CN102154300B - 中国南海疣镐芋螺神经毒素及其编码序列和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种中国南海疣镐芋螺神经毒素基因lv1.3及其编码的多肽lv1c，以及上述神经lv1c在制备神经生物学研究的工具药和镇痛药物中的应用。本发明采用构建cDNA文库的方法，从中国南海疣镐芋螺毒管中克隆得到的芋螺毒素基因lv1.3，通过工具软件SEQTOOL对碱基序列进行分析，确定上述芋螺毒素基因lv1.3编码的多肽lv1c的成熟肽氨基酸序列如序列表400<2>所示。本发明提供的多肽lv1c能阻断神经肌接头的递质传递，小鼠热板法显示该多肽lv1c具有镇痛作用，可用于制备神经生物学研究的工具药和镇痛药物。

Description

中国南海疣镐芋螺神经毒素及其编码序列和用途

技术领域

本发明涉及一种多肽及其编码序列和应用，尤其涉及一种芋螺神经毒素多肽及其编码序列和应用。

背景技术

芋螺，亦称鸡心螺，系软体动物门，腹足纲，前鳃亚纲，芋螺科(Conidae)动物之总称。芋螺是一类肉食性海洋软体动物，分类学上属腹足纲前鳃亚纲芋螺科，它们通过其毒管中的芋螺毒素麻醉动物以帮助捕食.芋螺根据其食性可以分为三类：食鱼性、食虫性和食螺性芋螺，其中食鱼性芋螺的毒素对人和哺乳动物毒性较大。芋螺毒素为其毒液中的有效成分，是一种具有独特神经药理作用的小肽，由7-41个氨基酸残基组成，一般富含二硫键。根据其二硫键的构成情况可分为两大类：含有多对二硫键及只含有一对或不含二硫键的。在近499种芋螺中据认为有超过49999种芋螺毒素肽，根据其前体信号肽序列可以分为几个超家族，如M、A和O)超家族，每个超家族的前体拥有共同的高保守的信号序列。

大量的研究表明，芋螺毒素具有独特的能够高特异选择性识别结合其作用靶(受体门控离子通道，电压门控离子通道)，产生拮抗剂(antagonist)或阻断剂(blocker)的作用。芋螺毒素识别其作用靶具有高特异性及选择性，它们只作用于某一类特定亚型的受体或通道。目前作用于受体门控离子通道的有nAchR拮抗剂、NMDA受体拮抗剂；作用于电压门控离子通道阻断剂的有Na⁺通道阻断剂、k⁺通道阻断剂Ca²⁺通道阻断剂等。

目前已知的芋螺毒素大多是从食鱼芋螺中分离得到，食虫芋螺的毒液研究的相对较少。至今已有数种芋螺毒素申请美国专利，它们在镇痛、局部缺血性保护、癫痫治疗、某些疾病诊断和受体研究中具有广泛的应用价值，有的已进入临床研究或已被FDA正式批准为治疗新药，用作特异诊断试剂和镇痛药。如由Olivera等从幻芋螺(Conus magus)中分离的ω-CTX，MVIIA，已被美国FAD正式批准为治疗顽痛的药物，其商品名Ziconotide。ω-芋螺毒素MVIIA是由25个氨基酸、3对二硫键组成的碱性亲水性小肽，C端酰胺化，N端为Cys。可选择性抑制N型电压敏感性钙通道，广泛用作神经生物学探针和无致瘾性镇痛剂，并具有多种药物发展前景；沿脊髓传递的Ziconotide能阻断伤害感受器释放神经传递素，阻止疼痛信号传入大脑，临床表现出强大的镇痛作用，效果优于吗啡等现有的镇痛剂，用于艾滋病、癌症及神经痛患者的治疗，无成瘾性，且疗效确切。来源不同的ω-CTX，尽管其氨基酸序列不同，但在结构上的差异都不是很大，如来自地纹芋螺(C.geographus)的GVIA、GVIC、GVIIA和GVOIB等，和来自幻芋螺MVIIA、MVIIC、以及来自线纹芋螺(C.striatus)的SO3等ω-CTX，在药理学方面有相似的作用。

