CN114560922A - 一种串联多拷贝酵母生物合成芋螺毒素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种串联多拷贝酵母生物合成芋螺毒素的方法。本发明将进行过密码子偏爱性优化人工合成的芋螺毒素基因，通过编码蛋白酶切位点的碱基对连接，从而形成串联多拷贝基因，并将其克隆至带有sfGFP筛选信号的表达载体，转入酵母后获得表达芋螺毒素的酵母工程菌，制备芋螺毒素。本发明采用的多拷贝串联表达技术能较为有效的提高酵母表达芋螺毒素的产量，并且对芋螺毒素的生物活性无显著影响，安全性极高，所得到的表达产物可用于制备治疗神经性等疾病的潜在药物。

Description

一种串联多拷贝酵母生物合成芋螺毒素的方法
技术领域
本发明涉及芋螺毒素生物合成的方法，尤其涉及一种串联多拷贝酵母生物合成芋螺毒素的方法，属于芋螺毒素的基因工程制备领域。
背景技术
芋螺毒素（Conotoxins），是芋螺在捕食时所使用的毒素的统称，其种类繁多，且能对神经系统表面多种受体产生影响，已成为药理学和神经科学中有力的工具。目前，无论时通过化学合成或者生物合成，所获得的芋螺毒素产量都无法满足实际使用中的需求，且化学合成的成本很高。本发明采用芋螺毒素成熟肽基因，将其通过编码蛋白酶切位点的序列连接形成多拷贝基因，再连接真核生物的信号肽，构建酵母表达的重组质粒，建立酵母表达系统用于获取芋螺毒素。
发明内容
本发明的目的在于提供一种串联多拷贝酵母生物合成芋螺毒素的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
1）GenBank 中检索获得芋螺毒素成熟肽基因，按照毕赤酵母对遗传密码子的偏爱性对反翻译芋螺毒素成熟肽基因进行密码子优化，并将多个密码子优化后的成熟肽基因拷贝通过中间加入含有编译蛋白酶切割位点的碱基序列串联连接；
2）重组产生的多拷贝芋螺毒素基因克隆至pPink-HC-MF-GFP质粒中；
3）重组表达载体转入毕赤酵母中，筛选重组酵母表达菌；
4）对同源重组成功的毕赤酵母进行诱导表达，从而得到分泌表达的多拷贝芋螺毒素融合蛋白；
5）通过使用蛋白酶对纯化过后的多拷贝芋螺毒素融合蛋白进行酶切，并再次纯化。
其中，所述的芋螺毒素基因的核苷酸序列可以是任何一种芋螺毒素基因的核苷酸序列。核苷酸序列是通过酵母密码子偏爱优化后的核苷酸序列。所使用的编码蛋白酶切位点的序列可以是任何一种蛋白酶切位点序列，多拷贝基因中的串联拷贝数目是6个拷贝以内。
所述的带有sfGFP标签的表达载体为pPink-HC，超折叠绿色荧光蛋白（superfolder green fluorescent protein，sfGFP），sfGFP 是无毒的，它可在不同的有机体中，高水平地予以表达，而对有机体的生理学影响很小的。此外，GFP与目的蛋白融合表达时可保持其荧光的发射能力，对目的蛋白活性影响小。酵母表达系统是目前基因工程中成熟的表达方法。本发明采用了载体作为蛋白表达载体,该载体的特点是带有sfGFP标签，会产生sfGFP和目的蛋白的融合蛋白。此外，sfGFP上游或下游带有任意的蛋白酶切位点。
该融合蛋白的序列中，芋螺毒素既可以融合GFP蛋白后，也可以在GFP蛋白前；GFP和连接部分的氨基酸序列允许有多种突变。
所述的酵母重组表达载体构建包括以下内容：pPinK-HC载体的酶切及酶切产物回收；芋螺毒素序列和载体的连接；连接产物的鉴定。连接产物的鉴定包括制备感受态细胞、转化反应、重组质粒提取和鉴定。
针对于大部分芋螺毒素二硫键较多，存在翻译后修饰的特点，本发明选用毕赤酵母为宿主菌。毕赤酵母具有真核生物特有的蛋白高效分泌表达，翻译后修饰，因此，近年来毕赤酵母成为表达外源目的蛋白，特别是真核来源的外源蛋白的高效表达系统。
本发明对测序鉴定后质粒,酶切线性化后电转化prb1和pep4双蛋白酶缺陷型毕赤酵母感受态细胞，转化后的细胞涂布于Pichia Adenine Dropout Agar（PAD）平板，挑选单克隆，对克隆进行小量发酵培养，对酵母菌检测荧光，发酵液采用15% SDS-PAGE分离后，胶上直接观察荧光，以获得表达芋螺毒素的毕赤酵母工程菌。
发酵液蛋白经Ni-NTA琼脂糖树脂亲和层析后，使用相应的蛋白酶进行切割，再对所的到的芋螺毒素纯化，采用CCK8测试蛋白活性，结果显示其抑制昆虫细胞系sf9生长，具有细胞毒性。
本发明的有益效果在于：
（1）芋螺毒素保守估计有5万种，而仅有两三个芋螺毒素在酵母中可直接表达成功，表明芋螺毒素在酵母中直接表达成功率极低。这可能原因是芋螺肽分子量小，具有毒性，表达量极低或易被宿主降解。本发明采用酵母表达芋螺毒素时，加入sfGFP作为荧光筛选信号，同时其可作为保护蛋白与芋螺毒素融合表达，成功制备芋螺毒素，通过串联多拷贝的方式，将芋螺毒素表达产量提高多倍。该技术具有通用性，作为一个芋螺毒素表达平台，可将不同的芋螺毒素在酵母中成功表达。
