CN113136349A - 一种高效表达不同来源肌红蛋白/血红蛋白毕赤酵母重组菌株的构建 - Google Patents

一种高效表达不同来源肌红蛋白/血红蛋白毕赤酵母重组菌株的构建 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高效表达不同来源肌红蛋白/血红蛋白毕赤酵母重组菌株的构建，属于基因工程技术领域。本发明首先实现了不同动植物来源的肌红蛋白/血红蛋白在毕赤酵母中的高效分泌表达，构建得到表达猪肌红蛋白、牛肌红蛋白、三叶草血红蛋白、大豆血红蛋白以及猪血红蛋白β单亚基的重组菌，在摇瓶条件下产量分别达到42.0mg/L、20.0mg/L、5.0mg/L、100.0mg/L与1.0mg/L；并进一步优化猪肌红蛋白在毕赤酵母中的分泌表达体系，最终构建得到的重组菌株X33‑△ku70‑△yps1‑1‑MB菌株48h摇瓶发酵产量达到69.0mg/L，较对照提高了59.4％。本发明有利于不同来源肌红蛋白/血红蛋白在人造肉等在食品加工领域的应用及进一步发展。

Description

一种高效表达不同来源肌红蛋白/血红蛋白毕赤酵母重组菌 株的构建
技术领域
本发明涉及一种高效表达不同来源肌红蛋白/血红蛋白毕赤酵母重组菌株的构建技术，属于基因工程技术领域。
背景技术
血红蛋白是自然界中普遍存在的血红素结合蛋白，在生物体中具有补铁、运输氧、呼吸等重要的生理功能，更赋予了肌肉组织鲜红的颜色。近年来，随着人造肉制品的兴起，为了模拟真肉的颜色和风味，需要在产品中添加血红蛋白。除此之外，肌红蛋白也被证实和真肉的肉色形成存在密切的关系。因此，随着在人造肉领域中越来越广泛的应用，国内外市场对肌红蛋白/血红蛋白的需求量也在不断增加。
肌红蛋白/血红蛋白的获取主要有两种途径。第一，从畜禽血中提取，但是这种方法由于需要使用多种有害化学试剂且提取工艺复杂，并不适合大规模工业化生产。第二，利用微生物细胞工厂异源合成血红蛋白。由于生物合成法具有低成本、条件温和、环境友好等优点，因此成为肌红蛋白/血红蛋白合成的首选方法。
毕赤酵母以其具有显著优势的蛋白表达系统(高效分泌、低蛋白糖基化以及高密度培养等)，被广泛应用于食品与制药领域。与常见的细菌宿主大肠杆菌相比，具有完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力。毕赤酵母表达合成系统是较早被开发的真核基因表达体系，目前已成功实现了动植物、细菌、病毒、真菌等外源基因的表达。因此，应用毕赤酵母表达系统来合成动植物来源的肌红蛋白/血红蛋白是最佳的选择。
目前，利用毕赤酵母虽然可以实现大豆血红蛋白的合成，但由于采用的是胞内表达形式产率较低且不易于纯化(纯度<65％)，应用于人造肉食品的添加存在一定的安全隐患；而其它不同来源的肌红蛋白/血红蛋白(猪肌红蛋白、牛肌红蛋白、三叶草血红蛋白或猪血红蛋白)在毕赤酵母中的合成还未见报道。
发明内容
针对目前存在的问题，本发明首先在毕赤酵母中尝试分泌表达不同来源的肌红蛋白/血红蛋白(猪肌红蛋白、牛肌红蛋白、三叶草血红蛋白、大豆血红蛋白或猪血红蛋白)；然后对猪肌红蛋白分泌表达体系进行优化(表达载体、发酵时间、毕赤酵母表达宿主、基因拷贝数以及重组蛋白促溶标签)，敲除毕赤酵母发酵过程中主要降解重组蛋白的蛋白酶基因(pep4、yps1-1与prb1)，从而进一步提高猪肌红蛋白的分泌表达量，由于蛋白分泌至胞外，简化了蛋白分离、纯化的过程。
本发明的第一个目的是提供一种重组菌，所述重组菌是利用毕赤酵母异源表达单拷贝、双拷贝或三拷贝的肌红蛋白或血红蛋白，所述肌红蛋白来源于但不限于猪、牛，所述血红蛋白来源于但不限于三叶草、大豆或猪。
在一种实施方式中，所述毕赤酵母也可替换为其它同源性接近的酵母属菌种，包括但不限于毕赤酵母突变株和葡萄汁酵母(S.uvarum)。
在一种实施方式中，以毕赤酵母X33、毕赤酵母KM71、毕赤酵母SMD1168或毕赤酵母GS115为宿主；所述肌红蛋白或血红蛋白以pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC或pPIC9K为表达载体。
在一种实施方式中，编码猪肌红蛋白MB基因的Gene ID:397467；编码牛肌红蛋白MB基因的Gene ID:280695；编码三叶草血红蛋白HB基因的GenBank:GAU42437.1；编码大豆血红蛋白c2基因的Gene ID:100527379；编码猪血红蛋白α亚基HBA1基因的Gene ID:110259958、β亚基HBB基因的Gene ID:407066。
在一种实施方式中，密码子优化后的编码猪肌红蛋白MB基因、编码牛肌红蛋白MB基因、编码三叶草血红蛋白HB基因、编码大豆血红蛋白c2基因、编码猪血红蛋白α亚基HBA1基因、编码猪血红蛋白β亚基HBB基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示。
在一种实施方式中，所述重组菌还包括如(a)～(c)所述的一种或多种特征：
(a)将所述肌红蛋白或血红蛋白与促溶标签Sumo、GST、MBP、TF、TrxA或NusA融合表达；
(b)敲除毕赤酵母基因组中的ku70基因，所述ku70基因的GeneID:8199462；
(c)敲除毕赤酵母基因组中的蛋白酶基因pep4、yps1-1、prb1中的一个或多个。
在一种实施方式中，利用促溶标签Sumo、GST、MBP、TF、TrxA或NusA与目的蛋白融合表达。
在一种实施方式中所述促溶标签为MBP、TrxA或NusA。
