CN102633874A - 重组缺失型人角质细胞生长因子i型的化学偶联物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了重组缺失型人角质细胞生长因子I型的聚乙二醇化学修饰而成的偶联物。其特征是以分子量为5K-40K经活化的聚乙二醇分子与N末端缺失23位氨基酸的重组缺失型人角质细胞生长因子I型(Δ23KGF-I)的第79位半胱氨酸的游离巯基共价化学偶联，再经柱层析分离纯化制备而获得聚乙二醇化重组缺失型人角质细胞生长因子I型。该偶联物在保留人角质细胞生长因子的生物学作用下，改变了其体内的代谢动力学特性，对放化疗引起的消化道粘膜损伤或溃疡性黏膜炎，急性化学性肝损伤有预防和治疗价值。

Description

重组缺失型人角质细胞生长因子I型的化学偶联物

技术领域

本发明属于基生物工程领域，具体涉及缺失型人角质细胞生长因子I型的重组制备，缺失型人角质细胞生长因子I型的聚乙二醇化学修饰，以及修饰前后的纯化及其应用。

背景技术

角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor，KGF)属于纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)家族，目前，发现了两种角质细胞生长因子(keratinocytegrowth factor，KGF)，即角质细胞生长因子I型(KGF-I)和角质细胞生长因子II型(KGF-II)，分别命名为FGF-7和FGF-10(Aaronoson SA.et al.J.Annals of the New YorkAcademy of science，1991，638：62-77.)。Rubin等人(Rubin，J.S.，et al.Proc Natl Acad SciU S A，1989.86(3)：p.802-6.)从人胎肺成纤维细胞的培养上清中分离并纯化得到KGF-I，并发现其具有促进小鼠角质细胞有丝分裂的作用，故将其定名为角质细胞生长因子。KGF-II是Emoto等(Emoto H Tagashira S Mattei MG，Journal of biology chemistry，1997(37))于1997年从肺中分离出编码人KGF-II的cDNA。

人角质细胞生长因子I型(human keratinocyte growth factor，hKGF-I)位于15号染色体，其cDNA编码194个氨基酸残基，包括一段21个氨基酸的分泌信号肽。成熟的hKGF-I为一含163个氨基酸残基的单链多肽。临床前研究和临床研究显示，人角质细胞生长因子I型是一种多功能的生长因子，通过促进细胞的增殖、迁移、分化、存活、DNA修复以及诱导对活性氧具有解毒功能的酶的表达来加强上皮功能，从而保护上皮免于毒性物质的损伤(Finch，P.W.，et al.，Science，1989.245(4919)：p.752-5.；Rubin，J.S.，et al.V；Farrell，C.L.，et al.，Int J Radiat Biol，1999.75(5)：p.609-20.；Farrell，C.L.，et al.，Cancer Res，1998.58(5)：p.933-9.；Ellison CA，et al.，J Clin Immunol，2008，28(5)：600-615.)。

天然野生型人角质细胞生长因子是一个含163个氨基酸残基的单链多肽，含位于1，15，40，102，106的五个半胱氨酸，其中Cys1-Cys15、Cys102-Cys106形成两对二硫键，Cys40以游离巯基形式存在(Timothy D.Osslund et al.，prorein Science(1998)，7：1681-1690)。文献报道(Osslund TD.，et al.，Protein Sci.1998 Aug；7(8)：1681-90.；Hsu E et al.，Protein Eng Des Sel.2006Apr；19(4)：147-53.Epub 2006 Feb 14.)缺失N端23个氨基酸(Δ23hKGF)和或突变其第40，102，106位半胱氨酸对其生物活性无影响，即二硫键的形成与否与其生物活性无关。

由Amgen公司开发的重组人角质形成细胞生长因子Palifermin(商品名Kepivance)是缺失人角质形成细胞生长因子I型的N末端23个氨基酸(Δ23hKGF)(Eric Hsu et al.，ProteinEngineering，Design&Selection vol.19 no.4pp.147-153，2006)，于2004年被美国FDA批准用于治疗血液肿瘤患者高剂量化疗或者联合放疗导致的严重口腔粘膜损伤。Δ23hKGF在体内的半衰期仅为2-3hr，临床给药剂量大(60μg/kg/日)，需连续给药6天(1次/天)。

