ES2432242T3

ES2432242T3 - Sistema mejorado de expresión de pentraxina 3 larga humana y sus usos

Info

Publication number: ES2432242T3
Application number: ES10740573T
Authority: ES
Inventors: Marica Sassano; Adelaide Esposito; Vincenzo Rivieccio; Giovanni Cassani
Original assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Current assignee: Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite SpA
Priority date: 2009-07-29
Filing date: 2010-07-20
Publication date: 2013-12-02
Anticipated expiration: 2030-07-20
Also published as: WO2011012496A1; SI2459721T1; EA023191B1; US8883446B2; DK2459721T3; CA2769257A1; SG177756A1; HK1172649A1; BR112012001980A2; EA201200198A1; AU2010277786A1; MX2012001109A; CY1116486T1; PT2459721E; HRP20130947T1; IL217696A; PL2459721T3; CA2769257C; CN102549160B; AU2010277786B2

Abstract

Uso de un vector de expresión eucariótico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína pentraxina PTX3 larga humana puesta bajo el control de un promotor efectivo y de una secuencia de nucleótidos que codifica un marcador seleccionable, que tiene esencialmente la secuencia de SEQ ID 1, para transformar una célula anfitriona humana recombinante que ya es capaz de expresar la proteína pentraxina PTX3 larga humana, en donde dicha célula anfitriona humana recombinante es el clon 293F/PTX3/2F12 recombinante depositado en la ECACC con el nº 08011001.

Description

Sistema mejorado de expresión de pentraxina 3 larga humana y sus usos

CAMPO DEL INVENTO

El presente invento se refiere a un sistema celular derivado de seres humanos, capaz de expresar altos niveles de la proteína pentraxina 3 humana (hPTX3), a unos métodos y al material usado.

ANTECEDENTES DEL INVENTO

La pentraxina 3 larga humana, PTX3 o hPTX3 (número de acceso en el GeneBank BD 131701) es una glicoproteína multimérica que se compone de ocho subunidades engarzadas por puentes de disulfuro.

Los autores del presente invento ya han diseñado un sistema de expresión para la producción de la PTX3 en el linaje de células humanas HEK293F. Este sistema está basado en un plásmido que contiene el gen de resistencia a neomicina, en donde el gen de PTX3 está puesto bajo el control de una secuencia del promotor de ubiquitina C humana. Dicho sistema evita la formación potencial de una PTX3 quimérica derivada de una producción endógena de PTX3 por un linaje de células de origen no humano. El clon aislado mejor productor, denominado 2F12, se seleccionó entre los que se habían obtenido. Se obtuvo una producción de aproximadamente 20 mg/l de PTX3, que no era suficiente para las necesidades de producción a escala comercial.

Con la meta de aumentar los niveles de expresión de PTX3, los autores del presente invento han construido un plásmido en el que el gen de PTX3 estaba bajo el control de promotor de CMV. El plásmido se usó para volver a transfectar el clon 2F12 que expresa la PTX3. El nivel de productividad detectado en los nuevos transfectomas aislados era más alto que lo esperado, a saber alrededor de 80 mg/l.

DESCRIPCIÓN DEL INVENTO

Se obtuvo un clon de origen humano que expresaba altos niveles de la PTX3 humana usando una estrategia experimental que incluía las siguientes etapas:

a) la construcción de unas casetes de expresión de plásmidos que son portadoras de la PTX3 humana bajo el control de un promotor de CMV (citomegalovirus);

b) la inserción de la casete de resistencia a higromicina en dicho plásmido, con el fin de seleccionar unos transfectomas estables que se originan a partir de una transfección renovada del clon G418 resistente que expresa la PTX3;

c) la modificación de la identidad y de los niveles de las proteínas recombinantes expresadas;

d) la caracterización bioquímica de la hPTX3 recombinante.

El contenido del documento de solicitud de patente internacional PCT/EP2009/050937 se incorpora a la presente memoria descriptiva por su referencia.

Es un objeto del invento el uso de un vector de expresión eucariótico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína pentraxina PTX3 larga humana bajo el control de un promotor efectivo y de una secuencia de nucleótidos que comprende un marcador seleccionable, que tiene esencialmente la secuencia de SEQ ID 1, para transformar a una célula anfitriona humana recombinante que ya es capaz de expresar la proteína pentraxina PTX3 larga humana, en donde la célula anfitriona humana recombinante es el clon 293F/PTX3/2F12 recombinante depositado en la ECACC con el nº 08011001. En un aspecto particular, el vector está linealizado.

Otro objeto del invento es una célula humana recombinante transformada que es capaz de expresar la proteína pentraxina PTX3 larga humana que es el clon 293F/PTX3/2F12 recombinante depositado en la ECACC bajo el nº 08011001, transformado adicionalmente por uso del vector que más arriba se ha descrito. En una forma preferida de realización, la célula humana recombinante transformada es el clon MS24PTX recombinante depositado en la Health Protection Agency, Culture Collections Centre For Emergency Preparedness and Response Salisbury UK [Agencia de Protección de la Salud, Centro de Colecciones de Cultivo para Preparación y Respuesta de Emergencia], Salisbury, Reino Unido, con el nº 09072902.

