CN101130775A - 一种新的信号芋螺毒素序列、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的信号芋螺毒素序列、制备方法及其应用。从中国南海信号芋螺毒管中分离得到的核苷酸序列如序列表中<400>1序列所示，以及含有上述基因编码的氨基酸序列、或其保守性变异多肽序列或其活性衍生物的多肽。该多肽的生产方法是：将成熟肽基因克隆到原核融合表达载体pTRX上，构建表达质粒并转化大肠杆菌BL21(DE3)；培养并进行超声裂解，将表达产物的裂解液层析得到融合蛋白；后经3C蛋白酶切割、离子交换层析和反相高效液相层析，得到重组Lt15.1多肽的成熟肽。本发明的目的在于提供一种具有新的半胱氨酸骨架的中国南海信号芋螺毒素基因Lt15.1及其编码的多肽片段lt15a，并为制备神经生物学研究的工具药和治疗多种疾病的药物提供数据。

Description

一种新的信号芋螺毒素序列、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种中国南海信号芋螺毒素基因Lt15.1及其编码的多肽序列lt15a和该多肽的制备技术，以及该毒素在神经生物学研究和离子通道药物开发中的应用。

背景技术

芋螺属于软体动物门，腹足纲，芋螺科(Conidae)，多数栖息在热带海洋的浅海水域，因外形呈圆锥形或芋头状而得名，表面常有各色花纹，壳口窄长。芋螺是比较年轻的生物，化石记录证明芋螺属最早出现于始新世(Eocene)，中生代(mesozoic)时期海洋捕食性软体动物菊石的消失客观上促进了芋螺的第一次大规模的物种形成。芋螺的第二次大规模的辐射始于中新世(Miocene)，基本上持续到现在(Terlau and Olivera，2004)。

芋螺具有强大的自然进化能力，全球有约700种芋螺，芋螺是海洋无脊椎动物中进化最成功的生物之一。芋螺虽然种类很多，但他们都是食肉动物，靠毒液来捕食，根据其捕食习性可分为食鱼芋螺(piscivorous)、食螺芋螺(molluscivorous)、食虫芋螺(vermivorous)。食虫性芋螺种类最多，占全部芋螺种类的70％左右。三种芋螺中食鱼芋螺毒液的毒性最高，食虫芋螺的毒性最低。

芋螺毒液是芋螺捕食与防御的主要武器，它是由许多单一毒肽组成的鸡尾酒样的混合毒素，称为芋螺毒素(Conotoxin)。芋螺毒素通常为由7～41个氨基酸残基组成的小分子多肽。大多富含半胱氨酸，具有高度保守的二硫键骨架。与蜘蛛、蝎、蛇、海葵等许多动物的毒素比较(40～80个氨基酸左右)，芋螺毒素的肽链短得多，富含二硫键，分子结构更为紧密，生物活性更高。大多数芋螺毒素均由单一的mRNA编码，原始的翻译产物是一种特定的多肽前体，约为70-100个氨基酸残基，经蛋白酶水解后得到成熟肽。这些成熟肽分别选择性的作用于钙、钠、钾离子通道，或者乙酰胆碱、NMDA、5-羟色胺等受体，许多已经成为神经生理学研究的工具药。但是，目前已知的芋螺毒素大多是从食鱼芋螺中分离得到，食虫芋螺的毒液研究的相对较少。

二十世纪八十年代初，美国犹它大学Olivera BM学者实验室最早开展了芋螺毒素全面系统研究工作。芋螺毒素按照其结构特点(前体肽中N端高度保守的信号肽区和C端的二硫键骨架)，可分为不同的超家族。至今已经得到分离的芋螺毒素有近千种，数十种芋螺毒素已申请美国专利。它们在镇痛、局部缺血性保护、癫痫治疗、某些疾病诊断和受体研究中具有广泛的应用价值，有的已进入临床研究或已被FDA正式批准为治疗新药，用作特异诊断试剂和镇痛药。目前，由Elan公司进行开发的ω-CTX M VIIA(SNXIII，商品名：Ziconotide)，因其直接作用分布于神经组织的N-型钙离子通道，无需第二信使或蛋白，不成瘾，已成为治疗难治性神经疼痛的新一代药物，已通过了III期临床试验，正式被FDA批准上市。而另一个衍生于ω-CTX C VID的化合物AM336作用类似于Ziconotide，因其对N-钙通道的选择性更强，副作用更低，已经批准作为对抗严重抗吗啡作用慢性疼痛的治疗药物进入临床试验阶段。此外，Conantokin-G作为NMDA受体高度选择性的拮抗剂，对难以治疗的癫痫有效，也已完成I期临床试验。