在治疗用蛋白质药物的研究中，解决蛋白类药物在机体内半衰期短的方法众多。其中最有效的方法之一是将蛋白质与水溶性聚合物共价结合成偶联物。而所使用的水溶性聚合物包括聚乙二醇、聚乳糖、聚合氨基酸等，其中聚乙二醇的使用最为普遍。

聚乙二醇-蛋白质偶联物具有良好的热稳定性、抗酶解、增加水溶性、延长体内半衰期、降低免疫原性和毒性等多重优点(Inada，et al.，J.Bioact.And CompatiblePolymers，5：343(1990)；Delgalo，et al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carriersystems，9：249(1992)；katre，Advanced Drug Delivery Systems，10：91(1993))。1991年第一种用聚乙二醇(PEG)修饰的药物PEG-ADA上市，近几年上市的产品有PEG-干扰素、PEG-粒细胞集落刺激因子、PEG-天冬酰胺酶、PEG-生长抑素以及PEG-利巴韦林等。此外，尚有数十种PEG修饰的蛋白药物处于研究或临床实验阶段。

对于聚乙二醇分子来说，可通过多种方法将其加到蛋白质上。总的来说，聚乙二醇分子是通过其分子上的反应基团而偶联到蛋白质分子上的。PEG的偶联的主要基团是氨基、巯基和羧基(Veroneee FM，Biomaterials，2001，22：405)，绝大部分修饰剂主要与Lys的ε-氨基和N-末端的氨基进行共价偶联的。但特异性不高，从而造成产物的不均一性。而与巯基偶联，特异性好，修饰率高，均一性好等特点。

检索国内外专利和文献发现，采用聚乙二醇修饰人角质细胞生长因子的公开文献仅有Zhifeng Huang等人(Zhifeng Huang.et al.，Journal of Biotechnology 142(2009)242-249.)针对人角质细胞生长因子N末端的聚乙二醇修饰。本专利发明了采用单甲氧基聚乙二醇特异性修饰重组缺失型人角质细胞生长因子I型(Δ23hKGF)的第79位半胱氨酸的游离巯基，该修饰方法修饰而成的重组缺失型人角质细胞生长因子I型偶联物，具有修饰位点专一、结构均一、易于实施等优势；更为重要的是在保留人角质细胞生长因子I型的生物活性下，能有效改善其体内代谢动力学特性，实现延长半衰期，减少给药频率，更适合作为一种预防或治疗性药物。

发明内容

本发明的目的是采用聚乙二醇与重组缺失型人角质细胞生长因子I型的半胱氨酸的游离巯基共价连接而形成的偶联物，该偶联物能有效改善人角质形成细胞生长因子在体内的药代动力学；同时该偶联物，可作为一种预防或治疗药物，或药物组合物，在有效治疗剂量用于治疗对放化疗引起的消化道粘膜损伤或溃疡性黏膜炎、急性化学性肝损伤。

本发明所述的聚乙二醇与重组缺失型人角质细胞生长因子I型的半胱氨酸的游离巯基共价连接中的半胱氨酸的游离巯基，指的是天然野生型人角质细胞生长因子I型(hKGF)N末端缺失23个氨基酸的人角质细胞生长因子突变体(Δ23hKGF)的第79位半胱氨酸(Cys)，相当于天然野生型人角质细胞生长因子I型的第102位半胱氨酸。

为了实现本发明的目的，本发明首先界定了缺失型人角质细胞生长因子I型的氨基酸序列或组成。所述的缺失型人角质细胞生长因子I型是指在天然野生型人角质细胞生长因子I型的氨基末端缺失23个氨基酸的突变体，序列特征为(序列为SEQ ID No：1)：

Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe

Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys

Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr

Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr

Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn

Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr

Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala

Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu

Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr

同时包含在SEQ ID No：1序列的基础上氨基末端增加或减少1-5个氨基酸的变异体。如从SEQ ID No：1序列的N末端增加一个甲硫氨酸(Met)，或增加5个氨基酸序列为Glu-Arg-His-Thr-Arg或Met-Arg-His-Thr-Arg；或从SEQ ID No：1序列的N末端减少一个丝氨酸(Ser)，或减少5个氨基酸序列为Ser-Tyr-Asp-Tyr-Met，或减少4个氨基酸序列为Ser-Tyr-Asp-Tyr。

同时也包含在SEQ ID No：1序列的基础上分别或同时将第17位和第83位半胱氨酸突变成其他氨基酸的变异体。如将SEQ ID No：1序列的第17位和第83位半胱氨酸突变成Ser、Gly或Ala等其他氨基酸。