在一种实施方式中，在敲除毕赤酵母基因组中ku70基因的同时，还敲除了蛋白酶基因pep4、yps1-1、prb1中的一种或多种。
在一种实施方式中，敲除pep4、yps1-1或prb1；或者，同时敲除pep4和yps1-1；或者，同时敲除pep4、yps1-1和prb1。
在一种实施方式中，所述蛋白酶基因pep4的GeneID:8200047，所述蛋白酶基因yps1-1的GeneID:8196641，所述蛋白酶基因prb1的GeneID:8196728。
本发明的第二个目的是提供一种胞外表达肌红蛋白或血红蛋白的方法，所述方法是利用所述重组菌发酵生产肌红蛋白或血红蛋白。
在一种实施方式中，将所述重组菌在YPD培养基中培养至OD600＝2～6，收集细胞，用发酵培养基重悬细胞，在25～35℃、100～600rpm下发酵24～120h。
在一种实施方式中，初始发酵时培养基中含有终浓度为10～50mg/L的血红素。
在一种实施方式中，每24h添加一次甲醇，使得甲醇在发酵体系中的终浓度为1％(v/v)。
在一种实施方式中，所述发酵培养基包括但不限于YNB、YPD、BMM或BMMY培养基。
本发明的第三个目的是提供提升肌红蛋白或血红蛋白表达量的方法，是利用毕赤酵母异源表达单拷贝的肌红蛋白基因或血红蛋白基因。
在一种实施方式中，所述毕赤酵母为毕赤酵母X33。
在一种实施方式中，将促溶标签Sumo、GST、MBP、TF、TrxA或NusA与目的蛋白融合表达。
在一种实施方式中，将MBP、NusA或TrxA与目的蛋白融合表达。
在一种实施方式中，敲除毕赤酵母X33基因组中的ku70基因，所述ku70基因的GeneID:8199462。
在一种实施方式中，敲除毕赤酵母X33基因组中的蛋白酶基因pep4、yps1-1、prb1中的一个或多个。
在一种实施方式中，敲除pep4、yps1-1或prb1；或者，同时敲除pep4和yps1-1；或者，同时敲除pep4、yps1-1和prb1。
本发明的第四个目的是提供所述重组菌在制备肌红蛋白或血红蛋白或其衍生物中的应用。
有益效果：本发明首先实现了不同动植物来源的肌红蛋白/血红蛋白在毕赤酵母中的高效表达，构建得到的基因工程菌X33-pPICZαA-MB(Sus scrofa)、GS115-pPIC9K-MB(Bos Taurus)、X33-pPICZαA-HB(Trifolium subterraneum)、X33-pPICZαA-c2(Soybean)与X33-pPICZαA-HBB(Porcine)菌株在最优发酵时间下，摇瓶发酵产量分别达到42.0mg/L、20.0mg/L、5.0mg/L、100.0mg/L与1.0mg/L。
然后在毕赤酵母表达系统的基础上，优化了猪肌红蛋白在毕赤酵母中的分泌表达体系(最优表达载体pPICZαA、最优发酵时间48h、最优毕赤酵母表达宿主X33、最优基因拷贝数为单拷贝、最优重组蛋白促溶标签TrxA)，敲除毕赤酵母基因组上编码主要蛋白酶的基因(pep4、yps1-1或prb1)，所得猪肌红蛋白最佳基因工程菌株X33-△ku70-△yps1-1-MB菌株48h摇瓶发酵产量达到69.0mg/L，较对照提高了59.4％。本发明为不同来源肌红蛋白/血红蛋白在人造肉等食品加工领域的应用奠定了基础。
附图说明
图1为不同来源肌红蛋白/血红蛋白毕赤酵母重组菌株摇瓶发酵SDS-PAGE分析图；泳道1～5分别为发酵上清液X33-pPICZαA-MB(24h),X33-pPICZαA-MB(48h),X33-pPICZαA-MB(72h),X33-pPICZαA-MB(96h)，marker；泳道6～10分别为marker，发酵液上清GS115-pPIC9K-MB(48h)，GS115-pPIC9K-MB(72h)，GS115-pPIC9K-MB(96h)，GS115-pPIC9K-MB(120h)；泳道11～12分别为marker，发酵液上清X33-pPICZαA-HB(48h)；Lane 13～15，marker，发酵液上清X33-pPICZαA-c2-1(48h)，X33-pPICZαA-c2-2(48h)；泳道16～18分别为marker，X33-pPICZαA-HBB(48h发酵上清液)，X33-pPICZαA-HBB(His-Tag法纯化48h发酵液上清液中的蛋白质)。
图2为不同宿主的猪肌红蛋白毕赤酵母重组菌株构建示意图。
图3为不同宿主的猪肌红蛋白毕赤酵母重组菌株摇瓶发酵SDS-PAGE分析图；泳道1～9分别为发酵上清X33-pPICZαA-His6-TEV site-MB(48h)，KM71-pPICZαA-His6-TEVsite-MB(48h)，SMD1168-pPICZαA-His6-TEV site-MB(48h)，GS115-pPICZαA-His6-TEVsite-MB(48h)，X33(48h)，KM71(48h)，SMD1168(48h)，GS115(48h)，marker；Lane 10～14，His-Tag纯化发酵液上清中蛋白X33-pPICZαA-His6-TEV site-MB(48h)，KM71-pPICZαA-His6-TEV site-MB(48h)，SMD1168-pPICZαA-His6-TEV site-MB(48h)，GS115-pPICZαA-His6-TEV site-MB(48h)，marker。
图4为不同猪肌红蛋白基因拷贝数毕赤酵母X33重组菌株构建示意图。
图5为不同猪肌红蛋白基因拷贝数毕赤酵母X33重组菌株摇瓶发酵SDS-PAGE分析图；泳道1～4分别为marker，发酵液上清X33-PIC-pAOX1-MB-pAOX1-MB-pAOX1-MB(48h)，X33-PIC-pAOX1-MB-pAOX1-MB(48h)，X33-pPICZαA-MB(X33-PIC-pAOX1-MB,48h)。