我国关于芋螺毒素研究的报道不多，大多为综述芋螺毒素的研究概况及应用前景。卢柏松等，魏开华等对我国的少数几种芋螺(线纹芋螺，织锦芋螺和桶形芋螺)的毒素基因或毒液成份进行了研究。我国近海的芋螺约有70种，主要分布在海南岛，西沙群岛和台湾，大多数种类的芋螺毒素研究还未展开。由于每种芋螺毒液都有自己特定的药理学作用范围和生物学活性，因而使芋螺毒素具有重要的理论研究价值和应用价值。多样性的芋螺毒素既可直接用作天然药物，又可以作为设计新药(用于治疗重大疑难杂症)的先导化合物。深入研究芋螺毒素，不仅对海洋制药工业具有重要意义，而且可为我国芋螺海洋资源的开发利用提供重要理论依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种中国南海疣镐芋螺神经毒素基因lv1.3。

本发明另一目的是提供上述神经毒素基因lv1.3编码的多肽lv1c。

本发明另一目的是提供上述多肽lv1c在制备神经生物学研究的工具药和镇痛药物中的应用。

本发明所选择的疣镐芋螺属于中国南海食虫性疣镐芋螺(Conus lividus)，采自海南省三亚市。

本发明采用构建cDNA文库的方法，从中国南海疣镐芋螺毒管中克隆得到神经毒素基因lv1.3。

中国南海疣镐芋螺毒管cDNA文库的构建：分离毒管，提取总RNA反转录合成cDNA第一链产物；再以A超家族的信号肽和3’UTR为引物，以cDNA为模板通过PCR进行基因克隆，将PCR产物与pGEM-T Easy Vector相连，连接产物转化液分别涂平板，从平板上挑取单克隆进行测序。得到中国南海疣镐芋螺神经毒素基因lv1.3，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。

利用工具软件SEQTOOL对上述神经毒素基因lv1.3的碱基序列进行分析，获得其最大读码框，长度195bp，可编码65个氨基酸残基的前体肽。通过进一步分析，确定神经毒素基因lv1.3编码的多肽lv1c的前体肽和推测的成熟肽氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示：上述多肽lv1c的成熟肽由16个氨基酸组成，分子量为1795.04道尔顿，具有典型芋螺毒素多肽一级结构的特征，分子内具有两对二硫键，第一个和第三个半胱氨酸成一对二硫键，第二个和第四个半胱氨酸成另一对二硫键。

本发明利用固相化学合成法合成上述多肽lv1c。采用仪器合成策略，运用FmocPHOBtPDCC方法，Rink树脂及Fmoc-氨基酸，偶联剂为DCC-HOBT，哌啶脱Fmoc-基，合成步骤参考仪器合成手册进行。肽-树脂裂解试剂组成及肽回收方法与手工合成方法相同。通过固相化学合成线性多肽，然后交叉环化成具有两对二硫键以及C末端酰胺化修饰的成熟肽，经HPLC鉴定通过固相化学合成法合成的多肽lv1c纯度达到95％，MALDI-TOF鉴定其分子量正确。

本发明提供的多肽lv1c作用于青蛙坐骨神经-腓肠肌标本，可有效阻断神经--肌接头处的递质传递并抑制肌肉收缩；而在小鼠热板法测定生理模型上的中枢镇痛药效实验中，上述多肽lv1c作用于小鼠时表现出明显的中枢镇痛效果，且药效优于阳性对照药利多卡因。因此，本发明提供的多肽lv1c可应用于制备神经生物学研究的工具药和镇痛药物。