所述的重组缺失型人角质细胞生长因子I型，是指通过基因工程重组技术，经大肠杆菌重组表达，表达后经层析分离技术获得纯度大于95％的重组缺失型人角质细胞生长因子I型(Δ23hKGF)。

为了实现本发明的目的，本发明提供了Δ23hKGF的聚乙二醇修饰制备。所述的聚乙二醇为单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺(Monomethoxy Polyethylene glycolMaleimide，mPEG-MAL)活化分子，或为单甲氧基聚乙二醇邻二硫吡啶(MonomethoxyPolyethylene glycol Ortho-pyridyldisulfide，mPEG-OPSS)活化分子，或为单甲氧基聚乙二醇乙烯基砜(Monomethoxy Polyethylene glycol Vinylsufone，mPEG-VS)活化分子，或单甲氧基聚乙二醇巯基(Monomethoxy Polyethylene glycol sulfhydryl，mPEG-SH)活化分子，或为单甲氧基聚乙二醇碘代乙酰胺(Monomethoxy Polyethylene glycol Iodo acetamide，mPEG-IA)活化分子，优选单甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺活化分子。聚乙二醇分子可为直链型或分枝型，分子量介于5,000-40,000道尔顿，其中优选20,000道尔顿的直链型聚乙二醇分子和40,000道尔顿的分枝型聚乙二醇分子。

通过基因工程重组表达制备的重组缺失型人角质细胞生长因子I型(Δ23hKGF)，其第79位半胱氨酸非游离(其与第83位半胱氨酸形成一对二硫键)，首先需要将该对二硫键还原，让Δ23hKGF的第79位半胱氨酸游离，充分暴露其巯基。二硫键的还原常用二硫苏糖醇(DTT，Dithiothreitol)、β-巯基乙醇、三[2-羧乙基]膦(Tris[2-carboxyethyl]phosphine(TCEP))以及半胱氨酸等试剂。本发明中优选用DTT将重组制备的重组缺失型人角质细胞生长因子I型(Δ23hKGF)中的二硫键还原，再经分子筛去除残余DTT，最终获得二硫键还原形式的Δ23hKGF(r-Δ23hKGF)。如果Δ23hKGF中的第83位半胱氨酸突变成其他氨基酸，则不需要此步骤。

所述的Δ23hKGF的聚乙二醇修饰，其是指重组制备的r-Δ23hKGF(第79位半胱氨酸游离)蛋白浓度为1-10mg/ml，在10-100mm的磷酸盐缓冲液，pH值5.0-8.0下，重组蛋白与聚乙二醇质量比在1∶0.5-6的条件与mPEG-MAL，或mPEG-OPSS，或mPEG-SH，或mPEG-IA，经4-37℃，100r/min搅拌反应0.5-24hr后，调低pH终止反应。再采用层析分离技术除去未被修饰的r-Δ23hKGF和游离PEG分子，获得纯度大于95％的聚乙二醇化重组r-Δ23hKGF的偶联物(PEG-Δ23KGF)。其中优选的修饰条件为：r-Δ23hKGF原液用100mmol/L磷酸盐缓冲液，pH6.5稀释样品至2mg/mL，按r-Δ23hKGF与mPEG-MAL-20KD质量比为1∶3称取mPEG-MAL-20KD加入r-Δ23hKGF溶液中，25℃，100r/min搅拌反应2hr后，用盐酸调低pH至3.0终止反应。再经SP-sepharose fast flow纯化获得纯度大于95％的聚乙二醇化重组缺失型人角质细胞生长因子I型(PEG-Δ23KGF)。该制备方法经实例证明，修饰率高、修饰特异性好、修饰后产物均一、且利于实施。

本专利发明技术制备的聚乙二醇化重组缺失型人角质细胞生长因子I型(PEG-Δ23KGF)，在试验动物中，经1次体内皮下注射，可有效保护由CCl₄引起的急性肝损伤，保护5氟尿嘧啶引起的急性小肠粘膜损伤。

因此，本发明所述的重组缺失型人角质细胞生长因子I型的化学偶联物，可作为一种预防或治疗药物，或药物组合物，在有效治疗剂量下用于预防和治疗对放化疗引起的消化道粘膜损伤或溃疡性黏膜炎以及急性化学性肝损伤。

