CN102154301B

CN102154301B - 中国南海线纹芋螺毒素S21a的制备及应用

Info

Publication number: CN102154301B
Application number: CN 201010620135
Authority: CN
Inventors: 徐安龙; 强媛媛; 王磊; 任政华; 吴赟; 覃梦颖
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2010-12-31
Filing date: 2010-12-31
Publication date: 2013-01-16
Anticipated expiration: 2030-12-31
Also published as: CN102154301A

Abstract

本发明涉及一种中国南海线纹芋螺毒素基因S21.1及其编码的多肽S21a的制备方法和应用。本发明通过构建cDNA文库，从中国南海线纹芋螺的毒管中克隆得到芋螺毒素基因S21.1。本发明提供一种多肽的制备方法，通过将芋螺毒素基因S21.1与载体pTRX连接得到重组表达载体pTRX-S21.1，将重组表达载体pTRX-S21.1转化宿主菌并在宿主菌中培养表达，表达产物重组融合蛋白经分离纯化得到目的蛋白——多肽S21a。本发明提供的多肽S21a具有阻断神经递质传递和中枢镇痛作用，可用于制备神经生物学研究的工具药和镇痛药物。

Description

中国南海线纹芋螺毒素S21a的制备及应用

技术领域

本发明涉及一种多肽及其编码基因序列、其制备方法和应用。尤其涉及一种芋螺毒素多肽及其编码基因序列、其制备方法和应用。

背景技术

芋螺(cone snail)是一种生活在海洋浅水域的肉食动物，有毒，属于软体动物门腹足纲(Gastropoda)、前鳃亚纲(Prosobranchia)、芋螺科(Conidae)、芋螺属(Conus)。目前估计全球有约500-700种芋螺，它们分布于热带海域的浅水区域，主要是印度洋和太平洋海域。

芋螺按其食性可分为三大类：食鱼性芋螺(piscivorous)，食软体动物性芋螺(molluscivorous)和食虫性芋螺(vermivorous)。其中食虫性芋螺种类最多，占全部芋螺种类的70％左右，而食鱼性芋螺虽然占芋螺总数最少，但毒性最强，至今为止报道的芋螺致死事件基本上是该类芋螺造成的。

芋螺毒素(conotoxin，CTx)是一类来源于芋螺(Conus)毒液的活性多肽.对芋螺自身而言，CTx主要用于捕食与防御.近几十年来的研究表明，它主要作用于细胞膜上各种离子通道和神经递质/激肽的受体，有很强的生物学活性。芋螺毒素有如下特点：分子质量小，富含二硫键；前导肽高度保守而成熟肽具有多样性；作用靶点广且具有高度组织选择性芋螺毒素常被作为探针用于各种离子通道和受体的类型及亚型的分类和鉴定，也极有望直接开发成药物或作为先导化合物用于新药的研发。

目前，国内外已明确功能的芋螺毒素只占了整个毒素库的很小一部分，但是对它们的生理功能已经有了较为清晰的认识。芋螺毒素二硫键骨架和结构的不同，决定了它们功能靶位的差异，已经清楚的靶位主要包括配体门控的离子通道、电压门控的离子通道及G蛋白偶联的受体。

芋螺毒素可用作神经递质受体或离子通道研究的分子探针。乙酰胆碱受体是一个庞大的受体家族，10种α亚基和3种β亚基以不同的组合构成乙酰胆碱受体的各种亚型广泛分布神经系统和肌肉等各组织，它的生理和病理意义日益受到关注。在中枢神经系统中，不同突触前nAChRs调节不同神经递质的释放，如海马区的去甲肾上腺素和纹状体内的多巴胺。由于缺乏选择性配体这些nAChRs的亚基组成还不能清楚阐明。最近利用亚型特异性的α芋螺毒素和敲除小鼠解析了参与纹状体中多巴胺释放的主要乙酰胆碱受体亚型是α6β2β3(Whiteaker，2002)。