图6为添加或无促溶标签-猪肌红蛋白融合表达毕赤酵母X33重组菌株构建示意图。
图7为添加或无促溶标签-猪肌红蛋白融合表达毕赤酵母X33重组菌株摇瓶发酵SDS-PAGE分析图；泳道1～8分别为marker，发酵液上清X33-pPICZαA-His6-Sumo-TEV site-MB(48h)，X33-pPICZαA-His6-GST-TEV site-MB(48h)，X33-pPICZαA-His6-MBP-TEV site-MB(48h)，X33-pPICZαA-His6-TF-TEV site-MB(48h)，X33-pPICZαA-His6-TrxA-TEV site-MB(48h)，X33-pPICZαA-His6-NusA-TEV site-MB(48h)，X33-pPICZαA-His6-TEV site-MB(对照，48h)；泳道9～16分别为marker，His-Tag纯化发酵液上清中蛋白X33-pPICZαA-His6-Sumo-TEV site-MB(48h)，X33-pPICZαA-His6-TrxA-TEV site-MB(48h)，X33-pPICZαA-His6-GST-TEV site-MB(48h)，X33-pPICZαA-His6-MBP-TEV site-MB(48h)，X33-pPICZαA-His6-TF-TEV site-MB(48h)，X33-pPICZαA-His6-NusA-TEV site-MB(48h)，X33-pPICZαA-His6-TEV site-MB(对照，48h)；泳道17～19分别为marker，X33-pPICZαA-His6-TrxA-Factor Xa site-MB(48h)，X33-pPICZαA-His6-TrxA-Factor Xa site-MB(Factor Xa酶切除标签)。
图8为毕赤酵母X33-△ku70菌株的构建图；泳道1～3分别为X33-△ku70，X33-ku70，DNA marker。
图9为毕赤酵母X33-△ku70不同蛋白酶敲除菌株的构建图；泳道1～7分别为DNAmarker，X33-△ku70-prb1，X33-△ku70-△prb1，X33-△ku70-yps1-1，X33-△ku70-△yps1-1，X33-△ku70-pep4，X33-△ku70-△pep4。
图10为猪肌红蛋白毕赤酵母不同蛋白酶敲除菌株摇瓶发酵SDS-PAGE分析图；泳道1-8分别为发酵液上清X33-△ku70-△pep4-MB-1(48h)，X33-△ku70-△yps1-1-MB-1(48h)，X33-△ku70-△prb1-MB-1(48h)，marker，X33-△ku70-△pep4-△yps1-1-MB-1(48h)，X33-△ku70-△pep4-△yps1-1-△prb1-MB-1(48h)，X33-pPICZαA-His6-TEV site-MB-1(对照，48h)，毕赤酵母X33；泳道9-16分别为发酵液上清X33-△ku70-△pep4-MB-2(48h)，X33-△ku70-△yps1-1-MB-2(48h)，X33-△ku70-△prb1-MB-2(48h)，X33-△ku70-△pep4-△yps1-1-MB-2(48h)，X33-△ku70-△pep4-△yps1-1-△prb1-MB-2(48h)，X33-pPICZαA-His6-TEVsite-MB-2(对照，48h)，marker，毕赤酵母X33；Lane 17-24，发酵液上清X33-△ku70-△pep4-MB-3(48h)，X33-△ku70-△yps1-1-MB-3(48h)，X33-△ku70-△prb1-MB-3(48h)，X33-△ku70-△pep4-△yps1-1-MB-3(48h)，X33-△ku70-△pep4-△yps1-1-△prb1-MB-3(48h)，X33-pPICZαA-His6-TEV site-MB-3(对照，48h)，毕赤酵母X33，marker。
具体实施方式
LLB液体培养基：10g/L胰蛋白胨(Tryptone)、5g/L酵母粉(Yeast Extract)、5g/LNaCl，121℃灭菌20min，用于大肠杆菌的培养。
LLB固体培养基：LLB液体培养基中添加20g/L琼脂粉，用于大肠杆菌的培养与筛选。
YPD液体培养基：20g/L胰蛋白胨(Tryptone)、10g/L酵母粉(Yeast Extract)、2％葡萄糖，115℃灭菌25min，用于毕赤酵母的培养。
YPD固体培养基：YPD液体培养基中添加20g/L琼脂粉，用于毕赤酵母的划线分离、培养与筛选。
BMMY(1L)：1％酵母粉、2％胰蛋白胨、100mM磷酸钾pH 6.0、1.34％YNB、4×10-5％生物素、1％甲醇。
实施例1不同来源的肌红蛋白/血红蛋白在毕赤酵母中的分泌表达
依次按以下步骤进行：
