CN102965342B - 高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株 - Google Patents
高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102965342B CN102965342B CN201210534876.5A CN201210534876A CN102965342B CN 102965342 B CN102965342 B CN 102965342B CN 201210534876 A CN201210534876 A CN 201210534876A CN 102965342 B CN102965342 B CN 102965342B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- leptin
- chinese hamster
- hamster ovary
- obese
- cell strain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Abstract
高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株，它涉及一种基因工程细胞株。解决现有转基因工程菌株瘦素分泌表达量低，且需要在发酵上清液中加入β-巯基乙醇再透析过夜，导致成本高，生产周期长，风险增加，不适合工业化大规模生产的问题。将人工设计的Obese’基因与真核表达质粒pcDNA3.1/V5-His-C重组构建的表达载体pcDNA3.1/V5-His-C-Obese’与含有dhfr基因的质粒pDCH1P11共转染入CHO-dhfr-，获得高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株。本发明可用于医药领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因工程细胞株。
背景技术
肥胖是长期以来困扰人类健康的主要问题之一，特别是随着社会经济的发展，人们生活水平的不断提高，肥胖患者越来越多，而且肥胖会引发高血糖、高血压、高血脂、高血粘、高尿酸、高胰岛素血症、冠心病、脑卒中、下肢静脉曲张、脂肪肝、胆石症、睡眠呼吸暂停症、糖尿病、痛风症及关节炎，是很多疾病的诱因之一。因此合理控制体重是很多肥胖者的梦想。
减肥属于以减少人体过度的脂肪、体重为目的的行为方式。指运用药物、饮食、运动、中医经络，心理疗法来达到减少身体脂肪堆积的一种现象，设法纠正肥胖者异常反应造成的不当行为，即用行为科学分析肥胖者摄食行为的特征和运动类型，以此为基础，合理修正导致肥胖的行动。
通过饮食和运动减肥都需要漫长的时间，而且需要毅力坚持，很多人都半途而废，导致体重反弹。中医经络减肥给人以恐惧感，很多人望而却步。药物减肥是目前减肥主要形式，被很多人采用。但是化学药剂都存在一定的毒副作用，损伤身体，因此人们比较推崇天然减肥制剂。但由于天然减肥物质种类少，而且含量低，生产周期长，很难满足市场的需求。
发明内容
本发明要解决现有天然减肥物质种类少，含量低，生产周期长，很难满足市场的需求的问题，而提供的一株高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株。
本发明高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株按以下步骤制备：
一、设计瘦素转基因序列，基因序列如SEQ ID NO：1所示；
二、合成瘦素转基因DNA片段Obese’，再导入T载体中；
三、目的片段双酶切，用BamHI及EcoRⅠ双酶切消化T载体，反应体系为
酶切反应条件为37℃放置10h，然后将酶切产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到插入片段Obese’；
四、质粒载体双酶切：用BamHI和EcoRⅠ双酶切消化质粒载体pcDNA3.1/V5-His-C，反应体系为
酶切反应条件为37℃放置10h，然后将酶切产物用0.6%琼脂糖凝胶电泳，再用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到酶切后的载体pcDNA3.1/V5-His-C；
