CN1122106C - 一种平颏海蛇磷脂酶a2以及编码它的基因 - Google Patents
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Abstract
本发明通过构建平颏海蛇(Lapemis hardwicki)毒腺cDNA文库和DNA测序，分离出一个新的磷脂酶A2(简称PLA2)基因，命名为PLA2-9，由此推倒其编码146个氨基酸，其中含27个氨基酸的信号肽。该蛋白等电点为8.5，分子量约为14,280道尔顿。该蛋白在体外具有对多种肿瘤细胞的细胞毒性。本发明不仅为海蛇新基因的基因工程表达及功能研究提供了可借鉴的方法，而且为开发新的抗癌药物奠定了基础。
Description
本发明涉及一种平颏海蛇磷脂酶A2以及编码它的基因。
磷脂酶是指能水解磷酸甘油酯的酶。自然界中有5种磷脂酶，即磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶B、磷脂酶C、磷脂酶D。蛇毒中主要含磷脂酶A2(phospholipase A2，EC3.1.1.4简称PLA2)，有极少数蛇毒含磷脂酶B，其它几种磷脂酶主要在动物组织和细菌中。PLA2是蛇毒中研究得最多的一种酶，它的底物为Sn-3-磷酸甘油酯第2位上的酯键。这种酶广泛存在于蛇毒、蜂毒、蝎毒和动物组织中，四科蛇毒中均含有丰富的PLA2。目前已发现的蛇毒PLA2都是胞外分泌型的水溶性蛋白，结构相似(如分子内都含有7对二硫键)，分子量一般在14kD左右。蛇毒PLA2除了酶活性外，还具有多种生理活性，例如：神经毒、心脏毒、肌肉毒、细胞毒、溶血作用、出血作用、水肿作用、促凝或抗凝作用等。不同来源的蛇毒PLA2所具上述生理作用各不相同，每种PLA2通常只有一种或少数几种生理作用。例如β-Bungarotoxin只有突触前神经毒性，但没有肌溶和抗凝活性；来自印度NAJA NAJA NAJA的NN-XIII-PLA2则具有水肿和肌毒作用而无溶血作用。(Vishwanath et al.，Toxicon，1987，25：501-515；Ogawa et al.，J.Mol.Evol.1995，41：867-877；Rosenberg，1990，Phospholipases.InHandbook of Toxinology，pp67-277；覃公平主编，中国毒蛇学，第2版，1998，广西，广西科学技术出版社，pp603)在一种蛇毒中往往含有PLA2的多种同功酶，如酸性、中性或碱性的PLA2。PLA2的这种多样性可能在捕食时通过PLA2相互作用或与其它蛇毒蛋白质一起起到补体或者协同的作用。
鉴于蛇毒PLA2的结构多样性和功能复杂性，人们一直对为什么相似的结构产生如此不同的生理作用感到迷惑，也提出了不少模型来解释PLA2为什么会表现众多的生理作用。在经过多年研究之后，Kini等(Kini etal.，Toxicon，1989，27：613-635)提出了一种模型，很好地解释了这类问题。Kini等认为：动物体内存在着各种能与PLA2特异结合的蛋白质，每种蛋白不是均匀地分布在动物体各组织中，而是重点分布在一个或几个组织器官中，有这些蛋白的组织或细胞称为靶组织或靶细胞，每种有特异作用的PLA2都有自己的靶组织或靶位点；PLA2的催化活性中心与起生理作用的活性中心是分开的或有部分重叠，起生理作用的活性中心能够与靶位点结合，是决定特异结合的部位；注射PLA2，尽管经过许多组织，但由于靶组织的亲和力大，所以它们只与这种组织结合，与其它组织结合甚少；结合后的PLA2通过结合作用本身或水解结合位点附近的关键磷脂而起作用。该模型认为，具有相同生理作用的PLA2有相似的生理作用活性位点，例如具有突触前神经毒素的PLA2，它们的分子中都有一个相似的疏水区。但它们的结合位点不一定就是一种。这说明了为什么具有相同生理作用的PLA2没有竞争结合作用。这种模型的最大特点是蛋白质是PLA2结合的位点。