Otro aspecto del invento es el uso de la célula recombinante humana transformada, que más arriba se ha descrito, para la producción de la proteína pentraxina PTX3 larga humana.

Otro objeto del invento es un procedimiento para la producción de la proteína pentraxina PTX3 larga humana recombinante que comprende:

a) transfectar una célula humana recombinante que ya expresa la proteína pentraxina PTX3 larga humana recombinante, con un plásmido seleccionable en el que el gen de la pentraxina larga humana está puesto bajo el control del promotor de CMV;

b) seleccionar y cultivar la célula humana recombinante transfectada;

c) purificar la proteína pentraxina PTX3 larga humana a partir del medio de cultivo de la célula humana recombinante transfectada,

en donde la célula humana recombinante que ya expresa la proteína PTX3 pentraxina larga humana recombinante es el clon 293F/PTX3/2F12 depositado en la ECACC bajo el nº 08011001. De manera preferible, la célula humana recombinante transfectada es el clon MS24PTX recombinante depositado en la Health Protection Agency, Culture Collections Centre For Emergency Preparedness and Response Salisbury UK Salisbury, Reino Unido, con el nº 09072902.

En una forma preferida de realización, la etapa de purificación incluye por lo menos una de las siguientes etapas: una cromatografía de intercambio aniónico, una cromatografía con hidroxiapatito o una cromatografía de exclusión por tamaños.

El invento será ilustrado ahora por medio de unos Ejemplos no limitadores, refiriéndose en particular a las siguientes figuras:

Figura 1: mapa y características principales del pSASSI-hPTX3

Figura 2: crecimiento, viabilidad y productividad en un matraz de agitación de (A) el clon MS24PTX y (B) el clon 293F/PTX3/2F12.

Figura 3: caracterización por el gradiente de SDS-PAGE 4-15% (A) y de cromatografía de exclusión por tamaños (B) de la PTX3 humana recombinante purificada a partir del clon MS24PTX.

Figura 4: capacidad de fijación de FGF2 del clon de hPTX3 293F/PTX3/2F12 y del clon de hPTX3 MS24PTX.

Figura 5: mapa y características principales de pSC1-hPTX3.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: clon 293F/PTX3/2F12

Construcción del plásmido pSC1-PTX3

1. Construcción del pSG/Ub

1.1 Preparación de la secuencia del promotor de ubiquitina C humana

El promotor de ubiquitina C humana se toma a partir del plásmido pUB/Bsd (de Invitrogen, nº de catálogo V512-20), por amplificación con una PCR (= acrónimo de Polymerase Chain Reaction = reacción en cadena de la polimerasa). Como una parte de la estrategia de clonación, se introducen en ambos extremos unas secuencias de reconocimiento por endonucleasas de restricción. Se construyen un sitio BsaAI en el cebador de amplificación situado secuencia arriba y un sitio EcoRI en el cebador situado secuencia abajo. La región amplificada corresponde a los nucleótidos 1.941 hasta 3.161 en la secuencia de pUB/Bsd.

Los oligonucleótidos se designan de la siguiente manera:

5’p UbC: longitud: 26mero (SEQ ID 3) ATATCACGTG ATC TGG CCT CCG CGC C

3’p UbC: longitud: 23mero (SEQ ID 4) GGAATTC GGT CCG GTC TAA CAA A

El protocolo para la amplificación es el siguiente: 1 ng/µl de un ADN plasmídico, 2 mM de MgCl2, 0,2 mM de dNTP’s, 400 nM de cada cebador, 1X del tampón suministrado y 0,04 u/ml de la polimerasa de ADN de Taq (de Sigma Genosys); perfil de temperaturas: 3 min. a 94ºC, 30 veces (30 s (segundos) a 94ºC, 30 s a 46ºC, 2 min. a 72ºC), 5 min. a 72ºC, enfriamiento a 4ºC hasta el uso ulterior.

El producto de la amplificación (con un tamaño de 1.238 pb = pares de bases) se purifica mediante una columna de centrifugación con una membrana de sílice (NucleoSpin, de Machery-Nagel GmbH & Co.), se liga en el vector pGEM-T (de Promega nº de catálogo A1360) y se transforma en el seno de la cepa anfitriona de E.coli HB2151 (de Pharmacia Biotech). Los transformantes se seleccionan por el crecimiento en un medio LB suplementado con 50 mg/l de ampicilina.

Los ADN plasmídicos, aislados a partir de las colonias resistentes a la ampicilina, se comprueban mediante un análisis por restricción con las enzimas StuI más SacI (se esperan unos fragmentos de ~ 3.650 y 600 pb).

Los plásmidos que muestran el modelo de restricción correcto se comprueban adicionalmente mediante un análisis de la secuencia del inserto entero y subsiguientemente se digieren con las enzimas de restricción EcoRI (de Sigma-Genosys) y BsaAI (de New England Biolabs).

