CN102268431B - 乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶启动子及应用和构建体与载体 - Google Patents

Abstract

通过扩增圆红冬孢酵母乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶基因组DNA上下游序列，进行生物学信息分析和功能验证，获得可有效表达目的基因于圆红冬孢酵母，并因此能够用于圆红冬孢酵母遗传工程操作和菌株改良的启动子和终止子。本发明还涉及包含这些元件的DNA构建体和载体。

Description

乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶启动子及应用和构建体与载体

技术领域

本专利属于基因工程技术领域，具体涉及圆红冬孢酵母启动子、终止子及其用途，包括基因工程菌株构建所必需的转化方法等。

背景技术

微生物是自然界中分布最广泛的物种之一，具有卓越的生物合成能力，几乎能合成地球上所有的有机化学品。微生物的种属多样性和遗传多样性决定了其代谢多样性。与多细胞生物相比，微生物的代谢途径虽然相对简单，但其化合物的生产高效、快捷，并与人类日常生产生活关系密切。

做为某一化学品的天然生产菌株或环境治理应用菌株，其特定的生产性能往往并非最优化。如何优化或改变工业菌株的代谢网络和表达调控网络，以提高生物基产品的积累速度或定向控制靶产品的质量，是当今生物技术领域研究的热点和难点。实际上，对微生物油脂代谢过程的理解、开发和利用是否能达到或者超过化学加工水平，也是提高发酵过程经济性的关键。全基因组测序和基因工程技术的进步，为菌株生理学特性的认识和菌株改良提供了比传统诱变技术更为合理的方法。

代谢工程的实质是利用重组DNA技术和其它技术，有目的地改变已有的代谢和表达调控网络，更好地理解和利用细胞的代谢途径。代谢工程可以在细胞与分子水平上认识和改造细胞过程，其不仅可以解释细胞生理生化特性，而且还可赋于出发菌株新的性状和表型：(1)扩大底物利用范围；(2)生产原来不存在的新化合物；(3)增强对环境中毒害物质的降解能力；(4)提高菌体对环境的适应能力；(5)阻断或降低副产品的生成；(6)代谢产品生产速率和生产性能的提高等(Bailey J E.Toward a science ofmetabolic engineering.Science.1991，252(5013)：1668-1675；Aristidou A，

M.Metabolic engineering applications to renewable resource utilization.Curr.Opin.Biotechnol.2000，11(2)：187-198)。

圆红冬孢酵母属于担子菌门异宗配合型真菌，是发酵工业中一种极为重要的微生物，可利用源于生物质的己糖和戊糖为原料生产重要的生物基产品：微生物油脂，胞内油脂可达细胞干重的60％以上(Ratledge C，WynnJ P.The biochemistry and molecular biology of lipid accumulation in oleaginousmicroorganisms.Adv.Appl.Microbiol.2002，51：1-51；Li Y，Zhao Z，Bai F.High-density cultivation of oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides Y4infed-batch culture.Enzyme Microb.Technol.2007，41(3)：312-317)；工业用酶或药物合成用酶如磷酸二酯酶、苯丙氨酸解氨酶(Hodgins D S.Yeastphenylalanine ammonia-lyase.Purification，properties，and the identification ofcatalytically essential dehydroalanine.J Biol.Chem.197l，246(9)：2977-2985；Gilbert H J，Clarke I N，Gibson R K，et al.Molecular cloning of the phenylalanineammonia lyase gene from Rhodosporidium toruloides in Escherichia coli K-12.JBacteriol.1985，161(1)：314-320)、D氨基酸氧化酶(Gadda G Negri A，PiloneM S.Reaction of phenylglyoxal with arginine groups in D-amino-acid oxidasefrom Rhodotorula gracilis.J Biol.Chem.1994，269(27)：17809-17814；Liao G J，Lee Y J，Lee Y H，et al.Structure and expression of the D-amino-acid oxidasegene from the yeast Rhodosporidium toruloides.Biotechnol.Appl.Biochem.1998，27(Pt 1)：55-61)等；β-胡萝卜素和胞外多糖；并在污水处理和生物制药中有较广泛的应用。实验结果表明，该菌可同时利用五碳糖和六碳糖为底物，抗逆性好，能直接以玉米秸秆酸水解液为碳源积累油脂，可实现生物质到生物基产品的高效转化(李永红，刘波，孙艳，等.广谱碳源产油酵母菌的筛选.中国生物工程杂志，2005，25(12)：39-44)。

虽然圆红冬孢酵母具有优良的工业生产性能，同时，圆红冬孢酵母来源的蛋白酶异源表达也获得成功(Pollegioni L，Molla G Campaner S，Cloning，sequencing and expression in E.coli of a D-amino acid oxidase cDNA fromRhodotorula gracilis active on cephalosporin C.J Biotechnol.1997，58(2)：115-123；Faulkner J D，Anson J G，Tuite M F，et al.High-level expression of thephenylalanine ammonia lyase-encoding gene from Rhodosporidium toruloidesin Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli using a bifunctionalexpression system.Gene.1994，143(1)：13-20)，但圆红冬孢酵母自身缺乏相应的遗传操作系统。以圆红冬孢酵母为宿主菌，无论是基因工程操作还是代谢工程菌株改良，都受到遗传操作系统的制约，难以进行靶向性的菌株改造。

启动子对于遗传操作系统来说必不可少。因此，如果要对圆红冬孢酵母进行遗传操作，获得能在圆红冬孢酵母中起作用的启动子是该工作的关键环节。

发明内容

鉴于上述现有技术瓶颈，本发明的主要目的是提供可用于在圆红冬孢酵母中有效表达外源基因，并且可通过遗传工程技术进行圆红冬孢酵母菌种改良的启动子和终止子。

为实现本发明的目的，本发明人对圆红冬孢酵母中的基因表达情况进行了深入研究，在对圆红冬孢酵母乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶及其编码基因Rtura3研究的基础上(中国专利，专利申请号：200710158415.1；Yang F，ZhangS，Tang W，Zhao Z.Identification of the orotidine-5’-monophosphatedecarboxylase gene of the oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides Yeast2008，25(9)：623-630)，利用染色体步移方法，从圆红冬孢酵母染色体DNA中成功获得了包含有效启动子的DNA片段，由此完成了本发明。

具体讲，本发明包含下述实施方案(A)到(F)

(A)本发明涉及一种具有圆红冬孢酵母转录启动子活性的DNA片段，所述DNA片段具有如SEQ ID NO：1所示DNA序列的全部或包含该DNA序列自3’-末端起900bp以内的部分序列，或具有可与如SEQ ID NO：1所示序列的全部或其DNA序列3’-末端起900bp以内的部分序列杂交的、且保持转录启动子活性的序列，或对SEQ ID NO：1所示的脱氧核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、插入或添加所获得的，与SEQ ID NO：1所示序列具有50％以上同源性、且具有启动子活性的序列。

(B)本发明涉及一种来自圆红冬孢酵母的DNA片段，所述DNA片段具有如下特征：(1)如SEQ ID NO：2所示的DNA序列的全部或包含该DNA序列5’-末端的部分序列；(2)或具有可与如(1)所示序列杂交的、且保持如(1)所述序列活性的序列。

(C)本发明涉及一种可完成靶基因在圆红冬孢酵母中转录起始和转录终止的DNA分子，它同时具有如(A)所述序列和如(B)所述序列，且如(B)所述序列位于如(A)所述序列的下游，与其相邻1-10000个核苷酸的DNA片段。

(D)本发明涉及一种可将靶基因与(A)-(C)所述的任一种DNA分子连接的DNA构建体，以便于靶基因能够在圆红冬孢酵母中表达的重组DNA。所述靶基因为蛋白编码核酸或反义核酸编码核酸。

(E)本发明涉及一种携带(A)-(D)所述的的DNA分子中的任意一个的载体。所述载体可以是质粒载体或粘粒载体。

(F)本发明涉及转入了如(D)所述的DNA分子或如(E)所述载体的圆红冬孢酵母或红冬孢酵母属(Rhodosporidium)真菌。

使用本发明的具有启动子活性的DNA分子和具有转录终止子活性的DNA，可实现外源基因或内源基因在圆红冬孢酵母中的表达，本发明提供了用于遗传工程圆红冬孢酵母的启动子、终止子和载体。为圆红冬孢酵母开启了一条育种新途径，并因此可以提供具有工业用途的新型圆红冬孢酵母。

附图说明

图1表示pRtura3启动子DNA片段的琼脂糖凝胶电泳的结果。

图2表示Rtura3t终止子DNA片段的琼脂糖凝胶电泳的结果。

图3表示Rtura3启动子-ORF-终止子基因全长片段的琼脂糖凝胶电泳的结果。

图4表示GFPuv在圆红冬孢酵母ATCC 10788中的整合性表达结果。

图5表示pRtura3启动子启动博来霉素抗性基因ble在红冬孢酵母ATCC10788的抗生表达结果。

图6表示pRtura3启动子启动遗传霉素抗性基因kanmx4在红冬孢酵母ATCC 10788的抗生表达结果。

图7表示重组圆红冬孢酵母在5’-FOA上的培养结果。

图8是质粒pura3gfp的结构图。

图9是质粒pura3ble的结构图。

图10是质粒pura3kan的结构图。

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

具体实施方式

在本文中，“启动子”是指能够被RNA聚合酶识别、结合并能启动基因转录的DNA序列。术语“启动子”还可理解为：包括5’非编码区、顺式作用元件(如增强子)以及其它能与转录因子结合的核苷酸序列。

启动子的存在或强度通常是通过启动子活性表示，其测定方法：将报告基因(如绿色荧光蛋白)连接于所述启动子的下游，并将该DNA构建体转化相应宿主细胞，检测报告基因表达量。如果人们观察到连接于所述启动子下游报告基因的表达，就可以认为所述启动子在它所转化的宿主细胞内有活性。

在本文中，“终止子”是指染色体上提供终止信号使RNA聚合酶与DNA模板分离而使转录终止的一段DNA序列。可以通过诸如Northern杂交或RT-PCR的方法检查所转录RNA的大小而确认终止子的存在。或通过“启动子-报告基因-终止子”构建体使报告基因有效表达而确定终止子的活性。

本发明中的“圆红冬孢酵母”，包括属于该“物种’’的任何二倍体和单倍体，野生型菌株和营养缺陷型菌株。本发明中的“红冬孢酵母属真菌”，没有具体限制，其例子包括归属于该属的真菌，除圆红冬孢酵母外，如Rhodosporidium azoricum，Rhodosporidium babjevae，Rhodosporidiumsphaerocarpum。

本发明的“目的基因”，包括能够在圆红冬孢酵母中表达的蛋白编码序列，反义RNA编码序列和核酸酶编码序列。能够在圆红冬孢酵母中表达的蛋白编码序列的例子包括源于圆红冬孢酵母的核酸序列，且并不局限于此。本发明的目的基因还包括来源于其它微生物、植物和动物的蛋白编码序列。

本发明中的启动子具有如SEQ ID NO：1所示DNA序列的全部或包含该DNA序列3’-末端的部分序列，或具有可与如SEQ ID NO：1所示序列的全部或其DNA序列3’-末端的部分序列杂交的、且保持转录启动子活性的序列，或对SEQ ID NO：1所示的脱氧核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、插入或添加所获得的，与SEQ ID NO：1所示序列具有50％以上同源性、且具有启动子活性的序列。

本发明中的终止子具有如SEQ ID NO：2所示的DNA序列的全部或包含该DNA序列5’-末端的部分序列，或具有可与如SEQ ID NO：2所示序列的全部或其DNA序列5’-末端的部分序列杂交的、且保持转录终止子活性的序列，或对SEQ ID NO：2所示的脱氧核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、插入或添加所获得的，与SEQ ID NO：2所示序列具有50％以上同源性、且具有终止子活性的序列。

本发明中的启动子-目的基因的构建体、目的基因-终止子的构建体或启动子-目的基因-终止子的构建体，可以直接或经载体介导转化圆红冬孢酵母，以便于目的基因表达，可以优选质粒载体作为介导载体。

本发明的启动子可以按照以下方面从圆红冬孢酵母中分离。

下面结合附图及实施例对本发明作进一步说明，将有助于本领域的普通技术人员理解本发明，但不以任何形式限制本发明。下述实施例中所有引物合成及测序工作，如无特别说明则均由大连TaKaRa公司完成。

实施例1：圆红冬孢酵母基因组DNA的制备

将新鲜圆红冬孢酵母R.toruloides ATCC 10788(购自美国标准生物品收藏中心，ATCC)由斜面接种到50ml YEPD液体培养基中，于30℃摇床培养24h，再以1∶50的体积比例将菌液分别转接到100ml YEPD液体培养基中，于30℃摇床培养12h达对数生长期。在4℃下，5000rpm离心4min，收集菌体。ATCC 10788的基因组DNA提取采用玻璃珠破壁法(精编分子生物学实验指南第三版第13章，奥斯伯等著，颜子颖等译，科学出版社出版)。制备好的基因组DNA，利用Nanodrop 1000测定，测得OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.85，表明基因组DNA质量很好。基因组DNA浓度为120ng/μl，共500μl，冻存于-20℃，备用。

实施例2：染色体步移获得Rtura3基因5’翼侧序列(启动子)

本实施例利用Genome Walking Kit(购自TaKaRa)完成。

根据已报道的圆红冬孢酵母乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶编码基因(Rtura3)的基因组DNA序列(中国专利，专利申请号：200710158415.1；Yang F，Zhang S，Tang W，Zhao Z.Identification of theorotidine-5’-monophosphate decarboxylase gene of the oleaginous yeastRhodosporidium toruloides Yeast 2008，25(9)：623-630)，设计3条SpecificPrimer(基因特异性引物)分别为ura3-SP1：5’-TCCCGGTCAAAGTCCTCGACGATGTC-3’，ura3-SP2：5’-CTTGATGCAGCAGCAGTACGGGCC-3’和ura3-SP3：5’-GGCGTAGGTGCGGGTCGTGATGGAC-3’，做为下游引物，按照GenomeWalking Kit(购自TaKaRa)说明书进行以下操作。

1.1^stPCR反应

以实施例1中精制的基因组DNA为模板，进行第一轮扩增。反应体系50μl：10×LA PCR buffer II(Mg²⁺plus，大连TakaRa)5.0μl，dNTPs(2.5mmol/l)8.0μl，TaKaRa LA Taq DNA聚合酶(5U/μl，大连TakaRa)1.0μl，AP1 Primer(100μmol/l，大连TakaRa)1.0μl，ura3-SP1(10μmol/l)1.0μl，R.toruloides ATCC 10788基因组DNA模板(120ng/μl)1.0μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：先进行5个高温退火温度的高特异性反应，然后进行1个极低退火温度的低特异性反应；然后进行热不对称PCR：2个高退火温度(65℃)的高特异性反应和1个低退火温度(44℃)的低特异性反应交替循环，共15次。具体参数如下：94℃1min，98℃1min；94℃30s，65℃1min，72℃2min，共5个循环；94℃30s，25℃3min，72℃2min；94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，44℃1min，72℃2min，共15个循环；72℃10min，结束反应。

