CN110183529A - 一种缺失型人角质细胞生长因子-1的重组制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种缺失型人角质细胞生长因子‑1的重组制备方法，其包括用于获取缺失型人角质细胞生长因子‑1的重组表达方法、用于形成重组缺失型人角质细胞生长因子‑1的102位和106位间的一对二硫键的二硫键形成方法，其中，缺失型人角质细胞生长因子‑1的氨基酸序列特征为SEQ ID NO:1。本发明的重组表达方法，通过采用含T7启动子或BAD启动子的表达载体与表达宿主组成表达体系，直接表达得到的缺失型人角质细胞生长因子‑1，其N端无甲硫氨酸，无需工具酶酶切；本发明的二硫键形成方法，通过采用半胱氨酸作为添加剂，重组缺失型人角质细胞生长因子‑1的102位和106位间正确形成一对二硫键配对形成效率大于95％，具有与天然型KGF‑1相同的生物效价和生物作用。

Description

一种缺失型人角质细胞生长因子-1的重组制备方法
技术领域
本发明涉及生物技术的技术领域，尤其是涉及一种缺失型人角质细胞生长因子-1的重组制备方法。
背景技术
角质细胞生长因子(Keratinocyte growth factor，KGF)是Rubin JS等人1989年从胚胎肺成纤维细胞培养上清液中发现的，为成纤维细胞生长因子(fibroblast growthfactor，FGF)家族一员，又称FGF-7。由于其具有促进小鼠角质细胞有丝分裂的能力，故命名为角质细胞生长因子。
人角质细胞生长因子(hKGF)为基因编码194个氨基酸残基的蛋白质，包含一个供分泌的信号肽(由31个氨基酸残基组成)和位于N端的糖基化位点。成熟的hKGF由163个氨基酸组成，由于受糖基化的影响，分子量约为26-28kDa。
天然的hKGF稳定较差，活性容易受环境影响，生物半衰期短，在温和的温度下也容易聚合。根据现有文献(Osslund TD etAl，Protein Sci，1998，7：1681-1690；Hsu E etAl，Protein Eng Des Sel，2006，19：147-153和美国专利US 5677278)报道，N端缺失23个氨基酸且形成Cys102-Cys106二硫键的缺失型人角质细胞生长因子-1(记为△N23KGF-1)，其稳定性较高，同时体内外生物学作用和活性也保持不变。
授权公告号为CN100545264C的中国专利公开了一种大肠杆GST菌融合表达制备截短型重组人角质细胞生长因子的方法，该方法先通过表达获得GST-KGF融合蛋白，再引入凝血酶或肠激酶酶切，以此获得截短型重组人角质细胞生长因子(KGF)，最后在纯化工艺中引入了肝素亲和柱纯化。该制备方法需要对GST-KGF融合蛋白进行酶切加工，且存在凝血酶或肠激酶和肝素残留的风险，有待改进。
授权公告号为CN1161380C的中国专利公开了一种角化细胞生长因子的表达、纯化制备方法，根据其公开的氨基酸序列表可得，该方法表达得到的KGF及其类似物的氨基酸序列的N端含有甲硫氨酸，容易引起免疫反应，影响该目的蛋白成药，因此需要对该目的蛋白的N端进行加工修饰，有待改进。
张增涛等.重组人角质细胞生长因子I型缺失突变体二硫键配对与生物活性.重庆理工大学学报(自然科学版)，2010年，24(5).第44至第53页公开了一种二硫键形成方法，该方法采用重组大肠杆菌可溶性表达的△23KGF-I经铜离子处理形成Cys102-Cys106配对的二硫键，由于铜离子存在与第40位Cys络合的可能性，仅Cys102-Cys106配对的△23KGF-I的产率不高，有待改进。另一方面该文献公开了所获得的△23KGF-I具有更高的刺激上皮细胞活性的作用，适用于放化疗后的口腔黏膜的保护、急性肝损伤的治疗。
发明内容
针对现有技术中所存在的上述不足，本发明的第一个目的在于提供一种缺失型人角质细胞生长因子-1的重组制备方法，达到了获得具有102位和第106位间的一对二硫键的缺失型人角质细胞生长因子-1的目的，其解决了现有方法中表达得到的目的蛋白需要加工修饰的问题，且有利于提高102位和第106位间的一对二硫键配对形成效率。