El promotor de ubiquitina C humana se purifica mediante una separación en un gel de agarosa y una elución en una columna de centrifugación con una membrana de sílice.

1.2 Preparación del fragmento del vector pSG5

El plásmido pSG5 (con un tamaño de 4.076 pb, de Stratagene) se cortó con las enzimas de restricción EcoRI (de Sigma-Genosys) y BsaAI (de New England Biolabs); los fragmentos resultantes tenían una longitud de 1.432 y 2.644 pb respectivamente. El fragmento de 2.644 pb, que contenía la estructura de pSG5, se preparó y purificó mediante una electroforesis en un gel de agarosa más una columna de centrifugación con una membrana de sílice.

1.3 Preparación de pSG/Ub

Los fragmentos de ADN preparados en las etapas 1.1 y 1.2 se ligaron usando la ligasa de ADN de T4 (de Promega) y se transformaron en el seno de células de E. coli HB2151. Los transformantes se seleccionaron por el crecimiento en un medio LB suplementado con 50 mg/l de ampicilina.

El ADN plasmídico, aislado a partir de colonias resistentes a la ampicilina, se comprobó mediante un análisis por restricción con las enzimas EcoRI más SacII (se esperan: unos fragmentos de 2.670 y 1.192 pb). El ADN plasmídico, con el modelo de restricción esperado, se designó como pSG/Ub.

2. Construcción de pSC1

2.1 Preparación de la casete de resistencia a neomicina (NeoR)

La Casete de Resistencia a Neomicina (NeoR) se tomó a partir del plásmido pcADN3 (con un tamaño de 5.446 pb, de Invitrogen), amplificándolo por una PCR. Como una parte de la estrategia de clonación, unas secuencias de reconocimiento por la endonucleasa de restricción AflIII se introdujeron en ambos extremos. La región amplificada corresponde a los nucleótidos 1.788 hasta 3.252 en la secuencia de pcADN3 e incluye el promotor y el origen de replicación de SV40 y el ORF (marco de lectura abierto) de resistencia a neomicina, y la señal de PolyA de SV40.

Los oligonucleótidos se designan de la siguiente manera:

5’NeoR (SEQ ID 5) ATATACATG TCC CCA GGC AGG CAG AA

3’NeoR (SEQ ID 6) ATATACAT GTAT ACA GAC ATG ATA AG

El protocolo para la amplificación fue el siguiente: 1 ng/µl de un ADN plasmídico, 2 mM de MgCl2, 0,2 mM de dNTP’s, 400 nM de cada cebador, 1X del tampón suministrado, 0,04 u/μl de la polimerasa de ADN de Taq (de Sigma Genosys); perfil de temperaturas: 3 min. a 94ºC, 30 veces (30 s a 94ºC, 30 s a 46ºC, 2 min. a 72ºC), 5 min. a 72ºC, enfriando a 4ºC hasta el uso ulterior.

El producto de la amplificación (con un tamaño de 1.484 pb) se purificó por medio de una columna de centrifugación con una membrana de sílice, se ligó en el vector pGEM-T-Easy (de Promega nº de catálogo A1360) y se transformó en el seno de la cepa anfitriona de E.coli HB2151. Los transformantes se seleccionan mediante el crecimiento sobre un medio LB, suplementado con 50 mg/l de ampicilina. Se comprueban los ADN plasmídicos aislados a partir de las colonias resistentes a la ampicilina mediante un análisis por restricción con SmaI más SacI (se esperan: unos fragmentos de ~ 1.200 y 3.300 pb).

Los plásmidos que mostraban el modelo de restricción correcto se comprobaron ulteriormente mediante un análisis de las secuencias del inserto entero y subsiguientemente se digirieron con la enzima de restricción AflIII (de New England Biolabs). La casete NeoR (1.471 pb) se purificó por medio de una separación en un gel de agarosa y de una elución en una columna de centrifugación con una membrana de sílice.

2.2 Preparación del fragmento de vector pSG/Ub

El plásmido pSG/Ub, preparado en la etapa 1.3, se linealizó por digestión con AflIII y se purificó en una columna de centrifugación con una membrana de sílice.

2.3 Preparación de pSC1

Unos fragmentos de ADN preparados como en las etapas 2.1 y 2.2 se ligaron usando una ligasa de ADN de T4 (de Promega) y se transformaron en el seno de la cepa de E. coli JM109 (de New England Biolabs). Los transformantes se seleccionaron por el crecimiento sobre un medio LB, suplementado con 50 mg/l de ampicilina.

Unas colonias resistentes a ciertos antibióticos se analizaron preliminarmente mediante una amplificación por PCR

con los oligonucleótidos 5’NeoR y 3’NeoR, como se han descrito con anterioridad, y subsiguientemente, los

plásmidos purificados se comprobaron mediante un análisis por restricción. Para esta finalidad, se usaron las enzimas SmaI (posición 602, secuencia de NeoR interna) y SacII (posición 4.142, secuencia de UbC interna). El ADN plasmídico, con el modelo de restricción esperado, (fragmentos de 3.540 y 1.793 pb), se designó como pSC1.

