CN101285064A - 一种新的信号芋螺m-超家族毒素序列、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种新的中国南海信号芋螺M－超家族毒素基因Lt16.1及其编码的多肽序列lt16a和制备技术，以及该多肽在神经生物学研究，离子通道研究和镇痛药物开发中的应用。本发明通过构建cDNA文库的方法，从中国南海信号芋螺的毒管中发现了一种新的M－超家族毒素基因Lt16.1。利用RT－PCR的方法克隆到该基因全长。多肽lt16a前体肽氨基酸序列如序列表<400>2序列所示，成熟肽氨基酸序列如序列表<400>3序列所示。该重组芋螺毒素lt16a在0.1μM浓度下即可以明显阻断部分的钠离子通道，降低钠通道的峰值电流。通过小鼠热板实验证实本发明制备的重组芋螺毒素lt16a具有中枢镇痛作用。

Description

一种新的信号芋螺M-超家族毒素序列、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种中国南海信号芋螺M-超家族毒素基因Lt16.1及其编码的多肽序列lt16a和该种多肽的制备技术，以及该种毒素在神经生物学研究，离子通道药物和镇痛药物开发中的应用。

背景技术

芋螺属于软体动物门腹足纲芋螺科(Conidae)，多数栖息在热带海洋的浅海水域，少数在水深几米至200余米的深水区，因外形呈圆锥形或芋头状而得名。芋螺是比较年轻的生物，化石记录证明芋螺属最早出现于始新世(Eocene)，中生代(mesozoic)时期与陆地上恐龙同时灭绝的海洋捕食性软体动物菊石的消失客观上促进了芋螺的第一次大规模的物种形成。芋螺的第二次大规模的辐射始于中新世(Miocene)，基本上持续到现在。每个芋螺物种的形成都伴随全新的毒液成分和有效的毒液输送装置的进化。

芋螺具有强大的自然进化能力，全球有约500种芋螺，单一种属中就包括数百种物种，这使芋螺成为海洋无脊椎动物中进化最成功的生物。芋螺是食肉动物，靠毒液来捕食，根据其捕食习性可分为食鱼芋螺(piscivorous)、食螺芋螺(molluscivorous)、食虫芋螺(vermivorous)。食虫性芋螺种类最多，占全部芋螺种类的70％左右。食鱼性芋螺占芋螺总数最少，但毒性最强，报道的芋螺致死事件基本上是该类芋螺造成的，如织锦芋螺(C.textile)、地纹芋螺(C.geographus)等。

芋螺毒液是捕食与防御作用的主要武器，它是由许多单一毒肽组成的鸡尾酒样的混合毒素，称为芋螺毒素(Conotoxin)。芋螺毒素能特异地作用于神经系统的电压门控和配体门控离子通道的不用亚型和递质受体，因此被广泛用于神经生物学研究。芋螺毒素通常为由7～41个氨基酸残基组成的小分子多肽。大多富含半胱氨酸，具有高度保守的二硫键骨架。与蜘蛛、蝎、蛇、海葵等许多动物的毒素比较(40～80个氨基酸左右)，芋螺毒素的肽链短得多，富含二硫键，分子结构更为紧密，生物活性更高。大多数芋螺毒素均由单一的mRNA编码，原始的翻译产物是一种特定的多肽前体，约为70-120个氨基酸残基，经蛋白酶水解后得到成熟肽。

二十世纪八十年代初，美国犹它大学Olivera BM学者实验室最早开展了芋螺毒素全面系统研究工作。芋螺毒素以其分子小，结构稳定，对受体作用范围广并且活性强的特点，已经跃居于动物神经毒素研究的首位。由于它们作用靶点广泛，能高度特异地结合细胞膜上神经递质和激肽的受体和各种离子通道，一方面，可以被直接开发成药物或作为新药的先导化合物应用于临床；另一方面，可以成为神经生物学中发现鉴定新受体，研究受体构效关系及其调控细胞分子机理的重要探针，并推动了离子通道的进化研究。