至此已对本发明进行了详细的描述，通过参考下列实例，能够对本发明有更清楚地理解，但所述实例仅为说明目的而并不旨在对本发明进行限制。

附图说明

图1重组Δ23hKGF表达和纯化后的SDS-PAGE图谱，A图中1为大肠杆菌诱导前，2为诱导后，M为蛋白质标准；B图中1为破菌上清，2为SP柱纯化后，3为肝素纯化后，4为分子筛分离的r-Δ23hKGF，M为蛋白质标准。

图2r-Δ23hKGF的mPEG-MAL-20k修饰前后和修饰后经纯化的SDS-PAGE图谱，图中1为修饰前，2为修饰后，3为修饰后纯化的PEG-20K-Δ23KGF，M为蛋白质标准。

图3r-Δ23hKGF和PEG-20K-Δ23KGF的RP-HPLC分析图谱，其中A图为r-Δ23hKGF的RP-HPLC分析图谱，B图为PEG-20K-Δ23KGF的RP-HPLC分析图谱。两者的保留时间相差0.8min左右。

图4为r-Δ23hKGF和PEG-20K-Δ23KGF的肽图。其中A图为r-Δ23hKGF的肽图，检测波长为214nm，B图为PEG-20K-Δ23KGF的肽图，检测波长为214nm。两者相比较，A图中18.805min肽段峰在B图中消失。

图5为PEG-20K-Δ23KGF肽图的ELSD检测色谱图。

具体实施方式

实例1、缺失N末端23个氨基酸的人角质细胞生长因子I型(Δ23hKGF)的重组表达

根据Δ23hKGF氨基酸序列(SEQ ID No：1)，设计大肠杆菌偏爱密码子的对应cDNA序列并包含5’端和3’分别设计限制性内切酶Nde I和BamH I位点(SEQ ID No：2)。委托宝生物工程(大连)有限公司全基因人工合成，并嵌入pUC18载体且命名为pUC18-Δ23hKGF/DH5α。

质粒pUC18-Δ23hKGF DH5α和表达载体质粒pET-3c用限制性内切酶Nde I和BamH I双酶切，经1％琼脂糖电泳，分别回收pET-3c酶切后约4638bp的片段和回收pUC18-Δ23hKGF/DH5α酶切后约450bp的片段，将两个片段用T4连接酶进行连接成质粒pET-3c-Δ23hKGF，再将质粒pET-3c-Δ23hKGF转化BL21(DE3)plysS宿主菌中，筛选正确高表达的工程菌命名pET-3c-Δ23hKGF/BL21(DE3)plysS。用于表达的载体和宿主菌菌购于Novagen公司，Nde I和BamH I酶购于宝生物工程(大连)有限公司。

将上述表达最佳工程菌株划线接种于LA琼脂平板(胰蛋白胨2g，酵母提取物1g，NaCl2g，琼脂3g，加水定溶至200mL，121℃，高压灭菌30min，当温度降到50℃左右时加入Amp至终浓度为100ug/mL，取适量倒培养皿，凝固后即成LA琼脂平板)，37℃培养过夜。从过夜培养的LA平板上挑取菌苔接种于含LB液体培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，加水定溶至1000mL，121℃，高压灭菌30min即可)试管中，37℃培养12小时，然后按1％的比例转接到含200mL LB培养液的1000mL三角瓶中，37℃培养过夜即成为上罐种子液。将上罐种子液按5％的比例接种于含20L M9培养液的30L发酵罐中，37℃培养，整个发酵过程中，通过调节转速、空气量、纯氧量来保持溶氧在30％以上，用28％的氨水调节pH并保持在7.0。至菌液OD600＝10～14时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG，28℃继续培养6小时后停止发酵(图1A)，收集菌液，8000rpm离心10分钟，弃上清，收集菌体放入-20℃冰箱保存备用。