另一方面，芋螺毒素作为研究离子通道和膜受体的极好探针或工具，已经成为电压门控型钙离子通道(VSCCs)和N型乙酰胆碱受体(nAChRs)等通道、受体鉴定和诊断的标准工具，在神经药理学领域得到了广泛的应用。

芋螺在我国南海海域有广泛分布，已查明的芋螺约有80余种，主要分布在台湾、广东、广西、海南诸省以及西沙和南沙群岛等。近年来国内也开展了芋螺毒素的生物化学、分子生物学以及药理作用等方面的研究工作。陈冀胜等人自桶形芋螺(C.betulinus)、独特芋螺(C.caracteristileus)、菖蒲芋螺(C.vexillum)、地纹芋螺等类芋螺中分离鉴定了十余种新序列的芋螺毒素。卢柏松、黄培堂以及戴秋云等从我国的线纹芋螺、织锦芋螺中也发现了一些新的毒素成分和基因序列。热带农业大学彭世清、罗素兰等已从菖蒲芋螺基因组中克隆到两个新芋螺毒素基因；同时还从海南产的大理石芋螺(C.marmoreus)、幻芋螺(C.magus)、等共12个种中分别发现了具有药用功能的35种O-超家族芋螺毒素及其基因。虽然我国有着丰富的芋螺资源，但目前对于芋螺毒素的研究尚处于初期阶段，有着广阔的研究空间和开发前景。

由于芋螺毒素在其基因序列和蛋白质结构及功能方面差异较大，具有种类繁多，结构复杂和高度遗传多样性特征。构建信号芋螺毒管cDNA文库可以系统地研究食虫芋螺的毒素组成、表达谱，发现新的食虫芋螺特有的毒素序列。迄今为止，国外已构建了多种芋螺的cDNA文库，中国南海信号芋螺是一种食虫性芋螺，世界上尚没有关于它的毒素研究的报道。

另外，目前有关芋螺毒素的生化结构及其神经药理活性的研究都是基于天然提取毒素的分子结构，用人工合成的毒素来研究的。虽然已克隆到很多芋螺毒素基因，但目前鲜有芋螺毒素基因体外表达的报道。重组芋螺毒素将以其质优、价廉的优势，代替产率低、成本昂贵的人工合成毒素。开展芋螺毒素体外表达技术的研究，将具有非常重要的理论研究价值和应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有新的半胱氨酸骨架的中国南海信号芋螺毒素基因Lt15.1及其编码的多肽片段lt15a。

本发明的另一目的在于提供该多肽的生产方法。

本发明的第三个目的在于提供了用全细胞膜片钳技术考察了该多肽对大鼠DRG细胞钠电流的抑制作用，从而为制备神经生物学研究的工具药和治疗心律失常、顽痛、癫痫以及中风等疾病药物提供数据。

通过cDNA文库的构建和测序的方法，从中国南海信号芋螺毒管中分离得到具有新的半胱氨酸骨架的芋螺毒素Lt15.1基因，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。

上述本发明基因所编码的多肽lt15a，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示；其成熟肽的分子量为4,266.8道尔顿，其理论等电点为6.79。

该蛋白通过原核细胞融合表达载体pTRX在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达。

所述表达载体pTRX(我实验室自行构建并申请专利，专利名称为：一种高效原核表达载体，专利申请号：ZL 00124832.4)是以硫氧还蛋白为融合伴体，中间插入His的亲和标记位点及蛋白酶3C识别位点的高效表达载体。

该重组信号芋螺毒素lt15a能增加钠通道电流的开放时间，同时降低钠电流峰值。

本发明所选择的信号芋螺采自海南省三亚市。

信号芋螺毒管cDNA文库的构建：取活螺体，使用喉闸破碎螺壳，暴露出螺肉，冰上小心并快速分离毒管组织，提取总RNA。反转录为一链cDNA后合成双链cDNA，双链cDNA与pMD18T载体连接后转化E.coli，并保存每个重组克隆。