为了更好地弄清PLA2结构和功能的关系，人们对各种不同来源的蛇毒PLA2进行了大量的研究，其中，主要通过生化提取的方法对蛇毒进行分离纯化，然后对所得PLA2进行氨基酸测序，并通过进一步的功能研究来探索不同结构的PLA2与其功能的关系的规律。如Menez等(Menez et al.，1991，United Stateds Patent，5045462，pp4)根据PLA2的酸碱性和致死毒性的不同，将其划分为3类：第一类为酸性或中性的PLA2，其毒性较低，仅有对磷脂组织的降解作用；第二类为毒性极大的PLA2，这类蛋白多为单一的碱性分子或分子内含有碱性亚基，存在于多数蛇毒中，能引起捕猎物的迅速麻痹，其特点是通过在突触前神经末梢阻断乙酰胆碱的释放或肌毒作用来引起致死毒性；第3类为一些强碱的毒性PLA2，在许多蛇毒中都含有这类PLA2，但其作用机理目前还不清楚。从80年代初至今，国内外对陆地蛇毒PLA2的研究已相当深入，如已成功地对30多种PLA2及与其有同源关系的蛋白或亚基的一级结构进行了测定，还对几种PLA2晶体进行了X-射线衍射研究，确定了与酶活性中心相关的氨基酸残基(Verheij，H.M.et al.，Rev.Physiol.Biochem.Pharmacol.，1981，91，91；Keith，C.et al.，J.Biol.Chem.，1981，256，8602)；M.K.BHAT等(M.K.BHAT et al.，Toxicon，1989，27(8)：pp86 1-873)研究了来自NAJA NAJA NAJA的蛇毒PLA2的肌毒性，其半数致死量为2.8mg/kg；Fernando Chaves等(1998，Toxicon)研究了Asp-49和Lys-49的两类肌毒PLA2的毒性与酶活性的关系，指出两类PLA2虽然都有强的肌毒性，但前者具有较强的酶活性而后者则不具有酶活性，由此，他们得出酶活性的有无对肌毒效应并非起到关键作用的结论；L.M.S.Rudrammaji等(L.M.S.Rudrammaji et al.，Toxicon，1998，36(12)：1861-1869)又从NAJA NAJA NAJA的蛇毒中提纯了三中酸性PLA2，研究发现，它们虽不具有对小鼠的致死作用，但却能引起小鼠足底的水肿，同时具有对艾式腹水癌细胞的细胞毒性；Menez等(Menez et al.1992，US Patent，5130130，pp1-14)则从Naja nigricollis中分离纯化出对MCF7，SK-N-SH，C13T等肿瘤细胞有细胞毒性的碱性PLA2，在经过PLA2的化学修饰研究后发现，与天然PLA2不同，改造过的PLA2具有对肿瘤细胞作用的选择性，而对正常细胞的作用却很小。蛇毒PLA2在功能上的复杂多样性，使其不仅成为生物化学家研究蛋白质结构与功能关系的极好工具，也为人们进行癌症、心血管等疾病的临床治疗研究提供了又一新的方向。
事实上，国外(Monaeesser和Tagnet，1953)早在1953年就首先把蛇毒用于癌症的治疗。他们用眼镜蛇毒治疗癌症，有明显的止痛作用，有些病例肿瘤明显变慢，有些缩小甚至完全斑痕化；1967年Brangance从印度产眼睛蛇毒中分离出细胞毒素P6，该细胞毒素对实验性肿瘤细胞如大白鼠腹水肝癌细胞、Hela细胞和KB细胞等有良好的抑制作用，后来证明P6是几种细胞毒素的混合物，并非单一成分。Louis J.DeTolla等(LouisJ.DeTolla et al.，Toxicology，1995，99：31-46)报道了来自Crotalus durissusterrificus的响尾蛇毒蛋白(简称CT，实际上是一种具有细胞毒性PLA2)和来自Naja naja atra的心脏毒素(CD)组成的混合物，在体内和体外均具有明显的抗肿瘤活性，其中，在体内对实验动物的抑瘤率可达到83％。我国对蛇毒抑癌的研究起步较晚，但十分活跃，中科院昆明动物研究所的研究人员将眼镜蛇科的蛇毒对腹水癌细胞进行作用，经过体内体体外实验和几种率试验观察发现：眼镜王蛇毒、眼镜蛇毒、和金环蛇毒均有抗癌作用，对此有学者认为，蛇毒的膜活性多肽对细胞膜有特殊作用，这种特殊作用使抗癌药物易透过细胞膜进入细胞内，从而增加抗癌药物的疗效，他们还发现，蛇毒细胞毒素对癌细胞的杀灭作用通常与膜破裂、细胞浆外渗和细胞坏死有关(覃公平主编，中国毒蛇学，第2版，1998，广西，广西科学技术出版社，pp538-540)。