3. Construcción de pSC1-PTX3

3.1 Preparación de la secuencia de codificación de hPTX3

La secuencia de hPTX3 (número de acceso al GeneBank BD 131701) se tomó del pSG5-PTX3 (documento de solicitud de patente internacional WO 99/32516 “composiciones farmacéuticas que contienen la pentraxina PTX3 larga) mediante una digestión con BamHI (de Roche Applied Science). El fragmento de PTX3 humana (con un tamaño de 1.463 pb) se purificó mediante una electroforesis en un gel de agarosa y en una columna de centrifugación con una membrana de sílice.

3.2 Preparación del fragmento de vector pSC1

El vector pSC1 se linealizó mediante una digestión con BamHI y se purificó sobre una columna de centrifugación con una membrana de sílice.

3.3 Construcción y verificación sobre pSC1-PTX3

Los fragmentos de ADN preparados en las etapas 3.2 y 3.3 se ligaron usando la ligasa de ADN de T4 (de Roche Applied Science) y se transformaron en el seno de la cepa de E. coli JM109. Los transformantes se seleccionaron por el crecimiento sobre un medio LB, suplementado con 50 mg/l de ampicilina y se escrutaron preliminarmente por una PCR con dos oligonucleótidos complementarios con la secuencia de PTX3.

Las secuencias de oligonucleótidos son:

5’PTX (SEQ ID 7) GTGAGAACTCGGATGATTATGAT

3’PTX (SEQ ID 8) TGAAACATACTGAGCTCCTCCAT

En un volumen final de 10 µl, los reactivos para la amplificación fueron: 1 µl de una colonia hervida (1 colonia en 50 ml de agua), 2 mM de MgCl2, 0,2 mM de dNTP’s, 320 nM de cada cebador, 0,06 % de formamida, 1X del tampón suministrado y 0,08 u/µl de la polimerasa de ADN de Taq (de Sigma Genosys); perfil de temperaturas: 3 min. a 96ºC, 30 veces (30 s a 94ºC, 30 s a 58ºC, 2 min. a 72ºC), 5 min. a 72ºC, enfriando a 4ºC hasta el uso ulterior.

Unos plásmidos purificados a partir de unas colonias positivas para el escrutinio por PCR, se digirieron con la enzima de restricción SalI (de Roche Applied Science) con el fin de comprobar la orientación del inserto de hPTX3. Un plásmido con el modelo de restricción esperado (6.619 y 177 pb) se secuenció en las regiones que codifican el promotor de UbC, la casete de NeoR y la hPTX3 y se identificó como pSC1-PTX3.

El nuevo plásmido (pSC1-PTX3) se construyó luego con la secuencia de ADNc de PTX3 puesta bajo el control de un promotor de ubiquitina y con un gen de resistencia a neomicina puesto bajo el control del promotor de SV40. Todas las otras características y el mapa del plásmido se representan en la Figura 1.

La secuencia completa de pSC1-PTX3 es como sigue (SEQ ID 2). La secuencia de pSC1-hPTX3 se representa comenzando a partir del primer sitio de EcoRI (figura 5). La secuencia que se deriva del pSG5 que contiene el ADNc de PTX3 está subrayada. El codón de partida (ATG) y el codón de terminación están puestos en letra negrita

Un linaje de células humanas (HEK293F) ha sido escogido por su capacidad para crecer en una suspensión y en un

medio exento de suero y proteínas (Florian M Wurm ”Producción de agentes terapéuticos de proteínas recombinantes en células de mamífero cultivadas” Nature Biotechnology 22 (11): 1393-1398, 2004, Yan SC y colaboradores, “Caracterización y nueva purificación de la proteína C humana recombinante procedente de tres linajes de células de mamíferos” Biotechnology (N.Y.) 8 de Julio de 1990 (7) : 655-61. “Uso de unos linajes de células para la producción de vacunas del virus de la influenza, una apreciación de consideraciones técnicas, de

producción y regulación” Initiative for Vaccine Research, World Health Organization [Iniciativa para la investigación

de vacunas, Organización Mundial de la salud], Ginebra, Suiza (10 de Abril de 2007). Para transfectar el HEK293F, el plásmido pSC1-PTX3 se usó o bien en una forma lineal (digerida con PvuI) o en una forma circular. El mejor rendimiento de transfección se obtuvo con el plásmido linealizado; la selección de clones se hizo sobre la base de la productividad y de la capacidad de crecimiento. Después de varias rondas de subclonación se seleccionó el clon 2F12.

El clon humano 2F12, que expresa la hPTX3, ha sido depositado en la ECACC (European Collection of Cell Cultures, Health Protection Agency [Colección Europea de Cultivo de Células, Agencia de Protección de la Salud], Porton Down, Wiltshire SP4 0JG, Reino Unido) el 10 de Enero de 2008, de acuerdo con las condiciones del tratado de Budapest bajo el número de depósito 08011001. Los detalles experimentales se describen más abajo.