1.将不同来源的肌红蛋白/血红蛋白基因(猪肌红蛋白MB基因的Gene ID:397467；牛肌红蛋白MB基因的Gene ID:280695；三叶草血红蛋白HB基因的GenBank:GAU42437.1；大豆血红蛋白c2基因的Gene ID:100527379；猪血红蛋白α亚基HBA1基因的Gene ID:110259958、β亚基HBB基因的Gene ID:407066)进行密码子优化，获得相应的优化后基因序列(分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6所示)。将优化后的基因与表达载体连接(所述表达载体为pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC或pPIC9K)，以电转法转化至毕赤酵母菌株中(X33、KM71、SMD1168或GS115)。经菌落PCR和测序验证后，获得正确阳性克隆菌株，分别为X33-pPICZαA-MB(猪肌红蛋白MB基因)、GS115-pPIC9K-MB(牛肌红蛋白MB基因)、X33-pPICZαA-HB(三叶草血红蛋白HB基因)、X33-pPICZαA-c2(大豆血红蛋白c2基因)、X33-pPICZαA-HBB(猪血红蛋白β亚基HBB基因)。
2.不同来源肌红蛋白/血红蛋白毕赤酵母重组菌株摇瓶发酵(50mL/250mL)验证：将构建好的菌株进行划线培养，培养2～3天至长出单菌落。挑取单菌落，接种至YPD培养基(50mL/250mL)中，30℃、100～600rpm摇至OD600＝2～6；4℃、1500～3000g离心5～10min，生理盐水洗涤细胞两次，去除培养基中的葡萄糖。离心后的全部菌体用50mL BMMY培养基重悬，在30℃、100～600rpm下发酵(发酵初在培养基中添加终浓度为20mg/L的血红素)，每24h，添加甲醇至终浓度为1％(v/v)以继续诱导，分别在发酵24h、48h、72h、96h、120h取发酵液。
3.SDS-PAGE分析：根据Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定发酵上清液中蛋白含量，以及利用Image Lab软件进行灰度分析，X33-pPICZαA-MB(Sus scrofa)、GS115-pPIC9K-MB(Bos Taurus)、X33-pPICZαA-HB(Trifolium subterraneum)、X33-pPICZαA-c2(Soybean)与X33-pPICZαA-HBB(Porcine)菌株在最优发酵时间下(GS115-pPIC9K-MB为120h，其余菌株均为48h)摇瓶发酵产量分别达到42.0mg/L、20.0mg/L、5.0mg/L、100.0mg/L与1.0mg/L(图1)。
实施例2猪肌红蛋白在不同毕赤酵母宿主中的分泌表达
依次按以下步骤进行(图2)：
1.重组质粒的构建：将质粒pPICZαA双酶切(XhoI与SacII)后的片段pPICZαA-XhoI-SacII与His6-TEV site-MB片段进行Gibson组装连接(His6-TEV site-MB片段即为His6+TEV site+MB总的核苷酸序列，His6核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；TEV核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示)，然后转化到DH5α感受态中，涂布于相应抗性(20μg/mL Zeocin)的LLB平板上，经过菌落PCR验证与测序后，获得重组大肠杆菌pPICZαA-His6-TEV site-MB。
2.毕赤酵母电转化：将构建正确的pPICZαA-His6-TEV site-MB质粒线性化，制备毕赤酵母X33、KM71、SMD1168与GS115电转感受态，按照毕赤酵母操作手册中的电转方法，将pPICZαA-His6-TEV site-MB质粒整合到毕赤酵母基因组上，涂布于相应抗性(100μg/mLZeocin)的YPD平板上，经过菌落PCR验证与测序后，分别获得重组毕赤酵母X33-pPICZαA-His6-TEV site-MB、KM71-pPICZαA-His6-TEV site-MB、SMD1168-pPICZαA-His6-TEV site-MB、GS115-pPICZαA-His6-TEV site-MB菌株。
3.重组菌株摇瓶发酵验证：具体实施方式参见实施例1中摇瓶发酵方法。
4.His-Tag蛋白纯化：利用海狸组氨酸标签蛋白纯化磁珠对发酵上清液中的蛋白进行纯化(图3)，具体操作步骤参考海狸镍离子螯合磁珠操作手册。
5.SDS-PAGE分析：根据Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定发酵上清液中蛋白含量，以及利用Image Lab软件进行灰度分析，X33-pPICZαA-His6-TEV site-MB、KM71-pPICZαA-His6-TEV site-MB、SMD1168-pPICZαA-His6-TEV site-MB、GS115-pPICZαA-His6-TEVsite-MB菌株48h摇瓶发酵产量分别达到42.0mg/L、28.3mg/L、22.0mg/L与35.0mg/L，结果表明：在相同发酵时间48h下，野生型X33明显有利于猪肌红蛋白分泌表达，且His-Tag蛋白纯化效果较好(图3)。
实施例3不同基因拷贝数的猪肌红蛋白在毕赤酵母X33中的分泌表达
依次按以下步骤进行(图4)：
1.双拷贝猪肌红蛋白重组质粒的构建：将实施例1中构建的pPICZαA-MB质粒分别进行单酶切(BamHI)与双酶切(BamHI与BglII)，将单酶切后的片段pPICZαA-MB-BamHI磷酸化，并利用T4连接酶(Solution I)将酶切后的pPICZαA-MB-BamHI-BglII片段(目的片段2.1kb、杂带片段2.7kb)与磷酸化的pPICZαA-MB-BamHI片段进行连接，然后转化到DH5α感受态中，涂布于相应抗性(20μg/mL Zeocin)的LLB平板上，经过菌落PCR验证与测序后，获得重组大肠杆菌PIC-pAOX1-MB-pAOX1-MB。