本发明的第二个目的在于提供一种缺失型人角质细胞生长因子-1在制药中的新应用，使用该种缺失型人角质细胞生长因子-1制造药物，其具有良好的产业应用前景。
为实现上述第一目的，本发明提供了如下技术方案：
一种缺失型人角质细胞生长因子-1的重组制备方法，包括用于获取缺失型人角质细胞生长因子-1的重组表达方法、用于形成重组缺失型人角质细胞生长因子-1的102位和106位间的一对二硫键的二硫键形成方法，其中，缺失型人角质细胞生长因子-1的氨基酸序列特征为SEQ ID NO:1。
本发明进一步设置为：所述重组表达方法包括以下步骤：
A1人工全基因合成缺失型人角质细胞生长因子-1的核苷酸序列，然后将其进行NdeⅠ/BamHⅠ双酶切或NcoⅠ/HindⅢ双酶切，并连接至含T7启动子或BAD启动子的表达载体中，构建得重组质粒；
A2将A1步骤所得的重组质粒转入表达宿主，筛选高拷贝转化子；
A3将A2步骤所得的转化子转入培养基中发酵培养，用诱导剂诱导表达得到可溶性缺失型人角质细胞生长因子-1。
本发明进一步设置为：所述A2步骤中，所述表达宿主为适宜T7启动子或BAD启动子调控的表达载体的大肠杆菌或酵母或哺乳动物细胞。
本发明进一步设置为：所述A3步骤中，所述诱导剂为乳糖或半乳糖或IPTG或阿拉伯糖，培养温度和诱导温度为15℃-37℃，诱导时间为2h-24h。
本发明进一步设置为：所述二硫键形成方法包括以下步骤：
B1在碱性条件下，用半胱氨酸处理缺失型人角质细胞生长因子-1溶液，使缺失型人角质细胞生长因子-1的第40位、第102位、第106位的巯基全部处于游离状态；
B2将步骤B1所得的反应溶液在25℃-37℃温度下反应1h-24h，促进重组缺失型人角质细胞生长因子-1形成第102位和第106位间的一对二硫键。
本发明进一步设置为：所述反应溶液中，缺失型人角质细胞生长因子-1的浓度为0.1mg/mL-2mg/mL，控制半胱氨酸的终浓度为0.5mmol/L-50mmol/L，控制反应溶液的pH值为7.0-10.0。
本发明进一步设置为：还包括纯化方法，所述纯化方法，包括以下步骤：用Source30S柱层析对复性后的重组缺失型人角质细胞生长因子-1进行纯化，分离获得具有102位和第106位的Cys间天然二硫键的重组缺失型人角质细胞生长因子-1。
为实现上述第二目的，本发明提供了如下技术方案：
一种缺失型人角质细胞生长因子-1，根据所述的重组制备方法制备所得，其中，所述缺失型人角质细胞生长因子-1仅含102位和106位间一对二硫键。
本发明进一步设置为：缺失型人角质细胞生长因子-1在制备用于预防和治疗黏膜、角膜和皮肤的损伤修复的药物中的应用。
本发明进一步设置为：缺失型人角质细胞生长因子-1的药物组合在有效剂量下制备而成的药物制剂，所述药物制剂为冻干制剂、滴眼液、喷雾剂或凝胶。
综上所述，本发明的有益技术效果为：
1.本发明的重组表达方法，通过采用含T7启动子或BAD启动子的表达载体与表达宿主组成表达体系，直接表达得到的缺失型人角质细胞生长因子-1，其N端无甲硫氨酸，无需工具酶酶切；
2.本发明的二硫键形成方法，通过采用半胱氨酸作为添加剂，重组缺失型人角质细胞生长因子-1的102位和106位间正确形成一对二硫键配对形成效率大于95％，具有与天然型KGF-1相同的生物效价和生物作用；
3.本发明优选采用Source 30S柱层析，有利于提高缺失型人角质细胞生长因子-1的纯度；
4.本发明通过缺失型人角质细胞生长因子-1在制药领域中的应用，使用该种缺失型人角质细胞生长因子-1制造药物，其具有良好的产业应用前景。
附图说明
图1为本发明的pET-3c-△N23KGF重组质粒构建示意图。
图2为本发明的pBAD-△N23KGF重组质粒构建示意图。
图3为本发明的pET-3c-△N23KGF的cDNA测序结果与理论序列比对。
图4为本发明的△N23KGF-1复性前后对比图。