3.4 Células 293F recombinantes generadas a partir de pSC1-PTX3.

Transfección y subclonación

106 células/ml de 293F (de Invitrogen nº de catálogo R790- 07) se sembraron en un matraz de centrifugación con una capacidad de 125 ml en un volumen final del medio Freestyle de 28 ml en el día de la transfección. El pSC1/PTX3 se dejó luego adsorberse en el reactivo 293fectin (de GIBCO/ Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Dicho brevemente, en dos tubos separados, 30 µg de pSC1-PTX3 circular o de PvuI linealizado se diluyeron en 1 ml de Optimem (de GIBCO/Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y 40 µl de 293fectin (de Invitrogen) diluido hasta 1 ml con Optimem. Ambas soluciones se incubaron durante 5 minutos a la temperatura ambiente, luego se mezclaron (con un volumen final de 2 ml) y se incubaron durante 30 minutos en las mismas condiciones. Un cóctel de ADN y un lípido se añadió a las células y se incubó a 37ºC, con CO2 al 5 % con agitación (120 rpm = revoluciones por minuto). Después de una cultivación durante 36 horas, el medio se cambió a un medio de selección (200 ml del medio Freestyle + 500 µg/ml de G418) y las células transfectadas se sembraron en diez placas de 96 pocillos, con una capacidad de 200 µl/pocillo. Después de 15 días, las agrupaciones de células productoras más altas se determinaron por un ELISA y se amplificaron en 24 pocillos, en 6 pocillos y en el matraz T25.

Las agrupaciones de células recombinantes obtenidas se subclonaron a razón de 1 célula por pocillo en placas de 96 pocillos en 50 % de un medio fresco (de nueva aportación) y 50 % de un medio acondicionado.

Ejemplo 2: clon MS24PTX

Construcción del plásmido pSASSI-hPTX3

1. Construcción de pCEPlightΔ

El plásmido pCEP4 (de Invitrogen nº de catálogo V044-50), en el que previamente se había clonado una cadena

5 ligera de anticuerpo, que había perdido una porción del sitio de clonación múltiple y del sitio de restricción con BamHI, se cortó con las enzimas de restricción EcoRV y ClaI (de Roche Applied Science); la digestión permitió obtener un plásmido sin el origen de replicación del virus de Epstein-Barr (oriP) y el antígeno nuclear (codificado por el gen de EBNA-1) que permite una replicación extracromosomal. Los resultantes fragmentos tenían unas longitudes de 6.910 y 4.281 pb respectivamente. El fragmento de 6.910 pb, que contenía la estructura del pCEP, se purificó mediante una electroforesis en un gel más una columna de centrifugación con una membrana de sílice. Puesto que la ClaI genera un extremo cohesivo, el fragmento se rellenó, usando la polimerasa de ADN de T4 (de Roche Applied Science) con el siguiente protocolo: 150 ng del fragmento purificado de ClaI/EcoRV (38 µl), 5 µl de 10x tampón de la

polimerasa de ADN de T4, 4 μl de una mezcla de dNTP’s 2,5 mM, 3 μl de la polimerasa de ADN de T4 (1 U/μl).

Después de 15 minutos a 37ºC, la reacción se detuvo a 70ºC durante 5 minutos y luego sobre hielo. El fragmento se

15 purificó sobre una columna de centrifugación con una membrana de sílice y se ligó consigo mismo durante una noche a la temperatura ambiente, usando la ligasa de ADN de T4 (de Promega). Unas células competentes TOP10 (de Invitrogen) se transformaron con la mezcla de ligación y los transformantes se seleccionaron por el crecimiento sobre unas placas LB suplementadas con 100 mg/l de ampicilina.

El ADN plasmídico, aislado a partir de colonias resistentes a la ampicilina, se designó como pCEPlightΔ.

2. Preparación del fragmento de vector que contiene la resistencia a higromicina y el promotor de CMV.

La casete de resistencia a higromicina conjuntamente con el intensificador/promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV) se tomo a partir del pCEPlightΔ amplificándolo por una PCR. Como una parte de la estrategia de clonación, la secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restricción BamHI se introdujo en el

oligonucleótido reanillándolo con el extremo 3’ del promotor de CMV.

25 La región amplificada con un tamaño de aproximadamente 5.500 pb, incluía el promotor de CMV, el gen de higromicina puesto bajo el control del promotor de TK, conjuntamente con la señal de PolyA de TK.

Los oligonucleótidos se designan de la siguiente manera:

El protocolo para la amplificación era el siguiente: 2 ng de pCEPlightΔ, 200 nM de cada cebador, 0,2 mM de dNTP’s, 1X del tampón suministrado, 1,5 µl de DMSO, 0,5 µl de la polimerasa de ADN de Taq (de Phusion), volumen final 50 µl; perfil de temperaturas: 1 min. a 98ºC, 35 veces (10 s a 98ºC, 30 s a 55°C, 3 min. a 72ºC), 10 min. a 72ºC, enfriando a 4ºC hasta el uso ulterior.