本发明通过对文库重组克隆大规模序列测定，从中得到了1个新的编码芋螺毒素的克隆，命名为Lt15.1(其DNA序列如序列表中<400>1序列所示)。新基因编码86个氨基酸残基，包括有23个氨基酸的信号肽、26个氨基酸的前导肽和37个氨基酸的成熟肽。其信号肽序列和成熟肽的半胱氨酸排布与O-超家族芋螺毒素其它成员具有较高的保守性。前导肽和成熟肽的氨基酸与δ-家族芋螺毒素成员相似性更高。成熟肽段分子量为4,266.8道尔顿，其理论等电点为6.79。

本发明通过设计了一对引物，将编码新毒素lt15a的成熟肽基因克隆到原核融合表达载体pTRX上(本实验构建)，构建表达质粒并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)。此表达载体(pTRX-lt15.1)以T7为启动子，TRX为分子融合伴体，帮助重组蛋白正确折叠，以可溶的形式表达，TRX的C端有柔链区和6×His结构，便于利用固定化金属配体亲和层析进行纯化。所设计的上游引物含有蛋白酶3C位点，利于外源蛋白单体的获得。通过对培养时间，诱导时间，温度等条件的摸索和优化，TRX-lt15.1融合蛋白的表达量较高，绝大部分处于可溶状态。

电生理实验结果证实，重组线纹芋螺毒素lt15a能增加钠通道电流的开放时间，同时降低钠电流峰值，可作为探针用于离子通道类型及亚型的分类鉴定或者用于工具药的研究开发，用于制备神经生物学研究的工具药和治疗心律失常、顽痛、癫痫以及中风等疾病的药物。

本发明的表达质粒复制方法：参照Sambrook(Sambrook，et al.1989，Moleculardoing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，用CaCl₂的方法将质粒转化E.coli.DH5或BL21(DE3)菌株，用含氨苄青霉素(100

g/mL)的LB培养基培养转化菌株，碱法提取质粒。

附图说明

图1为信号芋螺毒素lt15a与MEKL家族的序列比对

图2为信号芋螺毒素lt15a与桶形芋螺和瘦弱芋螺毒管Bt15a和Ec15a的前体肽序列比对

图3为PCR扩增Lt15.1基因2％琼脂糖凝胶电泳分析结果。

1：扩增到的Lt15.1基因；2：扩增的Bt15.1；3：扩增的Ec15.1；4：DL2000DNA分子量标准；

图4为融合表达质粒pTRX-Lt15.1的构建流程示意图。

图5为以T7启动子为引物对pTRX-Lt15.1重组表达载体进行序列测定

图6为融和蛋白pTRX-lt15.1镍金属离子亲和层析各组分的SDS-PAGE分析

1：TRX-lt15a全蛋白；2：TRX-lt15a可溶上清；3：Ni²⁺亲和层析穿透峰；4：20mM咪唑洗脱峰；5：50mM咪唑洗脱峰；6：100mM咪唑洗脱峰；7：150mM咪唑洗脱峰

图7为重组蛋白lt15a Sephadex G50分子筛层析图谱

1：峰1未切割的融合蛋白；2：峰2TRX；3：峰3重组芋螺毒素lt15a；4：峰4DTT和酶切缓冲液等成分

图8为重组蛋白lt15a Sephadex G50分子筛各组分Tricine SDS-PAGE电泳结果

1：G50的峰2组分(TRX)；2：G50的峰3组分(lt15a)3：G50的峰4组分(DTT和酶切缓冲液)4：3C酶切融合蛋白TRX-lt15a结果；5：G50的峰3组分(lt15a)；6：分子量标准

图9为重组蛋白lt15a电喷雾质谱鉴定结果

图10为重组蛋白lt15a对DRG细胞钠峰值电流-电压关系的影响

用药前，用药5min，10min，15min四个时间的I/V曲线叠加比较

图11芋螺毒素lt15a作用前后钠离子通道最大开放曲线单指数参数和绘制的拟合曲线

具体实施方式

以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1：信号芋螺毒管cDNA文库的构建和鉴定：

总RNA的提取和cDNA合成：分离中国南海信号芋螺毒管，参照Gibco BRL公司的TRIZOL LS试剂说明书进行毒管总RNA提取。取1μg信号芋螺毒管总RNA以                               SMART                        IIIolignuclotide(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3’)和CDSIII/3’PCR引物(5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)₃₀N_-1N-3’)进行逆转录合成第一链，得到10μl cDNA第一链产物。