图5为本发明的△N23KGF-1的质量肽图谱。
图6为本发明的△N23KGF-1的活性测定图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与作用更加清楚及易于了解，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步阐述：
缺失型人角质细胞生长因子-1的制备例
制备例1
一种缺失型人角质细胞生长因子-1的重组制备方法，包括以下步骤：
S1通过采用重组表达方法获得氨基酸序列特征为SEQ ID NO:1的缺失型人角质细胞生长因子-1；
S2通过采用二硫键形成方法促使S1所得的缺失型人角质细胞生长因子-1反应，使其仅在102位和106位间形成一对二硫键，获得含重组缺失型人角质细胞生长因子-1的反应溶液；
S3通过采用纯化方法纯化分离出S2所得的反应溶液，最终获得纯度大于95％、N端不含甲硫氨酸、N端和C端完全正确且102位和106位间二硫键正确形成的缺失型人角质细胞生长因子-1。
参照图1，本制备例1的重组表达方法包括以下步骤：
S1人工全基因合成缺失型人角质细胞生长因子-1的核苷酸序列，选用含有T7启动子的载体作为表达载体、大肠杆菌作为表达宿主；
S2选用两种合适的限制性内切酶，分别双酶切质粒载体和缺失型人角质细胞生长因子-1基因后，连接得到重组质粒，将重组质粒转入大肠杆菌宿主菌并筛选转化子；
S3将转化子转至培养基中在一定温度下发酵培养一定时间，用诱导剂诱导表达目的蛋白。
本制备例1的重组表达方法的S1中，质粒载体为pET-3c或pET-30a或在其基础上改造的载体，优选为pET-3c。
本制备例1的重组表达方法的S1中，表达宿主为大肠杆菌，更具体为E.coli BL21、E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)plysS，优选为E.coli BL21(DE3)pLysS。
本制备例1的重组表达方法的S2中，缺失型人角质细胞生长因子-1基因序列，是基于序列SEQ ID NO:1的氨基酸序列，结合大肠杆菌密码子偏爱性原则设计的cDNA序列。该序列为了插入表达重组pET载体，5'端设计含NdeⅠ核酸内切酶位点、3'端设计含BamHⅠ核酸内切酶位点。
本制备例1的重组表达方法的S2中，核苷酸内切酶分别为5'端为NcoⅠ核酸内切酶、3'端为HindⅢ核酸内切酶。
本制备例1的重组表达方法的S3中，培养基选用适合大肠杆菌生长的培养基，可以是LB、M9CA、M9-YE-Glu等培养基或在这些培养基的基础上的改进及其组合。其中，
LB培养基组成为：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L；
M9CA培养基组成为：Na2HPO4·7H2O 12.8g/L、KH2PO43.0g/L、NaCl 0.5g/L、NH4Cl1.0g/L、葡萄糖4g/L、MgSO40.24g/L、CaCl20.011g/L、酪蛋白氨基酸2.0g/L；
M9-YE-Glu培养基组成：Na2HPO4·7H2O 30g/L、NH4Cl 1.0g/L、NaCl 0.5g/L、KH2PO45.0g/L、葡萄糖10g/L、酵母提取物5g/L、胰蛋白胨3g/L。
本制备例1的重组表达方法的S3中，培养和诱导温度为15℃-37℃，优选为15℃-30℃。
本制备例1的重组表达方法的S3中，诱导剂选用乳糖、半乳糖或IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)；诱导剂的浓度为0.05mmol/L-1mmol/L；诱导时间为2h-24h，优选为2-10h。
本制备例1的缺失型人角质细胞生长因子-1通过重组DNA技术制备而成。重组DNA技术是指利用分子生物学技术，合成或提取外源目的基因，对外源基因进行缺失或突变，然后将外源基因转入表达宿主，利用表达宿主表达外源目的蛋白。表达宿主可以使原核系统也可以是真核系统，其中原核表达系统可以是大肠杆菌，真核表达系统可以是酵母或哺乳动物细胞。本制备例1优选大肠杆菌原核表达系统。