El producto de la amplificación (con un tamaño de ~5.500 pb) se purificó mediante una electroforesis en un gel de agarosa más una columna de centrifugación con una membrana de sílice. El fragmento purificado se ligó consigo

35 mismo y se usó para transformar unas células competentes TOP10 (de Invitrogen). El ADN plasmídico, aislado a partir de colonias resistentes a la ampicilina, se comprobó mediante un análisis por restricción y de la secuencia y se designó como pCEPΔBam.

3. Preparación del gen hPTX3

La secuencia de hPTX3 (número de acceso al GeneBank BD 131701) se tomó a partir de pSC1-PTX3 tal como se indica anteriormente mediante una digestión con BamHI (de Roche Applied Science). El fragmento de PTX3 humana (con un tamaño de 1.463 pb) se purificó mediante una electroforesis en un gel de agarosa y una columna de centrifugación con una membrana de sílice.

4. Preparación de pCEPΔBam-hPTX3

El vector pCEPΔBam se linealizó por digestión con BamHI y se purificó sobre una columna de centrifugación con

45 una membrana de sílice. El pCEPΔBam linealizado y el fragmento de ADN correspondiente al gen de hPTX3 preparado en la etapa 3 se ligaron usando la ligasa de ADN de T4 (de Roche Applied Science) y se usaron para transformar tuna célula de E. coli TOP10. Los transformantes se seleccionaron por el crecimiento sobre un medio de LB, suplementado con 100 mg/l de ampicilina y se escrutaron preliminarmente mediante un análisis por restricción para evaluar la orientación del fragmento PTX3.

5. Preparación de la señal de poliadenilación de SV40

La señal de PolyA de SV40 se tomó a partir del plásmido pCEPΔlight amplificándolo por una PCR. Como una parte de la estrategia de clonación, las secuencias de reconocimiento para las endonucleasas de restricción HindIII y XhoI se introdujeron junto a los extremos de los fragmentos, respectivamente.

Los oligonucleótidos se designaron como sigue:

El protocolo para la amplificación era el siguiente: 1 ng de pCEPlightΔ, 200 nM de cada cebador, 0, 2 mM de dNTP’s, 1X del tampón suministrado, 2 μl de MgCl2 50 mM, 0,5 µl de la polimerasa de ADN de Taq (de Invitrogen), volumen final 50 µl; perfil de temperaturas: 1 min. a 94ºC, 30 veces (30 s a 94ºC, 1 min. a 55ºC, 1 min. a 72ºC), 15

10 min. a 72ºC, enfriando a 4ºC hasta el uso ulterior.

El producto de la amplificación (~420 pb) se purificó mediante una electroforesis en un gel de agarosa más una columna de centrifugación con una membrana de sílice.

6. Preparación de pSASSI-hPTX3

Unos fragmentos purificados correspondientes a la señal de PolyA de SV40 y al pCEPABam-hPTX3, se digirieron

15 con las enzimas de restricción HindIII/XhoI y se ligaron usando la ligasa de ADN de T4 (de Promega). La mezcla de ligación se usó para transformar unas células competentes TOP10 (de Invitrogen) y los transformantes se seleccionaron por el crecimiento sobre placas de LB que contenían 100 mg/l de ampicilina.

El ADN plasmídico aislado a partir de colonias resistentes a la ampicilina, se comprobó por un análisis por restricción y de las secuencias y el plásmido se designó como pSASSI-hPTX3.

20 La secuencia completa de pSASSI-HPTX3 es como sigue (SEQ ID 1). La secuencia de pSASSI-hPTX3 es representada comenzando a partir del sitio de BamHI (figura 1). La secuencia de hPTX3 está en letras minúsculas. El codón de partida (atg) y el codón de terminación (taa) están en letras negritas.

Ejemplo 3

Clon MS24PTX recombinante generado por transfección de pSASSI-hPTX3

1. Transfección y subclonación

5 106 células/ml de 293F/PTX3/2F12 se sembraron en un matraz de centrifugación con una capacidad de 125 ml en un volumen de 28 ml del medio Freestyle final en el día de la transfección. El plásmido pSASSI-hPTX3 se dejó luego adsorberse en el reactivo 293fectin (de GIBCO/Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Dicho brevemente, 30 µg del pSASSI-hPTX3 NruI linealizado se diluyeron en 1 ml de Optimem GIBCO/Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y 40 µl de 293fectin (de Invitrogen) diluido hasta 1 ml con Optimem. Ambas soluciones se 10 incubaron durante 5 minutos a la temperatura ambiente y luego se mezclaron (con un volumen final de 2 ml) y se incubaron durante 30 minutos en las mismas condiciones. Un cóctel de ADN y un lípido se añadió a las células y se incubó a 37ºC, con CO2 al 5 % con agitación (120 rpm). Después de una cultivación durante 36 horas, el medio se cambió a un medio de selección (200 ml del medio Freestyle + 200 µg/ml de higromicina) y las células transfectadas se sembraron en placas de 96 pocillos, a razón de 200 µl/pocillo. Después de 15 días las agrupaciones de células

15 productoras más altas se determinaron por un ELISA y se amplificaron en 24 pocillos, en 6 pocillos y en el matraz T25.