蛇毒PLA2在生物学和医学上的广泛应用及其作用机理的复杂性，促使人们不断地发现新的更多PLA2结构，一方面为进一步弄清PLA2的功能提供依据，另一方面便于人们更好地利用PLA2为人类疾病的治疗服务。然而，由于目前蛇毒活性多肽主要采取生化提取方法从蛇毒中获得，成本高、纯度低、难以弄清其确切成分，加上全球生态环境日益恶化带来的资源短缺，在一定程度上制约了蛇毒PLA2的研究，所以，利用基因工程方法生产蛇毒PLA2具有明显的发展优势。从1992年眼镜蛇(Naja najanaja)PLA2基因被人工全合成，并在大肠杆菌中克隆与表达开始(Michaelet al.，BBA，1992，1118：107-115)，有关用生物工程方法生产蛇毒PLA2和其它毒素多肽的报道不断出现(Fu-Ming Pan et al.，Biochemical andbiophysical research communications，1998，250：154-160；Long-Sen Chang etal.，Biochemical and biophysical research communications，1996，221，328-332；Long-Sen Chang et al.，Biochemical and biophysical researchcommunications，1996，225：990-996；Hua Pan et al.，Toxicon，1998，36(8)：1155-1163)。
海蛇广泛地分布于印度洋和太平洋的较温暖流域，其中大部分生存在南亚及东印度洋海岸。它们可通过平的、桨状的尾部得以辨认。海蛇中除了Emydocephalus annulatus外，均有很高的毒性，且比陆地蛇毒性高得多。但在毒素组成上，海蛇又比陆地蛇简单很多。PLA2是海蛇毒液中的主要成分之一，其含量仅次于蛇神经毒素。和陆地蛇一样，海蛇PLA2因来源不同，在神经毒、肌毒、细胞毒以及酶活性上，均表现出较大差异(Chikahisa Takasaki，1998，The Toxinology of Sea Snake Venoms，J.Toxicol.-Toxin Reviews，17(3)，361-372)。目前，国内外对海蛇毒素的研究报道远比陆地蛇少，而且大多只停留在蛋白质水平，从事海蛇毒素基因研究的报道更是微乎其微。至今为止，Genbank中发表的海蛇毒素氨基酸序列约有100余种，而海蛇毒素编码基因序列发表还不到50个，其中PLA2基因只有2个。
由于海蛇毒的毒性强烈，排毒量甚微，难以采集到足够的毒液量，因此，给分离提纯海蛇毒的组分、研究毒素和酶分子的特性和结构、以及在科学研究和实际应用等各方面带来一定的困难。蛇毒被誉为自然界中最集中的酶源之一，其中含有丰富的酶、毒性蛋白和活性多肽。PLA2作为蛇毒的主要成分之一，在理论研究及实际应用中均具有重要的价值。由于PLA2具有结构多样性和，功能复杂性，因而弄清不同来源的PLA2的结构和功能具有重要的意义。传统的研究方法多采用生化提取、分离纯化以从天然蛇毒中得到PLA2组分。但由于同一种蛇毒中往往含有多种PLA2异构体或同功酶，且它们的性质相似，因而分离PLA2的单体较困难，而本专利用基因工程的方法，从PLA2的基因出发，通过表达、纯化获得纯度较高的PLA2，并对其生物活性进行研究，可直接将PLA2的分子结构与其功能对应起来。
由于PLA2能水解磷酸甘油酯，同时其生理作用是通过与特异的受体结合来完成。因而，本专利的获得的重组PLA2可作为研究膜脂结构和功能的工具酶。重组PLA2在临床上具有成为抗肿瘤准药物的应用前景。国外早已报道(见专利正文)某些蛇毒PLA2具有对肿瘤细胞的细胞毒性，而本专利已在实验室证明了此点。同时在动物的抑制率实验中，Louis J.Detolla(文献见正文第三页)证明了含有PLA2的细胞毒素混合物能起到很强的抑瘤作用，以1.8mg/kg的注射剂量开始，20天后达到6.3mg/kg的剂量，此时，含有PLA2的混合物对移植瘤小鼠的抑制率可达83％，本专利在动物体内的进一步抑瘤实验将，为今后的药物开发提供良好的基础。