本制备例1的二硫键形成方法包括以下步骤：
S1将纯化制备得到的缺失型人角质细胞生长因子-1，在碱性缓冲条件下处理；
S2在碱性条件下经半胱氨酸处理，第40位、第102位、第106位的半胱氨酸的巯基全部处于游离状态，促进形成Cys-Cys二硫键；
S3将S2中的缺失型人角质细胞生长因子-1溶液，在一定温度下，反应一定时间，以此正确形成二硫键配对，获得具有Cys间天然二硫键的蛋白，即102位与106位Cys配对，第40位游离。
本制备例1的二硫键形成方法的S1中，缓冲试剂是指含有具有碱性pH缓冲作用的溶液，可以是Tris、磷酸盐、乙醇胺、氨基酸、组氨酸等缓冲溶液，优选为氨基酸缓冲溶液，更优选为组氨酸缓冲溶液。
本制备例1的二硫键形成方法的S1中，pH范围为7.0-10.0，优选为8.5。
本制备例1的二硫键形成方法的S2中，半胱氨酸终浓度范围为0.5-50mmol/L，优选为10mmol/L。
本制备例1的二硫键形成方法的S3中，温度范围为10℃-40℃，优选为30℃。
本制备例1的二硫键形成方法的S3中，反应时间范围为1h-24h，优选为3h-15h。
本制备例1的纯化方法包括以下步骤：用Source 30S柱层析对复性后的重组缺失型人角质细胞生长因子-1进行纯化，分离获得具有102位和第106位的Cys间天然二硫键的缺失型人角质细胞生长因子-1。
制备例2：参照图2，与制备例1的不同之处在于，重组表达方法包括以下步骤：
S1人工全基因合成缺失型人角质细胞生长因子-1的核苷酸序列，选用含有BAD启动子作为表达载体、大肠杆菌作为表达宿主；
S2选用两种合适的限制性内切酶，分别双酶切质粒载体和缺失型人角质细胞生长因子-1基因后，连接得到重组质粒，将重组质粒转入大肠杆菌宿主菌筛选重组表达菌菌株；
S3将重组表达菌株转至培养基中一定温度下发酵培养一定时间，用诱导剂诱导表达目的蛋白。
本制备例2的重组表达方法的S1中，质粒载体为pBAD或在pBAD基础上改造的载体，优选为pBAD。
本制备例2的重组表达方法的S2中，缺失型人角质细胞生长因子-1基因序列，是基于序列SEQ ID NO:1的氨基酸序列，结合大肠杆菌密码子偏爱性原则设计的cDNA序列。该序列为了插入表达重组pBAD载体，5'端设计含NcoⅠ核酸内切酶位点、3'端设计含HindⅢ核酸内切酶位点。
本制备例2的重组表达方法的S3中，培养和诱导温度为20℃-37℃。
本制备例2的重组表达方法的S3中，诱导剂为阿拉伯糖；阿拉伯糖的浓度为0.01％-1.0％(m/v)；诱导时间为2h-24h。
实施例
实施例1：缺失型人角质细胞生长因子-1(记为△N23KGF-1)的cDNA序列的人工合成
根据缺失型人角质细胞生长因子-1的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)而设计的cDNA序列(SEQ ID NO:2)，委托人工全基因合成核苷酸序列，嵌入pUC-57载体，命名为pUC-57-△N23KGF。
实施例2：缺失型人角质细胞生长因子-1重组质粒和工程菌株的构建
参照图1，以pUC-57-△N23KGF质粒为模板，用NdeⅠ核酸内切酶和BamHⅠ核酸内切酶双酶切，回收目的片段，再用T4DNA连接酶与质粒pET-3C(购于大连TaKaRa公司)同样经NdeⅠ和BamHⅠ酶切回收的片段连接，转化大肠杆菌克隆宿主菌Top10，用酶切和PCR验证的方法筛选重组质粒pET-3c-△N23KGF。参照图3，经DNA测序证明重组质粒中△N23KGF的cDNA序列正确后，将上述重组质粒转化至大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)plysS(购于安诺伦生物科技有限公司)，最后经表达筛选获得转化子。
实施例3：重组缺失型人角质细胞生长因子-1的发酵培养