芋螺毒素有许多已经被开发成药物或者药物先导物。如ω-CVID，GVIA，MVIIA在治疗疼痛方面显示极大的应用价值(Smith，2002；Scott，202；Adams，2003)。2005年12月，美国FDA正式批准ω-MVIIA(也叫Ziconotide，或Prailt)作为一个治疗严重慢性疼痛的药物。ω-CVID也特异作用于N型VSCC，显示出治疗神经性疼痛的前景，现处于临床II期试验中。我国科学家从南海线纹芋螺中分离的SO3与ω-MVIIA具有很高的同源性，只有7个不同的残基，动物实验证明具有显著的镇痛效果，有望开发成我国具有自主知识产权的治疗药物(Wen，2005)。这些镇痛药物与吗啡相比具有特异性好、不成瘾的优点。缺氧缺血引起的神经元病理损伤是由于突触前后大量钙内流引起的，能阻断突触前后钙离子内流的ω-MVIIA和NMDA受体拮抗剂conantokin能起到显著的神经保护功能。癫痫是由于中枢神经系统谷氨酸能神经传导失调造成的，Conantokins特异阻断NMDA受体亚型，可开发成抗惊厥、抗癫痫药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种中国南海线纹芋螺毒素基因S21.1，其基因序列如序列表<400>1所示。

本发明的另一个目的是提供上述线纹芋螺毒素基因S21.1编码的多肽S21a，其氨基酸序列如序列表<400>2所示。

本发明的另一个目的是提供一种重组表达载体pTRX-S21.1。

本发明的再一个目的是提供一种多肽的表达方法，从表达、分离和纯化几个方面对原有的多肽表达方法进行改良。

本发明的再一个目的是提供上述芋螺毒素多肽S21a在神经生物学研究及镇痛药物开发中的应用。

本发明使用的线纹芋螺采自中国海南省三亚市。

本发明通过构建cDNA文库和测序的方法，从中国南海线纹芋螺毒管中分离得到中国南海线纹芋螺毒素基因S21.1。

本发明提供一种重组表达载体pTRX-S21.1，通过以下方式合成：

首先，将芋螺毒素基因S21.1的cDNA序列分拆为两对互补序列作为模板母链，在该母链基因的5’端和3’端分别加入限制性内切酶Kpn I和Not I的酶切位点；另外，在5’端加入了3C酶的识别位点，而在3′端还加入了两个终止密码子(TAA)，上述该两对引物经PCR扩增后分为互补配对的两组分别进行磷酸化与退火，合成出全长的芋螺毒素基因S21.1。

其次，通过限制性内切酶Kpn I和Not I双酶切法对载体pTRX(载体pTRX为申请人自行构建并申请中国专利，专利名称为：一种高效原核表达载体；专利号CN00124832.4，授权公告号CN1189565)进行酶切后得到线性化的载体pTRX。

最后，利用T4DNA连接酶连接上述芋螺毒素基因S21.1和上述线性化的载体pTRX，得到重组表达载体pTRX-S21.1。

本发明还提供一种多肽的表达方法，具体实施步骤为：

(1)将重组表达质粒pTRX-S21.1转化大肠杆菌BL21(DE3)；

(2)培养转化后的大肠杆菌BL21(DE3)；

(3)对培养后的大肠杆菌BL21(DE3)进行超声裂解，收集上清；上清液经亲和层析纯化，得到重组融合蛋白；

(4)重组融合蛋白经3C酶酶切，酶切的产物经层析过滤和HPLC纯化得到目的蛋白——多肽S21a。

上述多肽的表达方法使用重组表达载体pTRX-S21.1作为表达质粒，表达效率较高，且优化了培养条件和纯化分离方式，有效提高了多肽S21a的表达量。

本发明通过青蛙坐骨神经-腓肠肌标本肌肉收缩实验和小鼠热板法实验发现，一定浓度的多肽S21a具有阻断神经递质传递和镇痛性能，因此，多肽S21a可用于制备神经生物学研究及镇痛药物。