2.三拷贝猪肌红蛋白重组质粒的构建：将上述构建成功的双拷贝猪肌红蛋白重组质粒PIC-pAOX1-MB-pAOX1-MB进行双酶切(BamHI与BglII)，并利用T4连接酶(Solution I)将酶切后的PIC-pAOX1-MB-pAOX1-MB-BamHI-BglII片段(目的片段4.2kb、杂带片段2.7kb)与磷酸化的pPICZαA-MB-BamHI片段进行连接，然后转化到DH5α感受态中，涂布于相应抗性(20μg/mL Zeocin)的LLB平板上，经过菌落PCR验证与测序后，获得重组大肠杆菌PIC-pAOX1-MB-pAOX1-MB-pAOX1-MB。
3.毕赤酵母电转化：将构建正确的双拷贝PIC-pAOX1-MB-pAOX1-MB重组质粒与三拷贝PIC-pAOX1-MB-pAOX1-MB-pAOX1-MB重组质粒线性化，制备毕赤酵母X33电转感受态，按照毕赤酵母操作手册中的电转方法，将双拷贝PIC-pAOX1-MB-pAOX1-MB重组质粒与三拷贝PIC-pAOX1-MB-pAOX1-MB-pAOX1-MB重组质粒整合到毕赤酵母基因组上，涂布于相应抗性(100μg/mL Zeocin)的YPD平板上，通过菌落PCR与测序验证，获得重组毕赤酵母X33-PIC-pAOX1-MB-pAOX1-MB与X33-PIC-pAOX1-MB-pAOX1-MB-pAOX1-MB菌株。
4.X33-PIC-pAOX1-MB-pAOX1-MB与X33-PIC-pAOX1-MB-pAOX1-MB-pAOX1-MB菌株摇瓶发酵验证：具体实施方式参见实施例1中摇瓶发酵方法。
5.SDS-PAGE分析：根据Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定发酵上清液中蛋白含量，以及利用Image Lab软件进行灰度分析，单拷贝菌株X33-pPICZαA-MB(X33-PIC-pAOX1-MB)与双拷贝菌株X33-PIC-pAOX1-MB-pAOX1-MB的猪肌红蛋白表达量几乎相同(48h摇瓶发酵产量约在42.0mg/L)，而三拷贝菌株X33-PIC-pAOX1-MB-pAOX1-MB-pAOX1-MB(泳道2)却不分泌表达猪肌红蛋白(图5)，可能是增加剂量的AOX1启动子调节的表达盒会导致甲醇利用基因的转录减弱，甲醇消耗率降低，可能会减少目标蛋白的翻译，也有可能是大量表达的异源蛋白对分泌途径造成压力，导致未折叠的蛋白质反应(UPR)上调，并导致蛋白质降解，从而导致分泌饱和，结果表明：单拷贝菌株即可满足猪肌红蛋白的分泌表达。
实施例4添加促溶标签促进猪肌红蛋白分泌表达
依次按以下步骤进行(图6)：
1.促溶标签-猪肌红蛋白融合表达重组质粒的构建：将质粒pPICZαA双酶切(XhoI与SacII)后的片段pPICZαA-XhoI-SacII、PCR分别扩增得到的片段His6-Sumo-TEV site、His6-GST-TEV site、His6-MBP-TEV site、His6-TF-TEV site、His6-TrxA-TEV site、His6-NusA-TEV site(不同重组蛋白促溶标签核苷酸序列如SEQ ID NO.7～NO.12所示)、PCR扩增得到的猪肌红蛋白基因MB片段进行Gibson组装连接，然后转化到DH5α感受态中，涂布于相应抗性(20μg/mL Zeocin)的LLB平板上，经过菌落PCR验证与测序后，分别获得重组大肠杆菌pPICZαA-His6-Sumo-TEV site-MB、pPICZαA-His6-GST-TEV site-MB、pPICZαA-His6-MBP-TEV site-MB、pPICZαA-His6-TF-TEV site-MB、pPICZαA-His6-TrxA-TEV site-MB、pPICZαA-His6-NusA-TEV site-MB。
2.无促溶标签猪肌红蛋白表达重组质粒的构建(对照)：将质粒pPICZαA双酶切(XhoI与SacII)后的片段pPICZαA-XhoI-SacII与PCR扩增得到的His6-TEV site-MB片段进行Gibson组装连接，然后转化到DH5α感受态中，涂布于相应抗性(20μg/mL Zeocin)的LLB平板上，经过菌落PCR验证与测序后，获得重组大肠杆菌pPICZαA-His6-TEV site-MB。
3.毕赤酵母电转化：将构建正确的pPICZαA-His6-Sumo-TEV site-MB、pPICZαA-His6-GST-TEV site-MB、pPICZαA-His6-MBP-TEV site-MB、pPICZαA-His6-TF-TEV site-MB、pPICZαA-His6-TrxA-TEV site-MB、pPICZαA-His6-NusA-TEV site-MB与pPICZαA-His6-TEV site-MB质粒线性化，制备毕赤酵母X33电转感受态，按照毕赤酵母操作手册中的电转方法，将质粒pPICZαA-His6-Sumo-TEV site-MB、pPICZαA-His6-GST-TEV site-MB、pPICZαA-His6-MBP-TEV site-MB、pPICZαA-His6-TF-TEV site-MB、pPICZαA-His6-TrxA-TEVsite-MB、pPICZαA-His6-NusA-TEV site-MB以及pPICZαA-His6-TEV site-MB质粒分别转化至毕赤酵母中，整合到毕赤酵母基因组上，涂布于相应抗性(100μg/mL Zeocin)的YPD平板上，通过菌落PCR与测序验证，获得重组毕赤酵母X33-pPICZαA-His6-Sumo-TEV site-MB、X33-pPICZαA-His6-GST-TEV site-MB、X33-pPICZαA-His6-MBP-TEV site-MB、X33-pPICZαA-His6-TF-TEV site-MB、X33-pPICZαA-His6-TrxA-TEV site-MB、X33-pPICZαA-His6-NusA-TEV site-MB与X33-pPICZαA-His6-TEV site-MB菌株(对照)。