将转化子中表达最佳的pET-3C-△N23KGF/BL21(DE3)plysS重组工程菌划线接种于含氨苄青霉素和氯霉素的LB琼脂糖平板上，37℃培养过夜。从过夜培养的LB琼脂糖平板上挑取菌苔接种于含LB液体培养基试管中，37℃培养12小时，然后按1％的比例转接到含200mL的LB培养液的1000mL三角瓶中，37℃培养过夜即成为上罐种子液。将上罐种子液按5％的比例接种于含YT培养液(胰蛋白胨4g/L，酵母提取物3g/L，Na2HPO4·12H2O 30g/L，KH2PO4 3g/L，NaCl 1g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，葡萄糖8g/L，121℃下高压灭菌30min)的30L发酵罐中，30℃培养。整个发酵过程中，通过调节转速、通空气量、通纯氧量来保持溶氧在30％以上，用28％的氨水调节并保持pH在7.0。当菌液OD600达到10-14时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG。继续培养诱导4小时后，停止发酵，将培养液在8000rpm下离心10分钟，弃去上清液，收集菌体并放入-20℃冰箱保存备用。
实施例4：重组缺失型人角质细胞生长因子-1的捕获
从-20℃冰箱中取出菌体，放入缓冲液(50mmol/L Na2CO3，pH9.0)中重悬，室温搅拌过夜。取出上述溶液并在300bar下高压破碎。然后在10000rpm下离心10min，收集破菌上清液。取破菌上清，经阳离子柱层析(SP Sepharose FF)捕获回收△N23KGF-1。采用2柱体积以上平衡液(50mmol/L Na2HPO4，pH8.0)平衡SP柱，上样。上样结束后，采用2柱体积以上平衡液(50mmol/L Na2HPO4pH8.0)复平衡，洗脱液1(含50mmol/L Na2HPO4、0.35mol/L NaCl，pH8.0)洗脱去除部分杂蛋白，洗脱液2(含50mmol/L Na2HPO4、0.5mol/L的NaCl，pH8.0)洗脱收集目的蛋白△N23KGF-1。
实施例5：重组缺失型人角质细胞生长因子-1的二硫键配对形成
取捕获回收的△N23KGF-1，稀释至蛋白浓度0.2mg/mL-1.0mg/mL，调节pH至8.0-8.5，补入半胱氨酸终浓度10mmol/L，30℃缓慢搅拌反应10h，在10000rpm下离心10min，收集上清液。
实施例6：重组缺失型人角质细胞生长因子-1的精纯化
参照图4，将复性后的△N23KGF-1溶液，用Source 30S柱层析进行纯化。用平衡液(10mmol/L His，pH6.5)平衡后，上样分离纯化目的蛋白，用含10mmol/L His的0-1000mmol/L的NaCl，pH6.5线性梯度洗脱，收集含目的蛋白的洗脱峰。将纯化后的△N23KGF-1重组蛋白经12％的聚丙酰胺凝胶电泳后，考马斯亮蓝显示分子量约为16kDa的单一条带，纯度大于95％。参照图5，纯化制备的△N23KGF-1重组蛋白经过肽图谱分析，N端不含甲硫氨酸，N端和C端完全正确，102位和106位间二硫键正确形成。
实施例7：缺失型人角质细胞生长因子-1的生物效价测定
将对数生长期的Ba/f-3-FGFR2ⅢB细胞，在1000rmp下离心5min，用RPMI 1640洗涤3次，每次15mL，用样品测活培养液(量取新生牛血清10mL加入含双抗的RPMI 1640培养液90mL，再加入肝素钠1.0μg/mL，β-巯基乙醇50μmol/L，4℃保存)，重悬成5×105/mL的细胞悬液。
将已经稀释好的各样品分别加入各孔，每孔100μL，复孔。将已稀释好的细胞液接种到96孔板，每孔100μL，即每孔接种细胞50000个，在37℃下5％CO2培养48小时。48小时后每孔加入10μL的CCK-8，37℃下在5％CO2反应作用下过夜，450nm测定结果。
取△N23KGF-1精纯化的样品，用Lowry法测定相应蛋白含量。参照图6，以国际标准品(NIBSC)作为对照计算，相应蛋白含量不低于1×106IU/mg。