附图说明

图1表达质粒pTRX的物理图谱和多克隆位点

图2重组表达载体pTRX-S21.1合成过程示意图

图3重组表达载体pTRX-S21.1的菌落PCR阳性克隆琼脂糖凝胶图

图4重组融合蛋白分离纯化亲和层析图

图5重组融合蛋白的诱导表达及纯化的SDS-PAGE电泳图谱

图6酶切后的多肽S21a反相高效液相色谱图

图7多肽S21a的MALDI-TOF质谱图

图8多肽S21a蛙坐骨神经-腓肠肌标本肌肉收缩抑制实验结果分析图

图9多肽S21a对小鼠热板法的痛阈改变结果

具体实施方式

以下结合具体实施例，来进一步说明本发明的技术方案。应理解，以下实施例只用于说明本发明而不以任何形式限制本发明。

实施例1：线纹芋螺毒管组织总RNA的提取及毒素cDNA克隆

总RNA的提取参照Gibcol BRL公司的

LS试剂说明书进行。Taq DNA聚合酶、10×PCRBuffer和dNTP购自鼎国公司；PCR引物由Invitrogen公司合成；其他有机试剂均为国产分析纯试剂，购自广州化学试剂厂。

取活螺体，用石工锤破碎螺壳，暴露出螺肉，冰上小心并快速分离毒管组织，称重后迅速放入液氮并充分研磨，加入15倍重量体积的

LS试剂(即1g组织中加入15ml)，冰浴中充分匀浆，-80℃冰箱中保存以备提取总RNA。取50-100mg组织样品，用0.75ml

LS试剂匀浆，15-30℃静置5min。然后加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15秒后，15-30℃静置2-15min。4℃、12,000rpm离心15min，取上层水相。加入0.5ml异丙醇，15-30℃静置10min后，4℃、12,000rpm离心10min，弃上清。再加1ml 75％乙醇漂洗沉淀，5,000rpm离心5min，弃上清，真空干燥去除样品中痕量的乙醇，加入适量无RNase的去离子水。取1μl进行1％琼脂糖胶电泳，1μl用紫外分光光估算RNA的浓度与纯度，-20℃保存备用。

1)cDNA第一链的合成

cDNA第一链的合成使用Clontech公司的SMART^TM PCR cDNA Synthesis Kit，按照说明书进行试验。在5μl反应体系中加入下列组分(于冰上操作)：1μg芋螺毒管总RNA，SMARTIII olignucleotide和CDS III/3’PCR引物各1μl，以超纯水补齐体积，混匀，短暂离心。72℃温育2min，冰浴2min，短暂离心，使混合物集于管底。再依次加入2μl 5×First Strand Buffer、1μl20mmol/L的DTT、1μl 10mmol/L的dNTP Mix和1μl PowerScript RT(CLONTECH)后轻弹管壁，混匀并短暂离心。置PCR仪42℃反应1hr逆转录合成第一链，冰浴终止反应，-40℃保存。

2)A-超家族芋螺毒素的cDNA克隆

PCR引物序列：

上游引物5’ATGGGCATGCGGATGAT 3’

下游引物5’TGGACGATGTAATAACAGCAAG 3’

PCR体系		PCR程序
				组分	体积(μl)	95℃预变性	3min
cDNA第一链	1	30个循环
				上游引物(10μM)	1	95℃	45sec
下游引物(10μM)	1	55℃	45sec
				dNTP混合物(10Mm)	0.4	72℃	60sec
T4 Taq多聚酶	0.5	72℃延伸	10min
				10×PCR反应缓冲液	2
去离子三蒸水	14.6
				总体积	20

取5ul PCR产物用1.8％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，如有特异性条带则配制50ul的上述反应体系，按上述反应条件进行放大。