本发明的目的就是通过构建平颏海蛇毒素cDNA文库，从中筛选得到编码海蛇PLA2的新基因；并利用基因工程的方法，在高效大肠杆菌表达系统中表达并纯化出具有生物活性的重组海蛇PLA2蛋白。
本发明所选择的海蛇是属于海蛇科平颏海蛇属的平颏海蛇(Hydrophiinae，Lapemis hardwickii Gray)，采自广西省北海市。平颏海蛇毒素cDNA文库的构建：首先解剖得到海蛇的毒囊组织，提取总RNA，然后分离出mRNA进行逆转录，获得cDNA，最后将cDNA连接到质粒载体pcDNA3.0上并转化E.coli.从而构建成平颏海蛇毒素cDNA文库。
本发明通过对平颏海蛇毒素cDNA文库克隆的大规模序列测定，从中得到了一个编码平颏海蛇PLA2的cDNA克隆，命名为PLA2-9。此cDNA编码146个氨基酸，等电点约为8.5，分子量约为14,280道尔顿，包括27个氨基酸的信号肽和119个氨基酸的成熟肽，具有典型的蛇毒PLA2的一级结构的特征，分子内含有14个半胱氨酸，形成7对二硫键。PLA2-9的核苷酸及氨基酸序列如图4所示。
本发明通过设计了一对引物，将编码平颏海蛇PLA2-9成熟肽的基因用PCR方法从pcDNA3.0上扩增出来，克隆到原核融合表达载体pETTRX上，构建成表达质粒pETTRX PLA2-9并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)。此表达载体(pETTRX)以T7为启动子，采用分子伴侣TRX为融合伴体，帮助重组蛋白正确折叠，以可溶的形式表达，TRX的C端有柔链区和6×HIS结构，便于利用固定化金属配体亲和层析进行纯化。所设计的上游引物含有肠激酶位点，以便外源蛋白单体的获得，且保证切割后的成熟蛋白的氨基酸数目与通过基因推算的完全一致。通过对培养时间，诱导时间，温度等条件的摸索和优化，PLA2-9融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的20％以上，并且基本上处于可溶状态。
本发明还摸索和优化了PLA2-9融合蛋白的纯化条件，采用超声裂解液经Ni2+ Chelating Sepharose亲和色谱层析和Sephacryl S-100HR凝胶色谱层析两步纯化，重组PLA2-9融合蛋白纯度可高达95％。经肠激酶切割和进一步柱层析，可得到纯度在95％以上的成熟重组PLA2-9。
本发明获得的重组平颏海蛇PLA2-9是有生物活性的。参照Magee等(Magee W.L.et al.，Biochem.J.，1960，77，pp526)报道的方法，即体外检测酶水解卵黄卵磷脂释放游离脂肪酸的活力，对重组PLA2-9的酶活性进行测定，其酶活力可达到2.7×10-3mmolL-1min-1mg-1。
本发明获得的重组平颏海蛇PLA2-9具有对肿瘤细胞的细胞毒性。对重组PLA2-9进行体外抗肿瘤的活性实验，通过MTT等方法检测PLA2-9对HL60，SK-N-SH，MGC等肿瘤细胞的细胞毒性，发现作用后的肿瘤细胞出现细胞膜破裂、细胞浆外渗和细胞坏死等明显征兆，计算其对几种细胞的IC50，大约在0.045-0.069mg/ml的范围。有关重组蛇毒PLA2具有对肿瘤细胞的细胞毒性，目前国内外还未见报道，本发明首次利用基因工程的方法，并采用融合表达系统生产出具有抗肿瘤活性的重组海蛇PLA2，具有极高的应用前景及产业开发价值。
由该表达质粒载体经酶切，可得到430bp的片段，即为平颏海蛇短链神经毒素成熟肽编码序列(其中包含肠激酶识别位点)；另外，表达质粒及PLA2-9序列中均含有一PstI酶切位点，故用PstI酶切可得到约1.5kb的片段。(酶切结果见图8)