五、插入片段Obese’与经过双酶切的载体pcDNA3.1/V5-His-C连接，连接反应体系为
连接反应条件为16℃放置过夜，获得连接产物重组质粒pcDNA3.1/V5-His-C-Obese’；
六、重组质粒转染CHO：将构建好的重组质粒pcDNA3.1/V5-His-C-Obese’与质粒pDCH1P11混合，使用LipofeetmineTM 2000 Reagent共转染CHO-dhfr-细胞，在24孔板中进行转染，细胞达到95%融合时，将培养基更换为无抗生素、无血清的CHO-S-SFMⅡ，500μL/孔，转染6h后更换含100mL/L FBS、不含HT和NAA的CHO-S-SFMⅡ，继续培养48h，用ELISA试剂盒鉴定阳性转染的细胞按1:10传代，24h细胞贴壁后更换为不含HT和NAA、含G418 0.75mg/L和FBS 100mL/L的选择性培养基，培养14～16d后有阳性克隆形成，然后用定向消化的方法将阳性克隆转入24孔板，又传代至12孔板，经 ELISA试剂盒测定对阳性高表达的细胞克隆进行扩大培养；
七、MTX的加压培养：以MTX加压筛选，浓度依次为2×10-8 mmol/L、1×10-7 mmol/L和5×10-7 mmol/L，最终得到能够在5×10-7 mmol/L的MTX中正常生长的CHO细胞株，即为高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株。
Leptin是obese基因编码的表达产物，由白色脂肪细胞和胎盘产生的由167个氨基酸组成的分泌蛋白，此蛋白可作为影响能量平衡的传入信号，其功能主要是通过影响能量摄取和支出实现减低体重的作用。本实施方式对obese基因进行了重新的设计获得Obese’基因。Obese’基因由114个碱基组成，编码38个氨基酸的rhLeptin（Recombinant Human Leptin，人重组瘦素）。
本发明中设计的瘦素多肽（rhLeptin）由38个氨基酸组成（SEQ IDNO：2），在编码瘦素多肽的序列5’端加上Kozak序列和信号肽，然后在序列两端分别加上限制性内切酶BamHI和EcoRⅠ的位点；并根据表达系统选择CHO-dhft-偏爱密码子设计出本发明瘦素转基因序列。
本实施方式中瘦素转基因DNA片段的合成由生物工程公司合成，T载体由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
本发明高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株可以分泌rhLeptin，rhLeptin具有明显的减肥效果；而且在初始细胞浓度为5×10-7 mmol/L、产业化细胞培养液（DMEM/F12(1:1)+14mmol/L柠檬酸铁+0.8mg/L硫酸锌+0.3g/L酵母水解物）中培养72h可得到瘦素13mg/L。本发明基因工程细胞株具有高效分泌表达瘦素的优点，可以满足市场的需求。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株按以下步骤制备：
一、设计瘦素转基因序列，基因序列如SEQ ID NO：1所示；
二、合成瘦素转基因DNA片段Obese’，再导入T载体中；
三、目的片段双酶切，用BamHI及EcoRⅠ双酶切消化T载体，反应体系为
酶切反应条件为37℃放置10h，然后将酶切产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到插入片段Obese’；
四、质粒载体双酶切：用BamHI和EcoRⅠ双酶切消化质粒载体pcDNA3.1/V5-His-C，反应体系为
酶切反应条件为37℃放置10h，然后将酶切产物用0.6%琼脂糖凝胶电泳，再用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到酶切后的载体pcDNA3.1/V5-His-C；
五、插入片段Obese’与经过双酶切的载体pcDNA3.1/V5-His-C连接，连接反应体系为
连接反应条件为16℃放置过夜，获得连接产物重组质粒pcDNA3.1/V5-His-C-Obese’；