保守估计有50000种以上不同的芋螺毒素存在，至今已经得到分离的芋螺毒素有近千种，数十种芋螺毒素已申请美国专利。它们在镇痛、局部缺血性保护、癫痫治疗、某些疾病诊断和受体研究中具有广泛的应用价值，有的已进入临床研究或已被FDA正式批准为治疗新药，用作特异诊断试剂和镇痛药。目前，由Elan公司进行开发的ω-CTX M VIIA(SNXIII，商品名：Ziconotide)，因其直接作用分布于神经组织的N-型钙离子通道，无需第二信使或蛋白，不成瘾，已成为治疗难治性神经疼痛的新一代药物，已通过了III期临床试验，正式被FDA批准上市。而另一个衍生于ω-CTX C VID的化合物AM336作用类似于Ziconotide，因其对N-钙通道的选择性更强，副作用更低，已经批准作为对抗严重抗吗啡作用慢性疼痛的治疗药物进入临床试验阶段。此外，Conantokin-G作为NMDA受体高度选择性的拮抗剂，对难以治疗的癫痫有效，也已完成I期临床试验。芋螺毒素药用研究的其他方向还有：具有去甲肾上腺素转运蛋白抑制作用的T-超家族芋螺毒素，可用于治疗抑郁症。以及抑制α1-肾上腺素受体的一些芋螺毒素，可用于治疗良性前列腺过度增生引起的尿失禁。与此同时，围绕着增强药物分子的稳定性，降低过敏反应以及增加溶解性以利于口服目的的分子改造研究工作也正在进行。

另一方面，芋螺毒素作为研究离子通道和膜受体的极好探针或工具，已经成为电压门控型钙离子通道(VSCCs)和N型乙酰胆碱受体(nAChRs)等通道、受体鉴定和诊断的标准工具，在神经药理学领域得到了广泛的应用。

芋螺在我国南海海域有广泛分布，已查明的芋螺约有80余种，主要分布在台湾、广东、广西、海南诸省以及西沙和南沙群岛等。近年来国内也开展了芋螺毒素的生物化学、分子生物学以及药理作用等方面的研究工作。中国科学院北京药物化学研究所的陈冀胜研究员等人已自桶形芋螺(C.betulinus)、独特芋螺(C.caracteristileus)、菖蒲芋螺(C.vexillum)、地纹芋螺等类芋螺中分离鉴定了十余种新序列的芋螺毒素。军事医学科学院生物工程研究所的卢柏松、黄培堂以及戴秋云等从我国的线纹芋螺、织锦芋螺中也发现了一些新的毒素成分和基因序列。热带农业大学彭世清、罗素兰等已从菖蒲芋螺基因组中克隆到两个新芋螺毒素基因(GenBank登记号AY316159，AY316160)；同时还从海南产的大理石芋螺(C.marmoreus)、幻芋螺(C.magus)、信号芋螺(C.littertus)、勇士芋螺(C.miles)、独特芋螺、织锦芋螺、桶形芋螺、疵篙芋螺(C.lividus)等共12个种中分别发现了具有药用功能的35种O-超家族芋螺毒素及其基因。虽然我国有着丰富的芋螺资源，但由于起步较晚，目前对于芋螺毒素的研究尚处于初期阶段，有着广阔的研究空间和开发前景。

由于芋螺毒素在其基因序列和蛋白质结构及功能方面差异较大，具有种类繁多，结构复杂和高度遗传多样性特征。构建信号芋螺毒管cDNA文库可以系统地研究食虫芋螺的毒素组成、表达谱，发现新的食虫芋螺特有的毒素序列。迄今为止，国外已构建了多种芋螺的cDNA文库，中国南海信号芋螺是一种食虫性芋螺，世界上尚没有关于它的毒素研究的报道。

另外，目前有关芋螺毒素的生化结构及其神经药理活性的研究都是基于天然提取毒素的分子结构，用人工合成的毒素来研究的。虽然已克隆到很多芋螺毒素基因，但目前鲜有芋螺毒素基因体外表达的报道。重组芋螺毒素将以其质优、价廉的优势，代替产率低、成本昂贵的人工合成毒素。开展芋螺毒素体外表达技术的研究，将具有非常重要的理论研究价值和应用价值。

因此，开展我国南海信号芋螺毒素的生物化学、药理学尤其是其分子生物学和基因工程技术领域的探索研究将有助于对新毒素分子相应受体及其作用机制的深入研究，而且可为我国芋螺海洋资源的药用开发利用提供重要理论依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的中国南海信号芋螺M-超家族毒素基因Lt16.1，其编码的多肽序列lt16a及其类似物和衍生物。

本发明的另一目的在于提供该种多肽的生产方法。

本发明的第三个目的在于提供了用全细胞膜片钳技术考察了该种多肽的成熟肽对大鼠DRG细胞钠电流的抑制作用，从而为制备神经生物学研究的工具药和治疗心律失常、顽痛、癫痫以及中风等疾病药物提供数据。

本发明的第四个目的在于提供了用小鼠热板实验来考察该种多肽的成熟肽是否具有中枢镇痛作用，从而为制备镇痛药物提供数据。

通过cDNA文库的构建和测序的方法，从中国南海信号芋螺毒管中分离得到M-超家族芋螺毒素Lt16.1基因，其cDNA序列如序列表中<400>1序列所示。

上述本发明基因所编码的多肽是一毒素的前体肽，该前体肽的氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示；该前体肽的成熟肽的氨基酸序列如序列表中<400>3序列所示；其成熟肽的分子量为3237.57道尔顿。

该蛋白通过原核细胞融合表达载体pMal-p2x在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达。

该重组的成熟肽，命名为信号芋螺毒素lt16a，能阻断部分钠通道，，降低钠通道的峰值电流，但不影响通道的门控特性。

本发明所选择的信号芋螺采自海南省三亚市。

信号芋螺毒管cDNA文库的构建：取活螺体，使用喉闸破碎螺壳，暴露出螺肉，冰上小心并快速分离毒管组织，提取总RNA。反转录为一链cDNA后合成双链cDNA，双链cDNA与pMD18T载体连接后转化E.coli，并保存每个重组克隆。

本发明通过对文库重组克隆大规模序列测定，从中得到了1个新的编码芋螺毒素的克隆，命名为Lt16.1(其DNA序列如序列表中<400>1序列所示)。新基因编码83个氨基酸残基，成熟肽编码29个氨基酸残基，成熟肽段分子量为3237.57道尔顿。

本发明通过设计了一对引物，将编码新毒素lt16a的成熟肽基因克隆到原核融合表达载体pMal-p2x上，构建表达质粒并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)。原核细胞融合分泌表达载体质粒pMAL-p2X为New England Biolabs公司产品，以tac为启动子，具有malE的信号序列，麦芽糖结合蛋白(MBP)为融合伴侣和亲和层析纯化标签，在MBP与目的蛋白之间有柔韧区和Xa因子酶切位点。通过对培养时间，诱导时间，温度等条件的摸索和优化，MBP-lt16a融合蛋白的表达量较高，绝大部分处于可溶状态。

电生理实验结果证实，重组信号芋螺毒素lt16a在0.1μM浓度下即可以明显阻断部分钠离子通道的，降低钠通道的峰值电流，可作为探针用于离子通道类型及亚型的分类鉴定或者用于工具药的研究开发，用于制备神经生物学研究的工具药和治疗心律失常、顽痛、癫痫以及中风等疾病的药物。

小鼠热板试验结果证实，重组信号芋螺毒素lt16a的中、高剂量组与空白对照组相比，具有显著性差异(P＜0.05，P＜0.001)；由此可初步认为lt16a的中、高剂量组具有一定的镇痛作用，从而为制备镇痛药物提供数据。

本发明的表达质粒复制方法：参照Sambrook(Sambrook，et al.1989，Molecular cloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，用CaCl₂的方法将质粒转化E.coli.DH5或BL21(DE3)菌株，用含氨苄青霉素

的LB培养基培养转化菌株，碱法提取质料。

附图说明

图1为芋螺毒素Lt16.1基因PCR产物的2.5％琼脂糖凝胶电泳分析

1：DL2000 DNA分子量标准2：Lt16.1基因片段3：PCR阴性对照

图2为pMAL-p2X-Lt16.1重组表达载体鉴定2.5％琼脂糖凝胶电泳分析

1：1Kb DNA分子量标准2：pMAL-p2X-Lt16.1质粒3：pMAL-p2X-Lt16.1经XmnI和HindIII酶切后4：重组表达质粒pMAL-p2X-Lt16.的PCR产物5：PCR阴性对照

图3为融合蛋白MBP-lt16a冷渗透休克上清的离子交换层析图谱

图4为融合蛋白MBP-lt16a G-25分子筛层析图谱

图5为融合蛋白MBP-lt16a诱导表达及纯化的SDS-PAGE电泳图谱

M：蛋白质分子量标准；1：转入质粒pMAL-p2X-Lt16.1的大肠杆菌诱导前表达的总蛋白；2：转入质粒pMAL-p2X-Lt16.1的大肠杆菌37℃诱导表达的总蛋白；3：转入质粒pMAL-p2X-Lt16.1的大肠杆菌冷渗透休克后离心上清；4：DEAE-Sepharose(fast flow)的目的峰5：Sephadex-G25 Fine目的峰

图6为融合蛋白MBP-lt16a经Factor Xa酶切电泳图

1：蛋白质分子量标准；2：融合蛋白MBP-lt16a；3：20℃酶切融合蛋白MBP-lt16a 16小时；4：20℃酶切融合蛋白MBP-lt16a 24小时

图7为融合蛋白MBP-lt16a酶切后的反相高效液相色谱图

图8为重组蛋白lt16a反相高效液相色谱峰的电喷雾质谱分析图

图9为重组蛋白lt16a对DRG细胞TTX敏感型钠通道电流的影响

图10为重组蛋白lt16a对大鼠DRG细胞钠通道电流-电压关系的影响

其中，图10A为钳制电压为-80mV，刺激电压从-80mV至+30mV，脉冲间隔为10mV，刺激电压的脉冲宽度为15ms的条件下，TTX敏感型钠通道电流峰形的变化

图10b为钳制电压为-80mV，刺激电压从-80mV至+30mV，脉冲间隔为10mV，刺激电压的脉冲宽度为15ms的条件下，加入100nM lt16a 20min后TTX敏感型钠通道电流峰形的变化

图10C为I-V曲线，表明了对照和加100nM lt16a 20min后峰电流的变化

图11为重组蛋白lt16a生理模型上的镇痛药效

NS：空白对照组；H：lt16a样品高剂量组；M：lt16a样品中剂量组；L：lt16a样品低剂量组

具体实施方式

在本发明申请中，“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另外一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。

本发明中的多核苷酸指RNA序列、DNA序列或cDNA。

本发明用构建cDNA文库的方法，从中国南海信号芋螺毒管中克隆得到的芋螺毒素M-超家族成员lt16.1，其DNA序列如序列表中<400>1序列所示。

上述本发明基因编码的多肽是神经毒素lt16a的前体肽，其氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示，成熟肽氨基酸序列如序列表中<400>3序列所示。

该成熟多肽可以通过分离纯化得到，HPLC鉴定其纯度达到96.5％，MALDI-TOF鉴定其分子量正确。

本发明所选择的信号芋螺属于中国南海食虫性信号芋螺(Conuslitteratus)，采自海南省三亚市。

中国南海信号芋螺毒管cDNA文库的构建：首先分离信号芋螺毒管，提取总RNA。取总RNA进行反转录合成cDNA第一链产物。再取cDNA用于连接反应，转化液分别涂板，其余用于摇总库菌液，从平板上挑取单克隆保种。

本发明通过对以上重组克隆大规模序列测定，得到7条EST序列编码中国南海信号芋螺神经毒素M-超家族成员，命名为Lt16.1(其前体肽的DNA序列如序列表中<400>1序列所示)。新基因编码的前体肽氨基酸序列如序列表中<400>2序列所示，该前体肽的成熟肽氨基酸序列如序列表中<400>3序列所示，分子量为3237.57道尔顿，具有典型芋螺毒素一级结构的特征，分子内具有三对二硫键。

本发明通过分离纯化得到了一条多肽lt16a，成熟肽序列TGEDFLEECMGGCAFDFCCKRSLRDTTSD，分子量为3237.57道尔顿.信号芋螺Lt16.1编码的前体肽信号肽部分与M-超家族芋螺毒素具有很高的同源性，但是成熟肽部分采用-C-C-CC-这种新半胱氨酸骨架。

以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1：信号芋螺毒管cDNA文库的构建和鉴定

总RNA的提取和cDNA合成：分离中国南海信号芋螺毒管，参照Gibco BRL公司的TRIZOL LS试剂说明书进行毒管总RNA提取。取1μg信号芋螺毒管总RNA以SMART IIIolignuclotide(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3’)和CDSIII/3’PCR引物(5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)₃₀N_-1N-3’)进行逆转录合成第一链，得到10μl cDNA第一链产物。

信号芋螺毒管cDNA文库的构建和鉴定：取cDNA

用于连接反应，转化后涂板。从平板中挑取单克隆保种并随机挑取一定数目的单克隆进行测序和生物信息学分析。

实施例2：芋螺毒素基因Lt16.1的序列分析

南海信号芋螺神经毒素基因Lt16.1的质粒和序列来自中国南海信号芋螺毒管cDNA文库中所克隆到EST序列。南海信号芋螺神经毒素基因Lt16.1编码由83个氨基酸残基组成的前体肽，该前体肽的成熟肽由29个氨基酸残基组成。

利用BLAST N和BLAST X(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)算法在现有GenBank等公共数据库中对所测核苷酸和衍生蛋白质序列进行同源检索。潜在的读码框(ORFs)利用SEQTOOLS 8.0来定位。序列的同源性比较采用CLUSTAL X软件进行。蛋白信号肽序列预测是通过网站http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP进行的。蛋白质的分子量、理论等电点、电荷分布和稳定性参数等通过ProtParam tool(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)软件来完成。三级结构的预测是通过SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org//SWISS-MODEL.html)同源模建程序完成，生成的PDB文件由Swiss-PdbViewer软件进行分析。

实施例3：信号芋螺M-超家族毒素基因Lt16.1表达质粒的构建

由信号芋螺毒管cDNA文库测序所得的Lt16.1基因，根据其编码成熟蛋白的氨基酸序列，结合pMAL-p2X质粒的多克隆位点，设计Lt16.1基因片段的扩增引物，如下所示。在上游引物中引入Xmn I酶切位点(GAA GGA TTT)，下游引物中引入HindIII酶切位点(AAG CTT)及双终止密码子(TTA TTA)。通过上述两条引物进行PCR扩增，扩增出Lt16.1基因中的编码成熟蛋白的核苷酸序列，PCR产物经Xmn I和HindIII酶切与pMAL-p2X载体相连后，mal E基因、蛋白酶Factor Xa识别位点序列、Lt16.1基因编码成熟蛋白的核苷酸序列和终止子TTA TAA融合在一起，并构成一个完整的读码框。

Lt16.1基因中的成熟肽编码序列：

5’ACT GGT GAG GAC TTT CTG GAG GAA TGC ATG GGT GGC TGC GCC TTT GACTTC TGT TGC AAA AGG TCT TTG AGA GAC ACT ACA TCG GAC 3’

上游引物：

5’CGG GAA GGA TTT ACT GGT GAG GAC TTT CTGG 3’

          Xmn I

下游引物：

5’ATTT AAG CTT

GTC CGA TGT AGT GTC TCTC3’

HindIII  stop codon

以信号芋螺毒管cDNA文库的Lt16.1基因为DNA模板，经PCR扩增出的Lt16.1基因片段(含限制性内切酶酶切位点和终止密码子)约为120bp，与预期PCR产物大小一致(见图1)。

将回收纯化的Lt16.1基因片段，用Xmn I和Hind III双酶切后，与经Xmn I和Hind III双酶切后的线性载体pMAL-p2X连接，构建融合表达质粒pMAL-p2X-Lt16.1。用Lt16.1基因上下游特异引物，通过PCR筛选转化后的克隆，阳性克隆可扩增出一条与预期大小(约为120bp)一致的特征片段(见图2)。用Xmn I和Hind III双酶切检测重组质粒，酶切产物包括与PCR产物大小(约为120bp)一致的片段，以及与线性载体pMAL-p2X大小(5.8kb)一致的片段。表明Lt16.1基因已插入质粒载体pMAL-p2X中。

对纯化后的pMAL-p2X-Lt16.1重组质粒进行双向测序，其序列与合成的模板序列结果完全一致，并且读码框正确。

实施例4：重组pMAL-p2X-Lt16.1在大肠杆菌中的表达

重组的pMAL-p2X-Lt16.1转化E.coli TB1感受态细胞，次日挑单菌落37℃过夜培养，第3d按1∶50放大至1L的LB rich medium+Glucose+Amp(10gTryptone，5g Yeast Extract，5g NaCl，2g Glucose/L)培养基中，在A₆₀₀值达到0.4-0.6时，加入IPTG至终浓度0.3mmol/L，诱导表达，4h后离心收集菌体细胞。

冷渗透休克处理：将离心收集的菌体悬浮于60ml 30mM Tris-HCl，20％Sucrose(pH8.0)缓冲液中，然后加入1ml 0.1M EDTA溶液，室温摇动5-10min。然后在4℃，8000g离心10min，去掉上清，将沉淀悬浮于60ml冰浴的5mM MgSO₄溶液，在冰浴的条件下摇动10min，最后，在4℃下，8000g离心10min，收集上清。

实施例5：重组融合蛋白MBP-lt16a的纯化

用阴离子交换柱层析纯化，在AKTA explorer层析系统上进行。用溶液A平衡好的DEAE-Sepharose(fast flow)阴离子交换柱(2.6cm×10cm)，将上面得到的冷渗透休克样品加Tris-HCl(pH8.2)至终浓度为20mM，然后上样。按表1进行线性梯度洗脱，280nm检测，按峰收集(见图3)，取样Tricine SDS-PAGE电泳检测收集峰。(见图5)

表1阴离子交换柱层析梯度洗脱表

A：20mM Tris-HCl(pH8.2)；B：20mM Tris-HCl(pH8.2)，1.0M NaCl

实施例6：重组融合蛋白MBP-lt16a的酶切

将阴离子交换柱层析得到的融合蛋白用Sephadex-G25 Fine(2.0cm×60cm)更换缓冲液，在Biologic LP层析系统上进行。上样前用2倍柱床体积的Factor Xa酶切缓冲液平衡凝胶柱，再将融合蛋白(10％CV)加载到凝胶柱上，用Factor Xa酶切缓冲液洗脱，280nm检测，收集洗脱峰备用。(见图4)

目的峰用截留分子量(MWCO)为10K的超滤膜来进行浓缩处理。加入FratorXa酶切，切去N端的麦芽糖结合蛋白(MBP)，酶切的条件如下：

MBP-lt16a(5mg/ml)        100μl

Factor Xa(10unit/μl)    1.0μl

反应在20℃进行24小时。取样Tricine SDS-PAGE电泳检测收集峰(见图6)。

实施例7：重组蛋白酶切后的反相色谱纯化

酶切24小时后的融合蛋白溶液直接上Waters公司的Symmetry 300 C18反相柱(300

5μm，4.6mm×250mm)进行纯化。线性梯度洗脱，程序如表2所示，215nm检测，收集洗脱峰备用。(见图7)

表2反相高效液相色谱洗脱梯度

A：0.1％TFA  B：乙腈(含0.1％TFA)

实施例8：电喷雾和飞行时间质谱鉴定重组芋螺毒素lt16a的分子量

质谱鉴定在ABI公司的Voyager-DE^TMSTR型MALDI-TOF质谱上完成，用基质辅助激光解吸飞行时间质谱分析法(matrix assisted laser desorption/ionizationtime-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF mass spectrometry)进行：线性模式检测正离子；激光重复率5.00Hz；离子源加速电压1(IS/1)20kV；离子源加速电压2(IS/1)18.7kV；静电压(Lens voltage)7.5kV；仪器的控制和数据的处理由Brucker公司开发的控制软件和Sun工作站完成。用0.1％TFA/30％乙腈/69.9％水混合液制备基质CCA的饱和液，然后取2μl样品(约1 Picomol)与8μl CCA的饱和液混合，再取2μl混合液在质谱的样品盘上进行点样，室温干燥后测定分子量。用外标法进行校正。(见图8)

实施例9：重组信号芋螺毒素lt16a对钠离子通道的作用

以SD大鼠背根神经节细胞为实验标本，应用全细胞膜片钳模式进行全细胞电流的记录。在电压钳条件下，将细胞膜电位钳制在-80mV，然后给予持续时间为50ms、去极化电压为-10mV的单脉冲刺激，可诱导出TTX敏感型钠电流。在施加毒素后，重复给予同样的刺激，并观察毒素对内向电流的影响。在加入0.1μM毒素峰值电流降低约68.09±2.09％(n＝3)，但钠电流的峰形没有明显的改变。这说明重组表达的芋螺毒素可以阻断部分钠通道，而不影响通道的门控特性(见图9)。

在全细胞记录电压钳模式下，将细胞钳制在-80mV时，分别给予一组测试电压，变化范围为-80mV到+30mV，步阶为+10mV，持续时间为50ms，可在DRG细胞上得到TTX敏感型钠通道的激活电流-电压(I-V)关系曲线图，如(图10)所示。结果表明，在相应浓度毒素的作用下，大鼠背根神经节细胞钠电流与电压的依赖关系和钠通道的激活电位没有改变，峰值电流产生的电位(-20mV)和翻转电位(30mV)都没有发生明显改变。与此同时，毒素能够明显阻断部分细胞内向钠电流(n＝3)。从以上的分析可以看出，重组毒素分子在阻断钠通道的同时不改变通道的激活与失活的动力学曲线。

实施例10：生理模型上的中枢镇痛药效实验法

基本方案：小鼠热板法

选取NIH系小鼠100只，体重20

2g，全为雌性。实验前先对小鼠进行筛选，将小鼠放于事先加热到55℃的热板测痛仪上，用秒表记录小鼠自投入热板至出现舔后足的时间为该鼠的痛阈值，测定2次，挑选出痛阈值不超过20s的小鼠为合格者进行正式实验。将筛选后的小鼠随机分成4组，即空白对照组、lt16a样品低、中、高剂量组，每组10只。实验开始时进行腹腔注射给药，其中lt16a样品低、中、高剂量组给予剂量分别为0.07mg/kg，0.14mg/kg，0.28mg/kg，空白对照组给予等体积的生理盐水。于注射给药后0.5h、1h、1.5h、2h、3h测定一次，如痛阈值超过60s则按60s计算(注意时间不宜太久以免烫伤小鼠足部)。实验结束后，进行统计学处理并计算痛阈提高百分率。痛阈提高百分率＝(用药后平均痛阈值-用药前平均痛阈值)÷用药前平均痛阈值×100％。

由实验结果可得，空白对照组小鼠给药前后的痛阈值基本稳定，提示经过筛选后的小鼠对热刺激反应的耐受性较好。受试样品lt16a的低、中、高剂量组小鼠给药后的痛阈值均不同程度的提高，其中给药0.5h时，受试样品lt16a的三个剂量组小鼠的痛阈值与同期空白对照组相比，具有显著性差异(P＜0.01，P＜0.001)；给药1h和2h时，受试样品lt16a的中、高剂量组小鼠的痛阈值与同期空白对照组相比，具有显著性差异(P＜0.01，P＜0.001)；给药3h时，受试样品的痛阈值降至最低，其中lt16a的中、高剂量组与空白对照组相比，具有显著性差异(P＜0.05，P＜0.001)；由此可初步认为lt16a的中、高剂量组具有一定的镇痛作用。(见图11)

序列表

<110>中山大学

<120>一种新的信号芋螺M-超家族毒素序列、制备方法及其应用

<160>3

<210>1

<211>249

<212>DNA

<213>中国南海信号芋螺(Conus litterarus)

<400>1

atgcctaaac tgggagtctc gctgttcatt tttctggttc tgtttcccct ggcaactctt 60

cagctggatg gagatcaatc cgctggtcgt catgcacagg aaaggggcga ggacctgttt120

aaaatgtatc aatacttgag gcgcgctctg gaaaggaggc gtactggtga ggactttctg180

gaggaatgca tgggtggctg cgcctttgac ttctgttgca aaaggtcttt gagagacact240

acatcggac                                                        249

<210>2

<211>83

<212>PRT

<213>中国南海信号芋螺(Conus litterarus)

<400>2

Met Pro Lys Leu Gly Val Ser Leu Phe Ile Phe Leu Val Leu Phe

1                5                  10                   15

Pro Leu Ala Thr Leu Gln Leu Asp Gly Asp Gln Ser Ala Gly Arg

                 20                 25                   30

His Ala Gln Glu Arg Gly Glu Asp Leu Phe Lys Met Tyr Gln Tyr

                 35                 40                   45

Leu Arg Arg Ala Leu Glu Arg Arg Arg Thr Gly Glu Asp Phe Leu

                 50                  55                  60

Glu Glu Cys Met Gly Gly Cys Ala Phe Asp Phe Cys Cys Lys Arg

                 65                  70                  75

Ser Leu Arg Asp Thr Thr Ser Asp

                 80

<210>3

<211>29

<212>PRT

<213>中国南海信号芋螺(Conus litterarus)

<400>3

Thr Gly Glu Asp Phe Leu Glu Glu Cys Met Gly Gly Cys Ala Phe

1                5                   10                  15

Asp Phe Cys Cys Lys Arg Ser Leu Arg Asp Thr Thr Ser Asp

                 20                  25              29

Claims (6)

1、从中国南海信号芋螺毒管中分离得到一种基因，其核苷酸序列如序列表中<400>1序列所示。

2、一种多肽，其含有权利要求1所述基因编码的氨基酸序列或其保守性变异多肽序列或其活性衍生物。

3、权利要求2所述的多肽，其特征在于：该多肽的氨基酸序列如序列表<400>2所示。

4、权利要求3所述的多肽的成熟肽片段，其氨基酸序列如序列表<400>3所示。

5、权利要求4所述的多肽的生产方法，按照以下步骤进行：

(1)将编码权利要求4所述的成熟肽基因克隆到原核融合表达载体pMal-p2x上，构建表达质粒并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)；

(2)培养转化后的大肠杆菌BL21(DE3)；

(3)对大肠杆菌BL21(DE3)进行冷渗透休克处理，将冷渗透休克样品经阴离子交换柱层析纯化，得到融合蛋白；

(4)融合蛋白经因子Xa蛋白酶切割和反相高效液相层析，得到重组lt16a多肽的成熟肽。

6、权利要求2、3、4所述多肽可用于离子通道类型的检测，神经生物学工具药物和镇痛药物的应用。

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