3)PCR产物的纯化

上述PCR反应产物用1.5％的凝胶进行纯化，电压120V电泳30分钟。切下含目标核酸带(约200bp)的琼脂糖凝胶块，按OMEGA BIOTEK公司的GEL EXTRACTION KIT说明书操作。将琼脂糖凝胶块称重，按1g/ml换算，加4-5倍胶体积的Binding Buffer缓冲液，于55-60℃溶解7min，直到完全融溶，将凝胶液加入到HiBind^TM DNA柱上(可结合25μg的DNA)，每次可加入800μl样品(可重复加入)，10,000g离心1min，度计分别测定样品在分光光度计上测定260nm、280nm波长吸收值，初步弃废液；用750μl经乙醇稀释的DNA wash buffer洗柱一次，10,000g离心1min，弃液，再重复用DNA wash buffer洗柱一次；将空的HiBind^TM DNA柱在10,000g离心1min，弃痕量溶液；用30μl灭菌去离子水或TE缓冲液洗柱，10,000rpm离心1min收集DNA，DNA溶液在-20℃保存。1.8％凝胶电泳鉴定回收产物浓度。

4)PCR产物克隆到T-载体

按DNA Ligation Kit说明将目的条带连入pGEM-T Vector。

连接体系：

目的片断	x(依浓度而定，摩尔数为0.15pmol)
		dH₂O	2-x
pGEM-T Vector	0.5

ligase mix	2.5
		总体积	5

4℃，过夜，得到连接产物。

5)连接产物转化

将连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株。

首先用CaCl₂法制备大肠杆菌DH5α感受态细胞。挑取大肠杆菌DH5α单菌落接种于不含抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养16-18小时活化菌株，然后以1∶100的体积接种于50ml不含氨卞青霉素的LB液体培养基中，37℃、250rpm振荡培养2-3小时左右，在OD₆₀₀＝0.3左右时，将菌液冰浴15分钟，4℃4000rpm离心5分钟，倒置去尽上清，加入相当于原培养物1/2体积的预冷的100mM CaCl₂重悬沉淀，冰浴10分钟，4℃，5,000rpm离心5分钟，弃上清，再以相当于原培养物体积1/25的预冷的100mM CaCl₂重悬沉淀。每管分装200μl，置4℃冰箱2小时后可用，48小时内使用转化效率不变。

取三管新鲜制备的感受态细胞，各加入载体质粒DNA、连接产物或不加任何DNA，分别混匀后，冰浴30分钟，42℃热击90秒，冰浴2分钟，加入200μl Amp-的LB液体培养基，37℃温和振摇复苏细胞30分钟，取适量转化产物涂布于Amp⁺的LB平板上，37℃倒置培养箱培养16小时，观察菌落生长情况。

6)菌落PCR初步鉴定阳性克隆

取20个灭菌1.5ml小管，加入20μl LB培养基，在超净台中挑取20个阳性克隆分别到各个小管中。

PCR体系		PCR程序
				组分	体积(μl)	95℃预变性	3min
如上制备含菌培养基	1	30个循环
				F(10μM)	1	95℃	45sec
R(10μM)	1	60℃	45sec
				dNTP混合物(10μM)	0.4	72℃	60sec
T4 Taq多聚酶	0.5	72℃延伸	10min
				10×PCR反应缓冲液	2
去离子三蒸水	14.6
				总体积	20

7)阳性菌落的扩大培养和质粒提取

取菌落PCR阳性的菌液加到5ml的含Amp LB培养基中，37℃过夜培养，用OMEGAminiplasmid extraction kit提取质粒。挑取阳性克隆单菌落，37℃过夜培养14-16hr；取5ml菌液，10,000g离心lmin；弃上清，加入250μl溶液I/RNase，重悬细胞；加入250μl溶液II，颠倒4-6次轻柔混匀，获得澄清的溶液，室温稍放置；加入350μl溶液III，混匀直到出现白色沉淀；10,000g离心10min后，将上清转移到置于2ml离心管套管上的HiBind^TM DNA柱上；10,000g离心1min，弃液；用500μl HB buffer洗柱，10,000g离心1min，弃液；用750μl经乙醇稀释的DNAwash buffer洗柱一次，10,000g离心1min，弃液，重复洗柱一次；空HiBind^TMDNA柱再10,000g离心1min，弃痕液；40μl灭菌去离子水洗柱两次，10,000g离心1min，溶解质粒。

