CN1417333A - 海葵毒素新基因的克隆、表达及生物活性 - Google Patents

海葵毒素新基因的克隆、表达及生物活性 Download PDF

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Abstract

本发明通过构建侧花海葵(Anthopleura sp)触手cDNA文库和DNA测序,并根据海葵神经毒素蛋白的两端保守氨基酸序列,设计简并引物,用RT-PCR的方法,分离出1个新的海葵多肽神经毒素基因,命名为su。新基因长度为141bp,编码47个氨基酸的成熟肽(序列号码1)。所表达的蛋白质等电点为7.9,分子量约为4,800道尔顿。将su克隆于硫氧还蛋白基因融合表达载体pETTRX的trxA基因3’末端,构建符合读码框的融合基因,该融合蛋白在大肠杆菌中以胞内可溶的形式存在,表达量可达100~120mg/L。通过Ni-Chelating亲和色谱层析,蛋白酶3C切割和凝胶过滤,得到纯度在95%以上成熟的重组海葵神经毒素蛋白,得率为10~15mg/L。该蛋白对大鼠离体心脏具有强烈地促收缩作用。

Description

海葵毒素新基因的克隆、表达及生物活性
技术领域
本发明涉及海葵毒新基因的克隆、表达以及其生物活性,更具体说,涉及一种侧花海葵触手总RNA中分离1个新的基因,利用基因工程的方法在高效大肠杆菌表达系统表达并纯化出具有生物活性的重组神经毒素蛋白以及由这种蛋白构成的治疗心血管系统疾病的药物。
背景技术
海葵(anthopleura),属腔肠动物门(soelenterata),珊瑚纲(anthozoa),是海洋中较原始的动物类。在长期的生物进化过程中,为了抵御敌害及捕获食物,海葵触手的刺丝囊能够分泌多种海葵毒素,基本上是多肽类毒素,对人和动物有多种生理活性作用。根据海葵毒素的生理功能将其分为3类:海葵神经毒素、海葵溶细胞素及海葵钾离子通道抑制剂。
人们对海葵神经毒素的研究始于七十年代。1976年美国夏威夷大学Shibata等人从黄海葵(Anthopleura xanthogrammica)中分离纯化了Ap-A和Ap-B二种毒素,发现有增强心肌收缩的作用;1977年,Tanaka等对Ap-A的氨基酸序列进行了测定;随后,又有多种海葵神经毒素被发现,并做了氨基酸序列测定,以及二级、三级结构的分析。1992年,Gallagher等根据天然的Ap-B的氨基酸序列,体外合成了编码Ap-B的基因,在大肠杆菌中进行了重组表达,重组蛋白与天然的Ap-B在氨基酸组成、序列、二级结构、高压液相图谱及生物活性方面相同。海葵神经毒素的药理研究结果显示,这类毒素专一地和钠离子通道膜蛋白3位点结合,能延迟钠通道的失活。一方面,毒素作为分子探针可用于钠通道的生物学研究;另一方面,毒素对心肌组织产生非常强的正性收缩作用,而且,对实验动物的心率和血压没有影响,因此,研究开发海葵神经毒素用于治疗心衰,是一项很有意义的工作。
海葵在我国海域分布较广,但产量较少。我国的海葵种类主要有:黄海葵(Anthopleura xanthogrammica)、纵条肌海葵(Haliplanellaluciae)、日本侧花海葵(Anhopleura Japonica)、太平洋侧花海葵(Anthopleura pacifica)、暗侧花海葵(Anthopleura nigrescens)、青岛侧花海葵(Aanthopleura Qingdaoensis)、华丽黄海葵(anthopleura elegantissima)、须毛细指海葵(Metridium dianthus)、疣海葵(Adamsia palliata)、红海葵(Actinia equina)等。目前,国内对海葵神经毒素的研究报道较少。对我国特有的海葵资源进行研究,发现新的有应用前景的强心类海葵毒素,进行基因重组、表达,具有很重要的意义。
