ES2626232T3 - Vector de expresión de mamíferos - Google Patents

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ES2626232T3 ES09796376.3T ES09796376T ES2626232T3 ES 2626232 T3 ES2626232 T3 ES 2626232T3 ES 09796376 T ES09796376 T ES 09796376T ES 2626232 T3 ES2626232 T3 ES 2626232T3
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Abstract

Un vector de expresión de mamíferos que comprende los siguientes elementos reguladores: (a) el potenciador del virus del simio 40 y la región promotora temprana y (b) el intrón II de la Hbb humana, en donde el vector de expresión comprende al menos un gen de interés bajo el control de los elementos reguladores definidos en (a) y (b), y en donde el intrón II de la Hbb humana se localiza entre la secuencia que codifica el al menos un gen de interés y el potenciador de SV40 y una región promotora temprana.

Description

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DESCRIPCION
Vector de expresion de mamlferos
La presente invencion describe nuevos vectores de expresion de mamlferos (con o sin gen(es) de interes, GOI (siglas del ingles, gene(s) of interest) para la integracion en el genoma de mamlferos, comprendiendo los vectores una nueva combinacion de elementos reguladores. En particular, la presente invencion describe vectores de expresion que comprenden los siguientes elementos reguladores: (a) el potenciador del virus del simio 40 y la region promotora temprana y (b) el intron II de la Hbb humana, en donde el vector de expresion comprende al menos un gen de interes bajo el control de los elementos reguladores definidos en (a) y (b), y en donde el intron II de la Hbb humana se localiza entre la secuencia que codifica el al menos un gen de interes y el potenciador de SV40 y una region promotora temprana. Preferentemente, tal vector de expresion comprende al menos un gen marcador de selection (por ejemplo, pDGP que incluye gen(es) de interes, vease la Fig. 1; por ejemplo, pDGPAGOI sin gen(es) de interes). El vector (sin gen(es) de interes) permite la incorporation de al menos uno, preferentemente dos o mas genes de interes, su/sus posterior(es) expresion(es), y la seleccion de celulas transfectadas usando, por ejemplo, geneticina (G418) y/o metotrexato (MTX). El vector pDGPAGOI, como un ejemplo de vector de expresion de mamlferos segun la presente invencion, presenta una secuencia de 9555 pb, cuya una hebra se representa mediante la SEQ ID NO:2. El vector pDGP-AAGOI, como otro ejemplo de vector de expresion de mamlferos segun la presente invencion, presenta una secuencia de 3830 pb, cuya una hebra se representa mediante la SEQ ID NO:3.
Actualmente, antes de la donation de las celulas, se tienen que realizar muchas etapas de seleccion sucesivas en un gran numero de grupos de celulas para generar y seleccionar un grupo de celulas de alta productividad. Como resultado, el desarrollo de la llnea celular es una actividad que requiere mucho tiempo y que es laboriosa.
Existe un gran numero de publicaciones que tratan la influencia de los elementos reguladores en los niveles de expresion.
El efecto positivo de diferentes secuencias de intron posicionadas en o justo antes de la secuencia codificante de GOI se conoce desde hace tiempo y se ha descrito en muchas publicaciones (2, 4, 5, 6). Los estudios que tratan la eficacia transcripcional de diferentes promotores llevaron a identificar el promotor CMV como el mas eficaz (2, 3, 4, 5, 6). Por este motivo, los casetes de expresion de GOI en la mayorla de los vectores de expresion de mamlferos se dirigen hoy en dla mediante el promotor CMV y tienen una secuencia de intron justo aguas arriba de la secuencia codificante de GOI.
En lo referente a la combinacion de casetes de expresion de GOI y genes marcadores de seleccion en un vector de expresion particular, se ha comunicado y sometido a ensayo la funcionalidad de varias combinaciones (1). Para la expresion de anticuerpos monoclonales (mAb), se han descrito soluciones con dos vectores que expresan de
manera separada la cadena ligera y la cadena pesada, as! como vectores que portan casetes de expresion de
ambas cadenas de mAb junto con los casetes de expresion neo y dhfr en el mismo plasmido (1).
En la mayorla de los casos, solo se determinaron los niveles de expresion transitoria usando protelnas indicadoras intracelulares como luciferasa (2, 5, 6). Mediante este enfoque es diflcil predecir como influira un elemento regulador y/o un vector en los niveles de expresion estables de una protelna secretada tras su integracion en un cromosoma, donde el nivel de expresion final es el resultado de una interaction compleja entre la transcription, la traduction, el trafico intracelular y las tasas de secretion. Aunque es lo mas importante para la industria biofarmaceutica, esta cuestion raramente se trata en la bibliografla (3). En particular, parece que la relevancia de una combinacion especlfica de elementos reguladores y marcadores de seleccion durante el tiempo necesario para desarrollar una llnea celular y la eficacia del desarrollo de la llnea celular nunca se ha tratado. Por consiguiente, el principal objeto de la presente invencion fue buscar una combinacion de elementos reguladores y marcadores de seleccion
superiores a los conocidos en la tecnica en terminos de los parametros de tiempo y eficacia mencionados
anteriormente.
Por consiguiente, la presente invencion supera la desventaja descrita anteriormente y proporciona vectores de expresion de mamlferos para la integracion en el respectivo genoma de mamlferos (en particular, los vectores, si carecen de gen(es) de interes, designados pDGPAGOI, que presentan la secuencia de la SEQ ID NO:2 y pDGP- AAGOI que presentan la secuencia de la SEQ ID NO:3; y los vectores designados pDGP y pDGP-A, si incluyen el(los) gen(es) de interes, vease las Figs. 1 y 3, respectivamente) que presentan una nueva combinacion de elementos reguladores: el potenciador del virus del simio 40 (SV40, por las siglas del ingles simian virus 40) y una region promotora temprana, el intron II de la Hbb (que es distinto de, y por lo tanto, no debe confundirse con el intron quimerico descrito en la bibliografla, por ejemplo, Xu et al. (2)), y de manera opcional comprende al menos un gen marcador de seleccion (por ejemplo, neo, dhfr). Tales vectores de expresion son adecuados para recoger al menos un gen de interes y, si es asl, permitir su/sus expresiones y posterior seleccion de celulas transfectadas usando al menos un agente de seleccion adecuado (por ejemplo, G418 y/o MTX). Incluso una seleccion por etapas con G418 selecciona celulas que expresan el al menos uno polipeptido codificado por el al menos un gen de interes en altas cantidades y de un modo altamente reproducible, reduciendo de este modo el tiempo de desarrollo de llneas celulares y la carga de trabajo de una manera significativa.
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Como nota adicional, debe tenerse en cuenta lo siguiente: Los vectores de expresion que se integran en el genoma que se conocen en la tecnica anterior sobre dos o mas etapas de seleccion (una de las cuales es normalmente la seleccion con MTX) normalmente generan celulas que portan varias copias del GOI integrado en su genoma y expresan, por lo tanto, GOI a una tasa elevada. Muy al contrario, los vectores de expresion de la presente invention no requieren multiples copias de los mismos para integrarse en el genoma y/o dos o mas rondas de etapas de seleccion con el fin de permitir a las celulas hospedadoras de los mamlferos expresar GOI a una tasa elevada. Este es el resultado inmediato de la combination de los elementos reguladores segun la presente invencion y reside en elevadas tasas de expresion independientemente del numero de copias del gen integradas en el genoma. La ventaja de la presente invencion es, por lo tanto, que no es necesario realizar al menos una etapa de seleccion, cada una con G418 y MTX con el fin de lograr tasas de expresion satisfactorias, pero que solo una etapa de seleccion, bien con G418 o con MTX, por mencionar sistemas de seleccion ejemplares, es suficiente.