实施例8：新西兰大白兔的口腔溃疡的愈合模型试验
采用制备所得的缺失型人角质细胞生长因子-1原液制得的口腔喷雾制剂，对新西兰大白兔的口腔溃疡的愈合试验得出，由重组缺失型人角质细胞生长因子-1制成口腔喷雾剂可明显降低新西兰大白兔口腔溃疡愈合时间，促进口腔溃疡的愈合，减少愈合时间。说明本发明重组缺失型人角质细胞生长因子-1喷雾剂对口腔溃疡愈合有促进作用。
实施例9：家兔的角膜碱烧伤的愈合模型试验
取健康家兔18只，随机分为3组，每组6只，分别为溶媒对照组、hbFGF(购于中国药品生物制品检定所)对照组、△N23KGF-1实验组。采用对侧眼自身对照法和组间对照进行实验，在实验前24h，检查每只家兔两眼的刺激性体征，并用检眼镜检查角膜、结膜有无损伤，所有兔眼用2％荧光素钠溶液染色，检查证实没有角膜损伤。
将家兔左眼睑拉成杯状，于眼结膜囊内滴入无水乙醇，第1天滴入0.135mL(即3滴)，第2天0.09mL，第3天0.045mL，轻合眼睑约10s，右眼滴加相同体积的生理盐水作对照。自第4天起，各组家兔左眼滴入0.135mL含相应药物(50μg/mL)的滴眼液或生理盐水，右眼滴加生理盐水作对照，上、下午各一次，连续滴加14天，其中第7天和第14天做眼刺激评分(包括角膜、虹膜、结膜的损伤及充血、水肿以及分泌物)，并于第14天取角膜做病理切片。眼刺激评分结果见下表1。
表1
由表1可知，重组缺失型人角质细胞生长因子-1制成的滴眼液可显著促进角膜上皮细胞的愈合。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 重庆派金生物科技有限公司
<120> 一种缺失型人角质细胞生长因子-1的重组制备方法
<130> 2019
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ser Tyr Asp Tyr Met Glu Gly Gly Asp Ile Arg Val Arg Arg Leu Phe
1 5 10 15
Cys Arg Thr Gln Trp Tyr Leu Arg Ile Asp Lys Arg Gly Lys Val Lys
20 25 30
Gly Thr Gln Glu Met Lys Asn Asn Tyr Asn Ile Met Glu Ile Arg Thr
35 40 45
Val Ala Val Gly Ile Val Ala Ile Lys Gly Val Glu Ser Glu Phe Tyr
50 55 60
Leu Ala Met Asn Lys Glu Gly Lys Leu Tyr Ala Lys Lys Glu Cys Asn
65 70 75 80
Glu Asp Cys Asn Phe Lys Glu Leu Ile Leu Glu Asn His Tyr Asn Thr
85 90 95
Tyr Ala Ser Ala Lys Trp Thr His Asn Gly Gly Glu Met Phe Val Ala
100 105 110
Leu Asn Gln Lys Gly Ile Pro Val Arg Gly Lys Lys Thr Lys Lys Glu
115 120 125
Gln Lys Thr Ala His Phe Leu Pro Met Ala Ile Thr
130 135 140
<210> 3
<211> 438
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
catatgagct atgactatat ggaaggtggc gatattcgtg tgcgtcgtct gttttgccgt 60
acccagtggt atctgcgtat cgataaacgt ggcaaagtga aaggtaccca ggaaatgaaa 120