2.2^nd巢式PCR反应

反应体系50μl：10×LA PCR bufferII(Mg²⁺plus，大连TakaRa)5.0μl，dNTPs  (2.5mmol/l)8.0μl，TakaRa LA Taq DNA聚合酶(5U/μl，大连TakaRa)1.0μl，AP1 Primer(100μmol/l，大连TakaRa)1.0μl，1^stPCR反应产物1.0μl，ura3-SP2(10μmol/l)1.0μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，44℃1min，72℃2min，共15个循环；72℃10min，结束反应。

33^rd巢式PCR反应

反应体系50μl：10×LA PCR bufferII(Mg²⁺plus，大连TakaRa)5.0μl，dNTPs(2.5mmol/l)8.0μl，TaKaRa LA Taq DNA聚合酶(5U/μl，大连TakaRa)1.0μl，AP1 Primer  (100μmol/l，大连TakaRa)1.0μl，2^nd巢式PCR反应产物1.0μl，ura3-SP3(10μmol/l)1.0μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，44℃1min，72℃2min，共15个循环；72℃10min，结束反应。

3^rd巢式PCR反应产物经1％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳后切割目的条带，利用DNA片段凝胶纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。纯化后的DNA片段经TA克隆插入pMD18-T载体(购自TakaRa公司)，转化DH5α感受态细胞；其中感受态细胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)制备。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至TaKaRa公司测序，得到如SEQ ID NO：1所示的DNA序列，证实为预期的pRtura3基因序列。

序列号：1(SEQ ID NO：1)

序列长度：1529bp

序列类型：DNA

来源：圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)

来源菌株特征：分类地位：担子菌门，高产油脂菌株，胞内油脂最高达细胞干重的70％。

TGACCGGAGC AACAAGACGT GGGCGAGTAT ACGCACTGGA TGCAGGCGCC GACGCGTTTC    60

TTGCACAAAT AGCAGACCTG CGAACGAACT CTTCGTCAGC TCGAAGCTTG AAAGACTCGC    120

CGCTTTCGAC TCACCAGCTT CCATCGACTC TTGGGGATGT TCTCGAGACC GTCGACCGGC    180

TCCATATACA CCGTGTTGCT GACGCCTGTT TCGGGAACCC AGATCGCGCA GAGCAAGTGT    240

GCCCACTGGC CCGTTGTCGT TTGTTTGAAG GCGCCGTACG AGTTGGGGCA AAGCACGCAG    300

GTCTACGAGA GATAATAGTC AGGTTTTGAG CGTAGCAAAG GCCCCGGACG GAAACGCACG    360

ACTGGCTTGT CGGGCGAGAC GGTGCATTTG CGGCAGAGCC ACTGTCCTTC CGGGATGTAC    420

GGAACGCCGT AGCAATCTGC GAGGAAGCGA CAAAGATGAG CATCAGATCC TCGTCGTGAC    480

CACGCTGTGC AGCCATGCAA CGTGAGAACT CGCGACGCAC CTTGGTGGAC CGCCAAGTTG    540

CATCCGTCGC AGAAGACGAT CGCATTCGAG TTCTCGCACT CGCCGTCGTC GCAAATGGCA    600

CATTTGCTG TCTTCGCTCGG CAAGGCATTC GTCCGCTTCG GGATATTGCG AGTCTGCGAA    660

AGACGAGCGA GACGGTCAGC AGGTCGCGAG AAGTTGAGGG AGGGCGAGAA CGGACCAGGT    720

CGAACCACTC CTTCTCAATC TTGTCCATGA CAATCTCAAA GAGCTCGTAC GGGATGGTGG    780

CAAGACCGTC CTTCTTCCGC TCCGCGTTGA GCGTGTCGAG CCAGAGTTGG TCTGTGGGTT    840

TCGCCGTCCA TACAGGCTGT CAGCTGTCGT ACAAATCGTC AAGCCTGCCT GAGAGAACCT    900

CCCACCTTGC TCGTCCATGT CATACTCAAC CTGCTTCGCC AGGTCCGACT CCATAGGTTC    960

TGTGGGAGAC GGAGGGAGGG TGAGTAAGTC GACTTTTGAG ACGCTGGTCC GCCTGCAGAG    1020

GCGCAGACAT CGAAGAGCGA TCTTCGAGTG CTCCTGCAGC ATCTGCACGT CCGTCCGGGC    1080

GTCGCTCGCT GCTCCAGAGA CGCGACAAAC AATCCCCACT TGACGAGGAT CGAAGCGACT    1140

CACGCAGCCA CCGCAGGTAC CGCCCCGGCT CGCCATCCGC TATGCCCTTG TACGCATCCC    1200

ATTCCTGGCC GTCATTGTAC CCGAACGCGA CGAGCTGGGG GTTGTGAACA TCGGGCGGAG    1260

CGGGGGTGCT CGTGTCGACG ACGCGAAAGT TGACGACTGG GAGTGCGAGA GACGAGCCGT    1320

GAGCTCCTGG CATCCCGTTG GCAGTGTGTG AGCGTTCTAC TGATGAAGTC GAGGAGAGGA    1380

AGAGAAGGTT GTCGCTGGAC TGCTCGCTCC TACTGTCCCT GTGAGGCTAC GGGACTGCTT    1440

TCCGAGTCTA TCAGAGCTAC CTGAAGCCCT TAGTACCGCT CGACTTGCGC GCCACCCCAT    1500

CTCCTCCTCC TCCCGCTCCA TCCGTCGAG                                      1529

实施例3：染色体步移获得Rtura3基因3’翼侧序列(终止子)

本实施例也是利用Genome Walking Kit(购自TaKaRa)完成。

已报道的圆红冬孢酵母乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶编码基因(Rtura3)的基因组DNA序列(中国专利，专利申请号：200710158415.1；Yang F，ZhangS，Tang W，Zhao Z.Identification of the orotidine-5’-monophosphatedecarboxylase gene of the oleaginous yeast Rhodosporidium toruloides Yeast2008，25(9)：623-630)，设计3条Specific Primer(基因特异性引物)分别为ura3-SP11：5’-GGAGGGTGGACGAGCGGGAAGAGAC-3’，ura3-SP22：5’-GTCATCATGACGC CCGGCGTCGGACT-3’和ura3-SP33：5’-GCGTACGAGGACAGGCTG AGGCAGT-3’，做为上游引物，按照GenomeWalking Kit(购自TaKaRa)说明书进行3’翼侧染色体步移操作，除SpecificPrimer分别由ura3-SP1，ura3-SP2，ura3-SP3依次更换为ura3-SP11，ura3-SP22，ura3-SP33外，其它同实施例2。

3^rd巢式PCR反应产物利用DNA片段凝胶纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化，经TA克隆插入pMD18-T载体(购自TakaRa公司)，转化DH5α感受态细胞；其中感受态细胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)制备。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至TaKaRa公司测序，得到如SEQ ID NO：2所示的DNA序列，证实为预期的Rt ura3t基因序列。

实施例4：Rt ura3启动子-ORF-终止子全长序列的获得

以实施例1中制备的R.toruloides基因组DNA为模板，根据实施例2和实施例3获得的序列信息，设计一对引物，pRtura3t-p1：5’-TGACCGGAGCAACAAGACGTGGG-3’和pRtura3t-p2：5’-AAGCAGGAGGAGGAGAAGCGGAGG-3’，进行Rtura3启动子-ORF-终止子全长序列的PCR扩增。PCR体系(50μl)：10×Speed buffer(大连TakaRa)5.0μl，dNTPs(10mmol/l)1.0μl，上游引物(10μmol/l)2.0μl，下游引物(10μmol/l)2.0μl，SpeedSTAR^TMHS DNA聚合酶(扩增速度快，1kb/10s，购自大连TaKaRa公司)0.5μl，基因组DNA模板(120ng/μl)2μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：98℃1min，98℃10s，65℃1.0min，30个循环，68℃10min，4℃结束反应。PCR产物经1％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳分析后利用PCR片段纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。片段经TA克隆插入pMD18-T载体(购自TakaRa公司)，转化DH5α感受态细胞；其中感受态细胞按氯化钙法(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)制备。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取。重组质粒样品送至TaKaRa公司测序，得到如SEQ ID NO：3所示的DNA序列，证实为预期的pRtura3t全长序列，该重组载体命名为T-pRtura3t。

实施例5：圆红冬孢酵母特异性绿色荧光蛋白表达盒ura3gfp的构建

ura3gfp圆红冬孢酵母特异性绿色荧光蛋白表达盒的构建利用的是RF克隆(Van den Ent，F.，Lowe，J.，2006.RF cloning：A restriction-free method forinserting target genes into plasmids.J.Biochem.Biophys.Methods 67：67-74；Yang F，Zhang S，Tang W，Zhao Z，2008.Identification of theorotidine-5′-monophosphate decarboxylase gene of the oleaginous yeastRhodosporidium toruloides.Yeast 25(9)：623-630)的方法。

pRtura3t全长序列扩增和克隆见实施例4。

1.绿色荧光蛋白编码基因GFPuv的获得

以pGFPuv质粒(购自BD Biosciences)为模板，利用一对引物gfp-p1：5’-ATGAGTAAAGGAGAAGAACT-3′和gfp-p2：5’-TCATTTGTAGAGCTCATCCAT-3’，进行PCR扩增。体系(50μl)：5×Primebuffer(大连TakaRa)10.0μl，dNTPs(大连TakaRa，2.5mmol/l)4.0μl，上游引物gfp-p1(10μmol/l)2.0μl，下游引物gfp-p2(10μmol/l)2.0μl，PrimeSTAR^TM HS DNA聚合酶(大连TakaRa)1.0μl，pGFPuv质粒1μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：95℃3min，98℃8s，49℃15s，72℃1min，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。PCR反应产物利用DNA片段胶回收纯化试剂盒纯化，利用taq DNA聚合酶进行DNA片段3’末端加A，体系(50μl)：10×PCR buffer5.0μl，dNTPs(2.5mmol/l)4.0μl，纯化后的GFPuv DNA片段30μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：72℃30min，4℃结束反应。3’末端加A后的GFPuv DNA片段利用DNA片段胶回收纯化试剂盒纯化，克隆入pMD18-T载体，送TaKaRa公司测序，得到如SEQ ID NO：4所示的DNA序列，证实为预期的GFPuv基因序列。

2.参照文献方法(Van den Ent，F.，Lowe，J.，2006.RF cloning：Arestriction-free method for inserting target genes into plasmids.J.Biochem.Biophys.Methods 67：67-74)，设计RF克隆引物：ura3-gfp-p1：5′-TCCTCCCGCTCCATCCGTCGAG atgagtaaaggagaagaact-3′和ura3-gfp-p2：5′-GAAAGTCTAGAGAGCGCCGCGCCAT tcatttgtagagctcatccat-3′(其中大写字母部分序列与pRtura3t克隆载体中原有的ura3ORF翼侧序列互补，小写字母部分序列与绿色荧光蛋白GFPuv ORF互补)。

3.RF I反应体系及流程：以本实施例操作项1中构建的GFPuvTA克隆载体为模板，利用ura3gfp-p1和ura3gfp-p2为引物，进行RF第一轮扩增。体系(50μl)：5×Prime buffer 10.0μl，dNTPs(2.5mmol/l)4.0μl，上游引物(10μmol/l)2.0μl，下游引物(10μmol/l)2.0μl，PrimeSTAR^TM HS DNA聚合酶(大连TakaRa)1.0μl，T-GFPuv质粒(源自实施例4，100ng/μl)1μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：95℃3min，98℃8s，49℃15s，72℃1min，30个循环，72℃10min，4℃结束反应。RF I反应产物利用DNA片段胶回收纯化试剂盒纯化，-20℃保存备用。

4.RF II反应：5×Prime buffer 10.0μl，dNTPs(2.5mmol/l)4.0μl，实施例4中构建的T-pRtura3t质粒(100ng/μl)1.0μl，本实施例前述步骤中RFI反应产物(100ng/μl)5.0μl，PrimeSTAR^TM HS DNA聚合酶(大连TakaRa)1.0μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：95℃3min，68℃12min，之后95℃30s，65℃45s(-1℃/cyc)，68℃12min，15个循环，接下来再进行一轮：95℃30s，55℃45s，68℃12min，20个循环，72℃10min，4℃结束反应。

5.DpnI消化和电击转化：取8μl RF II反应产物加入1μl DpnI(购自New England Biolabs)和1μl DpnI buffer混匀后在37℃作用120min去除原T-pRtura3t质粒后，分别取2μl电击转化DH5α感受态细胞，感受态细胞按标准方法制备(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)，电击转化参数：2200-2500V，400Ω，25μF，0℃。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取，并利用RF I反应所用引物ura3gfp-p1和ura3gfp-p2进行菌落PCR鉴定，鉴定阳性的重组载体送TaKaRa进行测序，得到5’端和3’端分别为ura3启动子和ura3终止子的ura3gfp表达盒，同时，该重组载体命名为Pura3gfp。GFPuv ORF序列如SEQ ID NO：4所示；完整的ura3gfp表达盒如SEQ ID NO：5所示。

实施例6：利用ura3gfp表达盒进行Rtura3基因敲除兼绿色荧光蛋白表达

1.Rtura3gfp敲除盒的制备

以实施例5构建的Pura3gfp载体为模板，以实施例4中的寡核苷酸序列pRtura3t-p1和pRtura3t-p2为引物，进行Rtura3gfp敲除盒的大量制备。PCR体系(500μl)：10×Speed buffer 50.0μl，dNTPs(10mmol/l)10.0μl，上游引物(10μmol/l)20.0μl，下游引物(10μmol/l)20.0μl，SpeedSTAR^TMHS DNA聚合酶(扩增速度快，1kb/10s，购自大连TaKaRa公司)5.0μl，基因组DNA模板(120ng/μl)15.0μl，ddH₂O加至500μl。反应条件：98℃1min，98℃10s，65℃60s，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。

PCR产物经1％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳分析后利用PCR片段纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。纯化后的DNA片段浓度在400ng/μl，共50μl，-20℃保存备用。

2.单倍体圆红冬孢酵母ATCC 10788感受态细胞制备

R.toruloides np11感受态细胞的制备：R.toruloides ATCC 10788(购自美国标准生物品收藏中心ATCC)菌株挑菌落接种10ml YEPD培养基(葡萄糖20.0g/l，酵母提取物10.0g/l，蛋白胨20.0g/l，pH 6.0)，30℃，200rpm，培养20h；培养物1∶50比例转接新鲜YEPD培养基，100ml(500ml锥形瓶，装液量100ml)，30℃，200rpm，培养6-9h，OD值达到0.6-1.2；培养物冰浴10-30min，4℃，4000rpm离心5min，弃上清；0℃无菌Milli-Q水洗1次；0℃1mol/l山梨醇洗涤2次；冰浴，备用。

3.圆红冬孢酵母ATCC 10788的电击转化和转化子的PCR鉴定

Rtura3gfp敲除盒的电击转化：取100μl R.toruloides ATCC 10788感受态细胞，加入Rtura3gfp敲除盒5μl(总共2μg)，混匀后冰移入预冷至0℃的电击杯中，电击参数：电压0.8-2.0千伏，电阻200Ω，电容25μF，时间4-10ms；电击后立即加入1ml YEPD，30℃温育1-2h；涂布YEPD平板，10μl/平板，30℃培养28-36h；逐一挑单克隆利用荧光显微镜进行镜检，阳性重组子ATCC 10788Δura3::gfp的荧光相片如图4所示。