Las agrupaciones de células recombinantes se subclonaron con una 1 célula por pocillo en placas de 96 pocillos, en 50 % de un medio fresco y 50 % de un medio acondicionado.

2. Detección por un ELISA de la hPTX3 recombinante

20 La PTX3 purificada o la PTX3 secretada en el material sobrenadante de cultivo se valoraron usando un ELISA en emparedado. Para detectar la PTX3, unas placas de microtitulación Nunc Maxisorb de 96 pocillos (de Nunc, Roskilde, Dinamarca) se revistieron durante una noche, a 4ºC, con 700 ng/ml del anticuerpo monoclonal de rata MNB4 anti-PTX3 humana (de Alexis™ Biochemicals, Lausen, Suiza) en 15 mM de un tampón de carbonato de sodio, de pH 9,6. Los pocillos se lavaron con una PBS (acrónimo de Phosphate Buffered Saline = solución salina tamponada con fosfato) más 0,05 % de Tween-20 (PBS-Tw, solución de lavado) y se bloquearon con 300 µl de PBS-Tw que contenían 5 % de leche seca, durante 2 horas a la temperatura ambiente.

Los materiales sobrenadantes de células o la PTX3 humana recombinante purificada se añadieron a los pocillos, se diluyeron en una solución de lavado más 1 % de un BSA. Una curva patrón, establecida con una PTX3 humana recombinante purificada procedente de células CHO, que variaba entre 0 y 100 ng/ml, se estableció por cuantificación. Después de una incubación durante 1 hora a 37ºC, se detectó la PTX3 fijada usando un anticuerpo anti-PTX3 de conejo policlonal conjugado con biotina, seguido por una incubación con estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano rusticano (de Sigma-Aldrich, EE.UU.). Finalmente se añadió ácido 2,2’-azino-bis-3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico (de Sigma Chemical Co. EE.UU.) para el revelado del color y se determinó la densidad óptica a 405 nm usando un lector de microplacas modelo 3550 EIA (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.).

Ejemplo 4

Comparación del crecimiento, de la viabilidad y de la productividad de los clones 293F/PTX3/2F12 y MS24PTX

Unas células que se derivaban de los dos clones se sembraron con una densidad de 1.000.000 de células/ml

(viabilidad ≥ 90 %) en 500 ml en un medio FreeStyle 293 en unos matraces de centrifugación con una capacidad de

1 litro. El crecimiento, la viabilidad y la productividad se vigilaron durante aproximadamente 1 semana hasta que las células comenzaron a morir.

La Figura 2 muestra el crecimiento, la viabilidad y la productividad de los clones MS24PTX (panel A) y 293F/PTX3/2F12 (panel B) en las mismas condiciones de siembra y crecimiento. Como se muestra en la figura, con la transfección renovada del clon 293F/PTX3/2F12 que expresa la PTX3 con un nuevo plásmido en el que la PTX3 está puesta bajo el control del promotor de CMV (clon MS24PTX), los autores fueron capaces de obtener un aumento aproximadamente 4 veces mayor en la productividad de PTX3.

Ejemplo 5

Purificación de la PTX3 humana recombinante a partir del clon MS24PTX

El material sobrenadante de cultivo procedente del clon MS24PTX, que había crecido en un matraz de centrifugación, se cargó sobre una columna empaquetada con Q-SepharoseTM Fast Flow (de GE Healthcare, Reino Unido). El material retenido se eluyó usando un gradiente no lineal. La fracción que contenía la PTX3 se aplicó directamente a una columna empaquetada con hidroxiapatito cerámico (BioRad, Hercules, CA, EE.UU.). El material retenido se eluyó aumentando la concentración de fosfato de una manera no lineal. La fracción que contenía la PTX3 se concentró y se cambió de tampón sobre una membrana de ultrafiltración (Pellicon-Biomax 100, Millipore) y luego se caracterizó por una cromatografía de exclusión por tamaños sobre Biosep SEC S4000 (de Phenomenex) y por una SDS-PAGE (Figura 3).