8)含插入片断的T载体质粒测序

采用Perkin Elmer公司的ABI PRISM 3700自动测序仪进行测序工作，测序反应按ABIPRISM BigDye^TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits的说明书进行操作，使用T7和SP6primer进行双向序列测定。

实施例2：重组表达载体pTRX-S21.1的构建

1)质粒与菌株：

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α购自Invitrogen公司，由本实验室保存，其基因型为：DH5α：supE44Δlac U169(

80lacZAM15)hsdR17recA1endA1gyrA96thi-1relA1；大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)购自Stratagene公司，基因型为：BL21(DE3)：F-ompT hsdSB(r-B，m-B)dcm galλ(DE3)。

2)试剂与其他材料：

限制性内切酶Kpn I、Not I及T4DNA连接酶购自TaKaRa公司；Taq DNA聚合酶、10×PCRBuffer和dNTP购自鼎国公司；Gel Extraction Kit和Plasmid Miniprep Kit为OMEGA BIOTEK公司产品；BCA^TM Protein Assay Kit为PIERCE公司产品；Trans2K DNA Marker购自TransGen公司；低分子量标准蛋白14,400～108,000kD和14,300～97,200kD分别购自凯基生物和TaKaRa公司；3C酶购自中大南海海洋生物技术国家工程研究中心；色谱级TFA(三氟乙酸)购自Sigma公司；氨卞青霉素钠盐购自华北制药厂；Tryptone和Yeast Extract购自Oxoid公司；T7promoter sequencing primer(T7)，S21.1基因的寡聚核苷酸引物由Invitrogen公司合成；其它试剂均为国产分析纯试剂。

3)实验方法：

(1)中国南海线纹芋螺毒素基因S21.1的合成

引物合成：将线纹芋螺毒素基因S21.1分为(a)、(b)、(c)、(d)四段互补片段，在该基因的5′端和3’端分别加入了限制性内切酶Kpn I和Not I的酶切位点。另外，在5’端加入了3C酶的识别位点，而在3′端还加入了两个终止密码子(TAA)，以防止发生核糖体的跳跃，引物序列如下所示：

(a)5’C CTG GAA GTT CTG TTC CAG GGG CCC ACC GAT GAA CCG GAA GAATGC GAA CTG GAT 3’

(b)3’CATGG GAC CTT CAA GAC AAG GTC CCC GGG TGG CTA CTT GGC CTT CTTACG CTT GAC CTA 5’

(c)5’GGC AAC GGC TGC TGC CGC AAC CCG GAT GGC ACC ACC CAT GGC TGCCGC TAATAAGC 3’

(d)3’CCG TTG CCG ACG ACG GCG TTG GGC CTA CCG TGG TGG GTA CCG ACGGCG ATT ATT CGCCGG 5’

将上述(a)、(b)、(c)、(d)四段互补片段经PCR扩增，再将扩增所得的引物Oligo片断用原子级水溶解为10μmol/L的溶液。将引物分为互补配对的两组分别进行磷酸化与退火。磷酸化体系为(10μL)：

10μM Oligo	1.0μL
		10×T4磷酸化酶缓冲液	1.0μL
10mMATP	1.0μL
		T4多核苷酸激酶(10U/μL)	0.5μL
ddH2O	6.5μL