4.X33-pPICZαA-His6-Sumo-TEV site-MB、X33-pPICZαA-His6-GST-TEV site-MB、X33-pPICZαA-His6-MBP-TEV site-MB、X33-pPICZαA-His6-TF-TEV site-MB、X33-pPICZαA-His6-TrxA-TEV site-MB、X33-pPICZαA-His6-NusA-TEV site-MB与X33-pPICZαA-His6-TEVsite-MB(对照)菌株摇瓶发酵验证：具体实施方式参见实施例1中摇瓶发酵方法。
5.SDS-PAGE分析：根据Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定发酵上清液中蛋白含量，以及利用Image Lab软件进行灰度分析，X33-pPICZαA-His6-Sumo-TEV site-MB、X33-pPICZαA-His6-GST-TEV site-MB、X33-pPICZαA-His6-MBP-TEV site-MB、X33-pPICZαA-His6-TF-TEV site-MB、X33-pPICZαA-His6-TrxA-TEV site-MB、X33-pPICZαA-His6-NusA-TEV site-MB与X33-pPICZαA-His6-TEV site-MB(对照)菌株48h摇瓶发酵产量分别达到36.3mg/L、5.2mg/L、47.6mg/L、19.7mg/L、57.8mg/L、54.1mg/L与42.0mg/L，结果表明：添加促溶标签TrxA可强化猪肌红蛋白MB分泌表达(相对于对照提高37.6％)且几乎无其他杂蛋白，有利于纯化与工业应用；利用内切蛋白酶Factor Xa，可使促溶标签TrxA的切除效率达到95％以上(图7)。
实施例5毕赤酵母X33-△ku70菌株的构建
敲除毕赤酵母X33中的ku70(GeneID:8199462)基因：以毕赤酵母菌株X33基因组为模板，扩增得到ku70基因序列上下游各1000bp的片段，利用融合PCR技术将两个片段连接构建敲除框，再通过CRISPR/Cas9技术敲除毕赤酵母菌株X33中ku70基因，经过菌落PCR验证与测序后，获得正确敲除菌株X33-△ku70(图8)。
实施例6毕赤酵母X33-△ku70蛋白酶敲除菌株的构建
据报道，甲醇工艺的一个主要缺点是在细胞裂解时释放细胞内蛋白酶，导致重组蛋白降解。因此，敲除主要的蛋白酶有助于防止目的蛋白损失。
依次按以下步骤进行：
1.毕赤酵母蛋白酶单敲菌株的构建：以毕赤酵母菌株X33-△ku70基因组为模板，分别扩增得到蛋白酶基因pep4(GeneID:8200047)、yps1-1(GeneID:8196641)、prb1(GeneID:8196728)基因序列上下游各1000bp的片段，利用融合PCR技术将两个片段连接构建相应的三种蛋白酶基因的敲除框，再通过CRISPR/Cas9技术分别敲除毕赤酵母菌株X33-△ku70中pep4、yps1-1、prb1基因，经菌落PCR验证和测序后，分别获得正确蛋白酶单敲菌株X33-△ku70-△pep4、X33-△ku70-△yps1-1、X33-△ku70-△prb1(图9)。
2.毕赤酵母蛋白酶双敲菌株的构建：按照上述方法，通过CRISPR/Cas9技术敲除毕赤酵母菌株X33-△ku70-△pep4中yps1-1基因，经菌落PCR验证和测序后，获得正确蛋白酶双敲菌株X33-△ku70-△pep4-△yps1-1。
3.毕赤酵母蛋白酶三敲菌株的构建：按照上述方法，通过CRISPR/Cas9技术敲除毕赤酵母菌株X33-△ku70-△pep4-△yps1-1中prb1基因，经菌落PCR验证和测序后，获得正确蛋白酶三敲菌株X33-△ku70-△pep4-△yps1-1-△prb1。
实施例7猪肌红蛋白在毕赤酵母不同蛋白酶敲除菌株中的分泌表达
依次按以下步骤进行：
1.猪肌红蛋白毕赤酵母重组菌株的构建：将实施例4中pPICZαA-His6-TEV site-MB质粒线性化，分别电转到实施例6构建的蛋白酶敲除菌株X33-△ku70-△pep4、X33-△ku70-△yps1-1、X33-△ku70-△prb1、X33-△ku70-△pep4-△yps1-1、X33-△ku70-△pep4-△yps1-1-△prb1中，经菌落PCR验证和测序后，获得正确阳性克隆菌株X33-△ku70-△pep4-MB、X33-△ku70-△yps1-1-MB、X33-△ku70-△prb1-MB、X33-△ku70-△pep4-△yps1-1-MB、X33-△ku70-△pep4-△yps1-1-△prb1-MB，对照菌株X33-pPICZαA-His6-TEV site-MB已在实施例2中构建成功。
2.猪肌红蛋白毕赤酵母重组菌株摇瓶发酵验证：具体实施方式参见实施例1中摇瓶发酵方法。