（2）本发明采用基因工程技术，构建sfGFP融合蛋白的质粒，以毕赤酵母为宿主，成功表达多拷贝串联芋螺毒素与GFP的融合蛋白。通过进一步酶切GFP后，获得芋螺毒素小肽，进行药物研发。本发明制备芋螺毒素的方法具有通用性强、表达效率较高、具有生物活性、成本低、易规模化生产等优点。
（3）本发明相较于芋螺毒素的单拷贝表达，使得芋螺毒素的产量提高2-4倍，且并未增加生产工序，生产成本基本与单拷贝表达持平。
附图说明
图1：酵母表达的SrIA*2-GFP，SrIA*4-GFP，SrIA*6-GFP蛋白。
图2：芋螺肽酶切后的sfGFP抗体免疫印迹检测酶切情况。小带为切下来的sfGFP。泳道M为marker，泳道0为未切割的融合蛋白，泳道1为1UrTEV蛋白酶切割后的融合蛋白，泳道2为2UrTEV蛋白酶切割后的融合蛋白。
图3：芋螺肽对Sf9细胞增殖的抑制作用。误差条（Error bar）表示平均值±SD标准偏差（n = 3）；测试组对比与阴性对照GFP组，用Graphad prism 8进行Student’s t-test显著性分析，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。
图4：芋螺肽对斑马鱼胚胎发育(48h)致死的影响。 A，对照组， B，芋螺肽处理组。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
本发明中所述的YPDS培养基是由酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，山梨醇1M，加水至1L，121℃灭菌20分钟制成。
本发明中所述的PAD固体培养基是由马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g，加水至1L，121℃灭菌20分钟制成。
本发明中所述的BMMY培养基是由酵母粉10g、蛋白胨20g、KH2PO4 11.8g、K2HPO43g，加水至890mL，121℃灭菌20分钟，温度降至60℃以下时加入浓度13.4g/L过滤灭菌的YNB溶液100mL、0.4mg/L的生物素溶液1mL、甲醇5mL，混匀制成。
实施例1
SrIA*2，SrIA*4，SrIA*6多拷贝基因的全合成
根据GenBank检索获得SrIA蛋白序列（RTCCSROTCRM(Gla)YP(Gla)LCG(nh2)），优化为酵母菌偏爱的密码子基因片段并将其串联，在相邻两拷贝之间加入编码TEV蛋白酶酶切位点的序列（GAAAACTTGTACTTCCAAGGT），最后在基因序列两端引入限制性酶切位点Sph I、Stu I。
实施例2
对pPink-HC质粒进行改造：首先将分泌信号a-mating facter，插入到经EcoR I和Sph I双酶切的质粒pPink-HC，将质粒改造成分泌表达质粒pPink-HC-MF；其次加入sfGFP，作为筛选信号。具体操作是将PCR扩增的sfGFP插入到经Stu I和Fse I双酶切的pPink-HC-MF中，成功构建pPink-HC-MF-GFP；其中a-mating facter，sfGFP序列分别如下：
a-mating facter：
atgagatttccttcaatttttactgcagttttattcgcagcatcctccgcattagctgctccagtcaacactacaacagaagatgaaacggcacaaattccggctgaagctgtcatcggttacttagatttagaaggggatttcgatgttgctgttttgccattttccaacagcacaaataacgggttattgtttataaatactactattgccagcattgctgctaaagaagaaggggtatctttggataaaaga；
sfGFP：
TCCAAAGGAGAAGAGCTGTTCACTGGGGTTGTACCCATTTTGGTAGAACTGGACGGAGATGTAAACGGACATAAATTCTCTGTTAGAGGTGAGGGCGAAGGCGATGCCACCAATGGTAAATTGACTCTGAAGTTTATATGCACTACGGGTAAATTACCTGTTCCTTGGCCAACCCTAGTAACAACTTTGACATATGGTGTTCAATGTTTCTCAAGATACCCAGACCATATGAAAAGGCATGATTTCTTTAAAAGTGCTATGCCAGAAGGCTACGTGCAAGAGAGAACTATCTCCTTTAAGGATGACGGTACGTATAAAACACGAGCAGAAGTGAAATTCGAAGGGGATACACTAGTTAATCGCATCGAATTAAAGGGTATAGACTTTAAGGAAGATGGTAATATTCTCGGCCATAAACTTGAGTATAATTTCAACTCGCATAATGTGTACATTACAGCTGACAAACAAAAGAACGGAATTAAAGCGAATTTTAAAATCAGGCACAACGTCGAAGATGGGTCTGTTCAACTTGCCGATCATTATCAGCAAAACACCCCTATTGGTGATGGTCCAGTCTTGTTACCCGATAATCACTACTTAAGCACACAGTCTAGATTGTCAAAAGATCCGAATGAAAAGCGTGATCACATGGTTTTATTGGAATTTGTCACCGCTGCAGGAATAACTCACGGCATGGACGAGCTGTACAAG。
（2）重组融合蛋白SrIA*2，SrIA*4，SrIA*6表达载体的构建
采用采用限制性内切酶SphI、StuI双酶切的pPink-MF-HC-GFP（本实验室构建）。胶回收后的产物分别与合成的SrIA*2，SrIA*4，SrIA*6基因用T4 DNA连接酶连接，转入感受态E.coli DH5α。挑选单克隆，采用PCR及测序进行质粒阳性鉴定。
实施例3
重组酵母菌的诱导表达及检测
将80 µl prb1和pep4双蛋白酶缺陷型毕赤酵母感受态细胞和5µg EcoN I线性化后的质粒混合后转移至电转杯中，冰浴5min 。电击后立刻向电转杯加入1ml YPDS培养基，上下摇动混匀。28℃培养2h。混均后，吸取300µl 菌液涂布在PAD固体培养基平板上，在28℃培养3~7d。挑取3-8个白色且菌落大的单克隆，再一次在PAD固体培养基平板上面划线，28℃培养3~7 d，将构建表达质粒转入PichiaPink Strain 4。挑取单菌落接入，30℃，280rpm振荡培养。培养菌体浓度至OD600=2~6，更换为BMMY培养基。每隔24h，补加终浓度为0.5wt%的甲醇。发酵120h，收集的上清液，通过SDS-PAGE凝胶分析。酵母成功表达SrIA*2，SrIA*4，SrIA*6融合蛋白，且不同拷贝数间蛋白量无明显差异（图1）。
实施例4
蛋白的纯化及酶切
收集发酵液的上清液，采用Ni-NTA-琼脂糖凝胶柱进行纯化，0.3M 咪唑溶液(pH3.0)洗脱，收集洗脱液。使用nanodrop测定洗脱液OD280，使用TEV蛋白酶对蛋白进行酶切，在50μL体系中，加入融合蛋白和TEV蛋白酶使其OD280比值为10：1，体系中加入5μLTEVbuffer（500mM Tris-HCl, 500mM NaCl, 5mM EDTA, 10mM DTT, pH8.0），在4℃条件下反应14h。对酶切后的融合蛋白进行SDS-PAGE凝胶检测切除溴酚蓝条带。采用GBox Chemi XT4荧光化学发光成像系统（Gene company limited）观察胶上荧光。通过TEV蛋白酶处理后的SrIA*2，SrIA*4，SrIA*6融合蛋白，均由单一条带变为两条带，表明TEV蛋白酶成功将SrIA蛋白与sfGFP切割，但随着拷贝数的提升切割效率下降，表明通过串联多拷贝的方式成功的增加了酵母表达生产芋螺毒素的产量（图2）。
实施例 5
多拷贝表达产量与单拷贝表达产量的比较
分别取不同拷贝数的芋螺毒素表达菌株在相同情况下进行发酵（采用BMMY培养基进行发酵，初始OD600为2-6，转速250rpm，每隔24h添加培养基总量的2%的甲醇，共发酵7d）。取部分上清进行SDS-PAGE检测，以此衡量其融合蛋白产量，分别对等量不同拷贝数的融合蛋白进行酶切，检测不同拷贝数酶切后产物的百分比，以融合蛋白产量和酶切后产物百分比乘积作为最终芋螺毒素产量，衡量不同芋螺毒素拷贝数表达产量。
表1不同拷贝数SrIA芋螺毒素产量对比
Figure DEST_PATH_IMAGE001
实施例 6
CCK-8法检测细胞增殖：
取对数生长期sf9细胞制成单细胞悬液, 调整浓度为1×105个/mL, 以100 μL /孔接种于 96孔板中，置于27 ℃细胞培养箱中培养24 h。待细胞贴壁生长，弃去培养液，芋螺毒素设置成不同终浓度处理细胞, 其中0 μg/mL作为对照组。同时设立不加细胞的空白对照孔。细胞转置27 ℃培养箱中培养24 h，加入10 μL CCK-8工作液，孵育2 h，在酶标仪450 nm处测定各孔的吸光值(A)。计算抑制率：抑制率（%）=[1- (处理组A值-空白对照组A值) / (对照组A值-空白对照组A值) ]×100% 结果显示（图3），芋螺毒素抑制昆虫细胞系sf9细胞生长。
斑马鱼胚胎染毒对芋螺肽活性检测：