附图说明

图1为中国南海疣镐芋螺毒管cDNA的凝胶电泳图。

图2为pGEM-T Easy Vector载体环形图谱及相关的序列位点；

图3为神经毒素基因Lv1.3编码的成熟肽序列与A超家族芋螺毒素成熟肽序列的比较结果；

图4为固相化学合成多肽lv1c的HPLC分析图；

图5鉴定固相化学合成多肽lv1c分子量的MALDI-TOF质谱图；

图6为多肽lv1c的电生理活性鉴定实验结果图；

图7为多肽lv1c生理模型上的镇痛药效实验结果图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，来进一步说明本发明的技术方案。应理解，以下实施例只用于说明本发明而不以任何形式限制本发明。

实施例1：疣镐毒管组织总RNA的提取及毒素cDNA克隆

总RNA的提取参照Gibcol BRL公司的

LS试剂说明书进行。Taq DNA聚合酶、10×PCRBuffer和dNTP购自鼎国公司；PCR引物由Invitrogen公司合成；其他有机试剂均为国产分析纯试剂，购自广州化学试剂厂。

取活螺体，用石工锤破碎螺壳，暴露出螺肉，冰上小心并快速分离毒管组织，称重后迅速放入液氮并充分研磨，加入15倍重量体积的LS试剂(即1g组织中加入15ml)，冰浴中充分匀浆，-80℃冰箱中保存以备提取总RNA。取50-100mg组织样品，用0.75ml

LS试剂匀浆，15-30℃静置5min。然后加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15秒后，15-30℃静置2-15min。4℃、12,000rpm离心15min，取上层水相。加入0.5ml异丙醇，15-30℃静置10min后，4℃、12,000rpm离心10min，弃上清。再加1ml 75％乙醇漂洗沉淀，5,000rpm离心5min，弃上清，真空干燥去除样品中痕量的乙醇，加入适量无RNase的去离子水。取1μl进行1％琼脂糖胶电泳，1μl用紫外分光光度计估算RNA的浓度与纯度，-20℃保存备用。

1)cDNA第一链的合成

cDNA第一链的合成使用Clontech公司的SMART^TM PCR cDNA Synthesis Kit，按照说明书进行试验。在5μl反应体系中加入下列组分(于冰上操作)：1μg螺毒管总RNA，SMART IIIolignucleotide和CDS III/3’PCR引物各1μl，以超纯水补齐体积，混匀，短暂离心。72℃温育2min，冰浴2min，短暂离心，使混合物集于管底。再依次加入2μl 5×First Strand Buffer、1μl20mmol/L的DTT、1μl 10mmol/L的dNTP Mix和1μl PowerScript RT后轻弹管壁，混匀并短暂离心。置PCR仪42℃反应1hr逆转录合成第一链，冰浴终止反应，-40℃保存。

2)A-超家族芋螺毒素的cDNA克隆

PCR引物序列：

上游引物5’ATGGGCATGCGGATGAT  3’

下游引物5’TGGACGATGTAATAACAGCAAG 3’

PCR体系		PCR程序
				组分	体积(μl)	95℃预变性	3min
cDNA第一链	1	30个循环
				引物1(10μM)	1	95℃	45sec
引物2(10μM)	1	55℃	45sec
				dNTP混合物(10Mm)	0.4	72℃	60sec
T4Taq多聚酶	0.5	72℃延伸	10min
				10×PCR反应缓冲液	2
去离子三蒸水	14.6
				总体积	20

取5ul PCR产物用1.8％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，如图1所示，图1为中国南海疣镐芋螺毒管cDNA的凝胶电泳图谱。如有特异性条带则配制50ul的上述反应体系，按上述反应条件进行放大。