实例2、Δ23hKGF和r-Δ23hKGF的纯化制备

从-20℃冰箱中取出菌体，按1∶15w/v放入细菌裂解液(50mmol/L Tris-HCl，5mmol/LEDTA，10μg/mlDNase，2mmol/L MgCl₂，pH 8.5-9.0)中，37℃下搅拌待破菌液不粘稠时加入终浓度0.1M的柠檬酸三钠，继续搅拌0.5h。调节pH为7.5，10000rpm离心，15min，收集上清。上清液上SP-Sepharose Fast Flow柱(平衡液：50mmpb，pH7.5)，复平衡，用50-500mmNacl线性梯度洗脱，收集洗脱峰，经SDS-PAGE检测，确定含主要目的蛋白的洗脱峰。SP洗脱的目的样品上Heparin柱(平衡液：20mm pb，pH7.5)，复平衡，用50-500mm Nacl线性梯度洗脱，收集洗脱峰，经SDS-PAGE和HPLC检测，获得纯度大于95％的二硫键形成形式的Δ23hKGF。将纯度大于95％的二硫键形成形式的Δ23hKGF，调pH8.0，加入终浓度为5mmol/L的DTT，室温，作用2-3小时，再经Superdex-75分离(100mm pb，pH6.5)获得纯度大于95％的二硫键还原形式的r-Δ23hKGF(图1B)。

实例3、r-Δ23hKGF的mPEG-MAL-20K修饰及修饰后(PEG-20K-Δ23KGF)的纯化

纯度大于95％的r-Δ23hKGF溶液用100mmol/L磷酸盐缓冲液，pH6.5，稀释样品至2mg/mL，按r-Δ23hKGF与mPEG-MAL-20KD(直链型，购于北京健凯科技有限公司)质量比为1∶3称取mPEG-MAL-20KD加入r-Δ23hKGF溶液中，25℃，100r/min搅拌反应2hr，用盐酸调低pH终止反应。修饰后的r-Δ23hKGF(PEG-20K-Δ23KGF)溶液透析过夜(透析液：20mmNaAc，pH5.0)，透析后的PEG-20K-Δ23KGF溶液上SP-Sepharose Fast Flow柱(平衡液：20mmNaAc，pH5.0)，复平衡，用50-500mm Nacl线性梯度洗脱，收集洗脱峰，经SDS-PAGE和HPLC检测，获得纯度大于95％的PEG-20K-Δ23KGF(图2，图3)。

实例4：PEG-20K-Δ23KGF修饰位点的分析确认

r-Δ23KGF中含有三个游离半胱氨酸(第17位、79位和83位)，mPEG-MAL有可能分别或同时对r-Δ23KGF的三个游离半胱氨酸进行修饰，而本发明仅对r-Δ23KGF中的第79位游离半胱氨酸进行单独修饰。为了证明PEG-20K-Δ23KGF的修饰位点仅是r-Δ23KGF中的第79位游离半胱氨酸，通过选用专一性强的合适酶，裂解较少位点后对获得的裂解肽段进行分析和分离纯化，最后对目的序列进行氨基酸测序，确定修饰位点。通过对r-Δ23KGF氨基酸序列的分析，选用专一性强的胰蛋白酶特异性酶解赖氨酸和精氨酸的C端肽键，对r-Δ23KGF和PEG-20K-Δ23KGF做质量肽图分析，再收集修饰后的目的肽段进行氨基酸序列分析，从而确定修饰位点。

r-Δ23KGF肽图的理论肽段见下表：

将r-Δ23KGF和PEG-20K-Δ23KGF二种样品冻干除盐后用1％NH4HCO3溶解成2mg/ml，每个样品取0.9ml，补入50uL胰蛋白酶(质量比1∶50，sigma公司)，37℃反应24小时。再补入加入0.4M TCEP 10ul，37℃，反应30min，经RP-HPLC液质分析二者的质量肽图。分析型RP-HPLC分析条件：流动相A液，为含0.1％三氟乙酸超纯水溶液。流动相B液，为含0.1％三氟乙酸-乙腈溶液。上样量50μl，流速为1.0ml/min，梯度洗脱70分钟(A液从100％至30％，B液从0至70％)，检测波长为214nm(或ELSD)，分别记录色谱图。

对图4A图r-Δ23KGF肽图分析发现，保留时间21.759分钟的肽段的分子量为537.5道尔顿，通过序列对比发现，该肽段为LFCR，即含有第17位半胱氨酸的肽段。保留时间为18.805分钟和32.82分钟的肽段的分子量均为1100道尔顿左右。结合图4B图PEG-20K-Δ23KGF肽图分析发现，修饰后保留时间为18.805分钟的肽段消失，保留时间为32.8分钟的峰并未消失，因此确定保留时间为18.805分钟的肽段即为肽段ECNEDCNFK，该肽段含有第79位和第83位游离半胱氨酸的肽段；同时，修饰后的肽图出现了一个保留时间为54.715分钟的新峰，再用ELSD检测分析发现(图5)，该峰就是mPEG-MAL-20K修饰的肽段ECNEDCNFK的峰。