3株重组圆红冬孢酵母ATCC 10788Δura3::gfp YEPD培养24h的培养物，利用生理盐水(0.9％NaCl缓冲液)进行倍比稀释，选择其10^-3、10^-4、10^-5、10^-6四个稀释度，分别移取10μl菌液于含5’-FOA(5’-氟乳清酸，购自上海金和生物技术有限公司)的SC固体培养基(0.2％5’-FOA，葡萄糖70g/L，(NH₄)₂SO₄ 0.1g/L，酵母粉0.75g/L，KH₂PO₄ 0.4g/L，MgSO₄·7H₂O1.5g/L，pH 6.0)平板，待液体吸收完全，于30℃倒置培养3天，发现重组圆红冬孢酵母ATCC 10788Δura3::gfp具备5’-FOA抗性，而对照菌株圆红冬孢酵母ATCC 10788则无菌落生长。

以上结果说明，Rtura3gfp敲除盒(表达盒)在启动绿色荧光蛋白在圆红冬孢酵母中的整合性表达的同时，可以灭活整合位置ura3基因编码的乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶活性。这样的设计有利于后期的遗传操作。

实施例7：圆红冬孢酵母特异性博来霉素抗性表达盒ura3ble的构建

ura3ble圆红冬孢酵母特异性博来霉素表达盒的构建，同样是利用RF克隆的方法。

pRtura3t全长序列扩增和克隆见实施例4。

1.参照文献方法(Van den Ent，F.，Lowe，J.，2006.RF cloning：Arestriction-free method for inserting target genes into plasmids.J.Biochem.Biophys.Methods 67：67-74)，设计RF克隆引物：ura3-ble-p1：5′-TCCTCCCGCTCCATCCGTCGAG atggccaagttgaccagtgccgtt-3′和ura3-ble-p2：5′-GAAAGTCTAGAGAGCGCCG CGCCATtcagtcctgctcctcggccacg-3′(其中大写字母部分序列与pRtura3t克隆载体中原有的ura3ORF翼侧序列互补，小写字母部分序列与博来霉素抗性基因ble ORF互补)。

2.RF I反应体系及流程：以pPICZαA质粒(购自Invitrogen公司)为模板，利用ura3ble-p1和ura3ble-p2为引物，进行RF第一轮扩增。体系(50μl)：5×Prime buffer 10.0μl，dNTPs(2.5mmol/l)4.0μl，上游引物(10μmol/l)2.0μl，下游引物(10μmol/l)2.0μl，PrimeSTAR^TM HS DNA聚合酶(大连TakaRa)1.0μl，pPICZαA质粒(100ng/μl)1μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：95℃3min，98℃8s，49℃15s，72℃1min，30个循环，72℃10min，4℃结束反应。RF I反应产物利用DNA片段胶回收纯化试剂盒纯化，-20℃保存备用。

3.RF II反应：5×Prime buffer 10.0μl，dNTPs(2.5mmol/l)4.0μl，实施例4中构建的T-pRtura3t质粒(100ng/μl)1.0μl，本实施例前述步骤中RF I反应产物(100ng/μl)5.0μl，PrimeSTAR^TM HS DNA聚合酶(大连TakaRa)1.0μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：95℃3min，68℃12min，之后95℃30s，65℃45s(-1℃/cyc)，68℃12min，15个循环，接下来再进行一轮：95℃30s，55℃45s，68℃12min，20个循环，72℃10min，4℃结束反应。

4.DpnI消化和电击转化：取8μl RF II反应产物加入1μl DpnI(购自New England Biolabs)和1μl DpnI buffer混匀后在37℃作用120min去除原T-pRtura3t质粒后，分别取2μl电击转化DH5α感受态细胞，感受态细胞按标准方法制备(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)，电击转化参数：2200-2500V，400Ω，25μF，0℃。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取，并利用RF I反应所用引物ura3ble-p1和ura3ble-p2进行菌落PCR鉴定，鉴定阳性的重组载体送TaKaRa进行测序，得到5’端和3’端分别为ura3启动子和ura3终止子的ura3ble表达盒，同时，该重组载体命名为Pura3ble。ble ORF序列如SEQ ID NO：6所示；完整的ura3ble表达盒如SEQ ID NO：7所示。

实施例8：利用ura3ble表达盒进行Rtura3基因敲除兼博来霉素抗性表达

1.Rtura3ble敲除盒的制备

以实施例5构建的Pura3ble载体为模板，以实施例4中的寡核苷酸序列pRtura3t-p1和pRtura3t-p2为引物，进行Rtura3ble敲除盒的大量制备。PCR体系(500μl)：10×Speed buffer 50.0μl，dNTPs  (10mmol/l)10.0μl，上游引物(10μmol/l)20.0μl，下游引物(10μmol/l)20.0μl，SpeedSTAR^TMHS DNA聚合酶5.0μl，基因组DNA模板(120ng/μl)15.0μl，ddH₂O加至500μl。反应条件：98℃1min，98℃10s，65℃60s，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。

PCR产物经1％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳分析后利用PCR片段纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。纯化后的DNA片段浓度在300ng/μl，共50μl，-20℃保存备用。

2.单倍体圆红冬孢酵母ATCC 10788感受态细胞制备

R.toruloides np11感受态细胞的制备同实施例6中的操作项3。

3.圆红冬孢酵母ATCC 10788的电击转化和转化子的PCR鉴定

Rtura3ble敲除盒的电击转化：取100μl R.toruloides ATCC 10788感受态细胞，加入Rtura3ble敲除盒10μl(总共3μg)，混匀后移入预冷至0℃的电击杯中，电压0.8-2.0千伏，电阻200Ω，电容25μF，时间4-10ms；电击后立即加入1ml YEPD，30℃温育1-2h；涂布含20μg/ml Zeocin(购自Invitrogen公司)的YEPD平板，200μl/平板，30℃培养2-10d，约有100个转化子陆续出现。

挑取4个Zeocin抗性转化子于YEPD培养基中培养24h，培养物利用生理盐水(0.9％NaCl缓冲液)进行倍比稀释，选择其10^-3、10^-4、10^-5、10^-6四个稀释度，分别移取10μl菌液点样于含5’-FOA(购自上海金和生物技术有限公司)的SC固体培养基(0.2％5’-FOA，葡萄糖70g/L，(NH₄)₂S0₄0.1g/L，酵母粉0.75g/L，KH₂PO₄ 0.4g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，pH 6.0)平板，待液体吸收完全后，于30℃倒置培养3天，发现重组圆红冬孢酵母ATCC 10788Δura3::ble具备5’-FOA抗性，而对照菌株圆红冬孢酵母ATCC10788则无菌落生长。

以上结果说明，Rtura3ble敲除盒(表达盒)在启动博来霉素抗性基因在圆红冬孢酵母中整合性表达的同时，可以灭活整合位置ura3基因编码的乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶活性。这样的设计有利于后期的遗传操作。

实施例9：圆红冬孢酵母特异性遗传霉素抗性表达盒ura3kan的构建

ura3kan圆红冬孢酵母特异性遗传霉素抗性表达盒的构建，同样是利用RF克隆的方法。

pRtura3t全长序列扩增和克隆见实施例4。

1.参照文献方法(Van den Ent，F.，Lowe，J.，2006.RF cloning：Arestriction-free method for inserting target genes into plasmids.J.Biochem.Biophys.Methods 67：67-74)，设计RF克隆引物：ura3-kan-p1：5′-TCCTCCCGCTCCATCCGTCGAG atgggtaaggaaaagactcacgt-3′和ura3-kan-p2：5′-GAAAGTCTAGAGAGCGCCG CGCCAT ttagaaaaactcatcgagcatc-3′(其中大写字母部分序列与pRtura3t克隆载体中原有的ura3ORF翼侧序列互补，小写字母部分序列与遗传霉素抗性基因kanmx4 ORF互补)。

2.RF I反应体系及流程：以pFA6-kanmx4质粒(购自EUROSCARF)为模板，利用ura3kan-p1和ura3kan-p2为引物，进行RF第一轮扩增。体系(50μl)：5×Prime buffer 10.0μl，dNTPs(2.5mmol/l)4.0μl，上游引物(10μmol/l)2.0μl，下游引物(10μmol/l)2.0μl，PrimeSTAR^TM HS DNA聚合酶(大连TakaRa)1.0μl，pFA6-kanmx4质粒(110ng/μl)1μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：95℃3min，98℃8s，49℃15s，72℃1min，30个循环，72℃10min，4℃结束反应。RF I反应产物利用DNA片段胶回收纯化试剂盒纯化，-20℃保存备用。

3.RF II反应：5×Prime buffer 10.0μl，dNTPs(2.5mmol/l)4.0μl，实施例4中构建的T-pRtura3t质粒(100ng/μl)1.0μl，本实施例前述步骤中RFI反应产物(100ng/μl)5.0μl，PrimeSTAR^TM HS DNA聚合酶1.0μl，ddH₂O加至50μl。反应条件：95℃3min，68℃12min，之后95℃30s，65℃45s(-1℃/cyc)，68℃12min，15个循环，接下来再进行一轮：95℃30s，55℃45s，68℃12min，20个循环，72℃10min，4℃结束反应。

4.DpnI消化和电击转化：取8μl RF II反应产物加入1μl DpnI(购自New England Biolabs)和1μl DpnI buffer混匀后在37℃作用120min去除原T-pRtura3t质粒后，分别取2μl电击转化DH5α感受态细胞，感受态细胞按标准方法制备(分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁克著，黄培堂等译，科学出版社出版)，电击转化参数：2200-2500V，400Ω，25μF，0℃。挑选Amp抗性转化子进行增菌培养、质粒提取，并利用RF I反应所用引物ura3kan-p1和ura3kan-p2进行菌落PCR鉴定，鉴定阳性的重组载体送TaKaRa进行测序，得到5’端和3’端分别为ura3启动子和ura3终止子的ura3kan表达盒，同时，该重组载体命名为Pura3kan。kanmx ORF序列如SEQID NO：8所示；完整的ura3kan表达盒如SEQ ID NO：9所示。

实施例10：利用ura3kan表达盒进行Rtura3基因敲除兼遗传霉素抗性表达

1.Rtura3kan敲除盒的制备

以实施例9构建的Pura3kan载体为模板，以实施例4中的寡核苷酸序列pRtura3t-p1和pRtura3t-p2为引物，进行Rtura3kan敲除盒的大量制备。PCR体系(500μl)：10×Speed buffer 50.0μl，dNTPs(10mmol/l)10.0μl，上游引物(10μmol/l)20.0μl，下游引物(10μmol/l)20.0μl，SpeedSTAR^TMHS DNA聚合酶5.0μl，基因组DNA模板(120ng/μl)15.0μl，ddH₂O加至500μl。反应条件：98℃1min，98℃10s，65℃60s，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。

PCR产物经1％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳分析后利用PCR片段纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。纯化后的DNA片段浓度在320ng/μl，共40μl，-20℃保存备用。

2.单倍体圆红冬孢酵母ATCC 10788感受态细胞制备

R.toruloides np11感受态细胞的制备同实施例6中的操作项3。

3.圆红冬孢酵母ATCC 10788的电击转化和转化子的PCR鉴定

Rtura3kan敲除盒的电击转化：取100μl R.toruloides ATCC 10788感受态细胞，加入Rtura3kan敲除盒10μl(总共3.2μg)，混匀后移入预冷至0℃的电击杯中，电压0.8-2.0千伏，电阻200Ω，电容25μF，时间4-10ms；电击后立即加入1ml YEPD，30℃温育1-2h；涂布含50μg/ml G418(购自北京舟鼎国)的YEPD平板，200μl/平板，30℃培养2-10d，约有60个转化子陆续出现。

挑取3个G418抗性转化子于YEPD培养基中培养24h，培养物利用生理盐水(0.9％NaCl缓冲液)进行倍比稀释，选择其10^-3、10^-4、10^-5、10^-6四个稀释度，分别移取10μl菌液点样于含5’-FOA(购自上海金和生物技术有限公司)的SC固体培养基(0.2％5’-FOA，葡萄糖70g/L，(NH₄)₂SO₄0.1g/L，酵母粉0.75g/L，KH₂PO₄ 0.4g/L，MgSO₄·7H₂O 1.5g/L，pH 6.0)平板，待液体吸收完全后，于30℃倒置培养3天，发现重组圆红冬孢酵母ATCC 10788Δura3::kan具备5’-FOA抗性，而对照菌株圆红冬孢酵母ATCC10788则无菌落生长。

以上结果说明，Rtura3kan敲除盒(表达盒)在启动遗传霉素抗性基因在圆红冬孢酵母中整合性表达的同时，可以灭活整合位置的ura3基因编码的乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶活性。这样的设计有利于后期的遗传操作。

实施例11：pRtura3启动子和Rtura3t终止子的属内(不同种间)活性测定

也即ura3gfp、ura3ble、ura3kan等表达盒在R.babjevae的功能验证。

在此利用26SrDNA基因做为整合位点，通过融合PCR方法使每个整合表达盒5’末端携带有约500bp的26SrDNA基因同源重组臂，分别进行ura3gfp表达盒、ura3ble表达盒、ura3kan表达盒在R.babjevae中的整合性表达。

1.根据NCBI公布的R.babjevae 26SrDNA序列(NO.：EF595746)，设计一对引物：Rb26S-Rtura3-p1：5’-AGCGGCGAGCGAAGCGGTAAG-3’和Rb26S-Rtura3-p2：5’-cccacgtcttgttgctccggtcaACGCTGCGTTCCTCAGTCCCC-3’(其中大写字母部分序列与R.babjevae 26SrDNA序列3’端同源，小写字母部分序列与圆红冬孢酵母pura3启动子5’端互补)。

2.Rb26S-Rtura3gfp、Rb26S-Rtura3ble、Rb26S-Rtura3kan的构建

分别利用实施例5、实施例7和实施例9中的Pura3gfp、Pura3ble和Pura3kan载体为模板，分别进行Rb26S-Rtura3gfb、Rb26S-Rtura3ble、Rb26S-Rtura3kan等3个融合表达盒的构建。PCR体系(各500μl)：10×Speedbuffer 50.0μl，dNTPs(10mmol/l)10.0μl，上游引物(10μmol/l)20.0μl，下游引物(10μmol/l)20.0μl，SpeedSTAR^TM HS DNA聚合酶5.0μl，DNA模板质粒Pura3gfp或Pura3ble或Pura3kan(均120ng/μl)15.0μl，ddH₂O加至500μl。反应条件：98℃1min，98℃10s，65℃60s，35个循环，72℃10min，4℃结束反应。

PCR产物经1％(质量/体积浓度)琼脂糖凝胶电泳分析后利用PCR片段纯化试剂盒(购自碧云天)进行纯化。纯化后的Rb26S-Rtura3gfp、Rb26S-Rtura3ble和Rb26S-Rtura3kan表达盒浓度分别为300ng/μl、280ng/μl和260ng/μl，均40μl，-20℃保存备用。