六、重组质粒转染CHO：将构建好的重组质粒pcDNA3.1/V5-His-C-Obese’与质粒pDCH1P11混合，使用LipofeetmineTM 2000 Reagent共转染CHO-dhfr-细胞，在24孔板中进行转染，细胞达到95%融合时，将培养基更换为无抗生素、无血清的CHO-S-SFMⅡ，500μL/孔，转染6h后更换含100mL/L FBS、不含HT和NAA的CHO-S-SFMⅡ，继续培养48h，用ELISA试剂盒鉴定阳性转染的细胞按1:10传代，24h细胞贴壁后更换为不含HT和NAA、含G418 0.75mg/L和FBS 100mL/L的选择性培养基，培养14～16d后有阳性克隆形成，然后用定向消化的方法将阳性克隆转入24孔板，又传代至12孔板，经 ELISA试剂盒测定对阳性高表达的细胞克隆进行扩大培养；
七、MTX的加压培养：以MTX加压筛选，浓度依次为2×10-8 mmol/L、1×10-7 mmol/L和5×10-7mmol/L，最终得到能够在5×10-7 mmol/L的MTX中正常生长的CHO细胞株，即为高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株。
本实施方式步骤五挑取阳性菌落测序，阳性菌落包含SEQ ID NO：1所示序列，证明本实施方式设计的瘦素转基因DNA片段连接到载体上。
本实施方式步骤六中二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢细胞CHO-dhfr-用含100mL/L胎牛血清、NAA、1×HT的DMEM培养基培养。
本实施方式将人工设计的Obese’基因与真核表达质粒pcDNA3.1/V5-His-C重组构建的表达载体pcDNA3.1/V5-His-C-Obese’与含有dhfr基因的质粒pDCH1P11共转染入CHO-dhfr-，ELISA 检测到培养上清中重组蛋白的表达，对阳性表达的细胞进行G418筛选，对阳性克隆进行氨甲喋呤（MTX）加压扩增，获得高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株。
本实施方式步骤六中的选择性培养基为不含HT和NAA、含G418 0.75mg/L和FBS 100mL/L的无血清的CHO-S-SFMⅡ培养基。
本实施方式基因工程细胞株rhLeptin蛋白表达水平的ELISA检测：
将本实施方式高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株在初始细胞浓度为5×10-7 mmol/L、产业化细胞培养液（DMEM/F12(1:1)+14mmol/L柠檬酸铁+0.6mg/L硫酸锌+0.2g/L酵母水解物）中培养72 h的上清液用ELISA法测定蛋白含量，按说明书进行操作。本实施方式基因工程细胞株rhLeptin表达量为13mg/L。
利用本实施方式基因工程细胞株纯化分离rhLeptin的方法：
将产业化细胞培养液（DMEM/F12(1:1)+14mmol/L柠檬酸铁+0.6mg/L硫酸锌+0.2g/L酵母水解物）中培养的高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株的培养液经离心超滤后上柱Sepharose F.F[18mmol/L,pH7.0 PBS],0.15mol/L NaCI洗脱，收集峰值，用18mmol/L、pH7.1的Tris-Cl缓冲液透析过夜，上柱Q Sepharose F.F[18mmol/L,pH7.1的Tris-Cl]，0.15mol/L NaCI洗脱，收集峰值产物上柱Superdex75[pH7.1的Tris-Cl，100mmol/L NaCI]，收集峰值产物即得到rhLeptin。
rhLeptin纯度达99.8%以上。
本实施方式基因工程细胞株RT-PCR鉴定：
收集本实施方式高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株细胞，以Trizol进行总RNA提取，逆转后以引物P1和引物P2为引物进行PCR扩增。PCR反应条件为：95℃预变性5 min；94℃ 30 s，50℃30 s，72℃ 30 s，共30个循环；再72℃最终延伸5min。
引物P1 序列如SEQ ID NO：3所示，引物P2序列如SEQ ID NO：4所示.