La expresion "intron II de la Hbb" tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molecula de acido nucleico que presenta una secuencia del segundo intron del gen de la p-globina humana (hbb) (intron 2 de la Hbb) que incluye 10 pb de la secuencia inmediatamente aguas arriba de dicho intron 2 de la Hbb en el gen hbb y 10 pb de la secuencia inmediatamente aguas abajo del intron 2 de la Hbb en el gen hbb. Segun una realization preferida de la presente invencion, el intron II de la Hbb presenta la secuencia establecida en la SEQ ID NO:1.
De este modo, un primer aspecto de la presente invencion incluye la disposition de un vector de expresion para su integration en el genoma de mamlferos, comprendiendo dicho vector de expresion los siguientes elementos reguladores: (a) el potenciador del virus del simio 40 (SV40) y una region promotora temprana y (b) el intron II de la Hbb humana, y preferentemente el intron que presenta la secuencia de la SEQ ID NO:1, en donde el vector de expresion comprende al menos un gen de interes bajo el control de los elementos reguladores definidos en (a) y (b), y en donde el intron II de la Hbb humana se localiza entre la secuencia que codifica el al menos un gen de interes y el potenciador de SV40 y una region promotora temprana.
Las realizaciones preferidas de este aspecto de la presente invencion son
(i) un vector del primer aspecto de la presente invencion, en donde el vector comprende al menos un gen que codifica un marcador de seleccion eucariota y/o procariota, en particular, el gen de la neomicina fosfotransferasa (neo) de Tn5 y/o el gen de la dihidrofolato reductasa (dhfr);
(ii) un vector del primer aspecto de la presente invencion, en donde el vector es circular;
(iii) un vector del primer aspecto de la presente invencion, en donde el al menos un gen de interes es el gen que codifica la cadena ligera de una inmunoglobulina y/o el gen que codifica la cadena pesada de una inmunoglobulina;
(iv) un vector del primer aspecto de la presente invencion, en donde el orden de los elementos reguladores, los genes de interes y los genes que codifican un marcador de seleccion es tal como sigue: potenciador de SV40 5'- /region promotora temprana, intron II de la Hbb, gen que codifica la cadena ligera de una inmunoglobulina, secuencia de senal de poliadenilacion del SV40; potenciador del SV40/region promotora temprana, intron II de la Hbb, gen que codifica la cadena pesada de una inmunoglobulina, secuencia de senal de poliadenilacion del SV40; potenciador del SV40/region promotora temprana, gen de la neomicina fosfotransferasa de Tn5, una secuencia de senal de poliadenilacion sintetica, promotor temprano del SV40 sin secuencia de potenciador, gen de la dihidrofolato reductasa, secuencia de senal de poliadenilacion del SV40-3 ';
(v) un vector del primer aspecto de la presente invencion, en donde el vector comprende al menos un marcador de seleccion procariota, por ejemplo, un gen de resistencia a antibiotico tal como el gen de resistencia a la ampicilina, y/o elementos reguladores adicionales conocidos por el experto en la tecnica por incluirse de manera ventajosa en un vector de expresion de mamlferos; y
(vi) un vector del primer aspecto de la presente invencion, en donde el vector es el vector pDGPAGOI que presenta una secuencia de 9555 pb, una hebra que se representa mediante la secuencia de la sEq ID NO:2.
Un segundo aspecto de la presente invencion es un sistema de vectores que comprende al menos dos vectores tal como se define en cualquiera de las realizaciones preferidas (i) y (ii), en donde cada uno de los al menos dos vectores comprende al menos un gen de interes. Se prefiere tal sistema de vectores, en donde un primer gen de interes localizado en un primer vector codifica la cadena ligera de una inmunoglobulina, y un segundo gen de interes localizado en un segundo vector codifica la cadena pesada de una inmunoglobulina. Otro sistema de vectores tambien contemplado en la presente invencion comprende al menos dos vectores, en donde un primer vector es de acuerdo con el primer aspecto de la presente invencion pero no tiene marcador de seleccion eucariotico, y en donde un segundo vector comprende al menos un gen que codifica un marcador de seleccion que confiere resistencia a una celula transfectada.
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Un tercer aspecto de la presente invention es una celula de mamlfero aislada que comprende un vector de expresion de cualquiera de las realizaciones preferidas (i), (ii), (iii), (iv), (v) y (vi) del primer aspecto de la presente invencion o un sistema de vectores segun el segundo aspecto de la presente invencion. Basicamente, cualquier celula de mamlfero aislada se puede usar en conjunto con la presente invencion siempre que permita la expresion recombinante de un polipeptido.
Segun una realization preferida de ese tercer aspecto de la presente invencion, tal celula es una celula COP, una celula L, una celula Cl27, una celula Sp2/0, una celula NS-0, una celula NS-1, una celula NIH3T3, una celula PC12, una celula PC12h, una celula BHK, una celula CHO, una celula COS1, una celula COS3, una celula COS7, una celula CV1, una celula Vero, una celula HeLa, una celula HEK-293, una celula PER C6, o una celula derivada de fibroblastos diploides, celulas de mieloma y HepG2.
Un cuarto aspecto de la presente invencion se refiere a un metodo ex vivo para producir una celula del tercer aspecto de la presente invencion, el metodo comprende la etapa de proporcionar, y preferentemente transfectar, una celula de mamlfero con un vector de expresion de cualquiera de las realizaciones preferidas (i), (ii), (iii), (iv), (v) y (vi) del primer aspecto de la presente invencion o con un sistema de vectores segun el segundo aspecto de la presente invencion.
Un quinto aspecto de la presente invencion es un metodo para producir al menos un polipeptido de interes, en donde dicho metodo comprende la etapa de cultivar una celula del tercer aspecto de la presente invencion en un medio de cultivo celular en condiciones que permitan la expresion de dicho al menos un polipeptido de interes.
Segun una realizacion preferida de este quinto aspecto de la presente invencion, el al menos un polipeptido de interes se produce mediante el cultivo de una celula CHO segun el tercer aspecto de la presente invencion. Los vectores segun la presente invencion son particularmente adecuados para producir polipeptidos en celulas de roedores tales como celulas CHO. Segun otra realizacion preferida de este quinto aspecto de la presente invencion, tal metodo ademas comprende la etapa de aislar del medio de cultivo celular dicho al menos un polipeptido de interes.
Los vectores segun la presente invencion se pueden usar en un metodo de selection de protelnas a alto rendimiento.
La seleccion (pruebas) de protelnas, por ejemplo, de diferentes variantes de una protelna candidata, que difieren en su secuencia de aminoacidos es una etapa temprana convencional en el desarrollo de nuevas protelnas terapeuticas (productos biofarmaceuticos). El proposito de este programa de seleccion es la evaluacion y la posterior optimization de caracterlsticas moleculares tales como bioactividad, inmunogenicidad, comportamiento de agregacion, potencial de expresion, modificaciones postraduccionales, etc., de la protelna de interes sometida a ensayo.