3.R.babjevae ATCC90942感受态细胞制备

R.babjevae ATCC90942购自购自美国标准生物品收藏中心。首先，挑菌落接种10ml YEPD培养基，28℃，200rpm，培养24h；培养物1∶50比例转接新鲜YEPD培养基，100ml(500ml锥形瓶，装液量100ml)，28℃，200rpm，培养7-10h，OD值达到0.6-1.2；培养物冰浴10-30min，4℃，4000rpm离心5min，弃上清；0℃无菌Milli-Q水洗1次；0℃1mol/l山梨醇洗涤2次；冰浴，备用。

4.R.babjevae ATCC90942的电击转化和表达结果观察

取3份100μl R.babjevae ATCC90942感受态细胞，分别加入Rb26S-Rtura3gfp、Rb26S-Rtura3ble和Rb26S-Rtura3kan表达盒各10μl，混匀后移入预冷至0℃的电击杯中，电压0.8-2.0千伏，电阻200Ω，电容25μF，时间4-10ms；电击后立即加入1ml YEPD，30℃温育1-2h；Rb26S-Rtura3gfp转化液涂布YEPD平板，10μl/平板；Rb26S-Rtura3ble转化液涂布含20μg/mlZeocin(购自Invitrogen公司)的YEPD平板，200μl/平板；Rb26S-Rtura3kan转化液涂布含50μg/ml G418(购自北京舟鼎国)的YEPD平板，200μl/平板；均28℃培养2-10d。

R.babjevae ATCC90942/Rb26S-Rtura3gfp转化子逐一挑单克隆利用荧光显微镜进行镜检，每30个转化子中可有一个荧光表达的阳性重组子，荧光相片略；Rb26S-Rtura3ble转化液涂布含20μg/ml Zeocin的YEPD平板，28℃培养5d时可观察到大小不一的抗性重组子，平均200个/平板，转化重组效率400个重组子/μg表达盒DNA；Rb26S-Rtura3kan转化液涂布含50μg/ml G418的YEPD平板，28℃培养6d时可观察到大小不一的抗性重组子，平均100个/平板，转化重组效率200个重组子/μg表达盒DNA。

各表达盒在R.babjevae ATCC90942的表观转化重组效率，比在R.toruloides ATCC10788中的表观转化重组效率高，可能是由于在R.babjevaeATCC90942进行的是单位点同源重组，而在R.toruloides ATCC 10788进行的是双位点同源重组的原因。

以上实施例证明，ura3启动子能够启动绿色荧光蛋白基因、博来霉素抗性基因和遗传霉素抗性基因在R.toruloides ATCC 10788中和R.babjevaeATCC90942中的整合性表达，具有属内启动子活性；ura3gfp表达盒、ura3ble表达盒、ura3kan表达盒为基础构建的线性DNA敲除盒，能够敲除圆红冬孢酵母基因组上的ura3靶基因。

使用本发明的启动子和终止子，可实现目的基因在圆红冬孢酵母中的表达或特定靶基因的选择性敲除，本发明提供了用于遗传工程圆红冬孢酵母的启动子、终止子和一系列DNA构建体。为圆红冬孢酵母开启了一条育种新途径，并因此可以提供具有工业用途的新型圆红冬孢酵母。并为红冬孢酵母属的其它酵母菌的遗传操作提供了方法和平台。

本发明的有益效果是：

为圆红冬孢酵母或红冬孢酵母属的酵母菌提供了启动子、终止子、选择性标记基因表达盒和遗传转化方法，将有力促进今后的圆红冬孢酵母或红冬孢酵母属的酵母菌的菌株改良研究，加快圆红冬孢酵母代谢工程研究。

SEQ ID NO：1

TGACCGGAGC AACAAGACGT GGGCGAGTAT ACGCACTGGA TGCAGGCGCC GACGCGTTTC    60

TTGCACAAAT AGCAGACCTG CGAACGAACT CTTCGTCAGC TCGAAGCTTG AAAGACTCGC    120

CGCTTTCGAC TCACCAGCTT CCATCGACTC TTGGGGATGT TCTCGAGACC GTCGACCGGC    180

TCCATATACA CCGTGTTGCT GACGCCTGTT TCGGGAACCC AGATCGCGCA GAGCAAGTGT    240

GCCCACTGGC CCGTTGTCGT TTGTTTGAAG GCGCCGTACG AGTTGGGGCA AAGCACGCAG    300

GTCTACGAGA GATAATAGTC AGGTTTTGAG CGTAGCAAAG GCCCCGGACG GAAACGCACG    360

ACTGGCTTGT CGGGCGAGAC GGTGCATTTG CGGCAGAGCC ACTGTCCTTC CGGGATGTAC    420

GGAACGCCGT AGCAATCTGC GAGGAAGCGA CAAAGATGAG CATCAGATCC TCGTCGTGAC    480

CACGCTGTGC AGCCATGCAA CGTGAGAACT CGCGACGCAC CTTGGTGGAC CGCCAAGTTG    540

CATCCGTCGC AGAAGACGAT CGCATTCGAG TTCTCGCACT CGCCGTCGTC GCAAATGGCA    600

CATTTGCTGT CTTCGCTCGG CAAGGCATTC GTCCGCTTCG GGATATTGCG AGTCTGCGAA    660

AGACGAGCGA GACGGTCAGC AGGTCGCGAG AAGTTGAGGG AGGGCGAGAA CGGACCAGGT    720

CGAACCACTC CTTCTCAATC TTGTCCATGA CAATCTCAAA GAGCTCGTAC GGGATGGTGG    780

CAAGACCGTC CTTCTTCCGC TCCGCGTTGA GCGTGTCGAG CCAGAGTTGG TCTGTGGGTT    840

TCGCCGTCCA TACAGGCTGT CAGCTGTCGT ACAAATCGTC AAGCCTGCCT GAGAGAACCT    900

CCCACCTTGC TCGTCCATGT CATACTCAAC CTGCTTCGCC AGGTCCGACT CCATAGGTTC    960

TGTGGGAGAC GGAGGGAGGG TGAGTAAGTC GACTTTTGAG ACGCTGGTCC GCCTGCAGAG    1020

GCGCAGACAT CGAAGAGCGA TCTTCGAGTG CTCCTGCAGC ATCTGCACGT CCGTCCGGGC    1080

GTCGCTCGCT GCTCCAGAGA CGCGACAAAC AATCCCCACT TGACGAGGAT CGAAGCGACT    1140

CACGCAGCCA CCGCAGGTAC CGCCCCGGCT CGCCATCCGC TATGCCCTTG TACGCATCCC    1200

ATTCCTGGCC GTCATTGTAC CCGAACGCGA CGAGCTGGGG GTTGTGAACA TCGGGCGGAG    1260

CGGGGGTGCT CGTGTCGACG ACGCGAAAGT TGACGACTGG GAGTGCGAGA GACGAGCCGT    1320

GAGCTCCTGG CATCCCGTTG GCAGTGTGTG AGCGTTCTAC TGATGAAGTC GAGGAGAGGA    1380

AGAGAAGGTT GTCGCTGGAC TGCTCGCTCC TACTGTCCCT GTGAGGCTAC GGGACTGCTT    1440

TCCGAGTCTA TCAGAGCTAC CTGAAGCCCT TAGTACCGCT CGACTTGCGC GCCACCCCAT    1500

CTCCTCCTCC  TCCCGCTCCA TCCGTCGAG                                     1529

SEQ ID NO：2

ATGGCGCGGC GCTCTCTAGA CTTTCGAACG AGTGTAAGGC TATCTTGACA ACAACATGCA    60

CAATCCGGTC GAGTCTACAA CGTCTATCGC CTCTTCACGG ACCGCTTCGG ACCTGTCTGG    120

ACGACGTGGC TTGATGCGAA GCTGGGTAGC CACTTGTCGC TCGAACTCTT CGCCAATGGC    180

TGTTTCTTCG GTGGCGCGGC TGCCGTCTTG GCGGAAACAA GAGAAGGGAA GGGCGATGGC    240

TGCTTCGCGC TGAGTTGAGC TGAGGAGGCG GAAGAAGAGA CGTTCGACAG GCTGTTGTGG    300

GCGGAGAGCG GTCGTGTGGG CGCCTCCTGC TTCGCCTTAG CCGACGACGA CGCGAAGTAC    360

GACGACTCGA CGATCTCGAC GTCGCTGCTG TCGTCGTCAT TCCGCGCCTT TGCTGGTCGG    420

GCGGGCACCT CATTCTCCAT CTCCCTCAAC CTCTGCTCTT CTCGCACCGC AGCTCGCATC    480

GTTTCCTCAT CCGCATACTC CAGCTCATCA TCCTCGTCAT CGCTGTACTC GCGCGAGACC    540

TCGCACTCGT CCATCAGCGT GCGCTCGTGC CGCTTCTTCG TTGGCGAGGC GAGCAGCTTC    600

GATTTGTTGT TGACCTTGAA GGACGGGCCG TCAGAGGGAG GTGAAGGCGA TCTGTACGAG    660

CGCGAGGAGG CCGTGCGCTT GAACTGGCGC GAAGGGAAGG AGGTGGAGGG GTTGTCGGTC    720

ATAGGGGATT CTTCGGCGTC ACTGTCCGTC GCGACGATGC CGCGCTTCGC TCGCAGCTCG    780

GCAACTTTCT TCTTCAGGCG CGCGAGCTGT GGCACATCGT CTGTTAGCTC GACTAGTGCG    840

AACGAAGGAA AAGACCGGGC CACGCACGTC GGCTTCGTAC CGCTTGTTGG CTCCCTCCAC    900

CCGCCTCCGC  TTCTCCTCCT  CCTGCTT                                      927

SEQ ID NO：3(圆红冬孢酵母乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶启动子、圆红冬孢酵母乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶终止子)