信号芋螺毒管cDNA文库的构建和鉴定：取cDNA1.5

l用于连接反应，转化后涂板。从平板中挑取单克隆保种并随机挑取一定数目的单克隆进行测序和生物信息学分析。

实施例2：信号芋螺毒素Lt15.1基因的序列分析

南海信号芋螺神经毒素基因Lt15.1的质粒和序列来自中国南海信号芋螺毒管cDNA文库中所克隆到EST序列，编码Lt15.1的EST序列共5条，占总EST序列(576)的0.8％，在文库中出现的频率很低，估计对应的天然蛋白含量相对较低。Lt15.1编码一个86个氨基酸的前体肽(包括23aa的信号肽，26aa的前导肽和37aa的成熟肽)，SignalP预测的信号肽部分与O超家族中MEKL家族具有很高的同源性，但是成熟肽部分与MEKL家族采用的-C-C-CC-C-C-半胱氨酸骨架完全不同，(见图1)是一种全新的尚未从其他芋螺毒素中发现的骨架-C-C-CC-C-C-C-C-。我们将这个新半胱氨酸骨架命名为XV类骨架。把信号芋螺毒素Lt15.1与从桶形芋螺和瘦弱芋螺毒管克隆到的毒素Bt15a和Ec15a的前体肽序列比对，发现属于同一种XV类骨架，具有高度同源性。(见图2)

实施例3：重组信号芋螺毒素Lt15.1表达质粒的构建

根据Lt15.1基因编码成熟蛋白的氨基酸序列和大肠杆菌的密码子偏好性，设计并合成PCR反应的模板，并结合pTRX质粒(我实验室自行构建并申请专利，专利名称为：一种高效原核表达载体，专利申请号：ZL00124832.4)的多克隆位点，设计Lt15.1基因片段的扩增引物，如下所示。在上游引物中引入Kpn I酶切位点以及ProScission Protease切割位点，下游引物中引入NotI酶切位点及双终止密码子。PCR产物经Kpn I和Not I酶切与pTRX载体相连后，TRX基因、6个组氨酸序列、蛋白酶PreScission Protease识别位点序列、Lt15.1基因编码成熟蛋白的核苷酸序列和终止子TTATAA融合在一起，并构成一个完整的读码框。

TRX-Lt15.1(3C)upper primer：

5’CGGGGTACCCTGGAAGTTCTGTTCCAGGGGCCCGAATGCACAACTAAGCATCGGC3′

Kpn I    Precision Protease site         Lt15.1

TRX-Lt15.1(3C)lower primer：

5’ATTTGCGGCCGC TTA TTAAGGTTTACATTTATAACCAGACTG3’

         NotI   stop codon               Lt15.1

以文库中含Lt15.1的pcDNA3质粒为DNA模板，经PCR扩增出的片段(含限制性内切酶酶切位点和蛋白酶PreScission Protease识别序列)约为150bp，与预期PCR产物大小一致。(见图3)扩增产物用Kpn I和Not I酶切后，克隆进线性载体pTRX，构建融合表达质粒pTRX-Lt15.1。(构建过程见图4)。对重组质粒进行双向测序，其序列与合成的模板序列结果完全一致，说明合成的引物与PCR扩增的Lt15.1基因无误，插入表达载体的Lt15.1基因的读码框正确。(见图5)

实施例4：重组信号芋螺毒素Lt15.1的表达

将pTRX-Lt15.1转化大肠杆菌E.coli.BL21(DE3)。用CaCl₂法制备大肠杆菌E.coli.BL21(DE3)的感受态，在40ul大肠杆菌感受态细胞中加入1ul提取的pTRX-Lt15.1质粒DNA，混匀冰浴1小时，42℃热击90秒，加入1ml SOC溶液复苏后涂到含有100ug/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，37℃培养12小时，当长出菌落后挑取单菌，进行检测。构建好的基因工程菌超声裂解上清液经SDS-PAGE电泳分析表明，菌体经0.1mmol/L IPTG，19℃低温诱导后有明显的特异表达产物带，分子量与软件预测的理论值18kD相符(见图6)。