本发明的表达质粒载体的复制方法：参照Sambrook(Sambrook，etal.1989，Molecular cloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，按CaCl2法在E.Coli.DH5α或BL21(DE3)菌株中转化质粒，用含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基转化细菌，减法提取质粒。
附图简要说明
图1海蛇毒腺总RNA和mRNA电泳结果
图2海蛇毒腺cDNA电泳结果
图3海蛇毒素cDNA文库总质粒ECORI/NotI双酶切和PCR检测电泳结果
图4PLA2-9的核苷酸序列及由核苷酸序列推测的氨基酸序列
图5含基因PLA2-9的重组质粒pPETTrx-PLA2-9的构建图
图6可融性融合表达载体PETTrx的物理图谱
图7平颏海蛇PLA2-9基因的PCR产物电泳检测。泳道1：分子量标准，泳道2：PLA2-9PCR产物，泳道3：100bp标准。
图8 pETTrx-PLA2-9重组质粒酶切鉴定电泳分析。A)泳道1：100bp标准，泳道2：pETTrx-PLA2-9KpnI/NotI双酶切，泳道3：pETTrx KpnI/NotI双酶切，泳道4：1Kb标准；B)泳道1：100bp标准，泳道2：pETTrx-PLA2-9PstI单酶切，泳道3：pETTrx-PLA2-9KpnI/NotI双酶切，泳道4：1kb标准。
图9平颏海蛇重组PLA2-9在不同诱导时间里的表达量。1，marker；2，对照；3，在2小时时pETTrx的表达；4-7，在1小时，1.5小时，2小时，2.5小时时pETTrx PLA2-9的表达。
图10平颏海蛇重组PLA2-9的SDS-PAGE分析。1，Marker，2，对照，3，总细菌蛋白；4，总可溶性细菌蛋白；5，部分纯化的融合PLA2-9；6，纯化的融合PLA2-9；7，在用Enterokinase切割融合的PLA2-9后纯化的PLA2-9。
图11重组PLA2-9的Ni2+Chelating Sepharose亲和色谱层析图谱。A，用50mM PBS，500mM NaCl(pH7.8)洗脱；B，用50mM PBS，500mMNaCl(pH6.0)洗脱；C，用150mM咪唑，50mM PBS，500mM NaCl，(pH6.0)洗脱；D，重组PLA2-9，用500mM咪唑，50mM PBS，500mM NaCl，(pH6.0)洗脱。
图12重组PLA2-9的Sephacryl S-100HR凝胶过滤层析图谱。洗脱液：20mM PBS，0.1M NaCl，pH7.5；流速：0.4ml/min；B：充足PLA2-9。
图13重组PLA2-9对HL60细胞的细胞毒作用图。A：40小时后没有PLA2-9的HL60细胞对照；B：40小时后PLA2-9(1.1ug/孔)PLA2-9的效果；C：40小时后PLA2-9(2.2ug/孔)PLA2-9的效果。
图14重组PLA2-9对SK-N-SH细胞的细胞毒作用图。16小时后没有PLA2-9的SK-N-SH细胞对照；B：16小时后PLA2-9(2.8ug/孔)PLA2-9的效果；C：40小时后没有PLA2-9的SK-N-SH细胞对照；D：40小时后PLA2-9(2.8ug/孔)PLA2-9的效果；
图15重组PLA2-9对MGC细胞的细胞毒作用图。A：40小时后没有PLA2-9的MGC细胞对照；B：40小时后PLA2-9(1.7ug/孔)PLA2-9的效果；D：40小时后PLA2-9(3.4ug/孔)PLA2-9的效果。
实施例一 平颏海蛇毒素cDNA文库的构建
平颏海蛇毒囊总RNA的提取参考《现代分子生物学实验技术》的一步快速热酚抽提法进行；mRNA的提取按Amersham Pharmacia公司的mRNA Purification Kit说明书操作；cDNA的合成按Amersham Pharmacia公司的TimeSaverTM cDNA Synthesis Kit说明书操作。