TGACCGGAGC AACAAGACGT GGGCGAGTAT ACGCACTGGA TGCAGGCGCC GACGCGTTTC    60

TTGCACAAAT AGCAGACCTG CGAACGAACT CTTCGTCAGC TCGAAGCTTG AAAGACTCGC    120

CGCTTTCGAC TCACCAGCTT CCATCGACTC TTGGGGATGT TCTCGAGACC GTCGACCGGC    180

TCCATATACA CCGTGTTGCT GACGCCTGTT TCGGGAACCC AGATCGCGCA GAGCAAGTGT    240

GCCCACTGGC CCGTTGTCGT TTGTTTGAAG GCGCCGTACG AGTTGGGGCA AAGCACGCAG    300

GTCTACGAGA GATAATAGTC AGGTTTTGAG CGTAGCAAAG GCCCCGGACG GAAACGCACG    360

ACTGGCTTGT CGGGCGAGAC GGTGCATTTG CGGCAGAGCC ACTGTCCTTC CGGGATGTAC    420

GGAACGCCGT AGCAATCTGC GAGGAAGCGA CAAAGATGAG CATCAGATCC TCGTCGTGAC    480

CACGCTGTGC AGCCATGCAA CGTGAGAACT CGCGACGCAC CTTGGTGGAC CGCCAAGTTG    540

CATCCGTCGC AGAAGACGAT CGCATTCGAG TTCTCGCACT CGCCGTCGTC GCAAATGGCA    600

CATTTGCTGT CTTCGCTCGG CAAGGCATTC GTCCGCTTCG GGATATTGCG AGTCTGCGAA    660

AGACGAGCGA GACGGTCAGC AGGTCGCGAG AAGTTGAGGG AGGGCGAGAA CGGACCAGGT    720

CGAACCACTC CTTCTCAATC TTGTCCATGA CAATCTCAAA GAGCTCGTAC GGGATGGTGG    780

CAAGACCGTC CTTCTTCCGC TCCGCGTTGA GCGTGTCGAG CCAGAGTTGG TCTGTGGGTT    840

TCGCCGTCCA TACAGGCTGT CAGCTGTCGT ACAAATCGTC AAGCCTGCCT GAGAGAACCT    900

CCCACCTTGC TCGTCCATGT CATACTCAAC CTGCTTCGCC AGGTCCGACT CCATAGGTTC    960

TGTGGGAGAC GGAGGGAGGG TGAGTAAGTC GACTTTTGAG ACGCTGGTCC GCCTGCAGAG    1020

GCGCAGACAT CGAAGAGCGA TCTTCGAGTG CTCCTGCAGC ATCTGCACGT CCGTCCGGGC    1080

GTCGCTCGCT GCTCCAGAGA CGCGACAAAC AATCCCCACT TGACGAGGAT CGAAGCGACT    1140

CACGCAGCCA CCGCAGGTAC CGCCCCGGCT CGCCATCCGC TATGCCCTTG TACGCATCCC    1200

ATTCCTGGCC GTCATTGTAC CCGAACGCGA CGAGCTGGGG GTTGTGAACA TCGGGCGGAG    1260

CGGGGGTGCT CGTGTCGACG ACGCGAAAGT TGACGACTGG GAGTGCGAGA GACGAGCCGT    1320

GAGCTCCTGG CATCCCGTTG GCAGTGTGTG AGCGTTCTAC TGATGAAGTC GAGGAGAGGA    1380

AGAGAAGGTT GTCGCTGGAC TGCTCGCTCC TACTGTCCCT GTGAGGCTAC GGGACTGCTT    1440

TCCGAGTCTA TCAGAGCTAC CTGAAGCCCT TAGTACCGCT CGACTTGCGC GCCACCCCAT    1500

CTCCTCCTCC TCCCGCTCCA TCCGTCGAGA TGCCGTCCAT CACGACCCGC ACCTACGCCG    1560

AACGGGCTGC CAAGCACCCC GTCCCGGTCG CAAAGCAGTT GCTCGACATC TGCGACCGCA    1620

AAAAGACCAA CCTCTGCGTT TCAGTCGACG TGACGAGCAA GGCGGGCCTG CTCAGGATCG    1680

CAGAGGCTGC CGGCCCGTAC TGCTGCTGCA TCAAGGTAGG TTGTACCGGC GCTGAAGTAA    1740

TCCGAGGACC GCAGCTGACA GACCGAGACA CCGACGATAG ACCCACATCG ACATCGTCGA    1800

GGACTTTGAC CGGGATCTCG TTCAGCAACT GCAGGCTCTC GCAGACAAGC ACGATTTTCT    1860

GATTTGGGAG GACCGCAAGT TTGCCGACAT CGGTGCGTCA ATCGAGACTC CCGACTACCT    1920

TCCCCGCTGA TGGCCCGCGA GACGACAGGC AACACCGTTC GGCTGCAGTA CTCGTCCGGT    1980

ATCTACAAGA TCGCATCCTG GGCGCACATC ACCAACGCCC ACTTGGTCCC CGGCGAGGGC    2040

ATCCTGACGG GCCTCGCATC CGTCGGTCTG CCCCTTGGCC GCGGTCTCCT GCTTCTCGCC    2100

GAGATGAGCG CCAAGGGCAA CCTCGCGACT GGCGAGTACA CGGCCAAGAA TGTCGAGGCG    2160

GCGAGGCGGC ATCCTGAATT CGTGATGGGC TTCGTTGCGA TGCGGAGGGT GGACGAGCGG    2220

GAAGAGACGG CTGGCGGTGT TGCGCCGGGA GAAGGGGTGC GTCCCATCTC ACTCTTTTCC    2280

GCTCAACTTC AGCTGACTCC GTGCTCCACC AGGCCGACTA CGTCATCATG ACGCCCGGCG    2340

TCGGACTCGA CTCGAAGGGC GACGGCATGG GCCAGCAGTA CCGTACACCC GACGAGGTCA    2400

TCCGCGAGTC CGGCTGCGAC GTTATCATCG TCGGTCGGGG TATCTACGGC GGCGGCGACG    2460

GCAACCCTAA CGAAGAGATC GTCAAGCAGT GCAAGCGGTA TCAGGAGGCG GGCTGGAAGG    2520

CGTACGAGGA CAGGCTGAGG CAGTGAATGG CGCGGCGCTC TCTAGACTTT CGAACGAGTG    2580

TAAGGCTATC TTGACAACAA CATGCACAAT CCGGTCGAGT CTACAACGTC TATCGCCTCT    2640

TCACGGACCG CTTCGGACCT GTCTGGACGA CGTGGCTTGA TGCGAAGCTG GGTAGCCACT    2700

TGTCGCTCGA ACTCTTCGCC AATGGCTGTT TCTTCGGTGG CGCGGCTGCC GTCTTGGCGG    2760

AAACAAGAGA AGGGAAGGGC GATGGCTGCT TCGCGCTGAG TTGAGCTGAG GAGGCGGAAG    2820

AAGAGACGTT CGACAGGCTG TTGTGGGCGG AGAGCGGTCG TGTGGGCGCC TCCTGCTTCG    2880

CCTTAGCCGA CGACGACGCG AAGTACGACG ACTCGACGAT CTCGACGTCG CTGCTGTCGT    2940

CGTCATTCCG CGCCTTTGCT GGTCGGGCGG GCACCTCATT CTCCATCTCC CTCAACCTCT    3000

GCTCTTCTCG CACCGCAGCT CGCATCGTTT CCTCATCCGC ATACTCCAGC TCATCATCCT    3060

CGTCATCGCT GTACTCGCGC GAGACCTCGC ACTCGTCCAT CAGCGTGCGC TCGTGCCGCT    3120

TCTTCGTTGG CGAGGCGAGC AGCTTCGATT TGTTGTTGAC CTTGAAGGAC GGGCCGTCAG    3180

AGGGAGGTGA AGGCGATCTG TACGAGCGCG AGGAGGCCGT GCGCTTGAAC TGGCGCGAAG    3240

GGAAGGAGGT GGAGGGGTTG TCGGTCATAG GGGATTCTTC GGCGTCACTG TCCGTCGCGA    3300

CGATGCCGCG CTTCGCTCGC AGCTCGGCAA CTTTCTTCTT CAGGCGCGCG AGCTGTGGCA    3360

CATCGTCTGT TAGCTCGACT AGTGCGAACG AAGGAAAAGA CCGGGCCACG CACGTCGGCT    3420

TCGTACCGCT TGTTGGCTCC CTCCACCCGC CTCCGCTTCT CCTCCTCCTG CTT           3473

SEQ ID NO：4(绿色荧光蛋白编码基因)

ATGAGTAAAG GAGAAGAACT TTTCACTGGA GTTGTCCCAA TTCTTGTTGA ATTAGATGGT    60

GATGTTAATG GGCACAAATT TTCTGTCAGT GGAGAGGGTG AAGGTGATGC AACATACGGA    120

AAACTTACCC TTAAATTTAT TTGCACTACT GGAAAACTAC CTGTTCCATG GCCAACACTT    180

GTCACTACTT TCTCTTATGG TGTTCAATGC TTTTCCCGTT ATCCGGATCA TATGAAACGG    240

CATGACTTTT TCAAGAGTGC CATGCCCGAA GGTTATGTAC AGGAACGCAC TATATCTTTC    300

AAAGATGACG GGAACTACAA GACGCGTGCT GAAGTCAAGT TTGAAGGTGA TACCCTTGTT    360

AATCGTATCG AGTTAAAAGG TATTGATTTT AAAGAAGATG GAAACATTCT CGGACACAAA    420

CTCGAGTACA ACTATAACTC ACACAATGTA TACATCACGG CAGACAAACA AAAGAATGGA    480

ATCAAAGCTA ACTTCAAAAT TCGCCACAAC ATTGAAGATG GATCCGTTCA ACTAGCAGAC    540

CATTATCAAC AAAATACTCC AATTGGCGAT GGCCCTGTCC TTTTACCAGA CAACCATTAC    600

CTGTCGACAC AATCTGCCCT TTCGAAAGAT CCCAACGAAA AGCGTGACCA CATGGTCCTT    660

CTTGAGTTTG TAACTGCTGC TGGGATTACA CATGGCATGG ATGAGCTCTA CAAATAA       717

SEQ ID NO：5(绿色荧光蛋白编码基因)

TGACCGGAGC AACAAGACGT GGGCGAGTAT ACGCACTGGA TGCAGGCGCC GACGCGTTTC    60

TTGCACAAAT AGCAGACCTG CGAACGAACT CTTCGTCAGC TCGAAGCTTG AAAGACTCGC    120

CGCTTTCGAC TCACCAGCTT CCATCGACTC TTGGGGATGT TCTCGAGACC GTCGACCGGC    180

TCCATATACA CCGTGTTGCT GACGCCTGTT TCGGGAACCC AGATCGCGCA GAGCAAGTGT    240

GCCCACTGGC CCGTTGTCGT TTGTTTGAAG GCGCCGTACG AGTTGGGGCA AAGCACGCAG    300

GTCTACGAGA GATAATAGTC AGGTTTTGAG CGTAGCAAAG GCCCCGGACG GAAACGCACG    360

ACTGGCTTGT CGGGCGAGAC GGTGCATTTG CGGCAGAGCC ACTGTCCTTC CGGGATGTAC    420

GGAACGCCGT AGCAATCTGC GAGGAAGCGA CAAAGATGAG CATCAGATCC TCGTCGTGAC    480

CACGCTGTGC AGCCATGCAA CGTGAGAACT CGCGACGCAC CTTGGTGGAC CGCCAAGTTG    540

CATCCGTCGC AGAAGACGAT CGCATTCGAG TTCTCGCACT CGCCGTCGTC GCAAATGGCA    600

CATTTGCTGT CTTCGCTCGG CAAGGCATTC GTCCGCTTCG GGATATTGCG AGTCTGCGAA    660

AGACGAGCGA GACGGTCAGC AGGTCGCGAG AAGTTGAGGG AGGGCGAGAA CGGACCAGGT    720

CGAACCACTC CTTCTCAATC TTGTCCATGA CAATCTCAAA GAGCTCGTAC GGGATGGTGG    780

CAAGACCGTC CTTCTTCCGC TCCGCGTTGA GCGTGTCGAG CCAGAGTTGG TCTGTGGGTT    840

TCGCCGTCCA TACAGGCTGT CAGCTGTCGT ACAAATCGTC AAGCCTGCCT GAGAGAACCT    900

CCCACCTTGC TCGTCCATGT CATACTCAAC CTGCTTCGCC AGGTCCGACT CCATAGGTTC    960

TGTGGGAGAC GGAGGGAGGG TGAGTAAGTC GACTTTTGAG ACGCTGGTCC GCCTGCAGAG    1020

GCGCAGACAT CGAAGAGCGA TCTTCGAGTG CTCCTGCAGC ATCTGCACGT CCGTCCGGGC    1080

GTCGCTCGCT GCTCCAGAGA CGCGACAAAC AATCCCCACT TGACGAGGAT CGAAGCGACT    1140

CACGCAGCCA CCGCAGGTAC CGCCCCGGCT CGCCATCCGC TATGCCCTTG TACGCATCCC    1200

ATTCCTGGCC GTCATTGTAC CCGAACGCGA CGAGCTGGGG GTTGTGAACA TCGGGCGGAG    1260

CGGGGGTGCT CGTGTCGACG ACGCGAAAGT TGACGACTGG GAGTGCGAGA GACGAGCCGT    1320

GAGCTCCTGG CATCCCGTTG GCAGTGTGTG AGCGTTCTAC TGATGAAGTC GAGGAGAGGA    1380

AGAGAAGGTT GTCGCTGGAC TGCTCGCTCC TACTGTCCCT GTGAGGCTAC GGGACTGCTT    1440

TCCGAGTCTA TCAGAGCTAC CTGAAGCCCT TAGTACCGCT CGACTTGCGC GCCACCCCAT    1500

CTCCTCCTCC TCCCGCTCCA TCCGTCGAGA TGAGTAAAGG AGAAGAACTT TTCACTGGAG    1560

TTGTCCCAAT TCTTGTTGAA TTAGATGGTG ATGTTAATGG GCACAAATTT TCTGTCAGTG    1620

GAGAGGGTGA AGGTGATGCA ACATACGGAA AACTTACCCT TAAATTTATT TGCACTACTG    1680

GAAAACTACC TGTTCCATGG CCAACACTTG TCACTACTTT CTCTTATGGT GTTCAATGCT    1740

TTTCCCGTTA TCCGGATCAT ATGAAACGGC ATGACTTTTT CAAGAGTGCC ATGCCCGAAG    1800

GTTATGTACA GGAACGCACT ATATCTTTCA AAGATGACGG GAACTACAAG ACGCGTGCTG    1860

AAGTCAAGTT TGAAGGTGAT ACCCTTGTTA ATCGTATCGA GTTAAAAGGT ATTGATTTTA    1920

AAGAAGATGG AAACATTCTC GGACACAAAC TCGAGTACAA CTATAACTCA CACAATGTAT    1980

ACATCACGGC AGACAAACAA AAGAATGGAA TCAAAGCTAA CTTCAAAATT CGCCACAACA    2040

TTGAAGATGG ATCCGTTCAA CTAGCAGACC ATTATCAACA AAATACTCCA ATTGGCGATG    2100

GCCCTGTCCT TTTACCAGAC AACCATTACC TGTCGACACA ATCTGCCCTT TCGAAAGATC    2160

CCAACGAAAA GCGTGACCAC ATGGTCCTTC TTGAGTTTGT AACTGCTGCT GGGATTACAC    2220

ATGGCATGGA TGAGCTCTAC AAATGAATGG CGCGGCGCTC TCTAGACTTT CGAACGAGTG    2280

TAAGGCTATC TTGACAACAA CATGCACAAT CCGGTCGAGT CTACAACGTC TATCGCCTCT    2340

TCACGGACCG CTTCGGACCT GTCTGGACGA CGTGGCTTGA TGCGAAGCTG GGTAGCCACT    2400

TGTCGCTCGA ACTCTTCGCC AATGGCTGTT TCTTCGGTGG CGCGGCTGCC GTCTTGGCGG    2460

AAACAAGAGA AGGGAAGGGC GATGGCTGCT TCGCGCTGAG TTGAGCTGAG GAGGCGGAAG    2520

AAGAGACGTT CGACAGGCTG TTGTGGGCGG AGAGCGGTCG TGTGGGCGCC TCCTGCTTCG    2580

CCTTAGCCGA CGACGACGCG AAGTACGACG ACTCGACGAT CTCGACGTCG CTGCTGTCGT    2640

CGTCATTCCG CGCCTTTGCT GGTCGGGCGG GCACCTCATT CTCCATCTCC CTCAACCTCT    2700

GCTCTTCTCG CACCGCAGCT CGCATCGTTT CCTCATCCGC ATACTCCAGC TCATCATCCT    2760

CGTCATCGCT GTACTCGCGC GAGACCTCGC ACTCGTCCAT CAGCGTGCGC TCGTGCCGCT    2820

TCTTCGTTGG CGAGGCGAGC AGCTTCGATT TGTTGTTGAC CTTGAAGGAC GGGCCGTCAG    2880

AGGGAGGTGA AGGCGATCTG TACGAGCGCG AGGAGGCCGT GCGCTTGAAC TGGCGCGAAG    2940

GGAAGGAGGT GGAGGGGTTG TCGGTCATAG GGGATTCTTC GGCGTCACTG TCCGTCGCGA    3000

CGATGCCGCG CTTCGCTCGC AGCTCGGCAA CTTTCTTCTT CAGGCGCGCG AGCTGTGGCA    3060

CATCGTCTGT TAGCTCGACT AGTGCGAACG AAGGAAAAGA CCGGGCCACG CACGTCGGCT    3120

TCGTACCGCT TGTTGGCTCC CTCCACCCGC CTCCGCTTCT CCTCCTCCTG CTT           3173

SEQ ID NO：6(博来霉素抗性基因ble)

ATGGCCAAGT TGACCAGTGC CGTTCCGGTG CTCACCGCGC GCGACGTCGC CGGAGCGGTC    60

GAGTTCTGGA CCGACCGGCT CGGGTTCTCC CGGGACTTCG TGGAGGACGA CTTCGCCGGT    120

GTGGTCCGGG ACGACGTGAC CCTGTTCATC AGCGCGGTCC AGGACCAGGT GGTGCCGGAC    180

AACACCCTGG CCTGGGTGTG GGTGCGCGGC CTGGACGAGC TGTACGCCGA GTGGTCGGAG    240

GTCGTGTCCA CGAACTTCCG GGACGCCTCC GGGCCGGCCA TGACCGAGAT CGGCGAGCAG    300

CCGTGGGGGC GGGAGTTCGC CCTGCGCGAC CCGGCCGGCA ACTGCGTGCA CTTCGTGGCC    360

GAGGAGCAGG ACTGA                                                     375

SEQ ID NO：7(博来霉素抗性基因ble)