从所有已经纯化的海葵神经毒素一级结构来看,大部分为46~49个氨基酸,称为长链神经毒素,分子量在5kDa左右;另一些分子量在3kDa左右的多肽,称为短链神经毒素。目前文献报道的海葵长链神经毒素已有20多种,氨基酸序列比较可以看出其共性为:存在6个Cys残基;3对二硫键;多肽链末端都是亲水性氨基酸。这些海葵神经毒素根据来源又可以分为两类:来源于海葵科的Type-I类毒素称为海葵肽类毒素(Actiniid);而来源于刺海葵科的Type-II类毒素称为刺海葵肽类毒素(Stichodactylid)。本发明所找到的新的海葵毒素基因编码的为Type-I型毒素。
由于海葵在我国海域产量较少,且其排毒量甚微,难以采集到足够的毒液量,因此,给分离提纯海葵毒素的组分、研究毒素分子的特性和结构、以及在科学研究和实际应用等各方面带来一定的困难。
发明内容
本发明的目的是:(1)用RT-PCR的方法,从侧花海葵触手总RNA中分离到1个新的毒素基因;(2)利用基因工程的方法,在高效大肠杆菌表达系统中表达并纯化出具有生物活性的重组海葵神经毒素蛋白;(3)通过重组海葵神经毒素对大鼠心血管系统的促收缩作用以及在体外抑制人类恶性肿瘤细胞生长等功能的研究,确证其活性,找出其对心血管系统及恶性肿瘤的作用特点,为进一步的药物开发奠定基础。
本发明提供一种如序列表中序列号码1所示核苷酸序列的DNA。
本发明提供一种如序列表中序列号码1所示氨基酸序列的蛋白质。
本发明提供一种重组载体,该载体包括上述一种核苷酸序列。
本发明提供一种含有上述重组载体的原核细菌。
在一种实施方式中,上述的原核细菌是大肠杆菌。
在一种实施方式中,上述重组载体是以硫氧环蛋白为融合伴体,中间插入6个His的亲和标记位点及蛋白酶3C识别位点的高效表达载体pETTRX-su。
在一种实施方式中,上述载体使所述DNA在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达,其表达量为100~120mg/L。
在一种实施方式中,上述重组载体的表达产物超音裂解液经过Ni-Chelating亲和柱层析,蛋白酶3C切割和凝胶过滤可得到纯度在95%以上的性质稳定的成熟蛋白,得率为10~15mg/L。
本发明还提供一种用作引物的DNA片段,该DNA片段由上述核苷酸序列的一部分序列组成。
本发明还提供一种含有上述蛋白的预防或治疗心血管系统疾病的药物制剂。
本发明的上述蛋白可以用于制备预防和治疗心血管系统疾病的药物。
本发明所选择的海葵属于侧花海葵(anthopleura sp),采自广东省湛江海边滩涂。侧花海葵毒素cDNA文库的构建:首先解剖分离到海葵触手,提取总RNA(图1)。然后比较已发现的海葵神经毒素,它们的氨基酸组成及序列有很大的保守性,依据Ap-B两端的保守氨基酸序列,设计简并引物,运用RT-PCR方法,扩增得到目的条带,将目的条带连接到T载体,并转化E.coli挑选重组克隆(图2)。
本发明通过对以上重组克隆大规模序列测定,从中得到了1个新的编码侧花海葵毒素的克隆,命名为su。通过基因工程方法表达出重组蛋白。新基因编码47个氨基酸的成熟肽,等电点约为7.9,分子量约为4,800道尔顿,具有典型的海葵神经毒素一级结构的特征,分子内含有6个半胱氨酸,形成3对二硫键。
本发明通过设计了一对引物,将编码侧花海葵神经毒素的新基因su用PCR方法从T载体上扩增出来,克隆到原核融合表达载体pETTRX上,构建成表达质粒并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)(见图3)。此表达载体(pETTRX-su)以T7为启动子,采用分子伴侣TRX为融合伴体,帮助重组蛋白正确折叠,以可溶的形式表达,TRX的C端有柔链区和6×His结构,便于利用固定化金属配体亲和层析进行纯化。所设计的上游引物含有蛋白酶3C位点,以便外源蛋白单体的获得。通过对培养时间,诱导时间,温度等条件的摸索和优化,su融合蛋白的表达量可达到100mg/L,并且基本上处于可溶状态。