3)PCR产物的纯化

将步骤2)得到的PCR反应产物用1.8％的凝胶进行纯化，电压120V电泳25分钟。图1为中国南海疣镐芋螺毒管cDNA的凝胶电泳图，切下含目标核酸带(约200bp)的琼脂糖凝胶块，按OMEGA BIOTEK公司的GEL EXTRACTION KIT说明书操作。将琼脂糖凝胶块称重，按1g/ml换算，加4-5倍胶体积的Binding Buffer缓冲液，于55-60℃溶解7min，直到完全融溶，将凝胶液加入到HiBind^TM DNA柱上(可结合25μg的DNA)，每次可加入800μl样品(可重复加入)，10,000g离心1min，度计分别测定样品在分光光度计上测定260nm、280nm波长吸收值，初步弃废液；用750μl经乙醇稀释的DNA wash buffer洗柱一次，10,000g离心1min，弃液，再重复用DNAwash buffer洗柱一次；将空的HiBind^TM DNA柱在10,000g离心1min，弃痕量溶液；用30μl灭菌去离子水或TE缓冲液洗柱，10,000rpm离心1min收集DNA，DNA溶液在-20℃保存。1.8％凝胶电泳鉴定回收产物浓度，得到纯化后的PCR产物。

4)PCR产物克隆到T-载体

按DNALigation Kit说明将纯化后的PCR产物中的目的片段连入pGEM-T Easy Vector。pGEM-T Easy Vector载体的环形图谱及相关的序列位点如图2所示。

连接体系如下：

目的片断	x(依浓度而定，摩尔数为0.15pmol)
		dH2O	2-x
pGEM-T Easy Vector	0.5
		ligase mix	2.5
总体积	5

4℃，过夜，得到连接产物。

5)连接产物转化

将连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株。

首先用CaCl₂法制备大肠杆菌DH5α感受态细胞。挑取大肠杆菌DH5α单菌落接种于不含抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养16-18小时活化菌株，然后以1∶100的体积接种于50ml不含氨卞青霉素的LB液体培养基中，37℃、250rpm振荡培养2-3小时左右，在OD₆₀₀＝0.3左右时，将菌液冰浴15分钟，4℃4000rpm离心5分钟，倒置去尽上清，加入相当于原培养物1/2体积的预冷的100mM CaCl₂重悬沉淀，冰浴10分钟，4℃，5,000rpm离心5分钟，弃上清，再以相当于原培养物体积1/25的预冷的100mM CaCl₂重悬沉淀。每管分装200μl，置4℃冰箱2小时后可用，48小时内使用转化效率不变。

取三管新鲜制备的感受态细胞，分别加入载体质粒DNA、连接产物和不加任何DNA，分别混匀后，冰浴30分钟，42℃热击90秒，冰浴2分钟，加入200μl Amp^-的LB液体培养基，37℃温和振摇复苏细胞30分钟，取适量转化产物涂布于Amp⁺的LB平板上，37℃倒置培养箱培养16小时，观察菌落生长情况。

6)菌落PCR初步鉴定阳性克隆

取20个灭菌1.5ml小管，加入20μl LB培养基，在步骤5)培养菌落的超净台中挑取20个阳性克隆分别到各个小管中。

PCR体系		PCR程序
				组分	体积(μl)	95℃预变性	3min
如上制备含菌培养基	1	30个循环
				F(10μM)	1	95℃	45sec
R(10μM)	1	60℃	45sec
				dNTP混合物(10μM)	0.4	72℃	60sec
T4Taq多聚酶	0.5	72℃延伸	10min
				10×PCR反应缓冲液	2
去离子三蒸水	14.6
				总体积	20

7)阳性菌落的扩大培养和质粒提取

取菌落PCR阳性的菌液加到5ml的含Amp LB培养基中，37℃过夜培养，用OMEGAminiplasmid extraction kit提取质粒。挑取阳性克隆单菌落，37℃过夜培养14-16hr；取5ml菌液，10,000g离心1min；弃上清，加入250μl溶液I/RNase，重悬细胞；加入250μl溶液II，颠倒4-6次轻柔混匀，获得澄清的溶液，室温稍放置；加入350μl溶液III，混匀直到出现白色沉淀；10,000g离心10min后，将上清转移到置于2ml离心管套管上的HiBind^TM DNA柱上；10,000g离心1min，弃液；用500μl HB buffer洗柱，10,000g离心1min，弃液；用750μl经乙醇稀释的DNAwash buffer洗柱一次，10,000g离心1min，弃液，重复洗柱一次；空HiBind^TMDNA柱再10,000g离心1min，弃痕液；40μl灭菌去离子水洗柱两次，10,000g离心1min，溶解质粒。