Actualmente, en la mayorla de los casos, la cantidad de protelna necesaria para realizar la evaluation mencionada anteriormente se obtiene de la expresion de protelna transitoria en celulas HEK (de rinon embrionario humano), tales como las celulas HEK293. Por, entre otras cosas, razones reglamentarias, sin embargo, las celulas CHO se usan con mayor frecuencia como las celulas de production final en el caso de los productos biofarmaceuticos. Independientemente de esta discrepancia, los investigadores en la industria y el mundo academico mantienen el enfoque actual debido a los tltulos de protelna relativamente elevados que se pueden obtener casi desde el principio mediante una expresion de protelna transitoria en celulas HEK cuando se compara con celulas CHO, evitando de este modo la necesidad de un largo proceso de seleccion para obtener celulas CHO transfectadas de manera estable. Uno de los principales inconvenientes de este enfoque tradicional es, sin embargo, que el sistema de seleccion (pruebas) y el sistema de produccion final hacen uso de celulas hospedadoras de diferente origen (celulas humanas frente a celulas de hamster). Esta discrepancia de la seleccion y el sistema de produccion por supuesto supone el uso de diferentes medios de crecimiento, condiciones del proceso, etc., que dan como resultado datos mucho menos comparables - si es que lo son- (es decir, relevantes) referentes por ejemplo a la prediction del comportamiento de agregacion, niveles de expresion, modificaciones postraduccionales, etc., cuando la protelna de interes se va a expresar en el sistema de produccion final. De este modo, existe una necesidad por un sistema de seleccion/prueba que combine las ventajas de expresion rapida y alta de protelna de tltulo (tal como se obtiene, por ejemplo, mediante una expresion de protelna transitoria en celulas HEK) con la ventaja de realizar la evaluacion temprana de una protelna de interes que se ha obtenido de un sistema de expresion de protelna que se corresponde en gran medida con el sistema de produccion final.
El problema anterior se soluciona mediante los vectores de acuerdo con la presente invencion, dado que permiten la expresion de altas cantidades de la protelna de interes en celulas transfectadas de manera estable tras un solo tiempo de seleccion corto (por ejemplo, tras dos semanas de seleccion en, por ejemplo, medio que contiene G418). De este modo, los vectores de la invencion se pueden usar ventajosamente para expresar protelnas de interes (por ejemplo, diferentes variantes de protelna) con fines de prueba/seleccion directamente en el sistema de produccion
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(por ejemplo, celulas CHO) y en las condiciones del cultivo celular (por ejemplo, medio y proceso) que se usaran en ultima instancia para producir el producto biofarmaceutico final. Este enfoque elimina, particularmente en las fases de desarrollo tempranas de una multiplicidad de protelnas terapeuticas candidatas (por ejemplo, variantes de protelna), la perdida de tiempo significativa que de lo contrario se asociarla con la generacion de una llnea celular de produccion transfectada de manera estable para cada una de dichas protelnas candidatas. De manera concomitante, este nuevo enfoque genera mas datos comparables (es decir, relevantes) con respecto al pronostico de la cantidad de protelna y al comportamiento posterior tanto durante la produccion (a gran escala) as! como en estudios precllnicos y cllnicos.
Los vectores de expresion de mamlferos de la presente invencion que presentan dos o mas casetes de expresion de GOI son particularmente utiles para la expresion de protelnas multimericas, en particular, protelnas heteromultimericas que incluyen anticuerpos monoclonales. Los vectores de la presente invencion que presentan solo un casete de expresion de GOI se pueden usar ventajosamente para expresar protelnas monomericas tales como citocinas y hormonas que incluyen factores eritropoyeticos como darbepoyetina alfa. Cuando las protelnas multimericas, en particular, los anticuerpos monoclonales, se van a expresar, tambien se contempla un sistema de vectores que consiste en al menos dos vectores de la presente invencion, en donde un primer vector comprende un primer gen de interes y un segundo vector comprende un segundo gen de interes. Preferentemente, en dicho sistema de vectores, dicho primer gen de interes localizado en el primer vector codifica la cadena ligera de una inmunoglobulina y el segundo gen de interes localizado en el segundo vector codifica la cadena pesada de una inmunoglobulina.
Los vectores de mamlfero de acuerdo con la presente invencion son adecuados para la produccion (recombinante) de protelnas monomericas y multimericas, como anticuerpos. Generalmente, las protelnas (recombinantes) que se pueden producir con los vectores de mamlferos de la invencion incluyen aquellas que comprenden secuencias de aminoacidos identicas a, o sustancialmente similares a toda o parte de una de las siguientes protelnas: un ligando FI3, un ligando CD40, protelnas que estimulan la eritropoyesis como eritropoyetina (EPO), darbepoyetina que incluye darbepoyetina alfa y trombopoyetina, calcitonina, leptina, un ligando Fas, un ligando para el activador del receptor de NF-Kappa B (RANKL), un ligando (TRAIL) que induce apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TNF), linfopoyetina derivada del estroma tlmico, factor estimulante de colonias de granulocitos, factor estimulante de colonias de macrofagos y granulocitos (GM-CSF), factores de crecimiento que incluyen factor de crecimiento de mastocitos, factor de crecimiento de celulas madre, factor de crecimiento epidermico, factor de crecimiento de queratinocitos, factor de crecimiento y desarrollo de megacariocitos, RANTES, hormona de crecimiento, insulina, insulinotropina, factores de crecimiento de tipo insulina, hormona paratiroidea, interferones que incluyen a-interferon, 13-interferon y Y-interferon, factor de crecimiento nervioso, factor neurotrofico derivado del cerebro, protelnas de tipo sinaptotagmina (SLP1-5), neurotrofina-3"glucagon, interleucinas que incluyen IL-1, IL-1 a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17 e IL-18, factores estimulantes de colonias, linfotoxina-p, factor de necrosis tumoral (TNF), factor inhibidor de leucemia, oncostatina-M y diversos ligandos para las moleculas ELK y Hek de superficie celular (tales como los ligandos para quinasas relacionadas con eph o LERKS).
Las protelnas adicionales que se pueden producir usando los vectores de mamlfero de la invencion incluyen protelnas que comprenden toda o parte de la secuencia de aminoacidos de un receptor para cualquiera de las protelnas mencionadas anteriormente, un antagonista para tal receptor de cualquiera de las protelnas mencionadas anteriormente y protelnas sustancialmente similares a tales receptores o antagonistas.
Tambien, las protelnas que se pueden producir usando los vectores de mamlferos de la invencion incluyen protelnas que comprenden todas o parte de las secuencias de aminoacidos de los antlgenos de diferenciacion (denominados protelnas CD) o sus ligandos o protelnas sustancialmente similares a cualquiera de ellos. Ejemplos de tales antlgenos son los antlgenos de diferenciacion que incluyen CD20, CD22, CD27, CD30, CD39, CD40 y ligandos a los mismos.
Las protelnas enzimaticamente activas o sus ligandos tambien se pueden producir usando los vectores de mamlferos de la invencion. Los ejemplos incluyen protelnas que comprenden toda o parte de una de las siguientes protelnas o sus ligandos o protelnas similares a una de estas: miembros de la familia de las metaloproteinasas- desintegrinas, quinasas, glucocerebrosidasa, superoxido dismutasa, activador del plasminogeno tisular, Factor VIII, Factor IX, apolipoprotelna E, apolipoprotelna A-1, globinas, un antagonista de IL-2, alfa-1 antitripsina, enzima convertidora de TNF-alfa, ligandos para cualquiera de las enzimas mencionadas anteriormente y otras numerosas enzimas y sus ligandos.
