세포는 ECACC에 제09072902번으로 기탁된 재조합 MS24PTX 클론인 방법.
8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 정제 단계는 음이온-교환 크로마토그래피, 수산화인회석(hydroxyapatite) 크로마토그래피 또는 크기 배제(size exclusion) 크로마토그래피의 단계 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
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