取成年斑马鱼进行交配，收集鱼卵，按照每孔30枚鱼卵将鱼卵置于6孔板中，每孔加入2.7mL E3buffer，鱼卵分配好后，分别在每孔加入不同含有不同浓度芋螺毒素的E3buffer使终浓度达到10μM，做好标签，放入28℃培养箱中。由于分配鱼卵所需要的时间不同，实际处理的开始时间为1-2hpf。每隔24h对胚胎进行处理液的更换，以免由于水质导致的胚胎大量死亡，将每孔中的处理液吸净后在显微镜下对胚胎进行观察，记录下胚胎的发育情况，出膜率及死亡率，将死卵和其他杂质吸出后，再重新加入处理液。当用10μM芋螺毒素对胚胎进行染毒时，处理组胚胎在72hpf时完全死亡，通过与对照组在不同时间段胚胎发育情况的观察，尤其是48hpf时对照组和芋螺肽Lt14A染毒斑马鱼胚胎对比可以得出（图4），10μM芋螺毒素对胚胎的发育产生影响，使得斑马鱼胚胎无法正常的分化，最终导致大量细胞凋亡，而使胚胎最终死，故染毒处理仅进行到72h。（应注意，当染毒处理过晚或芋螺毒素浓度较低时胚胎仍可发育为幼鱼，且在死亡率并无显著区别，仅仅使染毒胚胎在对应时间出膜率大于对照组）。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 一种串联多拷贝酵母生物合成芋螺毒素的方法
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 255
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60
ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120
tacttagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180
aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240
tctttggata aaaga 255
<210> 2
<211> 711
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tccaaaggag aagagctgtt cactggggtt gtacccattt tggtagaact ggacggagat 60
gtaaacggac ataaattctc tgttagaggt gagggcgaag gcgatgccac caatggtaaa 120
ttgactctga agtttatatg cactacgggt aaattacctg ttccttggcc aaccctagta 180
acaactttga catatggtgt tcaatgtttc tcaagatacc cagaccatat gaaaaggcat 240
gatttcttta aaagtgctat gccagaaggc tacgtgcaag agagaactat ctcctttaag 300
gatgacggta cgtataaaac acgagcagaa gtgaaattcg aaggggatac actagttaat 360
cgcatcgaat taaagggtat agactttaag gaagatggta atattctcgg ccataaactt 420
gagtataatt tcaactcgca taatgtgtac attacagctg acaaacaaaa gaacggaatt 480
aaagcgaatt ttaaaatcag gcacaacgtc gaagatgggt ctgttcaact tgccgatcat 540
tatcagcaaa acacccctat tggtgatggt ccagtcttgt tacccgataa tcactactta 600
agcacacagt ctagattgtc aaaagatccg aatgaaaagc gtgatcacat ggttttattg 660
gaatttgtca ccgctgcagg aataactcac ggcatggacg agctgtacaa g 711

Claims (2)

1.一种在毕赤酵母中串联多拷贝基因表达芋螺毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）在GenBank中检索获得芋螺毒素成熟肽基因，按照毕赤酵母对遗传密码子的偏爱性对反翻译芋螺毒素成熟肽基因进行密码子优化，并将多个密码子优化后的成熟肽基因拷贝通过中间加入含有编译蛋白酶切割位点的碱基序列串联连接；
2）重组产生的多拷贝芋螺毒素基因克隆至pPink-HC-MF-GFP质粒中；
3）重组表达载体转入毕赤酵母中，筛选重组酵母表达菌；
4）对同源重组成功的毕赤酵母进行诱导表达，得到分泌表达的多拷贝芋螺毒素融合蛋白；
5）使用蛋白酶对纯化过后的多拷贝芋螺毒素融合蛋白进行酶切，并再次纯化。
2.一种如权利要求1所述方法所得到的芋螺毒素在制备神经性疾病药物中的应用。
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