3.SDS-PAGE分析：根据Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定发酵上清液中蛋白含量，以及利用Image Lab软件进行灰度分析，相对于对照，X33-△ku70-△yps1-1-MB与X33-△ku70-△pep4-△yps1-1-MB敲除菌株48h摇瓶发酵产量分别提高了59.4％、40.2％，产量分别达到69.0mg/L、60.7mg/L，其它蛋白酶敲除菌株猪肌红蛋白MB产量基本与对照保持一致(产量基本维持在43.3mg/L左右)；另外，所有蛋白酶敲除菌株生长性能基本与对照保持一致，表明蛋白酶敲除菌株可用于工业化生产(图10)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种高效表达不同来源肌红蛋白/血红蛋白毕赤酵母重组菌株的构建
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<170> PatentIn version 3.3
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ggtatcaaag gccacaaagc tggcgaagag ttcaccatcg acgtgacctt cccggaagaa 660
taccacgcag aaaacctgaa aggtaaagca gcgaaattcg ctatcaacct gaagaaagtt 720
gaagagcgtg aactgccgga actgaccgca gagttcatca aacgtttcgg cgttgaagat 780
ggttccgtag aaggtctgcg cgctgaagtg cgtaaaaaca tggagcgcga gctgaagagc 840
gccatccgta accgcgttaa gtctcaggcg atcgaaggtc tggtaaaagc taacgacatc 900
gacgtaccgg ctgcgctgat cgacagcgaa atcgacgttc tgcgtcgcca ggctgcacag 960
cgtttcggtg gcaacgaaaa acaagctctg gaactgccgc gcgaactgtt cgaagaacag 1020
gctaaacgcc gcgtagttgt tggcctgctg ctgggcgaag ttatccgcac caacgagctg 1080
aaagctgacg aagagcgcgt gaaaggcctg atcgaagaga tggcttctgc gtacgaagat 1140
ccgaaagaag ttatcgagtt ctacagcaaa aacaaagaac tgatggacaa catgcgcaat 1200
gttgctctgg aagaacaggc tgttgaagct gtactggcga aagcgaaagt gactgaaaaa 1260
gaaaccactt tcaacgagct gatgaaccag caggcgtaa 1299
<210> 11
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60
gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120
ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180
atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240
ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300
aaagagttcc tcgacgctaa cctggcctaa 330
<210> 12
<211> 1488
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
atgaacaaag aaattttggc tgtagttgaa gccgtatcca atgaaaaggc gctacctcgc 60
gagaagattt tcgaagcatt ggaaagcgcg ctggcgacag caacaaagaa aaaatatgaa 120
caagagatcg acgtccgcgt acagatcgat cgcaaaagcg gtgattttga cactttccgt 180
cgctggttag ttgttgatga agtcacccag ccgaccaagg aaatcaccct tgaagccgca 240
cgttatgaag atgaaagcct gaacctgggc gattacgttg aagatcagat tgagtctgtt 300
acctttgacc gtatcactac ccagacggca aaacaggtta tcgtgcagaa agtgcgtgaa 360
gccgaacgtg cgatggtggt tgatcagttc cgtgaacacg aaggtgaaat catcaccggc 420
gtggtgaaaa aagtaaaccg cgacaacatc tctctggatc tgggcaacaa cgctgaagcc 480
gtgatcctgc gcgaagatat gctgccgcgt gaaaacttcc gccctggcga ccgcgttcgt 540