采用异硫氰酸胍一步法提取的毒腺总RNA经1％甲醛变性胶电泳检测可见清晰的28S、18S和5.8S三条rRNA条带，和数条特异RNA条带(见图1)，表明总RNA完整性良好，而且表现出平颏海蛇毒腺的高分化特点。采用mRNA Purification Kit提取mRNA，电泳结果呈现均匀的smear(见图1)，表明mRNA的完整性良好。取约5μgmRNA进行逆转录，合成双链cDNA，电泳结果显示cDNA呈现smear状，大小在200bp到8kb的范围内，主要是在2kb以下的区域，在500bp附近更为集中(见图2)，表明所合成的cDNA编码的蛋白分子量大部分较小，这与海蛇蛇毒中富含小分子多肽的事实相吻合。将cDNA插入质粒载体pcDNA3上构建成cDNA表达文库，文库克隆数为9.96×105。提取总文库质粒进行酶切和PCR分析，结果表明cDNA插入片段大小落在500bp-8k的范围内，而在在500bp和1kb处出现较亮的泳带(见图3)，在其它区域还存在数条弱带，挑取172个克隆提取质粒，酶切鉴定表明超过95％的克隆为重组子，表明该cDNA表达文库具有较好的质量。
实施例二 平颏海蛇磷脂酶A2基因(PLA2-9)的序列的测定和分析
随机挑选500个cDNA克隆PEG纯化法(Sambrook，et al.1989，Molecular cloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)提取质粒DNA。以T7和SP6为测序引物，采用ABI377 DNA Sequencer DNA自动序列仪(由大连宝生物工程有限公司提供)，正反向进行序列测定。结果表明平颏海蛇毒腺cDNA表达文库中毒素基因的丰度很高。其中，有三个编码磷脂酶A2基因，分别命名为PLA2-8，PLA2-9，PLA2-73，其中PLA2-9编码146个氨基酸的蛋白，信号肽有27个氨基酸残基，成熟肽有119个氨基酸残基，具有典型的蛇毒磷脂酶A2的一级结构特征，蛋白中含有14个半胱氨酸，形成7对二硫键，等电点为8.5。
将PLA2-9核苷酸序列和推测的氨基酸序列通过因特网进行BLAST序列相似性查询，程序分别为BLASTN、BLASTP，结果表明PLA2-9为一全新的基因，由其推算出的编码PLA2的成熟肽氨基酸序列在GENEBANK中找不到相同的序列，为一崭新的氨基酸序列。
PLA2-9的核苷酸序列及由核苷酸序列推测的氨基酸序列见图-4，该基因的序列分别由三个以上不同的cDNA克隆通过序列测定而得出，排除了可能由cDNA合成和序列测定带来的误差。
实施例三 重组平颏海蛇磷脂酶A2表达质粒的构建根据基因PLA2-9编码的成熟肽两端序列，合成一对引物，序列如下：上游引物，5’CGG
GGT ACC
GAT GAC GAT GAC AAG AAC CTC GTA CAA TTC AGC TA 3’
KpnI 肠激酶位点下游引物，5’TT
G CGG CCG CGG AAT TCT ATC ATT TGC AAC GTT TGT TGG 3’
NotIPCR扩增、基因克隆皆按常规方法进行。
克隆到本实验室构建的原核融合表达载体pETTRX上，构建成表达质粒pETTrx PLA2-9(见图5、6)。PCR产物约510bp，编码119个氨基酸残基，外加酶切位点、肠激酶位点等(电泳结果见图7)。克隆后的目的基因经酶切、测序鉴定正确(酶切结果见图8)。
实施例四 重组平颏海蛇磷脂酶A2融合蛋白的表达
将pETTRX PLA2-9转化大肠杆菌BL21(DE3)。基因工程菌超声裂解上清液经SDS-PAGE电泳分析表明，菌体经诱导后有明显的特异表达产物带，分子量与用软件PROTEIN ANALYSIS预测的理论值31kD相符。
经过对培养时间，诱导浓度，温度等条件的摸索(见图9：菌体扩大培养不同时间后诱导表达比较)，基因工程菌的培养条件为：接单菌落于50ml氨卞抗性LB培养基中，37℃，250rpm培养过夜，取过夜培养物20ml接种于2L的氨卞抗性LB培养基中，37℃，250rpm培养至OD600＝0.6(扩大培养约2h)，加入100mM IPTG和20％葡萄糖至终浓度分别为1mM和0.2％，26℃，250rpm诱导培养10h后离心收获菌体。经SDS-PAGE电泳分析分析表明，在此条件下PLA2-9融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的20％以上，基本上处于可溶状态(见10)。