Los vectores de mamlfero de la invencion tambien se pueden usar para producir protelnas quimericas seleccionadas in vitro para unirse a una protelna diana especlfica y modificar su actividad, y anticuerpos o porciones de los mismos y anticuerpos quimericos, es decir, anticuerpos que tienen dominios constantes de inmunoglobulina o anticuerpo acoplados con uno o mas dominios variables de inmunoglobulina o anticuerpo murino, fragmentos del mismo o protelnas sustancialmente similares. Los vectores de mamlfero de la invencion tambien se pueden usar para producir conjugados que comprenden un anticuerpo y una sustancia citotoxica o luminiscente. Ejemplos de
anticuerpos, protelnas quimericas seleccionadas in vitro o conjugados de anticuerpo/citotoxina o de anticuerpo/luminoforo que se pueden producir usando los vectores de mamlfero de la invencion incluyen aquellos que reconocen uno cualquiera o una combinacion de protelnas que incluye, pero no se limita a, cualquiera de las protelnas mencionadas anteriormente y/o los siguientes antlgenos: CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a CD14, CD18, 5 CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, IL-Ia, IL-1, IL-2, IL-3, IL-
7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, receptor de IL-2, receptor de IL-4, receptor de IL-6, receptor de IL-13, subunidades del receptor de IL-18, PDGF-13 y analogos de los mismos, VEGF, TGF, TGF-132, TGF-p1, receptor de EGF, receptor de VEGF, factor de crecimiento de hepatocitos, ligando de osteoprotegerina, interferon gamma, estimulante de linfocitos B, complemento C5, IgE, antlgeno tumoral CA125, antlgeno tumoral MUC1, antlgeno PEM, ErbB2/HER-2, epltopos 10 asociados a tumores que estan presentes en niveles elevados en los sueros de los pacientes, epltopos asociados con cancer o protelnas expresadas en celulas cancerosas de mama, colon, celulas escamosas, prostata, pulmon y/o rinon y/o en celulas de melanoma, glioma o neuroblastoma, el nucleo necrotico de un tumor, integrina alfa 4 beta 7, la integrina VLA-4, integrinas B2, receptores 1, 2, 3 y 4 de TRAIL, RANK, un ligando de RANK, TNF-a, la molecula de adhesion VAP-1, la molecula de adhesion de celula epitelial (EpCAM), la molecula de adhesion intercelular 3 15 (ICAM-3 ), adhesina leucointegrina, la glicoprotelna de plaqueta gp IIb/IIIa, la cadena pesada de miosina cardlaca, hormona paratiroidea, MHC I, antlgeno carcinoembrionico (CEA), alfa-fetoprotelna (AFP), factor de necrosis tumoral (TNF), receptor Fc-y-1, HLA-DR 10 beta, antlgeno HLA-DR, L-selectina y iFn-y.
Los vectores de mamlferos de la invencion tambien se pueden usar para producir protelnas de fusion recombinantes que comprenden cualquiera de las protelnas mencionadas anteriormente o protelnas sustancialmente similares. Por 20 ejemplo, las protelnas de fusion recombinantes que comprenden una de las protelnas mencionadas anteriormente mas un dominio de multimerizacion, tal como una cremallera de leucina, una superhelice, una porcion Fc de un anticuerpo o una protelna sustancialmente similar, se pueden producir usando los vectores de mamlferos de la invencion. Las protelnas incluidas especlficamente entre tales protelnas de fusion recombinantes son las protelnas en las que al menos una porcion de TNFR o RANK esta fusionada con una porcion Fc de un anticuerpo.
25 Se entendera que el experto en la tecnica es totalmente capaz de determinar una variedad de protelnas adicionales que se contemplan para su uso en conexion con la presente invencion.
Los elementos geneticos (vease las abreviaturas utilizadas en la Fig. 1) comprendidos en los vectores de acuerdo con la presente invencion (y en particular, en pDGPAGOI/pDGP) son:
• pot/prom de SV40: el potenciador del virus del simio 40 y la region promotora temprana;
30 • Intron II de la Hbb humana.
Los elementos geneticos (vease las abreviaturas utilizadas en la Fig. 1) que pueden estar comprendidos en los vectores de acuerdo con la presente invencion (y en particular, en pDGPAGOI/pDGP) son:
• neo: El gen de la aminoglucosido-3'-fosfotransferasa (APH 3' II), tambien llamado gen de la neomicina fosfotransferasa, de Tn5; APH 3' II inactiva el antibiotico geneticina (G418);
35 • dhfr: el gen de la dihidrofolato reductasa;
• poli(A) de SV40: la secuencia de la senal de poliadenilacion del SV40;
• poli(A) sint: una senal de poliadenilacion sintetica basada en la senal de poliadenilacion del gen de la p-globina de conejo.
El vector pDGP como una realizacion que ejemplifica la presente invencion (para un vector con al menos un gen de 40 interes) se representa de manera esquematica en la Fig. 1. Contiene dos casetes de expresion de GOI, cada uno de los cuales presenta basicamente estructuras identicas y elementos reguladores, excepto que los genes a expresar son distintos: el gen de cadena ligera y pesada, respectivamente, de un anticuerpo monoclonal (un anticuerpo anti- CD20), los casetes de expresion, por tanto, permiten la expresion de dos genes distintos de interes en celulas de mamlfero.
45 El vector pDGP-A como otra realizacion que ejemplifica la presente invencion (para un vector con un gen de interes) se representa de manera esquematica en la Fig. 3. Contiene un casete de expresion de GOI que presenta el gen de la darbepoyetina alfa (que es una hormona o factor eritropoyetico) bajo el control de la novedosa e inventiva combinacion de elementos reguladores descrita anteriormente.
Los genes de interes tlpicamente son secuencias de ADNc, pero tambien puede ser secuencias de ADN 50 (genomicas).
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Tal como se menciona anteriormente, los vectores de acuerdo con la presente invencion (y en particular, pDGPAGOI/pDGP y pDGP-AAGOI/pDGP-A) tambien pueden contener genes/casetes de expresion que codifican un marcador de selection. Los marcadores de selection preferidos son la neomicina fosfotransferasa codificada por el gen/casete de expresion neo y la dihidrofolato reductasa codificada por el gen/casete de expresion dhfr. Los genes/casetes de expresion que codifican los marcadores seleccionables permiten la seleccion de celulas transfectadas mediante, por ejemplo, geneticina (G418) y metotrexato (MTX). El casete de expresion neo de pDGP contiene el gen de la neomicina fosfotransferasa dirigido por el potenciador de SV40 y la region promotora temprana y adicionalmente se regula de manera transcripcional mediante una secuencia de senal de poliadenilacion sintetica (tal como se muestra en la Fig. 1). El gen de la neomicina fosfotransferasa se origina a partir de bacterias y se expresa en celulas de mamlfero si esta bajo el control de los elementos reguladores mencionados anteriormente. Muy al contrario, el casete de expresion dhfr de pDGP contiene el gen dhfr dirigido por la region promotora temprana de SV40 (sin la secuencia del potenciador) y se regula de manera transcripcional por la senal de poliadenilacion de SV40 en 3' hasta la orientation en 5'. La enzima dihidrofolato reductasa (DHFR) se requiere para la conversion de dihidrofolato a tetrahidrofolato que, a su vez, se requiere para la slntesis de acido nucleico en las celulas. La seleccion de celulas eficaz se logra mediante una inhibition irreversible de dihidrofolato reductasa mediante metotrexato. De este modo, el crecimiento de las celulas de mamlfero transfectadas de manera satisfactoria con el vector pDGP (y, por tanto, sobreexpresando la protelna DHFR) se habilita en un medio de crecimiento suplementado con metotrexato.