未转染pcDNA3.1/V5-His-C-Obese’的CHO细胞进行扩增后无条带。由于CHO细胞自身并无瘦素mRNA形式存在，所以未转染细胞无相应片段被扩增。而本实施方式基因工程细胞株稳定的扩增出168bp的设计DNA片段，表明目的片段已完整的整合到CHO细胞中，有目的基因的转录。
本实施方式基因工程细胞株培养基上清液中分离得到的瘦素的体重调节实验：
将雌性ob/ob小鼠40只，以10只为一组，共分为4组。分别注射媒介物（0.7%生理盐水）、rhLeptin、Leptin（天然瘦素，obese基因编码表达产物）和L-肉碱，每天1mg、持续28天，每天记录小鼠的体重，实验结果如表1所示。本实施方式融合蛋白体重调节效果最为明显。
表1
| 0.7%生理盐水 | rhLeptin | Leptin | L-肉碱 | |
| 原始体重（g） | 57.6±0.6 | 59.7±0.8 | 58.7±0.7 | 57.8±0.8 |
| 28d后体重（g） | 56.6±0.5 | 51.2±0.8 | 51.5±0.8 | 50.8±0.7 |
| 体重改变（g） | -0.1 | -8.5 | -7.2 | -7.0 |
| P<d | 0.01 | 0.01 | 0.01 |
pcDNA3.1D/V5-His-C表达载体购自Invitrogen；ELISA检测试剂盒购自R&D公司。本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均购买获得，若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。
Claims (1)
1.高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株，其特征在于高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株按以下步骤制备：
一、设计瘦素转基因序列，基因序列如SEQ ID NO：1所示；
二、合成瘦素转基因DNA片段Obese’，再导入T载体中；
三、目的片段双酶切，用BamHI及EcoRⅠ双酶切消化T载体，反应体系为
酶切反应条件为37℃放置10h，然后将酶切产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，目的片段用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到插入片段Obese’；
四、质粒载体双酶切：用BamHI和EcoRⅠ双酶切消化质粒载体pcDNA3.1/V5-His-C，反应体系为
酶切反应条件为37℃放置10h，然后将酶切产物用0.6%琼脂糖凝胶电泳，再用DNA GEL EXTRACTION KIT纯化回收，得到酶切后的载体pcDNA3.1/V5-His-C；
五、插入片段Obese’与经过双酶切的载体pcDNA3.1/V5-His-C连接，连接反应体系为
连接反应条件为16℃放置过夜，获得连接产物重组质粒pcDNA3.1/V5-His-C-Obese’；
六、重组质粒转染CHO：将构建好的重组质粒pcDNA3.1/V5-His-C-Obese’与质粒pDCH1P11混合，使用LipofeetmineTM 2000 Reagent共转染CHO-dhfr-细胞，在24孔板中进行转染，细胞达到95%融合时，将培养基更换为无抗生素、无血清的CHO-S-SFMⅡ，500μL/孔，转染6h后更换含100mL/L FBS、不含HT和NAA的CHO-S-SFMⅡ，继续培养48h，用ELISA试剂盒鉴定阳性转染的细胞按1:10传代，24h细胞贴壁后更换为不含HT和NAA、含G418 0.75mg/L和FBS 100mL/L的选择性培养基，培养14～16d后有阳性克隆形成，然后用定向消化的方法将阳性克隆转入24孔板，又传代至12孔板，经 ELISA试剂盒测定对阳性高表达的细胞克隆进行扩大培养；
七、MTX的加压培养：以MTX加压筛选，浓度依次为2×10-8 mmol/L、1×10-7 mmol/L和5×10-7 mmol/L，最终得到能够在5×10-7 mmol/L的MTX中正常生长的CHO细胞株，即为高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210534876.5A CN102965342B (zh) | 2012-12-12 | 2012-12-12 | 高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210534876.5A CN102965342B (zh) | 2012-12-12 | 2012-12-12 | 高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102965342A CN102965342A (zh) | 2013-03-13 |
| CN102965342B true CN102965342B (zh) | 2014-06-25 |
Family
ID=47795778
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210534876.5A Expired - Fee Related CN102965342B (zh) | 2012-12-12 | 2012-12-12 | 高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102965342B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106318970B (zh) * | 2016-08-18 | 2019-06-25 | 广东东阳光药业有限公司 | 一种CHO-Dhfr表达系统细胞株的高通量筛选方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101012453A (zh) * | 2006-10-12 | 2007-08-08 | 南开大学 | 高效表达rhBMP2的CHO细胞株及其建立方法 |