TGACCGGAGC AACAAGACGT GGGCGAGTAT ACGCACTGGA TGCAGGCGCC GACGCGTTTC    60

TTGCACAAAT AGCAGACCTG CGAACGAACT CTTCGTCAGC TCGAAGCTTG AAAGACTCGC    120

CGCTTTCGAC TCACCAGCTT CCATCGACTC TTGGGGATGT TCTCGAGACC GTCGACCGGC    180

TCCATATACA CCGTGTTGCT GACGCCTGTT TCGGGAACCC AGATCGCGCA GAGCAAGTGT    240

GCCCACTGGC CCGTTGTCGT TTGTTTGAAG GCGCCGTACG AGTTGGGGCA AAGCACGCAG    300

GTCTACGAGA GATAATAGTC AGGTTTTGAG CGTAGCAAAG GCCCCGGACG GAAACGCACG    360

ACTGGCTTGT CGGGCGAGAC GGTGCATTTG CGGCAGAGCC ACTGTCCTTC CGGGATGTAC    420

GGAACGCCGT AGCAATCTGC GAGGAAGCGA CAAAGATGAG CATCAGATCC TCGTCGTGAC    480

CACGCTGTGC AGCCATGCAA CGTGAGAACT CGCGACGCAC CTTGGTGGAC CGCCAAGTTG    540

CATCCGTCGC AGAAGACGAT CGCATTCGAG TTCTCGCACT CGCCGTCGTC GCAAATGGCA    600

CATTTGCTGT CTTCGCTCGG CAAGGCATTC GTCCGCTTCG GGATATTGCG AGTCTGCGAA    660

AGACGAGCGA GACGGTCAGC AGGTCGCGAG AAGTTGAGGG AGGGCGAGAA CGGACCAGGT    720

CGAACCACTC CTTCTCAATC TTGTCCATGA CAATCTCAAA GAGCTCGTAC GGGATGGTGG    780

CAAGACCGTC CTTCTTCCGC TCCGCGTTGA GCGTGTCGAG CCAGAGTTGG TCTGTGGGTT    840

TCGCCGTCCA TACAGGCTGT CAGCTGTCGT ACAAATCGTC AAGCCTGCCT GAGAGAACCT    900

CCCACCTTGC TCGTCCATGT CATACTCAAC CTGCTTCGCC AGGTCCGACT CCATAGGTTC    960

TGTGGGAGAC GGAGGGAGGG TGAGTAAGTC GACTTTTGAG ACGCTGGTCC GCCTGCAGAG    1020

GCGCAGACAT CGAAGAGCGA TCTTCGAGTG CTCCTGCAGC ATCTGCACGT CCGTCCGGGC    1080

GTCGCTCGCT GCTCCAGAGA CGCGACAAAC AATCCCCACT TGACGAGGAT CGAAGCGACT    1140

CACGCAGCCA CCGCAGGTAC CGCCCCGGCT CGCCATCCGC TATGCCCTTG TACGCATCCC    1200

ATTCCTGGCC GTCATTGTAC CCGAACGCGA CGAGCTGGGG GTTGTGAACA TCGGGCGGAG    1260

CGGGGGTGCT CGTGTCGACG ACGCGAAAGT TGACGACTGG GAGTGCGAGA GACGAGCCGT    1320

GAGCTCCTGG CATCCCGTTG GCAGTGTGTG AGCGTTCTAC TGATGAAGTC GAGGAGAGGA    1380

AGAGAAGGTT GTCGCTGGAC TGCTCGCTCC TACTGTCCCT GTGAGGCTAC GGGACTGCTT    1440

TCCGAGTCTA TCAGAGCTAC CTGAAGCCCT TAGTACCGCT CGACTTGCGC GCCACCCCAT    1500

CTCCTCCTCC TCCCGCTCCA TCCGTCGAGA TGGCCAAGTT GACCAGTGCC GTTCCGGTGC    1560

TCACCGCGCG CGACGTCGCC GGAGCGGTCG AGTTCTGGAC CGACCGGCTC GGGTTCTCCC    1620

GGGACTTCGT GGAGGACGAC TTCGCCGGTG TGGTCCGGGA CGACGTGACC CTGTTCATCA    1680

GCGCGGTCCA GGACCAGGTG GTGCCGGACA ACACCCTGGC CTGGGTGTGG GTGCGCGGCC    1740

TGGACGAGCT GTACGCCGAG TGGTCGGAGG TCGTGTCCAC GAACTTCCGG GACGCCTCCG    1800

GGCCGGCCAT GACCGAGATC GGCGAGCAGC CGTGGGGGCG GGAGTTCGCC CTGCGCGACC    1860

CGGCCGGCAA CTGCGTGCAC TTCGTGGCCG AGGAGCAGGA CTGAATGGCG CGGCGCTCTC    1920

TAGACTTTCG AACGAGTGTA AGGCTATCTT GACAACAACA TGCACAATCC GGTCGAGTCT    1980

ACAACGTCTA TCGCCTCTTC ACGGACCGCT TCGGACCTGT CTGGACGACG TGGCTTGATG    2040

CGAAGCTGGG TAGCCACTTG TCGCTCGAAC TCTTCGCCAA TGGCTGTTTC TTCGGTGGCG    2100

CGGCTGCCGT CTTGGCGGAA ACAAGAGAAG GGAAGGGCGA TGGCTGCTTC GCGCTGAGTT    2160

GAGCTGAGGA GGCGGAAGAA GAGACGTTCG ACAGGCTGTT GTGGGCGGAG AGCGGTCGTG    2220

TGGGCGCCTC CTGCTTCGCC TTAGCCGACG ACGACGCGAA GTACGACGAC TCGACGATCT    2280

CGACGTCGCT GCTGTCGTCG TCATTCCGCG CCTTTGCTGG TCGGGCGGGC ACCTCATTCT    2340

CCATCTCCCT CAACCTCTGC TCTTCTCGCA CCGCAGCTCG CATCGTTTCC TCATCCGCAT    2400

ACTCCAGCTC ATCATCCTCG TCATCGCTGT ACTCGCGCGA GACCTCGCAC TCGTCCATCA    2460

GCGTGCGCTC GTGCCGCTTC TTCGTTGGCG AGGCGAGCAG CTTCGATTTG TTGTTGACCT    2520

TGAAGGACGG GCCGTCAGAG GGAGGTGAAG GCGATCTGTA CGAGCGCGAG GAGGCCGTGC    2580

GCTTGAACTG GCGCGAAGGG AAGGAGGTGG AGGGGTTGTC GGTCATAGGG GATTCTTCGG    2640

CGTCACTGTC CGTCGCGACG ATGCCGCGCT TCGCTCGCAG CTCGGCAACT TTCTTCTTCA    2700

GGCGCGCGAG CTGTGGCACA TCGTCTGTTA GCTCGACTAG TGCGAACGAA GGAAAAGACC    2760

GGGCCACGCA CGTCGGCTTC GTACCGCTTG TTGGCTCCCT CCACCCGCCT CCGCTTCTCC    2820

TCCTCCTGCT T                                                         2831

SEQ ID NO：8(遗传霉素抗性基因kanmx4)

ATGGGTAAGG AAAAGACTCA CGTTTCGAGG CCGCGATTAA ATTCCAACAT GGATGCTGAT    60

TTATATGGGT ATAAATGGGC TCGCGATAAT GTCGGGCAAT CAGGTGCGAC AATCTATCGA    120

TTGTATGGGA AGCCCGATGC GCCAGAGTTG TTTCTGAAAC ATGGCAAAGG TAGCGTTGCC    180

AATGATGTTA CAGATGAGAT GGTCAGACTA AACTGGCTGA CGGAATTTAT GCCTCTTCCG    240

ACCATCAAGC ATTTTATCCG TACTCCTGAT GATGCATGGT TACTCACCAC TGCGATCCCC    300

GGCAAAACAG CATTCCAGGT ATTAGAAGAA TATCCTGATT CAGGTGAAAA TATTGTTGAT    360

GCGCTGGCAG TGTTCCTGCG CCGGTTGCAT TCGATTCCTG TTTGTAATTG TCCTTTTAAC    420

AGCGATCGCG TATTTCGTCT CGCTCAGGCG CAATCACGAA TGAATAACGG TTTGGTTGAT    480

GCGAGTGATT TTGATGACGA GCGTAATGGC TGGCCTGTTG AACAAGTCTG GAAAGAAATG    540

CATAAGCTTT TGCCATTCTC ACCGGATTCA GTCGTCACTC ATGGTGATTT CTCACTTGAT    600

AACCTTATTT TTGACGAGGG GAAATTAATA GGTTGTATTG ATGTTGGACG AGTCGGAATC    660

GCAGACCGAT ACCAGGATCT TGCCATCCTA TGGAACTGCC TCGGTGAGTT TTCTCCTTCA    720

TTACAGAAAC GGCTTTTTCA AAAATATGGT ATTGATAATC CTGATATGAA TAAATTGCAG    780

TTTCATTTGA TGCTCGATGA GTTTTTCTAA                                     810

SEQ ID NO：9(遗传霉素抗性基因kanmx4)

TGACCGGAGC AACAAGACGT GGGCGAGTAT ACGCACTGGA TGCAGGCGCC GACGCGTTTC    60

TTGCACAAAT AGCAGACCTG CGAACGAACT CTTCGTCAGC TCGAAGCTTG AAAGACTCGC    120

CGCTTTCGAC TCACCAGCTT CCATCGACTC TTGGGGATGT TCTCGAGACC GTCGACCGGC    180

TCCATATACA CCGTGTTGCT GACGCCTGTT TCGGGAACCC AGATCGCGCA GAGCAAGTGT    240

GCCCACTGGC CCGTTGTCGT TTGTTTGAAG GCGCCGTACG AGTTGGGGCA AAGCACGCAG    300

GTCTACGAGA GATAATAGTC AGGTTTTGAG CGTAGCAAAG GCCCCGGACG GAAACGCACG    360

ACTGGCTTGT CGGGCGAGAC GGTGCATTTG CGGCAGAGCC ACTGTCCTTC CGGGATGTAC    420

GGAACGCCGT AGCAATCTGC GAGGAAGCGA CAAAGATGAG CATCAGATCC TCGTCGTGAC    480

CACGCTGTGC AGCCATGCAA CGTGAGAACT CGCGACGCAC CTTGGTGGAC CGCCAAGTTG    540

CATCCGTCGC AGAAGACGAT CGCATTCGAG TTCTCGCACT CGCCGTCGTC GCAAATGGCA    600

CATTTGCTGT CTTCGCTCGG CAAGGCATTC GTCCGCTTCG GGATATTGCG AGTCTGCGAA    660

AGACGAGCGA GACGGTCAGC AGGTCGCGAG AAGTTGAGGG AGGGCGAGAA CGGACCAGGT    720

CGAACCACTC CTTCTCAATC TTGTCCATGA CAATCTCAAA GAGCTCGTAC GGGATGGTGG    780

CAAGACCGTC CTTCTTCCGC TCCGCGTTGA GCGTGTCGAG CCAGAGTTGG TCTGTGGGTT    840

TCGCCGTCCA TACAGGCTGT CAGCTGTCGT ACAAATCGTC AAGCCTGCCT GAGAGAACCT    900

CCCACCTTGC TCGTCCATGT CATACTCAAC CTGCTTCGCC AGGTCCGACT CCATAGGTTC    960

TGTGGGAGAC GGAGGGAGGG TGAGTAAGTC GACTTTTGAG ACGCTGGTCC GCCTGCAGAG    1020

GCGCAGACAT CGAAGAGCGA TCTTCGAGTG CTCCTGCAGC ATCTGCACGT CCGTCCGGGC    1080

GTCGCTCGCT GCTCCAGAGA CGCGACAAAC AATCCCCACT TGACGAGGAT CGAAGCGACT    1140

CACGCAGCCA CCGCAGGTAC CGCCCCGGCT CGCCATCCGC TATGCCCTTG TACGCATCCC    1200

ATTCCTGGCC GTCATTGTAC CCGAACGCGA CGAGCTGGGG GTTGTGAACA TCGGGCGGAG    1260

CGGGGGTGCT CGTGTCGACG ACGCGAAAGT TGACGACTGG GAGTGCGAGA GACGAGCCGT    1320

GAGCTCCTGG CATCCCGTTG GCAGTGTGTG AGCGTTCTAC TGATGAAGTC GAGGAGAGGA    1380

AGAGAAGGTT GTCGCTGGAC TGCTCGCTCC TACTGTCCCT GTGAGGCTAC GGGACTGCTT    1440

TCCGAGTCTA TCAGAGCTAC CTGAAGCCCT TAGTACCGCT CGACTTGCGC GCCACCCCAT    1500

CTCCTCCTCC TCCCGCTCCA TCCGTCGAGA TGGGTAAGGA AAAGACTCAC GTTTCGAGGC    1560

CGCGATTAAA TTCCAACATG GATGCTGATT TATATGGGTA TAAATGGGCT CGCGATAATG    1620

TCGGGCAATC AGGTGCGACA ATCTATCGAT TGTATGGGAA GCCCGATGCG CCAGAGTTGT    1680

TTCTGAAACA TGGCAAAGGT AGCGTTGCCA ATGATGTTAC AGATGAGATG GTCAGACTAA    1740

ACTGGCTGAC GGAATTTATG CCTCTTCCGA CCATCAAGCA TTTTATCCGT ACTCCTGATG    1800

ATGCATGGTT ACTCACCACT GCGATCCCCG GCAAAACAGC ATTCCAGGTA TTAGAAGAAT    1860

ATCCTGATTC AGGTGAAAAT ATTGTTGATG CGCTGGCAGT GTTCCTGCGC CGGTTGCATT    1920

CGATTCCTGT TTGTAATTGT CCTTTTAACA GCGATCGCGT ATTTCGTCTC GCTCAGGCGC    1980

AATCACGAAT GAATAACGGT TTGGTTGATG CGAGTGATTT TGATGACGAG CGTAATGGCT    2040

GGCCTGTTGA ACAAGTCTGG AAAGAAATGC ATAAGCTTTT GCCATTCTCA CCGGATTCAG    2100

TCGTCACTCA TGGTGATTTC TCACTTGATA ACCTTATTTT TGACGAGGGG AAATTAATAG    2160

GTTGTATTGA TGTTGGACGA GTCGGAATCG CAGACCGATA CCAGGATCTT GCCATCCTAT    2220

GGAACTGCCT CGGTGAGTTT TCTCCTTCAT TACAGAAACG GCTTTTTCAA AAATATGGTA    2280

TTGATAATCC TGATATGAAT AAATTGCAGT TTCATTTGAT GCTCGATGAG TTTTTCTAAA    2340

TGGCGCGGCG CTCTCTAGAC TTTCGAACGA GTGTAAGGCT ATCTTGACAA CAACATGCAC    2400

AATCCGGTCG AGTCTACAAC GTCTATCGCC TCTTCACGGA CCGCTTCGGA CCTGTCTGGA    2460

CGACGTGGCT TGATGCGAAG CTGGGTAGCC ACTTGTCGCT CGAACTCTTC GCCAATGGCT    2520

GTTTCTTCGG TGGCGCGGCT GCCGTCTTGG CGGAAACAAG AGAAGGGAAG GGCGATGGCT    2580

GCTTCGCGCT GAGTTGAGCT GAGGAGGCGG AAGAAGAGAC GTTCGACAGG CTGTTGTGGG    2640

CGGAGAGCGG TCGTGTGGGC GCCTCCTGCT TCGCCTTAGC CGACGACGAC GCGAAGTACG    2700

ACGACTCGAC GATCTCGACG TCGCTGCTGT CGTCGTCATT CCGCGCCTTT GCTGGTCGGG    2760

CGGGCACCTC ATTCTCCATC TCCCTCAACC TCTGCTCTTC TCGCACCGCA GCTCGCATCG    2820

TTTCCTCATC CGCATACTCC AGCTCATCAT CCTCGTCATC GCTGTACTCG CGCGAGACCT    2880

CGCACTCGTC CATCAGCGTG CGCTCGTGCC GCTTCTTCGT TGGCGAGGCG AGCAGCTTCG    2940

ATTTGTTGTT GACCTTGAAG GACGGGCCGT CAGAGGGAGG TGAAGGCGAT CTGTACGAGC    3000

GCGAGGAGGC CGTGCGCTTG AACTGGCGCG AAGGGAAGGA GGTGGAGGGG TTGTCGGTCA    3060

TAGGGGATTC TTCGGCGTCA CTGTCCGTCG CGACGATGCC GCGCTTCGCT CGCAGCTCGG    3120

CAACTTTCTT CTTCAGGCGC GCGAGCTGTG GCACATCGTC TGTTAGCTCG ACTAGTGCGA    3180

ACGAAGGAAA AGACCGGGCC ACGCACGTCG GCTTCGTACC GCTTGTTGGC TCCCTCCACC    3240

CGCCTCCGCT TCTCCTCCTC CTGCTT                                         3266

乳清3.ST25

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院大连化学物理研究所

<120>乳清酸核苷？5’？磷酸脱羧酶启动子及应用和构建体与载体

<130>

<160>9

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1529

<212>DNA

<213>圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)