互补配对：将磷酸化好的互补Oligo加在一起，94℃反应2.5min，然后在水浴中自然冷却至45℃。得到配对好的线纹芋螺毒素基因S21.1。

(2)重组表达载体pTRX-S21.1的构建

载体pTRX(载体pTRX为申请人自行构建并申请中国专利，专利名称为：一种高效原核表达载体；专利号CN00124832.4，授权公告号CN1189565)是由Novagen公司的PET22b表达载体改造而成。载体pTRX的构建是用大肠杆菌硫氧还蛋白(thioredoxin，Trx)置换PET22b表达载体上的信号肽，并在TRX基因后加上连接区，包括柔韧区、编码6His的序列、蛋白酶切割位点以及多克隆位点(MCS)，是一个使用方便简单且高效表达的载体。上述载体pTRX的物理图谱和多克隆位点如图1所示。

取载体pTRX的保种菌液在氨苄抗性的平板上划线培养，以得到活化的单菌落。挑去单菌落接种于5ml LB加富液体培养基中，37℃振荡培养过夜后，收集菌体，提取载体pTRX。利用Kpn I和Not I双酶切法对载体pTRX进行线性化制备，目的是为了切除Kpn I和Not I酶切位点之间的基因片段，得到线性化的载体pTRX。载体pTRX线性化后进行胶回收和纯化操作，利用T4DNA连接酶对上述线性化的载体pTRX和上述配对好的芋螺毒素基因S21.1进行连接，连接后转入大肠杆菌DH5α中进行扩增。测序结果正确，说明重组表达载体pTRX-S21.1构建成功。重组表达载体pTRX-S21.1合成过程如图2所示。

i.提取的pTRX质粒DNA经限制性内切酶Kpn I和Not I双酶切。

酶切反应体系(30μL)：

质粒DNA	2.5μL
		10x K Buffer	3.0μL
Kpn I	2.0μL
		Not I	2.0μL
0.1％BSA	3.0μL
		ddH2O	20.0μL

将样品置于37℃酶切12hr，然后将酶切产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，切下含载体pTRX的琼脂糖凝胶块，采用OMEGA BIOTEK公司的Gel Extraction Kit(Cat.No.D2500-02)并按照其说明书进行胶回收操作，得到线性化的载体pTRX。

ii.连接反应

利用T4DNA连接酶对上述载体pTRX和上述配对好的线纹芋螺毒素基因S21.1进行连接。连接反应体系(20μL)：

将样品混匀，16℃连接过夜。将连接产物加入大肠杆菌DH5α感受态细胞进行转化，测序，结果正确，说明克隆成功，得到重组表达载体pTRX-S21.1。图3为重组表达载体pTRX-S21.1的菌落PCR阳性克隆琼脂糖凝胶图。

实施例3、中国南海线纹芋螺毒素多肽S21a的高效原核表达

1)重组融合蛋白的表达

将测序正确的重组表达载体pTRX-S21.1转化至大肠杆菌BL21(DE3)构建成工程菌株。挑取工程菌株单菌落接种于Amp+LB液体加富培养基中，37℃振荡培养过夜作为种子菌。取种子菌按1∶100体积比接种于新鲜的Amp+LB丰富培养基中，37℃剧烈振荡放大培养至OD600约为0.6，加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L，同时加入20％葡萄糖至终浓度0.2％，于18℃诱导表达12hr。诱导结束后4℃、10,000rpm离心10min，收菌，所得菌体用预冷的PBS缓冲液(pH7.4)洗涤菌体一次，离心，再用预冷的Lysis Buffer(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/LNaCl，10mmol/L咪唑，pH 8.0)以1∶10的比例重悬。以300W功率，冰浴下超声1.5h破碎细菌细胞。超声结束后4℃离心两次：10,000rpm离心10min，12,000转离心20min，收集含重组融合蛋白的上清。