| CN102264908A (zh) * | 2008-12-22 | 2011-11-30 | 力奇制药公司 | 哺乳动物表达载体 |
| CN102348715A (zh) * | 2009-02-03 | 2012-02-08 | 阿穆尼克斯运营公司 | 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007018619A2 (en) * | 2005-07-29 | 2007-02-15 | Amprotein Corporation | Chimeric therapeutic agents |
-
2012
- 2012-12-12 CN CN201210534876.5A patent/CN102965342B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101012453A (zh) * | 2006-10-12 | 2007-08-08 | 南开大学 | 高效表达rhBMP2的CHO细胞株及其建立方法 |
| CN102264908A (zh) * | 2008-12-22 | 2011-11-30 | 力奇制药公司 | 哺乳动物表达载体 |
| CN102348715A (zh) * | 2009-02-03 | 2012-02-08 | 阿穆尼克斯运营公司 | 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 张永亮等.生长激素释放因子在CHO细胞的表达.《中国兽医学报》.2002,(第01期), |
| 生长激素释放因子在CHO细胞的表达;张永亮等;《中国兽医学报》;20020130(第01期);53-55 * |
| 组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)突变体工程细胞株生物学特性分析;陈琳等;《实验生物学报》;19980615(第02期);111-115 * |
| 陈琳等.组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)突变体工程细胞株生物学特性分析.《实验生物学报》.1998,(第02期), |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102965342A (zh) | 2013-03-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102295695B (zh) | 重组人促卵泡激素及其制备 | |
| CN102321588A (zh) | 高效分泌表达AcAPc2的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株 | |
| CN102558362A (zh) | 一种用于治疗糖尿病的融合蛋白及其制备方法 | |
| CN103923207B (zh) | 一种fgf-21突变体蛋白的制备及其在治疗非酒精性脂肪肝中的应用 | |
| CN101134105B (zh) | 用于治疗和/或预防脑梗塞的含有重组人胰激肽原酶的药物组合物 | |
| CN102358893A (zh) | 高效分泌表达AcAP5的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株 | |
| CN101892241B (zh) | 一种草鱼白细胞介素1β基因和蛋白及其重组表达方法 | |
| CN103757026A (zh) | FGFR2b胞外段的基因序列、多肽及其应用 | |
| CN103710367B (zh) | 一种重组人激肽释放酶1及其编码基因和制备方法 | |
| CN102965342B (zh) | 高效分泌表达瘦素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株 | |
| CN101665798B (zh) | 一种制备重组人血清白蛋白与干扰素α融合蛋白的方法 | |
| CN101134953B (zh) | 重组人胰激肽原酶 | |
| CN101967468A (zh) | 一种重组人胰激肽原酶 | |
| CN104745613B (zh) | 一种人激肽释放酶及其编码基因和应用制备方法 | |
| CN102978165B (zh) | 高效分泌表达芋螺毒素的中国仓鼠卵巢基因工程细胞株 | |
| CN101130775A (zh) | 一种新的信号芋螺毒素序列、制备方法及其应用 | |
| CN101649340A (zh) | 人白细胞介素18的制备方法 | |
| CN102786589A (zh) | 重组人促卵泡成熟素rFSH及其基因工程菌株 | |
| CN103936865B (zh) | 一种抗血栓融合蛋白及编码该融合蛋白的基因 | |
| CN101891812B (zh) | 力生长因子多肽及其制备方法和用途 | |
| CN100535005C (zh) | 长链人胰岛素样生长因子(lr3igf-1)及其制备和应用方法 | |
| CN104178494A (zh) | 一种人白介素2的制备工艺及其应用 | |
| CN101298607A (zh) | 重组人促卵泡生长激素的生产方法 | |
| CN102533825A (zh) | 一种重组羧肽酶b的制备方法 | |
| CN1277921C (zh) | 利用基因工程技术在家蚕体内生产重组人乳铁蛋白的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140625 Termination date: 20151212 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |