CN114874929A - 一种高效合成血红素的毕赤酵母重组菌株的构建 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效合成血红素的毕赤酵母重组菌株的构建，属于基因工程技术领域。本发明实现了血红素在毕赤酵母中的高效合成，首先构建得到血红素合成关键酶双截短菌株X33‑pGAPZA‑△ku70‑△70aaHem14‑△70aaHem15‑mScarlet，菌株在最优发酵时间48h下，添加终浓度为150mg/LALA和20mg/LFe2+发酵培养基中，血红素产量达到0.352mg/L，较对照提高了41.9％，说明将hem14与hem15基因截短后定位于细胞质，可以提高血红素合成下游途径的酶促反应速率，本发明有利于解除血红素合成空间隔离障碍，提高血红素产量，为促进肌红蛋白/血红蛋白在人造肉等食品加工领域的应用奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种高效合成血红素的毕赤酵母重组菌株的构建，属于基因工程技术领域。
背景技术
血红蛋白是自然界中普遍存在的血红素结合蛋白，在生物体中具有补铁、运输氧、呼吸等重要的生理功能，更赋予了肌肉组织鲜红的颜色。近年来，随着人造肉制品的兴起，为了模拟真肉的颜色和风味，需要在产品中添加血红蛋白。除此之外，肌红蛋白也被证实和真肉的肉色形成存在密切的关系。因此，随着在人造肉领域中越来越广泛的应用，国内外市场对肌红蛋白/血红蛋白的需求量也在不断增加。
无论是血红蛋白还是肌红蛋白都需要血红素作为辅基，所以必须增强胞内血红素的供应水平，以满足血红蛋白/肌红蛋白合成过程中对血红素辅基的需求。
血红素是由亚铁离子和原卟啉组成，血红素合成的关键前体是5-氨基乙酰丙酸(ALA)。ALA的合成在不同生物体中有着不同的途径，可以通过两种可行的合成途径(C4或C5途径)之一来积累。
在供应足量血红素前体ALA的基础上，目前已经可以利用不同的微生物发酵合成血红素。毕赤酵母与常见的细菌宿主大肠杆菌相比，具有完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰及分泌能力，被广泛应用于食品与制药领域。毕赤酵母表达合成系统是较早被开发的真核基因表达体系，目前已成功实现了动植物、细菌、病毒、真菌等外源基因的表达。因此，应用毕赤酵母表达系统来合成血红素是最佳的选择。
目前，已鉴定所有血红素合成关键酶的胞内定位(Hem1-线粒体，Hem2-细胞质，Hem3-细胞质，Hem4-细胞质，Hem12-细胞质，Hem13-细胞质，Hem14-线粒体，Hem15-线粒体)。尚无通过将定位于线粒体中的血红素合成相关酶hem14和hem15基因截短，重新定位于细胞质，解除血红素合成过程中的空间隔离障碍，来提高血红素合成水平的报道。
发明内容
针对目前存在的问题，本发明首先在毕赤酵母中尝试表达截短碳端多个氨基酸的血红素合成关键酶基因(hem14和hem15)；然后对表达截短的血红素合成关键酶的菌株进行荧光蛋白亚细胞定位，通过摇瓶发酵检测血红素，产量提高说明将Hem14与Hem15截短后定位于细胞质，可以提高血红素合成下游途径的酶促反应速率，体现本策略的有效性。
本发明的第一个目的是提供一种重组菌，所述重组菌利用毕赤酵母表达碳端截短70个氨基酸的血红素合成关键酶基因△70hem14和/或△70hem15。
在一种实施方式中，所述截短是将血红素合成关键酶碳端的第2-71个氨基酸进行截短。
在一种实施方式中，所述重组菌还抑制了毕赤酵母基因组中ku70基因的表达。
在一种实施方式中，通过基因敲除技术抑制毕赤酵母基因组中ku70基因的表达。
在一种实施方式中，所述ku70基因的GeneID:8199462。
在一种实施方式中，所述△70hem14的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述△70hem15的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在一种实施方式中，未截短的血红素合成关键酶基因hem14的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，未截短的血红素合成关键酶基因hem15的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在一种实施方式中，所述毕赤酵母也可替换为其它同源性接近的酵母属菌种，包括但不限于毕赤酵母突变株。
在一种实施方式中，所述毕赤酵母包括毕赤酵母X33；
在一中实施方式中，所述重组菌以pGAPZαA为表达载体。
在一种实施方式中，所述重组菌还包括将所述△70hem14和△70hem15与红色荧光蛋白mScarlet连接。
在一种实施方式中，利用红色荧光蛋白mScarlet与所述截短70个氨基酸的血红素合成关键酶基因融合表达。
在一种实施方式中，所述红色荧光蛋白mScarlet的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的第二个目的是提供一种生产血红素的方法，所述方法是利用所述重组菌发酵生产血红素。
在一种实施方式中，将所述重组菌在YPD培养基中培养至OD600＝2～6，收集细胞，用发酵培养基重悬细胞，在30℃、220rpm下发酵24～96h。
在一种实施方式中，所述发酵生产的培养基包括但不限于YNB、YPD、BMM或BMMY培养基。
在一种实施方式中，所述培养基中含有终浓度为100～200mg/LALA和10～30mg/LFe2+。
在一种实施方式中，所述培养基中含有终浓度为150mg/LALA和20mg/L Fe2+。
本发明的第三个目的是提供一种提高血红素产量的方法，所述方法为以毕赤酵母为宿主，敲除毕赤酵母基因组中ku70基因，并表达碳端第2-71个氨基酸截短的血红素合成关键酶基因△70hem14和/或△70hem15。
在一种实施方式中，所述ku70基因的GeneID:8199462。
在一种实施方式中，所述△70hem14的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述△70hem15的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在一种实施方式中，所述毕赤酵母为毕赤酵母X33。
本发明的第四个目的是提供所述重组菌，或所述提高血红素产量的方法在制备血红素或其衍生物中的应用。
有益效果：本发明实现了血红素在毕赤酵母中的高效合成，构建得到的血红素合成关键酶双截短菌株X33-pGAPZαA-△ku70-△70Hem14-△70Hem15-mScarlet菌株在最优发酵时间48h下，添加终浓度为150mg/LALA和20mg/L Fe2+发酵培养基中，血红素产量达到0.352mg/L，较对照提高了41.9％，说明将hem14与hem15基因截短后定位于细胞质，可以提高血红素合成下游途径的酶促反应速率，本发明为解除血红素合成空间隔离障碍，提高血红素产量，促进肌红蛋白/血红蛋白在人造肉等食品加工领域的应用奠定了基础。
附图说明
图1为毕赤酵母X33-△ku70菌株的构建图；泳道1～3分别为X33-△ku70，X33-ku70，DNA marker。
图2为荧光显微镜观察血红素合成途径酶亚细胞定位图；经过荧光显微镜观察得知，八种血红素合成途径酶的亚细胞定位情况为：Hem1-线粒体、Hem2-细胞质、Hem3-细胞质、Hem4-细胞质、Hem12-细胞质、Hem13-细胞质、Hem14-线粒体与Hem15-线粒体。
图3为荧光显微镜观察两种血红素合成途径酶截短表达亚细胞定位图；经过荧光显微镜观察得知，两种血红素合成途径酶截短70aa重组菌株中关键酶的亚细胞定位情况为：△70aaHem14-细胞质与△70aaHem15-细胞质。
图4为血红素标准曲线图；根据标准曲线建立方法，一共八个平行，去掉最大值与最小值，然后算平均荧光值，建立标准曲线。
图5为荧光蛋白定位两种截短菌株摇瓶发酵结果图；在添加或不添加ALA和Fe2+的情况下，比较在第24h、48h、72h和96h时，X33-pGAPZA-△ku70-△70aaHem14-△70aaHem15-mScarlet与X33-△ku70(对照)的血红素产量。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
下述实施例中涉及的培养基如下：
LLB液体培养基：10g/L胰蛋白胨(Tryptone)、5g/L酵母粉(Yeast Extract)、5g/LNaCl，121℃灭菌20min，用于大肠杆菌的培养。
LLB固体培养基：LLB液体培养基中添加20g/L琼脂粉，用于大肠杆菌的培养与筛选。
YPD液体培养基：20g/L胰蛋白胨(Tryptone)、10g/L酵母粉(Yeast Extract)、2％葡萄糖，115℃灭菌25min，用于毕赤酵母的培养。
YPD固体培养基：YPD液体培养基中添加20g/L琼脂粉，用于毕赤酵母的划线分离、培养与筛选。
BMGY(1L)：1％酵母粉、2％胰蛋白胨、1％甘油、4×10-5％生物素。
实施例1毕赤酵母X33-△ku70菌株的构建
敲除毕赤酵母X33中的ku70(Gene ID:8199462)基因：以毕赤酵母菌株X33基因组为模板，扩增得到ku70基因序列上下游各1000bp的片段，利用融合PCR技术将两个片段连接构建敲除框，再通过CRISPR/Cas9技术敲除毕赤酵母菌株X33中ku70基因，经过菌落PCR验证与测序后，获得正确敲除菌株X33-△ku70(图1)。
实施例2毕赤酵母X33-△ku70血红素合成关键酶截短菌株的构建
目前，已鉴定所有血红素合成关键酶的胞内定位：Hem1-线粒体，Hem2-细胞质，Hem3-细胞质，Hem4-细胞质，Hem12-细胞质，Hem13-细胞质，Hem14-线粒体，Hem15-线粒体(图2)。因此，尝试通过截短线粒体中的血红素合成相关酶hem14和hem15基因的定位信号肽，使其能重新定位于细胞质，解除血红素合成过程中的空间隔离障碍，大大提高血红素合成水平。
依次按以下步骤进行：
1.毕赤酵母血红素合成关键酶截短菌株的构建：以毕赤酵母基因组为模板，分别扩增得到△70aaHem14与△70aaHem15基因片段；以PUC-mScarlet质粒为模板，扩增得到mScarlet基因片段(如SEQ ID NO.3所示)；利用Gibson组装将△70aaHem14基因片段与△70aaHem15基因片段分别和mScarlet基因片段进行连接，并转化至大肠杆菌DH5α感受态中，涂布于LLB平板上，PCR验证并测序，构建得到pGAPZA-△70aaHem14-mScarlet、pGAPZA-△70aaHem15-mScarlet重组质粒；mScarlet为红色荧光蛋白。
按照毕赤酵母操作手册中的电转方法，将重组质粒pGAPZA-△70aaHem14-mScarlet和pGAPZA-△70aaHem15-mScarlet电转至实施例1中构建的菌株X33-△ku70中，涂布于YPD平板，经菌落PCR验证和测序后，分别获得构建正确菌株X33-pGAPZA-△ku70-△70aaHem14-mScarlet、X33-pGAPZA-△ku70-△70aaHem15-mScarlet。
2.利用线粒体绿色荧光探针Mito-Tracker Green对步骤1构建的两种荧光蛋白亚细胞定位毕赤酵母重组菌株X33-pGAPZA-△ku70-△70aaHem14-mScarlet和X33-pGAPZA-△ku70-△70aaHem15-mScarlet进行活细胞的线粒体荧光标记(具体操作方法见碧云天C1048操作手册)，然后在荧光显微镜下分别利用绿色荧光与红色荧光激发波长观察线粒体与血红素合成途径酶的位置，经过荧光显微镜观察得知，两种毕赤酵母重组菌株中血红素合成途径酶的亚细胞定位情况为：△70aaHem14-细胞质与△70aaHem15-细胞质；由此结果可知，两种定位于线粒体的血红素合成关键酶Hem14与Hem15的定位信号肽均分别为前70aa(图3)。
3.毕赤酵母血红素合成关键酶双截短菌株的构建：按照上述方法，以毕赤酵母基因组为模板，分别扩增得到△70aaHem14与△70aaHem15基因片段；以PUC-mScarlet质粒为模板，扩增得到mScarlet基因片段；利用Gibson组装将△70aaHem14基因片段、△70aaHem15基因片段和mScarlet基因片段进行连接，并转化至大肠杆菌DH5α感受态中，涂布于LLB平板上，PCR验证并测序，构建pGAPZA-△70aaHem14-△70aaHem15-mScarlet重组质粒；mScarlet为红色荧光蛋白。
按照毕赤酵母操作手册中的电转方法，将重组质粒pGAPZA-△70aaHem14-△70aaHem15-mScarlet电转至实施例1中构建的菌株X33-△ku70中，涂布于YPD平板，经菌落PCR验证和测序后，获得构建正确的血红素合成关键酶双截短菌株X33-pGAPZA-△ku70-△70aaHem14-△70aaHem15-mScarlet。
实施例3血红素在毕赤酵母血红素合成关键酶双截短菌株中的分泌表达
依次按以下步骤进行：
1.血红素毕赤酵母重组菌株摇瓶发酵(50mL/250mL)验证：将实施例2中构建好的血红素合成关键酶双截短菌株X33-pGAPZA-△ku70-△70aaHem14-△70aaHem15-mScarlet和实施例1中构建好的菌株X33-△ku70在YPD平板上进行划线培养，培养2～3天至长出单菌落。挑取单菌落，接种至YPD培养基(50mL/250mL)中，30℃、100～600rpm摇至OD600＝2～6；4℃、1500～3000g离心5～10min，生理盐水洗涤细胞两次，去除培养基中的葡萄糖。离心后的全部菌体用50mLBMGY培养基(培养基中添加终浓度为150mg/LALA和20mg/L Fe2+)重悬，在30℃、100～600rpm下发酵，从发酵开始后每隔24h添加甲醇至终浓度为1％(v/v)以继续诱导，分别在发酵24h、48h、72h、96h取发酵液。
2.建立血红素标准曲线(荧光法)：
(1)首先利用20mmol/L的草酸溶液将1g/L血红素(Hemin)梯度稀释至10mg/L(稀释100倍)，然后逐级稀释成0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mg/L的标准溶液，接着取500μL不同浓度标准溶液，轻轻混匀后于4℃冰箱、暗室中过夜静置16h。
(2)次日在每个琥珀色离心管中加入500μL 2mol/L的草酸，充分混匀后，取一半样品在95℃水浴锅中加热30min反应作为实验组(用于卟啉和血红素总浓度荧光值的检测)，另一半样品则在置于常温下作为对照组(用于卟啉浓度荧光值的检测)。
(3)冷却后用12000r/min的转速离心5min，取200μL上清在激发波长为400nm，发射波长为620nm的荧光下检测，两组差值即为待测血红素浓度对应的荧光值(图4)。
3.血红素含量分析：根据血红素标准曲线分析发酵上清液中血红素含量，最佳摇瓶发酵时间为48h，培养基中添加终浓度为150mg/LALA和20mg/LFe2+，相对于对照菌株X33-△ku70，血红素合成关键酶双截短菌株X33-pGAPZA-△ku70-△70aaHem14-△70aaHem15-mScarlet摇瓶发酵产量达到0.352mg/L，提高了41.9％，说明将hem14与hem15截短后定位于细胞质，可以提高血红素合成下游途径的酶促反应速率；但在发酵进行至48h，不添加ALA和Fe2+情况下，血红素合成关键酶双截短菌株X33-pGAPZA-△ku70-△70aaHem14-△70aaHem15-mScarlet菌株与对照菌株X33-△ku70合成血红素的能力基本一致，说明只有生成足够的Hem14与Hem15底物，才能体现该策略的有效性。另外，血红素合成关键酶双截短菌株X33-pGAPZA-△ku70-△70aaHem14-△70aaHem15-mScarlet菌株生长性能基本与对照菌株保持一致，表明菌株可用于工业化生产(图5)。
对比例1：
采用实施例2中的方法构建截短hem14与hem15碳端第2-61个氨基酸重组菌株X33-pGAPZA-△ku70-△60aaHem14-mScarlet和X33-pGAPZA-△ku70-△60aaHem15-mScarlet，通过绿色荧光与红色荧光激发波长观察线粒体与血红素合成途径酶的位置，经过荧光显微镜观察得知，两种毕赤酵母重组菌株中血红素合成途径酶的亚细胞定位情况为：△60aaHem14-线粒体与△60aaHem15-线粒体。由此可见两种酶仍位于线粒体，存在空间隔离障碍，不能提高血红素水平。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种高效合成血红素的毕赤酵母重组菌株的构建
<130> BAA220795A
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1683
<212> DNA
<213> Pichia pastoris
<400> 1
atgctgaaaa gtcttgcacc aaattcctca attgccgttt taggttcagg gatatctgga 60
ttgactttca gctttttttt gaatcggttg cgtcccgatg ttaagatcca tatctttgaa 120
aaatccaagc aggttggagg atggatcaga tcagaagagc atgaaacttt tcattttgaa 180
aagggaccca gaactttgag aggcacaaat acgggtacct tgatgttgtt ggatcttctt 240
accaagatag gagcaaatga caaggtcctg ggactgcaca aagattctct tgctaataaa 300
aagtatctgt tgtccccgtt ctcagatgtt cacggaaaca acgcaaagct tcttcaagtg 360
ccacaggatt tcagctcttt tgtaaagttc atgtttgacc cgttgtctaa ggatctcatt 420
ctcggtcttt tgaaagaacc atggcaacca aaattaaagt attcagatga gtcggttgac 480
cattttttca acagaagatt tgctaccaaa ctatcagaga atatcgtcag cgcaattgtg 540
catggaatct atgcgggcga cgtgaagaag ttaagtgtga aagccatctt ccctaggctc 600
cctgagatgg aacaggaaag tggctctatt ataaggtata tgatcgccca atacaggaca 660
aaaaagaacg tcaaacaaaa agttgaccct tttttggcag attatgaaaa attgatcggt 720
acatctttga gtttcaaaaa tatttctttg tttctgaaaa actttcccat gctgagtttt 780
cagggtggac tacagaaact tcccatctca ttgaagaacc atttatcaca gattgaaaac 840
atcaagtttc attttgacag caaaatcaaa aacattgctt tggagagcgg taaggtggca 900
ttgactgacc atgatcaggt ttatcttgtt gaccatgtga gatctaccat taataccaac 960
gaattggcca aaatcatttc acccgttgtt ccaagttcta ctaagaaaaa atccgttttc 1020
aaatccaaag cgaatggccc agggctggtc aaatgtttga gctggctaca ctatacaaat 1080
atactaatgt gcaacattta tatacctaag cacgtctcaa aatctatcac cggatttgga 1140
tacttggttc ctcgatcaat gtcttctcag gcatccaaac ttctcggtgt catatttgac 1200
tcagacatcg agactgcaat gactcctaat tttacagagg ccaacattac ggcgataaac 1260
agtaactctg catctcccaa gcaactccaa aagttttctg accaattcgt caataatgat 1320
ctccctaaat acaccaagtt gacgctaatg cttggaggtc attatctcaa gtcggaggca 1380
gacatgcccg gttccgcaga gagtaaacat gctgtcaagg cgattctgtc aaatcacctg 1440
aatattgatc tagatgagtt tgcatctttg ccagacttca agatggaaat caccaagatc 1500
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gtggggatcc ctgactgtgt ccagaatgca ttcaaagatt cggctaccct cagtggcatt 1680
taa 1683
<210> 2
<211> 1125
<212> DNA
<213> Pichia pastoris
<400> 2
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<210> 3
<211> 696
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
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catagtacag gtggtatgga tgaattatat aaatag 696
<210> 4
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgggtacct tgatgttgtt ggatcttctt accaagatag gagcaaatga caaggtcctg 60
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<213> 人工序列
<400> 5
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ccattggatt ccatgctggg agtagtgtca gataattccc tcacagatcc aaaagagttt 900
ttcagagccc attga 915
Claims (10)
1.一种重组菌，其特征在于，利用毕赤酵母表达碳端第2-71个氨基酸截短的血红素合成关键酶基因△70hem14和/或△70hem15。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌还抑制了毕赤酵母基因组中ku70基因的表达。
3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于，所述△70hem14的核苷酸序列如SEQID NO.4所示，所述△70hem15的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述ku70基因的GeneID:8199462。
4.根据权利要求1～3任一项所述的重组菌，其特征在于，所述毕赤酵母也可替换为其它同源性接近的酵母属菌种，包括但不限于毕赤酵母突变株。
5.根据权利要求1～4任一项所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌以pGAPZαA为表达载体，以毕赤酵母X33为宿主。
6.一种生产血红素的方法，其特征在于，利用权利要求1～5任一项所述重组菌发酵生产血红素。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵生产的培养基包括但不限于YNB、YPD、BMM或BMMY培养基，培养基中含有终浓度为100～200mg/L ALA和10～30mg/L Fe2+。
8.一种提高血红素产量的方法，其特征在于，所述方法为以毕赤酵母为宿主，敲除毕赤酵母基因组中ku70基因，并表达碳端第2-71个氨基酸截短的血红素合成关键酶基因△70hem14和/或△70hem15。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述ku70基因的GeneID:8199462；所述△70hem14的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述△70hem15的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
10.权利要求1～5任一项所述重组菌，或权利要求8或9所述的方法在制备血红素或其衍生物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210656237.XA CN114874929B (zh) | 2022-06-10 | 2022-06-10 | 一种高效合成血红素的毕赤酵母重组菌株的构建 |
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2022
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