2)多肽S21a的制备

(1)重组融合蛋白的亲和层析

采用QIAGEN公司的Ni-NTA Superflow填料，以Ni2+为配体，层析柱的灌注及使用前后的处理方法见说明书。

Ni-NTA Superflow柱料孔径为60-160μm，整个操作过程维持2.0ml/min的恒定流速。用5倍柱床体积的Lysis Buffer清洗封存的Ni-NTA Superflow亲和层析柱，去除乙醇并平衡层析柱，接着将超声后的离心上清上柱，用Lysis Buffer洗柱至紫外吸收值达到基线，过程中留取穿流峰样品。然后使用咪唑浓度为20mmol/L的Wash Buffer进行杂蛋白洗脱，最后使用咪唑浓度为200mmol/L的Elution Buffer洗脱目的蛋白。通过上述亲和层析步骤对上述重组融合蛋白作进一步纯化。如图4和图5所示，图4为重组融合蛋白分离纯化亲和层析图。图5为重组融合蛋白的诱导表达及纯化的SDS-PAGE电泳图谱

(2)重组融合蛋白的酶切

采用Pharmacia公司的Sephadex G25柱更换样品缓冲系统。层析柱的灌注及处理方法详见说明书。整个操作过程维持2.0ml/min的恒定流速。先用2倍体积的3C酶酶切Buffer平衡层析住，接着将Ni2+纯化后的融合蛋白上柱，然后继续使用3C酶酶切Buffer进行洗脱并收集目的蛋白峰。样品经Sephadex G25凝胶过滤层析将缓冲液更换为酶切缓冲液后，加入1％的3C酶在20℃酶切10h。

(3)酶切产物凝胶过滤层析

Sephadex G50Fine分子筛层析柱规格为Pharmacia XK50(5.0cm×100cm)，使用AKTAexplorer系统进行中压层析，流速恒定为2ml/min。用50mM NH4HCO3平衡Sephadex G50层析柱1～1.5个柱床体积，上样50ml酶切产物样品。设定自动收集程序，收集紫外吸收目标蛋白峰，得到多肽S21a。

(4)HPLC检测与纯化

冻干后的多肽S21a用少量去离子水溶解后直接上C18反相柱进行检测并纯化。线性梯度洗脱，程序如图2所示，215nm和280nm处双波长检测，收集少量洗脱峰样品进行质谱检测，结果如图6所示，图7则为多肽S21a的MALDI-TOF质谱图。其余样品再次进行真空冷冻干燥并保存于-20℃。

实施例4：多肽S21a的生理活性鉴定

本实施例中通过青蛙坐骨神经-腓肠肌标本肌肉收缩实验来鉴定由芋螺毒素基因S21.1编码的多肽S21a的生理活性。

实验步骤：双毁髓青蛙后制备坐骨神经-腓肠肌标本，用无菌脱脂棉给药，待测药品多肽S21a工作浓度为1μM。刺激参数为：延时100ms，波宽0.5ms，频率0.5Hz，强度5v，扫描速度为4.00s/div。使用电生理实验系统为泰盟科技BL-410生物机能实验系统以及成都仪器厂制造JZJ01型肌肉张力换能器，量程为30g，编号为4037。

结果分析：如图8所示，多肽S21a终浓度达1μM时可有效的阻断神经--肌接头处的递质传递并抑制肌肉收缩，高浓度多肽S21a可显著有阻断神经递质传递，可用于制备神经生物学研究的工具药。

实施例5：多肽S21a在生理模型上的中枢镇痛药效实验

基本方案：小鼠热板法

实验步骤：选取km系小鼠100只，体重20±2g，全为雌性。实验前先对小鼠进行筛选，将小鼠放于事先加热到55℃的热板测痛仪(RB-200型，成都泰盟科技有限责任公司)上，用秒表记录小鼠自投入热板至出现舔后足的时间为该鼠的痛阈值，测定2次，挑选出痛阈值不超过20s的小鼠为合格者进行正式实验。将筛选后的小鼠随机分成4组，即空白对照组、多肽S21a样品低、中、高剂量组，每组10只。实验开始时进行腹腔注射给药，其中多肽S21a样品低、中、高剂量组给予剂量分别为0.025mg/kg，0.05mg/kg，0.10mg/kg，空白对照组给予等体积的生理盐水。于注射给药后0.5h、1h、1.5h、2h、3h，4h，5h测定一次，如痛阈值超过60s则按60s计算(注意时间不宜太久以免烫伤小鼠足部)。实验结束后，进行统计学处理并计算痛阈提高百分率。痛阈提高百分率＝(用药后平均痛阈值-用药前平均痛阈值)÷用药前平均痛阈值×100％。