<220>

<221>promoter

<222>(630)..(1529)

<223>

<400>1

tgaccggagc aacaagacgt gggcgagtat acgcactgga tgcaggcgcc gacgcgtttc   60

ttgcacaaat agcagacctg cgaacgaact cttcgtcagc tcgaagcttg aaagactcgc  120

cgctttcgac tcaccagctt ccatcgactc ttggggatgt tctcgagacc gtcgaccggc  180

tccatataca ccgtgttgct gacgcctgtt tcgggaaccc agatcgcgca gagcaagtgt  240

gcccactggc ccgttgtcgt ttgtttgaag gcgccgtacg agttggggca aagcacgcag  300

gtctacgaga gataatagtc aggttttgag cgtagcaaag gccccggacg gaaacgcacg  360

actggcttgt cgggcgagac ggtgcatttg cggcagagcc actgtccttc cgggatgtac  420

ggaacgccgt agcaatctgc gaggaagcga caaagatgag catcagatcc tcgtcgtgac  480

cacgctgtgc agccatgcaa cgtgagaact cgcgacgcac cttggtggac cgccaagttg  540

catccgtcgc agaagacgat cgcattcgag ttctcgcact cgccgtcgtc gcaaatggca  600

catttgctgt cttcgctcgg caaggcattc gtccgcttcg ggatattgcg agtctgcgaa  660

agacgagcga gacggtcagc aggtcgcgag aagttgaggg agggcgagaa cggaccaggt  720

cgaaccactc cttctcaatc ttgtccatga caatctcaaa gagctcgtac gggatggtgg  780

caagaccgtc cttcttccgc tccgcgttga gcgtgtcgag ccagagttgg tctgtgggtt  840

tcgccgtcca tacaggctgt cagctgtcgt acaaatcgtc aagcctgcct gagagaacct  900

cccaccttgc tcgtccatgt catactcaac ctgcttcgcc aggtccgact ccataggttc  960

tgtgggagac ggagggaggg tgagtaagtc gacttttgag acgctggtcc gcctgcagag  1020

gcgcagacat cgaagagcga tcttcgagtg ctcctgcagc atctgcacgt ccgtccgggc  1080

gtcgctcgct gctccagaga cgcgacaaac aatccccact tgacgaggat cgaagcgact  1140

cacgcagcca ccgcaggtac cgccccggct cgccatccgc tatgcccttg tacgcatccc  1200

attcctggcc gtcattgtac ccgaacgcga cgagctgggg gttgtgaaca tcgggcggag  1260

cgggggtgct cgtgtcgacg acgcgaaagt tgacgactgg gagtgcgaga gacgagccgt  1320

gagctcctgg catcccgttg gcagtgtgtg agcgttctac tgatgaagtc gaggagagga  1380

agagaaggtt gtcgctggac tgctcgctcc tactgtccct gtgaggctac gggactgctt  1440

tccgagtcta tcagagctac ctgaagccct tagtaccgct cgacttgcgc gccaccccat  1500

ctcctcctcc tcccgctcca tccgtcgag                                    1529

<210>2

<211>927

<212>DNA

<213>圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)

<220>

<221>terminator

<222>(1)..(927)

<223>

<400>2

atggcgcggc gctctctaga ctttcgaacg agtgtaaggc tatcttgaca acaacatgca  60

caatccggtc gagtctacaa cgtctatcgc ctcttcacgg accgcttcgg acctgtctgg  120

acgacgtggc ttgatgcgaa gctgggtagc cacttgtcgc tcgaactctt cgccaatggc  180

tgtttcttcg gtggcgcggc tgccgtcttg gcggaaacaa gagaagggaa gggcgatggc  240

tgcttcgcgc tgagttgagc tgaggaggcg gaagaagaga cgttcgacag gctgttgtgg  300

gcggagagcg gtcgtgtggg cgcctcctgc ttcgccttag ccgacgacga cgcgaagtac  360

gacgactcga cgatctcgac gtcgctgctg tcgtcgtcat tccgcgcctt tgctggtcgg  420

gcgggcacct cattctccat ctccctcaac ctctgctctt ctcgcaccgc agctcgcatc  480

gtttcctcat ccgcatactc cagctcatca tcctcgtcat cgctgtactc gcgcgagacc  540

tcgcactcgt ccatcagcgt gcgctcgtgc cgcttcttcg ttggcgaggc gagcagcttc  600

gatttgttgt tgaccttgaa ggacgggccg tcagagggag gtgaaggcga tctgtacgag  660

cgcgaggagg ccgtgcgctt gaactggcgc gaagggaagg aggtggaggg gttgtcggtc  720

ataggggatt cttcggcgtc actgtccgtc gcgacgatgc cgcgcttcgc tcgcagctcg  780

gcaactttct tcttcaggcg cgcgagctgt ggcacatcgt ctgttagctc gactagtgcg  840

aacgaaggaa aagaccgggc cacgcacgtc ggcttcgtac cgcttgttgg ctccctccac  900

ccgcctccgc ttctcctcct cctgctt                                      927

<210>3

<211>3473

<212>DNA

<213>圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)

<220>

<221>promoter

<222>(630)..(1529)

<223>

<220>

<221>terminator

<222>(2547)..(3473)

<223>

<400>3

tgaccggagc aacaagacgt gggcgagtat acgcactgga tgcaggcgcc gacgcgtttc  60

ttgcacaaat agcagacctg cgaacgaact cttcgtcagc tcgaagcttg aaagactcgc  120

cgctttcgac tcaccagctt ccatcgactc ttggggatgt tctcgagacc gtcgaccggc  180

tccatataca ccgtgttgct gacgcctgtt tcgggaaccc agatcgcgca gagcaagtgt  240

gcccactggc ccgttgtcgt ttgtttgaag gcgccgtacg agttggggca aagcacgcag  300

gtctacgaga gataatagtc aggttttgag cgtagcaaag gccccggacg gaaacgcacg  360

actggcttgt cgggcgagac ggtgcatttg cggcagagcc actgtccttc cgggatgtac  420

ggaacgccgt agcaatctgc gaggaagcga caaagatgag catcagatcc tcgtcgtgac  480

cacgctgtgc agccatgcaa cgtgagaact cgcgacgcac cttggtggac cgccaagttg  540

catccgtcgc agaagacgat cgcattcgag ttctcgcact cgccgtcgtc gcaaatggca  600

catttgctgt cttcgctcgg caaggcattc gtccgcttcg ggatattgcg agtctgcgaa  660

agacgagcga gacggtcagc aggtcgcgag aagttgaggg agggcgagaa cggaccaggt  720

cgaaccactc cttctcaatc ttgtccatga caatctcaaa gagctcgtac gggatggtgg  780

caagaccgtc cttcttccgc tccgcgttga gcgtgtcgag ccagagttgg tctgtgggtt  840

tcgccgtcca tacaggctgt cagctgtcgt acaaatcgtc aagcctgcct gagagaacct  900

cccaccttgc tcgtccatgt catactcaac ctgcttcgcc aggtccgact ccataggttc  960

tgtgggagac ggagggaggg tgagtaagtc gacttttgag acgctggtcc gcctgcagag  1020

gcgcagacat cgaagagcga tcttcgagtg ctcctgcagc atctgcacgt ccgtccgggc  1080

gtcgctcgct gctccagaga cgcgacaaac aatccccact tgacgaggat cgaagcgact  1140

cacgcagcca ccgcaggtac cgccccggct cgccatccgc tatgcccttg tacgcatccc  1200

attcctggcc gtcattgtac ccgaacgcga cgagctgggg gttgtgaaca tcgggcggag  1260

cgggggtgct cgtgtcgacg acgcgaaagt tgacgactgg gagtgcgaga gacgagccgt    1320

gagctcctgg catcccgttg gcagtgtgtg agcgttctac tgatgaagtc gaggagagga    1380

agagaaggtt gtcgctggac tgctcgctcc tactgtccct gtgaggctac gggactgctt    1440

tccgagtcta tcagagctac ctgaagccct tagtaccgct cgacttgcgc gccaccccat    1500

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aaaagaccaa cctctgcgtt tcagtcgacg tgacgagcaa ggcgggcctg ctcaggatcg    1680

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tccgaggacc gcagctgaca gaccgagaca ccgacgatag acccacatcg acatcgtcga    1800

ggactttgac cgggatctcg ttcagcaact gcaggctctc gcagacaagc acgattttct    1860

gatttgggag gaccgcaagt ttgccgacat cggtgcgtca atcgagactc ccgactacct    1920

tccccgctga tggcccgcga gacgacaggc aacaccgttc ggctgcagta ctcgtccggt    1980

atctacaaga tcgcatcctg ggcgcacatc accaacgccc acttggtccc cggcgagggc    2040

atcctgacgg gcctcgcatc cgtcggtctg ccccttggcc gcggtctcct gcttctcgcc    2100

gagatgagcg ccaagggcaa cctcgcgact ggcgagtaca cggccaagaa tgtcgaggcg    2160

gcgaggcggc atcctgaatt cgtgatgggc ttcgttgcga tgcggagggt ggacgagcgg    2220

gaagagacgg ctggcggtgt tgcgccggga gaaggggtgc gtcccatctc actcttttcc    2280

gctcaacttc agctgactcc gtgctccacc aggccgacta cgtcatcatg acgcccggcg    2340

tcggactcga ctcgaagggc gacggcatgg gccagcagta ccgtacaccc gacgaggtca    2400

tccgcgagtc cggctgcgac gttatcatcg tcggtcgggg tatctacggc ggcggcgacg    2460

gcaaccctaa cgaagagatc gtcaagcagt gcaagcggta tcaggaggcg ggctggaagg    2520

cgtacgagga caggctgagg cagtgaatgg cgcggcgctc tctagacttt cgaacgagtg    2580

taaggctatc ttgacaacaa catgcacaat ccggtcgagt ctacaacgtc tatcgcctct    2640

tcacggaccg cttcggacct gtctggacga cgtggcttga tgcgaagctg ggtagccact    2700

tgtcgctcga actcttcgcc aatggctgtt tcttcggtgg cgcggctgcc gtcttggcgg    2760

aaacaagaga agggaagggc gatggctgct tcgcgctgag ttgagctgag gaggcggaag    2820

aagagacgtt cgacaggctg ttgtgggcgg agagcggtcg tgtgggcgcc tcctgcttcg    2880

ccttagccga cgacgacgcg aagtacgacg actcgacgat ctcgacgtcg ctgctgtcgt    2940

cgtcattccg cgcctttgct ggtcgggcgg gcacctcatt ctccatctcc ctcaacctct    3000

gctcttctcg caccgcagct cgcatcgttt cctcatccgc atactccagc tcatcatcct    3060

cgtcatcgct gtactcgcgc gagacctcgc actcgtccat cagcgtgcgc tcgtgccgct    3120

tcttcgttgg cgaggcgagc agcttcgatt tgttgttgac cttgaaggac gggccgtcag    3180

agggaggtga aggcgatctg tacgagcgcg aggaggccgt gcgcttgaac tggcgcgaag    3240

ggaaggaggt ggaggggttg tcggtcatag gggattcttc ggcgtcactg tccgtcgcga    3300

cgatgccgcg cttcgctcgc agctcggcaa ctttcttctt caggcgcgcg agctgtggca    3360

catcgtctgt tagctcgact agtgcgaacg aaggaaaaga ccgggccacg cacgtcggct    3420

tcgtaccgct tgttggctcc ctccacccgc ctccgcttct cctcctcctg ctt           3473

<210>4

<211>717

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>gene

<222>(1)..(717)

<223>

<400>4

atgagtaaag gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt  60

gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga  120

aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaaactac ctgttccatg gccaacactt  180

gtcactactt tctcttatgg tgttcaatgc ttttcccgtt atccggatca tatgaaacgg  240

catgactttt tcaagagtgc catgcccgaa ggttatgtac aggaacgcac tatatctttc  300

aaagatgacg ggaactacaa gacgcgtgct gaagtcaagt ttgaaggtga tacccttgtt  360

aatcgtatcg agttaaaagg tattgatttt aaagaagatg gaaacattct cggacacaaa  420

ctcgagtaca actataactc acacaatgta tacatcacgg cagacaaaca aaagaatgga  480

atcaaagcta acttcaaaat tcgccacaac attgaagatg gatccgttca actagcagac  540

cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac  600

ctgtcgacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agcgtgacca catggtcctt  660

cttgagtttg taactgctgc tgggattaca catggcatgg atgagctcta caaataa     717

<210>5

<211>3173

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>promoter

<222>(630)..(1529)

<223>

<220>

<221>terminator

<222>(2247)..(3173)

<223>

<220>

<221>gene

<222>(1530)..(2246)

<223>

<400>5

tgaccggagc aacaagacgt gggcgagtat acgcactgga tgcaggcgcc gacgcgtttc    60

ttgcacaaat agcagacctg cgaacgaact cttcgtcagc tcgaagcttg aaagactcgc    120

cgctttcgac tcaccagctt ccatcgactc ttggggatgt tctcgagacc gtcgaccggc    180

tccatataca ccgtgttgct gacgcctgtt tcgggaaccc agatcgcgca gagcaagtgt    240

gcccactggc ccgttgtcgt ttgtttgaag gcgccgtacg agttggggca aagcacgcag    300

gtctacgaga gataatagtc aggttttgag cgtagcaaag gccccggacg gaaacgcacg    360

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catttgctgt cttcgctcgg caaggcattc gtccgcttcg ggatattgcg agtctgcgaa    660

agacgagcga gacggtcagc aggtcgcgag aagttgaggg agggcgagaa cggaccaggt    720

cgaaccactc cttctcaatc ttgtccatga caatctcaaa gagctcgtac gggatggtgg    780

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tcgccgtcca tacaggctgt cagctgtcgt acaaatcgtc aagcctgcct gagagaacct    900

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tttcccgtta tccggatcat atgaaacggc atgacttttt caagagtgcc atgcccgaag    1800

gttatgtaca ggaacgcact atatctttca aagatgacgg gaactacaag acgcgtgctg    1860

aagtcaagtt tgaaggtgat acccttgtta atcgtatcga gttaaaaggt attgatttta    1920

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ttgaagatgg atccgttcaa ctagcagacc attatcaaca aaatactcca attggcgatg  2100

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atggcatgga tgagctctac aaatgaatgg cgcggcgctc tctagacttt cgaacgagtg  2280

taaggctatc ttgacaacaa catgcacaat ccggtcgagt ctacaacgtc tatcgcctct  2340

tcacggaccg cttcggacct gtctggacga cgtggcttga tgcgaagctg ggtagccact  2400

tgtcgctcga actcttcgcc aatggctgtt tcttcggtgg cgcggctgcc gtcttggcgg  2460

aaacaagaga agggaagggc gatggctgct tcgcgctgag ttgagctgag gaggcggaag  2520

aagagacgtt cgacaggctg ttgtgggcgg agagcggtcg tgtgggcgcc tcctgcttcg  2580

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cgtcatcgct gtactcgcgc gagacctcgc actcgtccat cagcgtgcgc tcgtgccgct  2820