ggcgtgctct attccgttcg cccggaagcg cgtggcgcgc aactgttcgt cactcgttcc 600
aagccggaaa tgctgatcga actgttccgt attgaagtgc cagaaatcgg cgaagaagtg 660
attgaaatta aagcagcggc tcgcgatccg ggttctcgtg cgaaaatcgc ggtgaaaacc 720
aacgataaac gtatcgatcc ggtaggtgct tgcgtaggta tgcgtggcgc gcgtgttcag 780
gcggtgtcta ctgaactggg tggcgagcgt atcgatatcg tcctgtggga tgataacccg 840
gcgcagttcg tgattaacgc aatggcaccg gcagacgttg cttctatcgt ggtggatgaa 900
gataaacaca ccatggacat cgccgttgaa gccggtaatc tggcgcaggc gattggccgt 960
aacggtcaga acgtgcgtct ggcttcgcaa ctgagcggtt gggaactcaa cgtgatgacc 1020
gttgacgacc tgcaagctaa gcatcaggcg gaagcgcacg cagcgatcga caccttcacc 1080
aaatatctcg acatcgacga agacttcgcg actgttctgg tagaagaagg cttctcgacg 1140
ctggaagaat tggcctatgt gccgatgaaa gagctgttgg aaatcgaagg ccttgatgag 1200
ccgaccgttg aagcactgcg cgagcgtgct aaaaatgcac tggccaccat tgcacaggcc 1260
caggaagaaa gcctcggtga taacaaaccg gctgacgatc tgctgaacct tgaaggggta 1320
gatcgtgatt tggcattcaa actggccgcc cgtggcgttt gtacgctgga agatctcgcc 1380
gaacagggca ttgatgatct ggctgatatc gaagggttga ccgacgaaaa agccggagca 1440
ctgattatgg ctgcccgtaa tatttgctgg ttcggtgacg aagcgtaa 1488
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
catcaccatc accatcac 18
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gaaaacttgt actttcaagg t 21

Claims (10)

1.一种重组菌，其特征在于，利用毕赤酵母异源表达1～3个拷贝数的肌红蛋白或血红蛋白；所述肌红蛋白来源于但不限于猪、牛，所述血红蛋白来源于但不限于三叶草、大豆或猪。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，以毕赤酵母X33、毕赤酵母KM71、毕赤酵母SMD1168或毕赤酵母GS115为宿主；所述肌红蛋白或血红蛋白以pPICZαA、pPICZαB、pPICZαC或pPIC9K为表达载体。
3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌还包括如(a)～(c)所述的一种或多种特征：
(a)将所述肌红蛋白或血红蛋白与促溶标签Sumo、GST、MBP、TF、TrxA或NusA连接；
(b)敲除毕赤酵母基因组中的ku70基因，所述ku70基因的GeneID:8199462；
(c)敲除毕赤酵母基因组中的蛋白酶基因pep4、yps1-1、prb1中的一个或多个。
4.一种胞外表达肌红蛋白或血红蛋白的方法，其特征在于，利用权利要求1～3任一项所述重组菌发酵生产肌红蛋白或血红蛋白。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将所述重组菌接种至YPD培养基中培养至OD600＝2～6，收集细胞，将细胞加入含终浓度为10～50mg/L血红素的发酵体系，在25～35℃、100～600rpm下发酵24～120h；所述发酵体系中含有发酵培养基，发酵培养基包括但不限于YNB、YPD、BMM或BMMY培养基。
6.提升肌红蛋白或血红蛋白表达量的方法，其特征在于，利用毕赤酵母异源表达单拷贝的肌红蛋白基因或血红蛋白基因。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，利用促溶标签Sumo、GST、MBP、TF、TrxA或NusA融合表达目的蛋白。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，敲除毕赤酵母X33基因组中的ku70基因，所述ku70基因的GeneID:8199462。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，敲除毕赤酵母X33基因组中的蛋白酶基因pep4、yps1-1、prb1中的一种或多种。
10.权利要求1～3任一项所述重组菌在制备肌红蛋白或血红蛋白或其衍生物中的应用。
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