8)含插入片断的T载体质粒测序

采用Perkin Elmer公司的ABI PRISM 3700自动测序仪进行测序工作，测序反应按ABIPRISM BigDye^TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits的说明书进行操作，使用T7和SP6primer进行双向序列测定。

实施例2：神经毒素基因lv1.3序列的测定和分析

从实施例1构建的中国南海疣镐芋螺毒管cDNA文库中克隆测序得到神经毒素基因lv1.3。神经毒素基因lv1.3属于高表达基因，利用工具软件SEQTOOL对其碱基序列进行分析，并获得其最大读码框，长度195bp，编码65个氨基酸残基的前体肽。进一步分析显示，该前体肽的第1-21位氨基酸残基为其信号肽区域，其第48位残基为精氨酸，可认为是标准蛋白质水解信号，将前体肽的前导肽和成熟肽部分分开。另外，在绝大多数的芋螺毒素中，前体肽末端的甘氨酸残基往往在翻译后修饰过程中被切除，提供给其前一位氨基酸残基的酰胺化修饰信号，故确定神经毒素基因lv1.3成熟肽序列为GCCSDPPCRHKHQDLC*(*表示酰胺化修饰)，分子量为1795.4道尔顿，并认为上述神经毒素基因lv1.3编码的成熟肽和A超家族中alphaconotoxin最相似(如图3所示)。

实施例3：多肽lv1c的固相化学合成

固相化学合成神经毒素lv1c序列为GCCSDPPCRHKHQDLC*(*表示酰胺化修饰)，分子量为1795.4道尔顿，分子内第一个和第三个半胱氨酸成一对二硫键，第二个和第四个半胱氨酸成另一对二硫键。采用仪器合成策略，运用FmocPHOBtPDCC方法，Rink树脂及Fmoc-氨基酸，偶联剂为DCC-HOB T，哌啶脱Fmoc-基，合成步骤参考仪器合成手册进行。肽-树脂裂解试剂组成及肽回收方法与手工合成方法相同。如图4所示，固相化学合成多肽lv1c的HPLC分析鉴定其纯度为96.5％；如图5所示，MALDI-TOF鉴定多肽lv1c的分子量正确。

实施例4：神经毒素lv1c的生理活性鉴定

青蛙坐骨神经-腓肠肌标本肌肉收缩实验

双毁髓青蛙后制备坐骨神经-腓肠肌标本，用无菌脱脂棉给药，待测药品多肽lv1c工作浓度为1μM。刺激参数为：延时100ms，波宽0.5ms，频率0.5Hz，强度5v，扫描速度为4.00s/div。使用电生理实验系统为泰盟科技BL-410生物机能实验系统以及成都仪器厂制造JZJ01型肌肉张力换能器，量程为30g，编号为4037。结果如图6所示，多肽lv1c 10μM的Lv1.10可以抑制大约60％的腓肠肌收缩幅度。这表明其作用位点在神经肌肉接头的终板膜上，具阻断神经-肌接头处的递质。

实施例5：生理模型上的中枢镇痛药效实验法

基本方案：小鼠热板法

选取健康雌性SPF级昆明小鼠，体重20±2g，购自广东中医药大学实验动物中心。把小鼠放于事先加热到55℃的GJ-8402型热板镇痛仪(成都泰盟科技有限责任公司)上，用秒表记录小鼠自投入热板至出现舔后足或跳跃的时间(秒)为该鼠的痛阈值。腹腔注射前先测定每只小鼠的痛阈(共测两次，以平均值不超过20秒者为合格。)注射后0.5h，1h，1.5h，2h，3h，4h，5h测定一次，如痛阈值超过60秒，即停止测试而按60秒计算(时间过久，易烫伤足部)。实验结束，按所测之痛阈平均值计算痛阈提高百分率，即：