aacaattata acattatgga aattcgtacc gtggcggttg gcattgtggc gattaaaggc 180
gttgaatctg aattttacct ggcgatgaat aaagaaggta aactgtatgc gaaaaaagaa 240
tgcaatgaag attgcaattt caaagaactg attctggaaa accattataa tacctatgcg 300
tcagcgaaat ggacccacaa tggcggtgaa atgtttgtgg cgctgaatca gaaaggcatt 360
ccggtgcgtg gcaaaaaaac caaaaaagaa cagaaaaccg cgcattttct gccgatggcg 420
attacctaat gaggatcc 438

Claims (10)

1.一种缺失型人角质细胞生长因子-1的重组制备方法，其特征在于：包括用于获取缺失型人角质细胞生长因子-1的重组表达方法、用于形成重组缺失型人角质细胞生长因子-1的102位和106位间的一对二硫键的二硫键形成方法，其中，缺失型人角质细胞生长因子-1的氨基酸序列特征为SEQ ID NO:1。
2.根据权利要求1所述的一种缺失型人角质细胞生长因子-1的重组制备方法，其特征在于：所述重组表达方法包括以下步骤：
A1人工全基因合成缺失型人角质细胞生长因子-1的核苷酸序列，然后将其进行NdeⅠ/BamHⅠ双酶切或NcoⅠ/HindⅢ双酶切，并连接至含T7启动子或BAD启动子的表达载体中，构建得重组质粒；
A2将A1步骤所得的重组质粒转入表达宿主，筛选高拷贝转化子；
A3将A2步骤所得的转化子转入培养基中发酵培养，用诱导剂诱导表达得到可溶性缺失型人角质细胞生长因子-1。
3.根据权利要求2所述的一种缺失型人角质细胞生长因子-1的重组制备方法，其特征在于：所述A2步骤中，所述表达宿主为适宜T7启动子或BAD启动子调控的表达载体的大肠杆菌或酵母或哺乳动物细胞。
4.根据权利要求2所述的一种缺失型人角质细胞生长因子-1的重组制备方法，其特征在于：所述A3步骤中，所述诱导剂为乳糖或半乳糖或IPTG或阿拉伯糖，培养温度和诱导温度为15℃-37℃，诱导时间为2h-24h。
5.根据权利要求1所述的一种缺失型人角质细胞生长因子-1的重组制备方法，其特征在于：所述二硫键形成方法包括以下步骤：
B1在碱性条件下，用半胱氨酸处理缺失型人角质细胞生长因子-1溶液，使缺失型人角质细胞生长因子-1的第40位、第102位、第106位的巯基全部处于游离状态；
B2将步骤B1所得的反应溶液在25℃-37℃温度下反应1h-24h，促进重组缺失型人角质细胞生长因子-1形成第102位和第106位间的一对二硫键。
6.根据权利要求5所述的一种缺失型人角质细胞生长因子-1的重组制备方法，其特征在于：所述反应溶液中，缺失型人角质细胞生长因子-1的浓度为0.1mg/mL-2mg/mL，控制半胱氨酸的终浓度为0.5mmol/L-50mmol/L，控制反应溶液的pH值为7.0-10.0。
7.根据权利要求1所述的一种缺失型人角质细胞生长因子-1的重组制备方法，其特征在于：还包括纯化方法，所述纯化方法，包括以下步骤：用Source 30S柱层析对复性后的重组缺失型人角质细胞生长因子-1进行纯化，分离获得具有102位和第106位的Cys间天然二硫键的重组缺失型人角质细胞生长因子-1。
8.一种缺失型人角质细胞生长因子-1，其特征在于：根据权利要求1-7任一项所述的重组制备方法制备所得，其中，所述缺失型人角质细胞生长因子-1仅含102位和106位间一对二硫键。
9.根据权利要求8所述的缺失型人角质细胞生长因子-1在制备用于预防和治疗黏膜、角膜和皮肤的损伤修复的药物中的应用。
10.根据权利要求8所述的缺失型人角质细胞生长因子-1的药物组合在有效剂量下制备而成的药物制剂，所述药物制剂为冻干制剂、滴眼液、喷雾剂或凝胶。
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