制备型RP-HPLC色谱获取保留时间为54.715分钟的肽段：洗脱条件同分析色谱，上样4mL，流速为20mL/min，收集分析色谱所对应保留时间为54.715分钟的峰，并按分析型RP-HPLC方法对该肽段分析。委托中科院上海生化所对该肽段进行测序分析。测序结果为：EXNEDCNFK，其中X为被PEG化。该结果证明PEG-20K-Δ23KGF修饰位点唯一，即仅修饰第79位的半胱氨酸。

实例5、Δ23hKGF和PEG-20K-Δ23KGF的体外活性检测

样品Δ23hKGF、r-Δ23hKGF和PEG-20K-Δ23KGF分别用含0.5％胎牛血清的1640培养基稀释至1μg/ml，再按1∶4梯度稀释7个浓度。将NBL-7细胞每孔3×10³接种于96孔细胞培养板，置于37℃，5％CO₂条件下培养过夜，吸净上清后复孔加入以上配制的不同稀释浓度的样品。置于二氧化碳培养箱继续培养72h，每孔加入MTT 10μl染色，再培养4～6h后弃掉培养液，加入100μl的DMSO，振荡混匀后在570nm波长下测定各孔吸光度OD值。根据KGF-I的国际活性标准品(来源于NIBSC)计算PEG修饰前后的Δ23hKGF的体外生物比活性(IU/mg)。

结果：

组别	EC50(ng/ml)	比活(IU/mg)
			Δ23hKGF	25.8	1.17×106
r-Δ23hKGF	25.2	1.20×106

PEG-20K-Δ23KGF

38.4

0.78×106

经NBL-7细胞活性测定Δ23hKGF、r-Δ23hKGF和PEG-20K-Δ23KGF的EC₅₀分别为25.8，25.2和38.4ng/ml。经相同条件下测定的KGF-I活性标准品计算的比活性分别为1.17×10⁶，1.20×10⁶和0.78×10⁶IU/mg。证明Δ23hKGF和r-Δ23hKGF活性基本一致，经PEG修饰后的Δ23hKGF的活性保留了66％。

实例6、Δ23hKGF和PEG-20K-Δ23KGF在新西兰兔体内的药代动力学的研究

新西兰大白兔20只，随机分成二组(Δ23hKGF组和PEG-20K-Δ23KGF)。二组均按4.0mg/kg皮下注射；于注射后0、30min、60min、1hr、2hr、4hr、12hr、24hr、48hr、72hr、96hr、120hr、144hr从耳静脉取血。采用rhKGF的ELISAKit(R&D公司)测定相应的血药浓度，用标准品曲线计算Δ23hKGF和PEG-20K-Δ23KGF单次给药后体内药代动力学变化。

实验结果表明，Δ23hKGF的半衰期t_α1/2为2.9hr，t_β1/2为6.9hr；而PEG-20K-Δ23KGF的半衰期t_α1/2为61.2hr，r_β1/2为149.5hr；结果证明PEG化Δ23hKGF的体内半衰期显著延长。

实例7、Δ23hKGF和PEG-20K-Δ23KGF对模型小鼠CCl4急性肝损伤的疗效评价

昆明小鼠40只，20-25g/只，雌雄各半，随机分为4组(正常组、模型对照组，Δ23hKGF组和PEG-20K-Δ23KGF组)。正常组只注射生理盐水，其他三组小鼠按150mg/kg腹腔CCl₄溶液1次，对照组在注射CCl₄前一天，皮下注射生理盐水，1次/天，连续注射3天；Δ23hKGF组在注射CCl₄前一天，皮下按4.0mg/kg注射Δ23hKGF，1次/天，连续注射3天。PEG-20K-Δ23KGF组在注射CCl₄前一天，皮下按4.0mg/kg注射PEG-20K-Δ23KGF，只注射1次。于CCl₄注射48h后小鼠眼球取血，离心后取血清测定ALT和AST活力单位。

结果：

组别	ALT(Unit/L)(平均值)	AST(Unit/L)(平均值)
			正常	31.8	20.4
模型对照	367.2	301.3
			Δ23hKGF	235.8	184.2
PEG-20K-Δ23KGF	76.3	98.2