痛阈提高百分率＝(用药后平均痛阈值-用药前平均痛阈值)/用药前平均值。

实验设计：选取健康雌性SPF级昆明小鼠，体重20±2g，随机分为3组，每组10只，空白对照、阳性对照和待测药品多肽lv1c各一组。具体如下：

第一组：空白对照组10只小鼠每只均注射5ul生理盐水；

第二组：阳性对照组10只小鼠10mg/kg给药注射药品母液浓度为1mg/ml利多卡因；

第三组：多肽lv1c样品10只小鼠分为低、中、高剂量组。给予剂量分别为0.025mg/kg，0.05mg/kg，0.10mg/kg。受试样品多肽lv1c的中、高剂量组小鼠给药后的痛阈值均不同程度的提高，受试样品多肽lv1c的中、高剂量给药3h和4h时组小鼠的痛阈值与同期空白对照组相比，具有显著性差异(P＜0.01)。结果如图7所示，多肽lv1c作用浓度为0.10mg/kg时具有明显的中枢镇痛效果，其药效明显优于阳性对照药利多卡因，有望用于制备新的高效中枢镇痛药物。

序列表

<110>中山大学

<120>中国南海疣镐芋螺神经毒素及其编码序列和用途

<160>2

<210>1

<211>195

<212>DNA

<213>中国南海疣镐芋螺(Conus lividus)

<220>

<221>precursor peptide

<222>(1)...(195)

<400>1

atg ggc atg cgg atg atg ttc acc atg ctt ctg ttg gtt gtc ttg 45

Met Gly Met Arg Met Met Phe Thr Met Leu Leu Leu Val Val Leu

 1               5                   10                  15

gca acc act gtc gtt tcc ttc acg tta gat cat gca ttt gat ggc 90

Ala Thr Thr Val Val Ser Phe Thr Leu Asp His Ala Phe Asp Gly

                 20                  25                  30

agg aat acc gca gcc aac aac aaa gcg act gac ctg atg gct ctg 135

Arg Asn Thr Ala Ala Asn Asn Lys Ala Thr Asp Leu Met Ala Leu

                 35                  40                  45

cct gtc agg gga tgc tgt tcc gat cct ccc tgt aga cac aag cac 180

Pro Val Arg Gly Cys Cys Ser Asp Pro Pro Cys Arg His Lys His

                 50                  55                  60

caa gat ctt tgt ggc tga 195

Gln Asp Leu Cys Gly  *

                 65

<210>2

<211>65

<212>PRT

<213>中国南海疣镐芋螺(Conus lividus)

<220>

<221>precursor peptide

<222>(1)...(65)

<400>2

Met Gly Met Arg Met Met Phe Thr Met Leu Leu Leu Val Val Leu

 1               5                   10                  15

Ala Thr Thr Val Val Ser Phe Thr Leu Asp His Ala Phe Asp Gly

                 20                  25                  30

Arg Asn Thr Ala Ala Asn Asn Lys Ala Thr Asp Leu Met Ala Leu

                 35                  40                  45

Pro Val Arg Gly Cys Cys Ser Asp Pro Pro Cys Arg His Lys His

                 50                  55                  60

Gln Asp Leu Cys Gly  *

                 65

Claims (2)

1.一种中国南海疣镐芋螺神经毒素基因，其特征在于：其序列如序列表中序列1所示核苷酸序列。

2.一种由根据权利要求1所述的芋螺神经毒素基因编码的多肽，其特征在于：该多肽的氨基酸序列如序列2所示。

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