实施例五 重组平颏海蛇磷脂酶A2融合蛋白的纯化及成熟PLA2的获得
将收获的总菌体用TE(pH8.0)洗涤，再用PBS(pH7.8)悬浮，超声处理后，裂解上清也经Ni2+Chelating Sepharose亲和色谱层析和Sephacryl S-100HR凝胶色谱层析两步纯化，经SDS-PAGE分析和薄层扫描分析表明重组PLA2纯度分别达到85％和95％(Fig.9，10)。以2L基因工程菌培养物为材料，最终获得约80mg纯化的融合蛋白。
为了提高重组蛋白的得率和浓度，简化实验步骤，缩短对重组蛋白的处理时间，在用Ni2+亲和色谱层析纯化重组蛋白时，我们采用两步法进行纯化。根据载体质粒pETTRX所表达的外源蛋白与Ni2+亲和柱的结合能力较强的特点，我们选用了较简化的洗脱条件：50mMPBS，500mMNaCl，pH7.8(A液)；50mMPBS，500mMNaCl，pH6.0(B液)；150mM咪唑，50mMPBS，500mMNaCl，pH6.0(C液)；500mM咪唑，50mMPBS，500mMNaCl，pH6.0(D液)。重组PLA2-9蛋白在D液被洗脱下来(Fig.11)。将经Ni2+亲和柱初步纯化的重组蛋白直接上样SephacrylS-100HR凝胶色谱层析，用20mMPBS，0.1 MNaCl，pH7.5洗脱，根据洗脱峰(Fig.12)分段收集洗脱液，从SDS-PAGE结果来判断分离效果最好的部分。
利用Folin-酚法测定重组PLA2的蛋白浓度，收获浓度在0.7mg/ml以上的洗脱液，用20mMPBS，0.1MNaCl，pH7.5将蛋白浓度调至约0.7mg/ml，并加入肠激酶(Invitrogen公司产品)及酶切Buffer进行酶切反应，反应体积参见Invitrogen公司EK产品说明书，反应条件为25-30℃，20小时。反应完毕后，用SDS-PAGE检测酶切结果，可明显看到14kD附近代表成熟PLA2的谱带(见Fig8)。将反应液用Ni2+Chelating Sepharose亲和色谱层析柱纯化(条件同前)，收获含成熟PLA2的穿流液，并用Sephadex G-50进一步纯化(洗脱液为PBS)，便得纯度在95％以上的成熟重组海蛇PLA2-9(见Fig.10)。
实施例六 重组平颏海蛇磷脂酶A2的酶活性测定
采用测定卵黄悬液浑浊度下降的方法来确定PLA2的酶活性。先将PLA2溶液对0.15mol/LNaCl透析(4℃)过夜，得PLA2-9的NaCl溶液。用0.15mol/LNaCl配制0.5-0.8ml的卵黄悬液，用巴比妥钠调pH至6.8，加0.15mol/LNaCl使体积为2.8ml。在30℃下平衡，加0.2ml酶液，对照组加0.2ml的生理盐水代替酶液。在925nm处测定因酶处理样品吸收值的减少。对照样品的吸收值定在A925nm＝0.600，每分钟吸收值降低1mU的酶活力定为1个酶活单位。由此测得PLA2-9的酶活力为2.7×10-3mmolL-1min-1mg-1。
实施例七 重组平颏海蛇磷脂酶A2对肿瘤细胞的细胞毒性鉴定
参照鄂征(鄂征等，组织培养和分子细胞生物学技术，1995年，北京出版社)的方法培养HL60，SK-N-SH和MGC三种哺乳动物肿瘤细胞(培养基为RPMI1640，37℃，5％CO2，饱和湿度)。取对数生长期的细胞，1000r/min离心5-6min(贴壁细胞先用0.125％胰酶，0.01％EDTA消化)，沉降细胞用PBS洗1次，再悬于RPMI1640培养基中，计数后，调整细胞浓度为105个/ml，以每孔100ul的量加入96孔板，待其培养至对数生长期加入PLA2-9样(样品溶于PBS缓冲液中)，以PBS作空白对照。