实施例5：重组信号芋螺毒素TRX-Lt15.1的纯化

将诱导表达后的培养菌液在4℃，6,000rpm/min离心5分钟，菌体先用TE缓冲液(pH8.0)重悬，离心，再用预冷的50mmol/LTris-HCl(pH8.0)，500mmol/LNaCl溶液洗涤菌体，超声处理后，裂解上清液经Ni²⁺Chelating Sepharose亲和色谱层析一步纯化。收集穿流峰，分别用不同浓度咪唑(20mmol/L、50mmol/L、150mmol/L)的50mM Tris(pH8.0)，500mmol/L NaCl缓冲液洗脱至平台期，分别收集洗脱峰进行Tricine SDS-PAGE检测。结果表明，重组TRX-Lt15.1蛋白主要集中于50-100mmol/L的咪唑洗脱峰中，在100mmol/L咪唑洗脱峰中融合蛋白的含量达70％以上(见图6)。

实施例6：重组信号芋螺毒素Lt15.1酶切后纯化

通过Ni²⁺Chelating Sepharose Fast Flow亲和层析所得到的纯化的融合蛋白，进行3C酶酶切。酶切条件为：50mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，1mmol/LEDTA，1mmol/L DTT(pH8.0)酶切缓冲液中20℃酶切作用3hr。

融合蛋白酶切后lt15a分子量为4.4KD左右，而伴体蛋白TRX的分子量为13.8KD，没有切开的融和蛋白的分子量为18KD左右，三种蛋白的分子量差别较大，因此可采用分子筛效应根据蛋白分子量的大小将蛋白分开，得到纯化的目的蛋白。Sepharose G50分子筛的分离范围为1.5kD-30kD，因此我们采用SepharoseG50纯化酶切后的目的蛋白。

Sepharose G50分子筛用50mM NH₄CO₃平衡，融合蛋白酶切后直接上样到G50，5cm×100cm的XK50柱上样50毫升，流速2.5ml/min。设定自动收集程序，收集各蛋白紫外吸收峰，取样进行18％SDS-PAGE电泳检测。G50分子筛层析图谱见图7，Tricine SDS-PAGE电泳结果见图8。电泳结果显示G50分子筛层析的第二个峰是酶切下来的TRX伴体，第三个峰为目的蛋白lt15a

实施例7：电喷雾质谱重组rlt15a分子量和纯度

质谱图见图9

根据公式：M1＝(M+n)/n

M2＝(M+n+1)/(n+1)

(其中M1，M2为相邻两个质谱峰的荷质比值)

取前两个峰和后两个峰分别得到的分子量为：4412.4和4412.7，与重组蛋白rlt15a的计算分子量4413.0相一致，说明纯化到的蛋白确实是rlt15a。荷质比为883.7，1104.1，1471.9的三个峰是分别带5+，4+，3+价的完整蛋白分子离子，说明纯化得到的重组rlt15a纯度很高，不含其他杂质分子。

实施例8：重组信号芋螺毒素lt15a对钠离子通道的作用

选用细胞表面光滑的大鼠背根神经节(DRG)细胞进行全细胞电流膜片钳实验。对照组和实验组分别记录的是使用4μM毒素前后在梯度去极化条件下的全细胞钠电流。细胞钳制电压为-70mV，刺激电压为-80mV到+30mV，步阶为10mV，刺激电压脉冲宽度为150mS。由I/V曲线可见(见图10)，在3个时间点记录的电流电压关系与用药前相比：1)电流的激活电压都是-40mV没变，但是最大电流的电压发生了变化，对照和用药5分钟均在-20mV达到最大值，而用药10、15分钟最大电流在-10mV才达到；2)在-20mV的电压下，峰值电流随时间的延长减少，由最初的2460pA减少到688pA。3)电流的翻转电位发生了改变，对照组与用药5分钟在30mV的电压下还没有翻转过来，用药10分钟翻转电位为25mV，用药15分钟变为了15mV，翻转电位的变化趋势是变小。