La Figura 1 ilustra de manera esquematica un vector de acuerdo con una realization preferida de la presente invencion (vector pDGP) que incluye dos genes de interes, es decir, mAb HC y mAb LC (mAb: anticuerpo monoclonal; HC: cadena pesada; LC: cadena ligera).
La Figura 2 ilustra de manera esquematica un vector de control.
La Figura 3 ilustra de manera esquematica un vector de acuerdo con una realizacion preferida de la presente invencion (vector pDGP -) que incluye dos genes de interes, es decir, darbepoyetina alfa (abreviatura: Darbe alfa).
La Figura 4 ilustra de manera esquematica otro vector de control, es decir, el vector de control 1, en donde la expresion de GOI (darbepoyetina alfa) esta bajo el control regulador del potenciador/promotor CMV (pot/prom CMV) y el intron II de la Hbb.
La Figura 5 ilustra de manera esquematica otro vector de control mas, es decir, vector de control 2, en donde la expresion de GOI (darbepoyetina alfa) esta bajo el control regulador del potenciador/promotor SV40 (pot/prom SV40) solo (sin secuencias de intrones).
En un intento de probar el rendimiento del vector de expresion pDGP segun la presente invencion, los inventores compararon pDGP (ilustrado en la Fig. 1) con el vector control (ilustrado en la Fig. 2). Tanto el pDGP como el vector control incluyen los mismos dos genes de interes: mAB HC y mAb LC (de un anticuerpo anti-CD20). Ambos vectores se transfectaron en las mismas llneas celulares hospedadoras (por ejemplo, CHO K1PD, COS1, CV1, Vero, HeLa, HEK-293, PER C6). Las celulas se sometieron despues a sucesivas etapas de seleccion en presencia de G418 y MTX. Despues de cada etapa de seleccion, se determinaron y compararon los tltulos de mAb en lotes de matraz de agitation convencional. Los detalles experimentales se presentan a continuation.
En un intento adicional de probar el rendimiento del vector de expresion pDGP-A segun la presente invencion, los inventores compararon pDGP-A (ilustrado en la Fig. 3) con el vector de control 1 y 2 (representado en las Figs. 4 y 5, respectivamente). Tanto el pDGP-A y el vector de control 1 y 2 incluyen el mismo gen de interes: darbepoyetina alfa, una hormona (factor eritropoyetico). Los vectores se transfectaron en las mismas llneas celulares hospedadoras (por ejemplo, CHO K1PD, COS1, CV1, Vero, HeLa, HEK-293, PER C6). Al contrario de lo mencionado anteriormente para el vector pDGP, cada uno de los vectores de expresion de pDGP-A, los vectores de control 1 y 2 comprenden un unico casete de expresion de GOI y no comprenden ningun gen(es) marcador(es) de seleccion eucariotico. Por lo tanto, el vector Neo - que comprende el gen de la resistencia a la neomicina - se cotransfecto con el fin de posibilitar la seleccion de una etapa en medio que contiene geneticina (G418). Los detalles experimentales se presentan a continuacion.
Experimentos
Los vectores de mamlferos segun la invencion se pueden usar y se usaron para producir diversas protelnas diferentes (recombinantes). Los siguientes ejemplos ilustran la configuration experimental general de una expresion recombinante de una protelna monomerica y multimerica, respectivamente. En particular, los datos presentados en lo sucesivo en este documento se han recogido usando un anticuerpo monoclonal dirigido contra CD20 y darbepoyetina alfa, una hormona (factor eritropoyetico), como protelnas ejemplares que se pueden expresar usando el vector de mamlfero segun la invencion.
Ejemplo 1: Expresion de una protefna multimerica (anticuerpo monoclonal anti-CD20) Diseno y construccion de vector de expresion
Los vectores usados en el presente estudio se disenaron in silico usando el programa informatico de evaluacion de vector NTI 9.0. Los fragmentos requeridos para la construccion de vectores tales como el vector pDGP y el vector de 5 control (Fig. 2) se prepararon en Geneart AG, Regensburg, Alemania. Los expertos en la tecnica entienden que son factibles varios ensamblajes vectoriales de acuerdo con las ensenanzas de la presente invencion. Dado que los elementos individuales de los vectores de acuerdo con la invencion son conocidos en la tecnica, los vectores adecuados se pueden ensamblar, por ejemplo, mediante secuenciacion o amplificacion y la clonacion apropiada de los elementos geneticos basicos y los casetes de expresion. Por lo tanto, se entendera que otras varias 10 realizaciones y modos de obtener los respectivos vectores son adecuados y facilmente disponibles.
Los elementos geneticos reguladores que dirigen la expresion de los 4 casetes de expresion en cada vector de expresion se enumeran en la Tabla 1.
Tabla 1: Listado de elementos geneticos reguladores comprendidos en el pDGP/vector de control
Vector
GOI (2) neo dhfr
promotor
intron poli(A) promotor poli(A) promotor poli(A)
vector pDGP
pot/prom de SV40 intron II de la Hbb poli(A) de SV40 pot/prom de SV40 poli(A) sint pot/prom de SV40 poli(A) de SV40
Vector de control
pot/prom de CMV intron de RK poli(A) de SV40 pot/prom de SV40 poli(A) sint pot/prom de SV40 poli(A) de SV40
Preparacion de vector para la transfeccion
15 Ambos vectores de expresion se alinearon usando la endonucleasa de restriccion de un solo corte Swal (ATTTAAAT, Roche, n.° de cat. 11 371 525 001). Se digirio un maximo de 100 pg de ADN del vector por reaccion usando Swal a 5 U/pg de ADN. A las mezclas de reaccion se anadieron las cantidades apropiadas de tampon de reaccion 10x y H2O. Las mezclas de reaccion se incubaron a 25 °C durante 4 h durante la noche. Tras la digestion del ADN, la precipitacion se realizo en una camara de aire de flujo laminar tal como se describe a continuacion:
20 • Anadir 1 volumen de isopropanol
• Agitar vorticialmente de manera concienzuda
• Centrifugar 30 min a 21000 x g a 4 °C
• Descartar el sobrenadante
• Anadir cuidadosamente 1 volumen de etanol esteril y frlo al 70 %
25 • Centrifugar 1 min a maxima velocidad, a 4 °C
• Descartar el sobrenadante
• Secar al aire el sedimento a TA durante 5-30 min (en laminar)
• Resuspender el ADN en 100 pl de agua esteril.
Tras a digestion, la pureza (OD 260/280) y la concentracion de ADN lineal se determino usando NanoDrop ND-1000. 30 La electroforesis en gel de ADN digerido (e-gel de agarosa al 0,8 %, Invitrogen) se realizo para controlar la linearizacion.
Celulas hospedadoras
Se usaron las celulas CHO K1PD, COS1, CV1, Vero, HeLa, HEK-293 y PER C6.
La llnea celular CHO K1PD es una subpoblacion de la llnea celular CHO K1 que se origina a partir de ATCC (n°. de 35 cat. CCL-61.3). La llnea celular original se adapto a un cultivo de suspension libre de suero en medio DM122. El medio de crecimiento DM122 se uso para todos los experimentos que emplean celulas CHO K1PD.
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Transfeccion
El sistema Amaxa se uso para la transfeccion celular (Nucleofector kit V, n.° de cat.: VCA-1003). No se transfectaron mas de 5 grupos a la vez, para permitir el tiempo suficiente para todas las manipulaciones celulares necesarias. El protocolo detallado es como sigue:
1. En el momento de la transfeccion, las celulas deben ser de hasta 2 x 106/ml con una viabilidad > al 90 %.
2. Se usan 5 x 106 celulas por transfeccion.
3. Contar las celulas y centrifugar a 90 x g, 10 min, a TA en un tubo de centrifugacion de 50 ml.
4. Retirar cuidadosamente el medio y resuspender el sedimento celular en 100 pl de solucion V (contenida en el kit Amaxa)
5. Anadir ADN (3 pg) y mezclar suavemente.
6. Anadir la mezcla de la etapa 5 a una cubeta de transfeccion y colocar la misma en un dispositivo Amaxa Nucleofector.
7. Transfectar las celulas usando el programa Amaxa a 23 U.
8. Para las celulas que crecen en matraces de agitacion (por ejemplo, CHO K1PD) anadir un poco de medio de crecimiento en la cubeta y transferir cuidadosamente las celulas a un matraz de agitacion de 125 ml utilizando 20 ml de medio de crecimiento. Enjuagar la cubeta una vez o dos con medio de crecimiento y anadirlo al matraz de agitacion. Incubar las celulas 24 - 48 h en un agitador (110 rpm), a 37 °C, con CO2 al 10 %.
Medio de crecimiento y seleccion con G418/MTX
Las celulas (por ejemplo, celulas CHO K1PD, COS1, CV1, Vero, HeLa, HEK-293, PER C6) se cultivaron en un medio adecuado para cultivar celulas de mamlfero, tal como medio de crecimiento DM122 suplementado con L- glutamina 8 mM (Sigma, n.° de cat. G7513) cuando se usa CHO K1PD para los experimentos.
Las etapas de seleccion se realizaron en el mismo medio suplementado adicionalmente con G418 (Geneticina, Gibco, n.° de cat. 10131-027; concentracion final: 0,8 mg/ml) y/o metotrexato (metotrexato hidrato, Sigma, n.° de cat. M8407150; concentracion final: 150 o 250 nM).
La seleccion con G418 fue la primera etapa de seleccion tras la transfeccion. Se anadio G418 a las celulas 2-5 dlas despues de la transfeccion, cuando la viabilidad de las celulas superaba el 60 %. La seleccion con G418 normalmente dura 2-4 semanas. Una vez que la viabilidad de las celulas habla alcanzado al menos el 85 %, se llevo a cabo la seleccion con MTX.
Se uso una densidad de cultivo de 2 x 105 celulas viables por ml para comenzar la seleccion con MTX en celulas preseleccionadas con G418. Se realizaron dos subetapas de seleccion usando las concentraciones de MTX indicadas anteriormente (150/250 nM). La seleccion con MTX normalmente dura de 2 a 3 semanas, hasta que la viabilidad de las celulas alcanza mas del 85 %.
Descongelacion/congelacion de celulas
Las celulas se descongelaron a 37 °C y se inocularon gota a gota directamente a matrices de agitacion de 250 ml que contienen 50 ml de medio precalentado en una densidad celular inicial de aproximadamente 105 celulas variables por ml. Las celulas se cultivaron a 37 °C, con CO2 al 10 % y a 110 rpm.
Las celulas se congelaron en fase de crecimiento exponencial a una viabilidad > del 90 %. Se congelaron 5-10 x 106 celulas viables por frasco en medio acondicionado que contiene DMSO al 7,5 %. En primer lugar, el cultivo celular se centrifugo a 180 x g, 5 min, TA. En segundo lugar, se retiro parcialmente el sobrenadante. A continuacion, se anadio DMSO al sobrenadante restante hasta una concentracion final del 7,5 %. Los sedimentos celulares se resuspendieron suavemente. Los frascos de congelacion se rellenaron cada uno con 1 ml de suspension celular y se transfirieron a un congelador profundo a - 80 °C en un recipiente de congelacion Mr. Frosty. En 1 mes, las celulas congeladas en los frascos de congelacion se transfirieron en un recipiente de nitrogeno llquido.
Cultivo y manejo de celulas
Las celulas se dividieron cada 2-3 dlas a una densidad de 1-1,5 x 105 celulas viables por ml y se anadieron al medio de crecimiento precalentado apropiado para mantener el crecimiento exponencial.
Condiciones de incubacion: 37 °C, 90-110 rpm (para matraces de agitacion de 125 y 250 ml), CO2 al 10 %(para medio DM122).
5 Prueba para la expresion de mAb
Despues de cada etapa de seleccion (G418, MTX) un experimento de lote de diez dlas en medio suplementado de manera apropiada (por ejemplo, DM122) se realizo para evaluar la expresion de mAb. Las celulas se cultivaron a una densidad final de 1,5 x 105 celulas viables/ml en matraces de agitacion de 125 ml. Los volumenes de cultivo total fueron de 25 ml. Las celulas se cultivaron en un incubador de agitacion (a 37 °C, 110 rpm, con CO2 al 10 %). En el 10 dla 10, se tomo 1 ml de las muestras de sobrenadante de cultivo celular para medir el tltulo de mAb. El contenido en mAb se determino mediante CA (Cromatografla de Afinidad con protelna A).
Resultados
Los tltulos de lote de diez dlas de celulas transfectadas con vector pDGP tras las diferentes etapas de seleccion se muestran en la Tabla 2.
15 Tabla 2: Tltulos de lote de diez dlas; celulas transfectadas con vector pDGP tras las diferentes etapas de seleccion
Experimento
G418 MTX 150 nM MTX 250 nM
Tftulo (mg/l) Tftulo (mg/l) Tftulo (mg/l)
1
94 246 281
2
80 249 284
3
94 225 288
4
96 229 303
5
91 218 309
6
84
7
74 212 339
8
89 216 289
9
89
10
94 243 260
Los tltulos de lote de diez dlas de celulas transfectadas con vector de control tras las diferentes etapas de seleccion se muestran en la Tabla 3
Tabla 3: Tltulos de lote de diez dlas; celulas transfectadas con vector de control tras las diferentes etapas de 20 seleccion
Experimento
G418 MTX 150 nM MTX 250 nM
Tftulo (mg/l) Tftulo (mg/l) Tftulo (mg/l)
1
15 190 192
2
15 247 372
3
14 251 219
4
15 207 341
5
15 154 385
6
15 422 646
En comparacion con las celulas transfectadas con el vector de control, se midieron tltulos 4-5 veces mayores para las celulas transfectadas con pDGP tras la seleccion con G418. En promedio, se midieron los mismos tltulos para ambos enfoques experimentales tras la seleccion con MTX. Sin embargo, los tltulos logrados fueron mucho mas reproducibles con las celulas transfectadas con pDGP (± 10 %) en comparacion con las celulas transfectadas con el 5 vector de control (± 50 %).
Ejemplo 2: Expresion de una protefna monomerica (darbepoyetina alfa)
Diseno y construccion del vector de expresion
Los vectores y fragmentos usados en el presente estudio se disenaron y prepararon tal como se describe en el Ejemplo 1. Los experimentos de expresion con darbepoyetina alfa se realizaron usando un derivado adicional del 10 vector pDGPAGOI mencionado anteriormente, el vector pDGP-AAGOI. El vector pDGP-AAGOI comprende la misma combinacion novedosa e inventiva de elementos reguladores que dirigen la expresion de GOI, cuando se insertan, el vector pDGP-AAGOI mencionado anteriormente (y el vector pDGP del Ejemplo 1): el potenciador del virus del simio 40 y la region promotora temprana y el intron II de la Hbb. En el ejemplo presente, la darbepoyetina alfa se inserta en pDGP-AAGOI como una protelna ejemplar de interes. Ademas, el vector de control 1, el vector de control 2 t el 15 vector Neo se usaron en este estudio (vease mas abajo).
Al contrario de vector pDGP usado en el Ejemplo 1, cada uno de los vectores de expresion mencionados anteriormente (excepto el vector Neo) comprende un unico casete de expresion de GOI y no comprende ningun gen(es) marcador(es) de seleccion eucariotico. Por lo tanto, el vector Neo - que comprende el gen de la resistencia a la neomicina - se cotransfecto en todos los experimentos con el fin de posibilitar la seleccion en medio que contiene 20 geneticina (G418). El Ejemplo 2, por tanto, representa un sistema de vectores segun el tercer aspecto de la invencion.
Los elementos geneticos reguladores que dirigen la expresion de darbepoyetina alfa en el vector pDGP-A y en el vector de control 1 y 2 se enumeran en la Tabla 4. As! mismo, la Tabla 4 muestra los elementos geneticos reguladores que dirigen la expresion del gen de resistencia a la neomicina en el vector Neo.
25 Tabla 4: Listado de elementos geneticos reguladores comprendidos en el pDGP-A, el vector de control 1, el vector
de control 2 y el vector Neo
Vector
GOI (darbepoyetina alfa) neo
promotor
intron poli(A) promotor poli(A)
pDGP-A
pot/prom de SV40 intron II de la Hbb poli(A) de SV40 - -
Vector de control 1
pot/prom de CMV intron II de la Hbb poli(A) de SV40 - -
Vector de control 2
pot/prom de SV40 - poli(A) de SV40 - -
Vector Neo
- - - pot/prom de SV40 poli(A) de SV40
Celulas hospedadoras
Se usaron las mismas llneas celulares que en el Ejemplo 1.
30 Transfeccion
Se uso el mismo metodo y sistema de transfeccion que en el Ejemplo 1.
Medio de crecimiento y seleccion con G418
Las celulas (por ejemplo, celulas CHO K1PD, COS1, CV1, Vero, HeLa, HEK-293, PER C6) se cultivaron en un medio adecuado para cultivar celulas de mamlfero, tal como el medio de crecimiento DM122 desarrollado 35 internamente suplementado con L-glutamina 8 mM (Sigma, n.° de cat. G7513) cuando se usa CHO K1PD para los experimentos.
La etapa de seleccion se realizo en el mismo medio suplementado adicionalmente con G418 (Geneticina, Gibco, n.° de cat. 10131-027; concentracion final: 0,8 mg/ml).
Se anadio G418 a las celulas 2-5 dlas despues de la transfeccion, cuando la viabilidad de las celulas superaba el 60
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%. La seleccion con G418 normalmente dura 2-4 semanas.
Descongelacion/congelacion de celulas
La descongelacion/congelacion de celulas se realizo tal como se describe en el Ejemplo 1.
Cultivo y manejo de celulas
El cultivo y manejo de celulas se realizo tal como se describe en el Ejemplo 1.
Prueba para la expresion de darbepoyetina alfa
Los grupos se sometieron a ensayo con respecto a la expresion de darbepoyetina alfa estable tras la etapa de seleccion con G418. Un experimento de lote en medio suplementado de manera apropiada (por ejemplo, DM122) se realizo para evaluar la expresion de darbepoyetina alfa. Las celulas se cultivaron a una densidad final de 1,5 x 105 celulas viables/ml en matraces de agitacion de 125 ml. Los volumenes de cultivo total fueron de 25 ml. Las celulas se cultivaron en un incubador de agitacion (a 37 °C, 110 rpm, con CO2 al 10 %). En los dlas 5 y 9, se tomaron 0,5 ml de las muestras de sobrenadante de cultivo celular para medir el tltulo de darbepoyetina alfa. El contenido de darbepoyetina alfa se determino mediante un ensayo ELISA especlfico de EPO (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) (kit Epo-ELISA Quantikine, R&D Systems, n.° de cat.: DEP00).
Resultados
Los contenidos en darbepoyetina alfa en los dlas 5 y 9 en los cultivos de lotes de celulas transfectadas con pDGP-A, vector de control 1 y vector de control 2 se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5: Contenido en darbepoyetina alfa en los dlas 5 y 9 en cultivos de lotes de celulas transfectadas con el vector pDGP-A, el vector de control 1 y el vector de control 2, respectivamente.
Experimento
Dfa 5 Dfa 9
Tltulo (mg/l) Tltulo (mg/l)
pDGP-A
1
27,4 76,4
2
26,9 49,1
Vector de control 1
1
3,7 8,4
2
5,0 8,3
Vector de control 2
1
1,9 5,5
2
1,7 4,2
En comparacion con las celulas transfectadas con el vector de control 1, se obtuvieron tltulos de 5 a 10 veces mayor a partir de celulas transfectadas con el vector pDGP-A tras la seleccion con G418. En comparacion con las celulas transfectadas con el vector de control 2, el uso del vector pDGP-A dio como resultado un tltulo de alfa darbepoyetina de hasta 14 veces mayor, mostrando la ventaja y superioridad de la combinacion del potenciador del virus del simio 40 y la region promotora temprana y el intron II de la Hbb como elementos reguladores para dirigir la expresion de protelna recombinante.
Conclusion
Los vectores de expresion de la presente invencion (tales como pDGP y pDGP-A) proporcionan las siguientes ventajas sobre vectores de expresion usados actualmente en la tecnica (tales como los vectores de control):
• Debido a la alta reproducibilidad, el uso de pDGP y pDGP-A, como ejemplos de vectores de acuerdo con la invencion, reduce de manera considerable el numero de muestras celulares (es decir, grupos celulares transfectados) a generar y someter a ensayo a solo de 3 a 5, reduciendo de este modo la carga de trabajo de
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manera significativa. Actualmente, se requiere la generacion de un elevado numero de muestras celulares (hasta 50) debido a la baja reproducibilidad generalmente para identificar muestras celulares de alta productividad.
• El uso de vectores, tales como pDGP y pDGP-A, proporciona tltulos adecuados de la protelna expresada de interes para la caracterizacion del producto, estudios precllnicos y de fase I tras solo una unica etapa de seleccion con G418. No se requieren etapas de seleccion con MTX adicionales para aumentar el tltulo de la protelna (es decir, anticuerpo) antes de la clonacion celular.
• El tiempo requerido para desarrollar una llnea celular se puede reducir notablemente cuando se usa, por ejemplo, pDGP o pDGP-A, as! como el numero de etapas de seleccion se reduce a una sola etapa con G418.
Referencias
1 Trill JJ, Shatzman AR, Ganguly S: Production of monoclonal antibodies in COS and CHO cells. Current Opinion in Biotechnology 6, 1995: 553-560
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LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Lek Pharmaceuticals d.d.