48小时内显微镜观察细胞形态变化，48小时后做MTT反应(程宝鸾等，动物细胞培养技术，2000，华南理工大学出版社，p131)，并用酶标仪检测细胞在570nm下的光吸收值，计算每种细胞的IC50。实验观察表明，加样后7、10、12小时，HL60，SK-N-SH和MGC分别开始出现不同程度的细胞皱缩变型，细胞质凝集等症状，且随培养时间延长症状愈加明显。进一步观察表明，作用后的肿瘤表现出细胞数量减少，细胞膜破裂、细胞浆外渗和细胞坏死等症状(见图13-15)。HL60，SK-N-SH和MGC三种细胞的IC50分别为0.045 mg/ml，0.057 mg/ml，0.069mg/ml(见表1)。
国外曾有过报道，来自Naja nigricollis的PLA2具有对MCF-7和HL60等肿瘤细胞的细胞毒性(Menez et al.1992，US Patent，5130130，pp1-14)，但都是陆地蛇，而PLA2样品也是通过分离纯化得到。本发明首次通过基因工程的方法生产出具有对肿瘤细胞细胞毒性的重组平颏海蛇PLA2-9，不仅消除了大量采集带来的资源浪费，而且更具有技术上的先进性。与生化提取的陆地蛇PLA2相比，PLA2-9具有作用明显，缓释性强的特点。本发明不仅为海蛇新基因的功能研究提供了一套可借鉴的技术方法，而且为进一步开发新型重组海蛇磷脂酶A2抗肿瘤药物奠定了良好的基础。
表1.不同浓度的PLA2-9作用HL60，SK-N-SH和
MGC细胞48小时后MTT反应结果
| samples&IC50cell line | PLA2-9 PLA2-9 PLA2-9 PLA2-9 PLA2-9IC50control 0.005 0.010 0.020 0.040 0.080(mg/ml)mg/ml mg/ml mg/ml mg/ml mg/ml |
| HL60(OD570nm)SK-N-SH(OD570nm)MGC(OD570nm) | 0.569 0.526 0.492 0.453 0.318 0.068 0.0450.668 0.652 0.579 0.561 0.434 0.198 0.0571.178 1.150 1.088 1.073 0.822 0.519 0.069 |
Claims (4)
1.一种分离的磷脂酶A2，它具有以下的氨基酸序列：N L V Q F S Y V I T C A N H G R R S SL D Y A D Y G C Y C G A G G S G T P VD E L D R C C Q I H D D C Y G E A E KQ G C Y P K M L I Y D Y Y C G S D G PY C R N V K K K C N R M V C D C D V AA A K C F A R N A Y N N A N Y N I D TN K R C K。
2.一种编码权利要求1所述的磷脂酶A2的基因。
3.按照权利要求2所述的基因，它具有如下的核苷酸序列：
AACCTCGTACAATTCAGCTACGTGATTACATGTGCCAACCATGGCCGTCGAAGTTCACTTGATTATGCGGACTACGGTTGCTACTGCGGCGCAGGAGGTAGCGGGACACCGGTAGATGAGTTGGATAGGTGCTGCCAAATACATGACGACTGCTATGGTGAAGCCGAAAAACAAGGATGCTACCCCAAGATGTTGATATATGATTACTACTGTGGCAGCGATGGACCCTACTGCAGAAATGTCAAAAAGAAGTGTAATCGTATGGTGTGTGATTGTGATGTCGCAGCAGCCAAGTGCTTTGCCAGAAATGCTTACAACAACGCGAACTACAATATCGACACCAACAAACGTTGCAAA。
4.权利要求1所述的磷脂酶A2在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
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