拟合曲线如图11。结果显示lt15a能增加钠通电流的开放时间，同时降低钠峰值电流。

                            序列表

<110>中山大学

<120>一种新的信号芋螺毒素序列、制备方法及其应用

<160>3

<210>1

<211>258

<212>DNA

<213>中国南信号芋螺(Conus litterarus)

<400>1

atg gag aaa ctt aca atc ctg att ctt gtt gcc act gtc ctg ttg    45

Met Glu Lys Leu Thr Ile Leu Ile Leu Val Ala Thr Val Leu Leu

1               5                   10                  15

gcg atc cag gtc ctg gtt caa agt gac gga gaa aac cct gtg aag    90

Ala Ile Gln Val Leu Val Gln Ser Asp Gly Glu Asn Pro Val Lys

                20                  25                  30

ggg agg gtc aaa cac tat gca gcg aaa cgt ttc tcg gca ctc ttc    135

Gly Arg Val Lys His Tyr Ala Ala Lys Arg Phe Ser Ala Leu Phe

                35                  40                  45

aga ggg cca cgc gaa tgc aca act aag cat cgg cgt tgt gaa aag    180

Arg Gly Pro Arg Glu Cys Thr Thr Lys His Arg Arg Cys Glu Lys

                50                  55                  60

gat gag gaa tgt tgc cca aat ctt gag tgt aaa tgc tta acc agt    225

Asp Glu Glu Cys Cys Pro A sn Leu Glu Cys Lys Cys Leu Thr Ser

                65                   70                  75

cct gat tgc cag tct ggt tat aaa tgt aaa cct                    258

Pro Asp Cys Gln Ser Gly Tyr Lys Cys Lys Pro

                80                  85

<210>2

<211>86

<212>PRT

<213>中国南海信号芋螺(Conus litteratus)

<220>

<221>precursor peptide

<222>(1)...(86)

<400>2

Met Glu Lys Leu Thr Ile Leu Ile Leu Val Ala Thr Val Leu Leu

1               5                   10                  15

Ala Ile Gln Val Leu Val Gln Ser Asp Gly Glu Asn Pro Val Lys

                20                  25                  30

Gly Arg Val Lys His Tyr Ala Ala Lys Arg Phe Ser Ala Leu Phe

                35                  40                  45

Arg Gly Pro Arg Glu Cys Thr Thr Lys His Arg Arg Cys Glu Lys

                50                  55                  60

Asp Glu Glu Cys Cys Pro Asn Leu Glu Cys Lys Cys Leu Thr Ser

                65                  70                  75

Pro Asp Cys Gln Ser Gly Tyr Lys Cys Lys Pro

                80                  85

<210>3

<211>37

<212>PRT

<213>中国南海信号芋螺(Conus litteratus)

<220>

<221>成熟肽

<222>(1)...(37)

<400>3

Glu Cys Thr Thr Lys His Arg Arg Cys Glu Lys Asp Glu Glu Cys

1               5                   10                  15

Cys Pro Asn Leu Glu Cys Lys Cys Leu Thr Ser Pro Asp Cys Gln

                20                  25                  30

Ser Gly Tyr Lys Cys Lys Pro

                35

Claims (6)

1.从中国南海信号芋螺毒管中分离得到的核苷酸序列，其核苷酸序列如序列表中<400>1序列所示。

2.一种多肽，其含有权利要求1所述基因编码的氨基酸序列、或其保守性变异多肽序列或其活性衍生物。

3.按权利要求2所述的多肽，其特征在于：该多肽的氨基酸序列如序列表400<2>所示。

4.权利要求3所述的多肽的成熟肽片段，其氨基酸序列如序列表400<3>所示。

5.权利要求4所述的多肽的生产方法，按照以下步骤进行：

(1)将编码权利要求4所述的成熟肽基因克隆到原核融合表达载体pTRX上，构建表达质粒并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)；

(2)培养转化后的大肠杆菌BL21(DE3)；

(3)对大肠杆菌BL21(DE3)进行超声裂解，将表达产物的裂解液经Ni²⁺Chelating Sepharose亲和色谱层析，得到融合蛋白；

(4)融合蛋白经3C蛋白酶切割、离子交换层析和反相高效液相层析，得到重组Lt15.1多肽的成熟肽。

6.权利要求2、3、或4所述多肽用于离子通道类型的检测和神经生物学工具药物的应用。

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