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agggaggtga aggcgatctg tacgagcgcg aggaggccgt gcgcttgaac tggcgcgaag  2940

ggaaggaggt ggaggggttg tcggtcatag gggattcttc ggcgtcactg tccgtcgcga  3000

cgatgccgcg cttcgctcgc agctcggcaa ctttcttctt caggcgcgcg agctgtggca  3060

catcgtctgt tagctcgact agtgcgaacg aaggaaaaga ccgggccacg cacgtcggct  3120

tcgtaccgct tgttggctcc ctccacccgc ctccgcttct cctcctcctg ctt         3173

<210>6

<211>375

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>gene

<222>(1)..(375)

<223>

<400>6

atggccaagt tgaccagtgc cgttccggtg ctcaccgcgc gcgacgtcgc cggagcggtc    60

gagttctgga ccgaccggct cgggttctcc cgggacttcg tggaggacga cttcgccggt    120

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aacaccctgg cctgggtgtg ggtgcgcggc ctggacgagc tgtacgccga gtggtcggag    240

gtcgtgtcca cgaacttccg ggacgcctcc gggccggcca tgaccgagat cggcgagcag    300

ccgtgggggc gggagttcgc cctgcgcgac ccggccggca actgcgtgca cttcgtggcc  360

gaggagcagg actga                                                   375

<210>7

<211>2831

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>promoter

<222>(630)..(1529)

<223>

<220>

<221>terminator

<222>(1905)..(2831)

<223>

<220>

<221>gene

<222>(1530)..(1904)

<223>

<400>7

tgaccggagc aacaagacgt gggcgagtat acgcactgga tgcaggcgcc gacgcgtttc  60

ttgcacaaat agcagacctg cgaacgaact cttcgtcagc tcgaagcttg aaagactcgc  120

cgctttcgac tcaccagctt ccatcgactc ttggggatgt tctcgagacc gtcgaccggc  180

tccatataca ccgtgttgct gacgcctgtt tcgggaaccc agatcgcgca gagcaagtgt  240

gcccactggc ccgttgtcgt ttgtttgaag gcgccgtacg agttggggca aagcacgcag  300

gtctacgaga gataatagtc aggttttgag cgtagcaaag gccccggacg gaaacgcacg  360

actggcttgt cgggcgagac ggtgcatttg cggcagagcc actgtccttc cgggatgtac  420

ggaacgccgt agcaatctgc gaggaagcga caaagatgag catcagatcc tcgtcgtgac  480

cacgctgtgc agccatgcaa cgtgagaact cgcgacgcac cttggtggac cgccaagttg  540

catccgtcgc agaagacgat cgcattcgag ttctcgcact cgccgtcgtc gcaaatggca  600

catttgctgt cttcgctcgg caaggcattc gtccgcttcg ggatattgcg agtctgcgaa  660

agacgagcga gacggtcagc aggtcgcgag aagttgaggg agggcgagaa cggaccaggt  720

cgaaccactc cttctcaatc ttgtccatga caatctcaaa gagctcgtac gggatggtgg  780

caagaccgtc cttcttccgc tccgcgttga gcgtgtcgag ccagagttgg tctgtgggtt  840

tcgccgtcca tacaggctgt cagctgtcgt acaaatcgtc aagcctgcct gagagaacct  900

cccaccttgc tcgtccatgt catactcaac ctgcttcgcc aggtccgact ccataggttc  960

tgtgggagac ggagggaggg tgagtaagtc gacttttgag acgctggtcc gcctgcagag  1020

gcgcagacat cgaagagcga tcttcgagtg ctcctgcagc atctgcacgt ccgtccgggc  1080

gtcgctcgct gctccagaga cgcgacaaac aatccccact tgacgaggat cgaagcgact  1140

cacgcagcca ccgcaggtac cgccccggct cgccatccgc tatgcccttg tacgcatccc  1200

attcctggcc gtcattgtac ccgaacgcga cgagctgggg gttgtgaaca tcgggcggag  1260

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ctcctcctcc tcccgctcca tccgtcgaga tggccaagtt gaccagtgcc gttccggtgc  1560

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gcgcggtcca ggaccaggtg gtgccggaca acaccctggc ctgggtgtgg gtgcgcggcc  1740

tggacgagct gtacgccgag tggtcggagg tcgtgtccac gaacttccgg gacgcctccg  1800

ggccggccat gaccgagatc ggcgagcagc cgtgggggcg ggagttcgcc ctgcgcgacc  1860

cggccggcaa ctgcgtgcac ttcgtggccg aggagcagga ctgaatggcg cggcgctctc  1920

tagactttcg aacgagtgta aggctatctt gacaacaaca tgcacaatcc ggtcgagtct  1980

acaacgtcta tcgcctcttc acggaccgct tcggacctgt ctggacgacg tggcttgatg  2040

cgaagctggg tagccacttg tcgctcgaac tcttcgccaa tggctgtttc ttcggtggcg  2100

cggctgccgt cttggcggaa acaagagaag ggaagggcga tggctgcttc gcgctgagtt  2160

gagctgagga ggcggaagaa gagacgttcg acaggctgtt gtgggcggag agcggtcgtg  2220

tgggcgcctc ctgcttcgcc ttagccgacg acgacgcgaa gtacgacgac tcgacgatct  2280

cgacgtcgct gctgtcgtcg tcattccgcg cctttgctgg tcgggcgggc acctcattct  2340

ccatctccct caacctctgc tcttctcgca ccgcagctcg catcgtttcc tcatccgcat  2400

actccagctc atcatcctcg tcatcgctgt actcgcgcga gacctcgcac tcgtccatca  2460

gcgtgcgctc gtgccgcttc ttcgttggcg aggcgagcag cttcgatttg ttgttgacct  2520

tgaaggacgg gccgtcagag ggaggtgaag gcgatctgta cgagcgcgag gaggccgtgc  2580

gcttgaactg gcgcgaaggg aaggaggtgg aggggttgtc ggtcataggg gattcttcgg  2640

cgtcactgtc cgtcgcgacg atgccgcgct tcgctcgcag ctcggcaact ttcttcttca  2700

ggcgcgcgag ctgtggcaca tcgtctgtta gctcgactag tgcgaacgaa ggaaaagacc  2760

gggccacgca cgtcggcttc gtaccgcttg ttggctccct ccacccgcct ccgcttctcc  2820

tcctcctgct t                                                       2831

<210>8

<211>810

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>gene

<222>(1)..(810)

<223>

<400>8

atgggtaagg aaaagactca cgtttcgagg ccgcgattaa attccaacat ggatgctgat  60

ttatatgggt ataaatgggc tcgcgataat gtcgggcaat caggtgcgac aatctatcga  120

ttgtatggga agcccgatgc gccagagttg tttctgaaac atggcaaagg tagcgttgcc  180

aatgatgtta cagatgagat ggtcagacta aactggctga cggaatttat gcctcttccg  240

accatcaagc attttatccg tactcctgat gatgcatggt tactcaccac tgcgatcccc  300

ggcaaaacag cattccaggt attagaagaa tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat  360

gcgctggcag tgttcctgcg ccggttgcat tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac  420

agcgatcgcg tatttcgtct cgctcaggcg caatcacgaa tgaataacgg tttggttgat  480

gcgagtgatt ttgatgacga gcgtaatggc tggcctgttg aacaagtctg gaaagaaatg  540

cataagcttt tgccattctc accggattca gtcgtcactc atggtgattt ctcacttgat  600

aaccttattt ttgacgaggg gaaattaata ggttgtattg atgttggacg agtcggaatc  660

gcagaccgat accaggatct tgccatccta tggaactgcc tcggtgagtt ttctccttca  720

ttacagaaac ggctttttca aaaatatggt attgataatc ctgatatgaa taaattgcag  780

tttcatttga tgctcgatga gtttttctaa                                   810

<210>9

<211>3266

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>promoter

<222>(630)..(1529)

<223>

<220>

<221>terminator

<222>(2340)..(3266)

<223>

<400>9

tgaccggagc aacaagacgt gggcgagtat acgcactgga tgcaggcgcc gacgcgtttc    60

ttgcacaaat agcagacctg cgaacgaact cttcgtcagc tcgaagcttg aaagactcgc    120

cgctttcgac tcaccagctt ccatcgactc ttggggatgt tctcgagacc gtcgaccggc    180

tccatataca ccgtgttgct gacgcctgtt tcgggaaccc agatcgcgca gagcaagtgt    240

gcccactggc ccgttgtcgt ttgtttgaag gcgccgtacg agttggggca aagcacgcag    300

gtctacgaga gataatagtc aggttttgag cgtagcaaag gccccggacg gaaacgcacg    360

actggcttgt cgggcgagac ggtgcatttg cggcagagcc actgtccttc cgggatgtac    420

ggaacgccgt agcaatctgc gaggaagcga caaagatgag catcagatcc tcgtcgtgac    480

cacgctgtgc agccatgcaa cgtgagaact cgcgacgcac cttggtggac cgccaagttg    540

catccgtcgc agaagacgat cgcattcgag ttctcgcact cgccgtcgtc gcaaatggca    600

catttgctgt cttcgctcgg caaggcattc gtccgcttcg ggatattgcg agtctgcgaa    660

agacgagcga gacggtcagc aggtcgcgag aagttgaggg agggcgagaa cggaccaggt    720

cgaaccactc cttctcaatc ttgtccatga caatctcaaa gagctcgtac gggatggtgg    780

caagaccgtc cttcttccgc tccgcgttga gcgtgtcgag ccagagttgg tctgtgggtt    840

tcgccgtcca tacaggctgt cagctgtcgt acaaatcgtc aagcctgcct gagagaacct    900

cccaccttgc tcgtccatgt catactcaac ctgcttcgcc aggtccgact ccataggttc    960

tgtgggagac ggagggaggg tgagtaagtc gacttttgag acgctggtcc gcctgcagag    1020

gcgcagacat cgaagagcga tcttcgagtg ctcctgcagc atctgcacgt ccgtccgggc    1080

gtcgctcgct gctccagaga cgcgacaaac aatccccact tgacgaggat cgaagcgact    1140

cacgcagcca ccgcaggtac cgccccggct cgccatccgc tatgcccttg tacgcatccc    1200

attcctggcc gtcattgtac ccgaacgcga cgagctgggg gttgtgaaca tcgggcggag    1260

cgggggtgct cgtgtcgacg acgcgaaagt tgacgactgg gagtgcgaga gacgagccgt    1320

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tccgagtcta tcagagctac ctgaagccct tagtaccgct cgacttgcgc gccaccccat    1500

ctcctcctcc tcccgctcca tccgtcgaga tgggtaagga aaagactcac gtttcgaggc    1560

cgcgattaaa ttccaacatg gatgctgatt tatatgggta taaatgggct cgcgataatg    1620

tcgggcaatc aggtgcgaca atctatcgat tgtatgggaa gcccgatgcg ccagagttgt    1680

ttctgaaaca tggcaaaggt agcgttgcca atgatgttac agatgagatg gtcagactaa    1740

actggctgac ggaatttatg cctcttccga ccatcaagca ttttatccgt actcctgatg    1800

atgcatggtt actcaccact gcgatccccg gcaaaacagc attccaggta ttagaagaat    1860

atcctgattc aggtgaaaat attgttgatg cgctggcagt gttcctgcgc cggttgcatt    1920

cgattcctgt ttgtaattgt ccttttaaca gcgatcgcgt atttcgtctc gctcaggcgc    1980

aatcacgaat gaataacggt ttggttgatg cgagtgattt tgatgacgag cgtaatggct    2040

ggcctgttga acaagtctgg aaagaaatgc ataagctttt gccattctca ccggattcag    2100

tcgtcactca tggtgatttc tcacttgata accttatttt tgacgagggg aaattaatag    2160

gttgtattga tgttggacga gtcggaatcg cagaccgata ccaggatctt gccatcctat    2220

ggaactgcct cggtgagttt tctccttcat tacagaaacg gctttttcaa aaatatggta    2280

ttgataatcc tgatatgaat aaattgcagt ttcatttgat gctcgatgag tttttctaaa    2340

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aatccggtcg agtctacaac gtctatcgcc tcttcacgga ccgcttcgga cctgtctgga    2460

cgacgtggct tgatgcgaag ctgggtagcc acttgtcgct cgaactcttc gccaatggct    2520

gtttcttcgg tggcgcggct gccgtcttgg cggaaacaag agaagggaag ggcgatggct    2580

gcttcgcgct gagttgagct gaggaggcgg aagaagagac gttcgacagg ctgttgtggg    2640

cggagagcgg tcgtgtgggc gcctcctgct tcgccttagc cgacgacgac gcgaagtacg    2700

acgactcgac gatctcgacg tcgctgctgt cgtcgtcatt ccgcgccttt gctggtcggg    2760

cgggcacctc attctccatc tccctcaacc tctgctcttc tcgcaccgca gctcgcatcg    2820

tttcctcatc cgcatactcc agctcatcat cctcgtcatc gctgtactcg cgcgagacct    2880

cgcactcgtc catcagcgtg cgctcgtgcc gcttcttcgt tggcgaggcg agcagcttcg    2940

atttgttgtt gaccttgaag gacgggccgt cagagggagg tgaaggcgat ctgtacgagc    3000

gcgaggaggc cgtgcgcttg aactggcgcg aagggaagga ggtggagggg ttgtcggtca    3060

taggggattc ttcggcgtca ctgtccgtcg cgacgatgcc gcgcttcgct cgcagctcgg    3120

caactttctt cttcaggcgc gcgagctgtg gcacatcgtc tgttagctcg actagtgcga    3180

acgaaggaaa agaccgggcc acgcacgtcg gcttcgtacc gcttgttggc tccctccacc    3240

cgcctccgct tctcctcctc ctgctt                                         3266

Claims (6)

1.乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶启动子，简写为pRtura3，其核苷酸序列组成为如SEQ ID NO：1所示DNA序列。

2.一种权利要求1所述乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶启动子的应用，其特征在于：pRtura3作为启动子用于构建酵母遗传操作系统及重组工程菌株；所述重组工程菌株为红冬孢酵母属(Rhodosporidium)基因工程菌株，所述酵母遗传操作系统为圆红冬孢酵母遗传操作系统。

3.一种DNA构建体，含有权利要求1所述SEQ ID NO：1所示的脱氧核苷酸序列，或同时含有权利要求1所述SEQ ID NO：1所示的脱氧核苷酸序列和如SEQ ID NO：2所示的脱氧核苷酸序列，且SEQ ID NO：1所示序列位于SEQ ID NO：2所示序列的上游，SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2之间为一编码基因的开放阅读框架。

4.按照权利要求3所述的构建体，其特征在于：所述的SEQ ID NO：2所示序列为一种乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶终止子Rtura3t。

5.一种携带权利要求1的启动子pRtura3或权利要求3的构建体的载体。

6.按照权利要求5所述的载体，其特征在于：所述载体为质粒载体。

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