Ejemplo 6

Fijación de h-PTX3 a FGF2

La fijación de una hPTX3 recombinante purificada a la FGF2 se comprobó en un sistema de ELISA. Una placa de 96 pocillos (Falcon 3912) se revistió con 2 µg/ml de FGF2 (de Calbiochem) en una PBS y se incubó durante una noche a 4ºC. Los pocillos se lavaron con una PBS más 0,1 % de Triton X-100 (PBS-Tr, solución de lavado) y se bloquearon con 200 µl de PBS-Tr que contenía 3 % de un BSA (bloqueo de PBS-B y una solución diluyente) durante 2 horas a la temperatura ambiente. Después de haber lavado, la fijación se realizó añadiendo 100 µl de unas muestras, diluidas en PBS-B en unas concentraciones de la PTX3 que variaban entre 0 y 120 ng/ml, e incubando la placa a 37ºC durante 1 hora. Después de un lavado, las placas se incubaron con 100 µl/pocillo de 100 ng/ml de un anticuerpo policlonal anti- PTX3 de conejo (durante 1 hora a 37ºC), se lavaron de nuevo y se incubaron con 100 µl de IgG anti-conejo de cabra marcada con peroxidasa de rábano rusticano (1:1.000 en un PBS-B; 1 hora a 37ºC). Después de haber lavado se añadieron 100 μl de un substrato cromogénico de 3,3’,5,5’-tetrametil-bencidina (TMB) (de Sigma-Aldrich) y después de 10-15 min, la reacción se detuvo añadiendo 100 µl de HCl 1 M y la absorbencia se determinó usando un lector de microplacas Microplate Reader Modelo 3550 EIA (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.) . (Figura 4).

Listado de Secuencias

<110> TECNOGEN SpA SASSANO, Marica ESPOSITO, Adelaide RIVIECCIO, Vincenzo CASSANI, Giovanni

<120> IMPROVED HUMAN LONG PENTRAXIN 3 EXPRESSION SYSTEM AND USES THEREOF

<130> PCT 109660

<150> EP09 166 759.2

<151>

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7469

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> plásmido recombinante pSASSI-HPTX3

<400> 1

5: <210> 2 <211> 6796 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

10: <220>

17

<223> plásmido recombinante pSC1-PTX3

<400> 2

<210> 3 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador sintético

<400> 3

atatcacgtg atctggcctc cgcgcc: 26

<210> 4 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador sintético

<400> 4

ggaattcggt ccggtctaac aaa: 23

<210> 5 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia Artificial

<220> <223> cebador sintético

<400> 5

atatacatgt ccccaggcag gcagaa: 26

<210> 6

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 6

atatacatgt atacagacat gataag

<210> 7

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 7

gtgagaactc ggatgattat gat

<210> 8

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 8

tgaaacatac tgagctcctc cat

<210> 9

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 9

gagaactgta acgttggatc cagctgg

<210> 10

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 10

gtgtacaaag gatccagaca tgataag

<210> 11

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador sintético

<400> 11 5 aagcttagac atgataagat acattg 26

<210> 12

<211> 26

<212> ADN 10 <213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador sintético 15 <400> 12 ctcgagagtc gaccggtcat ggctgc 26

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Uso de un vector de expresión eucariótico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína pentraxina PTX3 larga humana puesta bajo el control de un promotor efectivo y de una secuencia de nucleótidos que codifica un marcador seleccionable, que tiene esencialmente la secuencia de SEQ ID 1, para transformar una célula anfitriona humana recombinante que ya es capaz de expresar la proteína pentraxina PTX3 larga humana, en donde dicha célula anfitriona humana recombinante es el clon 293F/PTX3/2F12 recombinante depositado en la ECACC con el nº 08011001.
2.

El uso del vector de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el vector está linealizado.
3.

Una célula humana recombinante transformada que es capaz de expresar la proteína pentraxina PTX3 larga humana, que es el clon 293F/PTX3/2F12 depositado en la ECACC con el nº 08011001 transformado ulteriormente por uso del vector de acuerdo con la reivindicación 1.
4.

La célula humana recombinante transformada de acuerdo con la reivindicación 3, que es el clon MS24PTX recombinante depositado en la Health Protection Agency, Culture Collections Centre For Emergency Preparedness and Response Salisbury, Reino Unido, con el nº 09072902.
5.

Uso de la célula humana recombinante transformada de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4 para la producción de la proteína pentraxina PTX3 larga humana.
6.

Un procedimiento para la producción de la proteína pentraxina PTX3 larga humana que comprende

a) transfectar una célula humana recombinante que ya expresa la proteína pentraxina PTX3 larga humana recombinante, con un plásmido en el que el gen de la pentraxina larga humana está puesto bajo el control del promotor de CMV;

b) seleccionar y cultivar la célula humana recombinante transfectada;

c) purificar la proteína pentraxina PTX3 larga humana a partir del medio de cultivo de la célula humana recombinante transfectada,

en donde la célula humana recombinante que ya expresa la proteína pentraxina PTX3 larga humana recombinante es el clon 293F/PTX3/2F12 recombinante depositado en la ECACC bajo el nº 08011001.
7.

El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la célula humana recombinante transfectada es el clon MS24PTX depositado en la Health Protection Agency, Culture Collections Centre For Emergency Preparedness and Response Salisbury, Reino Unido, con el nº 09072902.
8.

El procedimiento de la reivindicación 6 ó 7, en el que la etapa de purificación incluye por lo menos una de las siguientes etapas: cromatografía con intercambio aniónico, cromatografía con hidroxiapatito o cromatografía de exclusión por tamaños.