结果分析：如图9所示，由实验结果可得，空白对照组小鼠给药前后的痛阈值基本稳定，提示经过筛选后的小鼠对热刺激反应的耐受性较好。受试样品多肽S21a的低、中、高剂量组小鼠给药后的痛阈值均不同程度的提高，其中给药2h时，受试样品多肽S21a的三个剂量组小鼠的痛阈值与同期空白对照组相比，具有显著性差异(P＜0.05)；给药3h和4h时，受试样品多肽S21a的中、高剂量组小鼠的痛阈值与同期空白对照组相比，具有显著性差异(P＜0.01)；其中多肽S21a的中、高剂量组与空白对照组相比，具有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)；由此可初步认为多肽S21a的中、高剂量组具有一定的镇痛作用。

序列表

<110>中山大学

<120>中国南海线纹芋螺毒素S21a的制备及应用

<160>2

<210>1

<211>78

<212>DNA

<213>中国南海线纹芋螺(Conus Striatus)

<220>

<221>precursor peptide

<222>(1)...(78)

<400>1

acc gat gaa ccg gaa gaa tgc gaa ctg gat ggc aac ggc tgc tgc 45

Thr Asp Glu Pro Glu Glu Cys Glu Leu Asp Gly Asn Gly Cys Cys

1 5 10 15

cgc aac ccg gat ggc acc acc cat ggc tgc cgc 78

Arg Asn Pro Asp Gly Thr Thr His Gly Cys Arg

20 25

<210>2

<211>26

<212>PRT

<213>中国南海线纹芋螺(Conus Striatus)

<220>

<221>precursor peptide

<222>(1)...(26)

<400>2

Thr Asp Glu Pro Glu Glu Cys Glu Leu Asp Gly Asn Gly Cys Cys

1 5 10 15

Arg Asn Pro Asp Gly Thr Thr His Gly Cys Arg

20 25

Claims

1.一种中国南海线纹芋螺毒素基因S21.1，其特征在于：基因序列如序列表中序列1所示。

2.一种由根据权利要求1所述的芋螺毒素基因S21.1编码的多肽S21a，其特征在于：氨基酸序列如序列表中序列2所示。

3.一种重组表达载体pTRX-S21.1，其特征在于：由线性化的载体pTRX和中国南海线纹芋螺毒素基因S21.1连接组成,其中，所述线性化的载体pTRX为申请人自行构建并记载于专利号为CN00124832.4的中国发明专利中的载体pTRX经限制性内切酶Kpn I和Not I双酶切后所获得；所述中国南海线纹芋螺毒素基因S21.1的序列如序列表中序列1所示，其5’端添加有3C酶识别位点和KpnI酶切位点、3’端添加有两个终止密码子TAA和Not I酶切位点。

4.一种多肽的表达方法，其特征在于：实施步骤为：

（1）将如权利要求3所述的重组表达载体pTRX-S21.1转化宿主菌BL21(DE3)；

（2）培养转化后的宿主菌BL21(DE3)；

（3）对培养后的大肠杆菌BL21(DE3)进行超声裂解，收集上清；上清液经亲和层析纯化，得到重组融合蛋白；

（4）重组融合蛋白经3C酶酶切，酶切的产物经凝胶过滤层析和HPLC纯化得到目的蛋白——多肽S21a。

5.根据权利要求2所述的多肽S21a在制备镇痛药物中的应用。