<120> Vector de expresion de mamlferos
<130> HEX-001 PCT
<140> ..
<141 > <150> 08 172 630.9 <151 > <150> 09 158 118.1 <151 > <160>3
<170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 870 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<223> Secuencia sintetica <400> 1
gaacttcagg
gtgagtctat gggacccttg atgttttctt tccccttctt ttctatggtt 60
aagttcatgt
cataggaagg ggagaagtaa cagggtacag tttagaatgg gaaacagacg 120
aatgattgca
tcagtgtgga agtctcagga tcgttttagt ttcttttatt tgctgttcat 180
aacaattgtt
ttcttttgtt taattcttgc tttctttttt tttcttctcc gcaattttta 240
ctattatact
taatgcctta acattgtgta taacaaaagg aaatatctct gagatacatt 300
aagtaactta
aaaaaaaact ttacacagtc tgcctagtac attactattt ggaatatatg 360
tgtgcttatt
tgcatattca taatctccct actttatttt cttttatttt taattgatac 420
ataatcatta
tacatattta tgggttaaag tgtaatgttt taatatgtgt acacatattg 480
accaaatcag
ggtaattttg catttgtaat tttaaaaaat gctttcttct tttaatatac 540
ttttttgttt
atcttatttc taatactttc cctaatctct ttctttcagg gcaataatga 600
tacaatgtat
catgcctctt tgcaccattc taaagaataa cagtgataat ttctgggtta 660
aggcaatagc
aatatttctg catataaata tttctgcata taaattgtaa ctgatgtaag 720
aggtttcata
ttgctaatag cagctacaat ccagctacca ttctgctttt attttatggt 780
tgggataagg
ctggattatt ctgagtccaa gctaggccct tttgctaatc atgttcatac 840
ctcttatctt
cctcccacag ctcctgggca 870
5 <210>2
<211> 9555 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
10 <223> Secuencia sintetica
<400>2

Claims (16)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    REIVINDICACIONES
    1. Un vector de expresion de mamlferos que comprende los siguientes elementos reguladores:
    (a) el potenciador del virus del simio 40 y la region promotora temprana y
    (b) el intron II de la Hbb humana,
    en donde el vector de expresion comprende al menos un gen de interes bajo el control de los elementos reguladores definidos en (a) y (b), y en donde el intron II de la Hbb humana se localiza entre la secuencia que codifica el al menos un gen de interes y el potenciador de SV40 y una region promotora temprana.
  2. 2. El vector de la reivindicacion 1, en donde el intron II de la Hbb humana presenta la secuencia de SEQ ID NO:1.
  3. 3. El vector de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el vector ademas comprende al menos un gen que codifica un marcador de seleccion eucariota y/o procariota, en particular en donde el al menos un gen de marcador de seleccion eucariota es el gen de la neomicina fosfotransferasa de Tn5 y/o el gen de la dihidrofolato reductasa.
  4. 4. El vector de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el vector es circular.
  5. 5. El vector de la reivindicacion 4, en donde dicho al menos un gen codifica la cadena ligera de una inmunoglobulina y/o la cadena pesada de una inmunoglobulina.
  6. 6. El vector de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el orden de los elementos reguladores, el(los) gen(es) de interes y los genes que codifican un marcador de seleccion es tal como sigue: potenciador de SV40 5'- /region promotora temprana, intron II de la Hbb humana, gen que codifica la cadena ligera de una inmunoglobulina, secuencia de senal de poliadenilacion del SV40; potenciador del SV40/region promotora temprana, intron II de la Hbb humana, gen que codifica la cadena pesada de una inmunoglobulina, secuencia de senal de poliadenilacion del SV40; potenciador del SV40/region promotora temprana, gen de la neomicina fosfotransferasa de Tn5, una secuencia de senal de poliadenilacion sintetica; promotor temprano del SV40, gen de la dihidrofolato reductasa, secuencia de senal de poliadenilacion del SV40-3'.
  7. 7. El vector de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el vector es el vector pDGPAGOI que presenta una secuencia de 9555 pb, cuya una hebra se representa mediante la SEQ ID NO:2.
  8. 8. Un sistema de vectores, que comprende al menos dos vectores tal como se define en las reivindicaciones 3 o 4, en donde cada uno de los al menos dos vectores comprende al menos un gen de interes.
  9. 9. El sistema de vectores de la reivindicacion 8, en donde un primer gen de interes localizado en un primer vector codifica la cadena ligera de una inmunoglobulina, y un segundo gen de interes localizado en un segundo vector codifica la cadena pesada de una inmunoglobulina.
  10. 10. Un sistema de vectores, que comprende al menos dos vectores, en donde un primer vector se define tal como en la reivindicacion 1 o 2 y en donde un segundo vector comprende al menos un gen que codifica un marcador de seleccion que confiere resistencia a una celula transfectada.
  11. 11. El sistema de vectores de la reivindicacion 10, en donde el primer vector es el vector pDGP-AAGOI que presenta una secuencia de 3830 pb, cuta una hebra se representa mediante la SEQ ID NO:3.
  12. 12. Una celula de mamlfero aislada que comprende un vector de expresion de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, o que comprende un sistema de vectores de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.
  13. 13. La celula de la reivindicacion 12, en donde la celula es una celula COP, una celula L, una celula C127, una celula Sp2/0, una celula NS-0, una celula NS-1, una celula NIH3T3, una celula PC12, una celula PC12h, una celula BHK, una celula CHO, una celula COS1, una celula COS3, una celula COS7, una celula CV1, una celula Vero, una celula HeLa, una celula HEK-293, una celula PER C6, o una celula derivada de fibroblastos diploides, celulas de mieloma y HepG2.
  14. 14. Un metodo ex vivo para producir una celula de la reivindicacion 12, comprendiendo el metodo la etapa de proporcionar una celula de mamlfero con un vector de expresion de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, o con un sistema de vectores de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11.
  15. 15. Un metodo para producir al menos un polipeptido de interes, en donde dicho metodo comprende la etapa de
    cultivar una celula de la reivindicacion 12 en un medio de cultivo celular en condiciones que permitan la expresion de dicho al menos un polipeptido de interes.
  16. 16. El metodo de la reivindicacion 15, en donde dicho al menos un polipeptido de interes es/son secretado(s) en el medio de cultivo celular y dicho metodo ademas comprende la etapa de aislar del medio de cultivo celular dicho al 5 menos un polipeptido de interes.
    imagen1
    poli(A) sint
    neo
    mAb HC
    poli(A) de SV40
    pot/prom de SV40
    region del fago f1
    Fig. 1
    pot/prom de SV40
    poli(A) de 5V40
    Intron II de la Hbb
    DHFR
    prom de SV40
    mAb LC
    poli A de SV40
    vector pDGP
    % pot/prom de SV40
    amp
    poli(A) de SV40 pot/prom de CMV
    imagen2
    pot/prom de SV40 poll,A) de SV4°
    region del fago f1
    Fig. 2
    imagen3
    Darbe alfa
    poli(A) de SV40
    vector pDGP-A
    4417 pb
    Intron II de la Hbb
    Fig. 3
    imagen4
    poli(A) de SV40 Darbepoyetina alfa
    Fig. 4
    Vector de contro 1
    474* pb
    Intron II de la Hbb
    imagen5
    Vector de control 2
    3553 pb
    Darbe alfa
    poli(A) de SV40
    amp
    Fitf- 5
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