上表试验结果表明：Δ23hKGF连续注射后可降低由CCl₄引起的肝损伤导致的血中ALT和AST的升高，其降低率为30-40％，而仅注射一次的PEG-20K-Δ23KGF在相同剂量下可降低由CCl₄引起的肝损伤导致的血中ALT和AST升高，其降低率为60-70％。

实例8、Δ23hKGF和PEG-20K-Δ23KGF对模型小鼠5氟尿嘧啶肠粘膜损伤的疗效评价

昆明小鼠60只，20-25g/只，雌雄各半，随机分为4组(正常组，模型对照组，Δ23hKGF组和PEG-20K-Δ23KGF)。正常组只注射生理盐水，其他三组小鼠按50mg/kg/天腹腔注射5氟尿嘧啶，连续注射5天。对照组在注射5氟尿嘧啶前二天开始，皮下注射生理盐水，1次/天，连续注射10天；Δ23hKGF组在注射5氟尿嘧啶前二天开始，皮下按4.0mg/kg注射Δ23hKGF，1次/天，连续注射10天；PEG-20K-Δ23KGF组在注射5氟尿嘧啶前二天开始，皮下按4.0mg/kg注射PEG-20K-Δ23hKGF，1次/3天，连续注射3次。实验期间考察各组的体重变化、死亡率，同时解剖动物，观察肠道损伤大体和病理改变。

结果：

由上表可知，正常动物组动物全部存活，体重逐渐增加，肉眼观小肠粘膜无充血和坏死、无脱落，病理无异常改变。而模型对照组从第五天开始体重减轻，到10天出现动物死亡，死亡率为33.3％，15天死亡率为60.0％，小肠可见严重的大面积充血和坏死、变薄和脱落，镜下可见大量炎症细胞浸润。Δ23hKGF和PEG-20K-Δ23KGF组动物体重至15天仍有轻微增加，至15天时，死亡率分别为26.7％和6.7％，两组动物的小肠粘膜损伤和病理改变均显著轻于模型对照组。

Claims (8)

1.重组缺失型人角质细胞生长因子I型的半胱氨酸游离巯基的聚乙二醇化学修饰及其偶联物。

2.权利要求1所述的重组缺失型人角质细胞生长因子I型，指天然含163个氨基酸组成的人角质细胞生长因子I型在氨基末端缺失23个氨基酸，氨基酸序列为SEQ ID No：1；同时包含在SEQ ID No：1序列的基础上氨基末端增加或减少1-5个氨基酸的变异体；也包含在SEQ ID No：1序列的基础上分别或同时将第17位和第83位半胱氨酸突变成其他氨基酸的变异体。

3.权利要求1所述的重组缺失型人角质细胞生长因子I型的半胱氨酸的游离巯基，指位于氨基酸序列SEQ ID No：1中的第79位氨基酸。

4.权利要求1所述的聚乙二醇，其特征在于，聚乙二醇为单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺(Monomethoxy Polyethylene glycol Maleimide，mPEG-MAL)活化分子，或为单甲氧基聚乙二醇邻二硫吡啶(Monomethoxy Polyethylene glycol Ortho-pyridyldisulfide，mPEG-OPSS)活化分子，或为单甲氧基聚乙二醇乙烯基砜(Monomethoxy Polyethylene glycolVinylsufone，mPEG-VS)活化分子，或单甲氧基聚乙二醇巯基(Monomethoxy Polyethyleneglycol sulfhydryl，mPEG-SH)活化分子，或为单甲氧基聚乙二醇碘代乙酰胺(MonomethoxyPolyethylene glycol Iodo acetamide，mPEG-IA)活化分子，优选单甲氧基聚乙二醇马来酰亚胺活化分子。

5.权利要求1、4任一项所述聚乙二醇分子，其特征在于聚乙二醇分子可为直链型或分枝型或星型；

6.权利要求1、4、5任一项所述聚乙二醇分子，其特征在于聚乙二醇分子分子量为5,000-40,000道尔顿，其中优选20,000道尔顿的直链型聚乙二醇分子和40,000道尔顿的分枝型聚乙二醇分子。

7.根据权利要求1所述的偶联物可作为一种预防和治疗性药物，其特征在于，所述药物为治疗有效剂量的聚乙二醇化重组重组缺失型人角质细胞生长因子I型的蛋白。

8.权利要求7所述作为预防和治疗药物的偶联物，可用于预防和治疗放化疗引起的消化道粘膜损伤、急性化学性肝损伤或溃疡性黏膜炎的临床治疗。

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