本发明还摸索和优化了重组su蛋白的纯化条件,表达产物的超声裂解液经Ni2+ Chelating Sepharose亲和色谱层析,得到纯度较高的融合蛋白,融合蛋白经3C蛋白酶切割和进一步的G50凝胶柱层析,可得到纯度在95%以上的成熟重组海葵神经毒素蛋白。
本发明获得的重组海葵神经毒素是有生物活性的。
本发明获得的重组海葵神经毒素对大鼠离体心房具有强烈的促进收缩作用。对重组海葵神经毒素进行的活性实验,检测su重组蛋白对大鼠离体心房的作用,发现用药后的大鼠心脏心房收缩明显增强,最高可增强343.5%(见表1)。本发明利用基因工程的方法,找到了1个海葵毒素新基因,并采用融合表达系统生产出具有强心作用的重组海葵毒素,具有极高的应用前景及产业开发价值。
本发明的含有su海葵神经毒素成熟肽编码序列的表达质粒pETTRX-su的工程菌大肠杆菌BL21(DE3)(构建过程见图3)已经保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC,中国,武汉,珞珈山,武汉大学校内),保藏号为: M201037;保藏日为: 2001年10月26日
由该表达质粒载体经Kpn I/Not I双酶切,可得到191bp的片段,即为侧花海葵神经毒素su成熟肽编码序列(其中包含蛋白酶3C识别位点)(酶切结果见图4)
本发明的表达质粒载体的复制方法:参照Sambrook(Sambrook,et al.1989,Molecular cloing.Cold Spring Harbor LabroratoryPress.USA)方法,按CaCl2法在E.Coli.DH5α或BL21(DE3)菌株中转化质粒,用含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基转化细菌,碱法提取质粒。
附图说明
图1海葵神经毒素总RNA电泳结果。
图2海葵神经毒素su基因的RT-PCR电泳结果。1:PCR阴性对照;2:PCR目的条带;3:100bp DNA marker。
图3为含基因su的重组质粒pPETTRX-su表达质粒构建图。
图4含基因su的pPETTRX-su表达质粒酶切鉴定图。1:pPETTRXKpn I/Not I双切;2:100bp DNA marker;3:pPETTRX-su Kpn I/NotI双切。
图5重组su蛋白诱导表达、亲和层析、酶切及分子筛层析电泳图。
1.protein marker(华美)
2.BL21-pPRTTRX-su总蛋白(未诱导)
3.BL21-pPRTTRX-su总蛋白(IPTG诱导)
4.超声上清
5.超声上清亲和层析穿流峰
6.超声上清亲和层析洗脱峰
7.经过亲和层析得到的TRX-su融合蛋白
8.TRX-su融合蛋白经Prescission protease切割
9.纯化的重组su
10.wide range protein marker(sigma)
图6重组su蛋白亲和层析图谱。B:B液洗脱;C:C液洗脱;D:D液洗脱;E:E液洗脱。
图7重组su蛋白分子筛层析图谱。A:第1峰;B:第2峰;C:第3峰。
实施例一 侧花海葵触手总RNA的提取和RT-PCR扩增
总RNA的提取和cDNA合成:分离一只侧花海葵触手,采用异硫氰酸胍法提取触手总RNA,酚/氯仿抽提去除蛋白质.获得100μg毒腺总RNA,其A260/A280=2.03,经1%甲醛变性胶电泳检测可见清晰的18s和28s两条带,比值>1,以及数条特异RNA条带(见图1),表明总RNA完整性良好。取5μg RNA用Oligo-dT进行反转录以合成cDNA第一链,得到20μl cDNA第一链产物。
引物设计和RT-PCR扩增依:据Ap-B的两端氨基酸序列,用oligo引物设计软件辅助分析,设计出两条简并引物。Ap-B两端氨基酸序列:(N端)GVPCLCD-----------GWCCKK(C端)正义链(A1):5’GG(A/C/T/G)GT(A/C/T/G)CC(A/C/T/G)TG(T/C)(T/C)T
        (A/C/T/G)TG(T/C)GA 3’反义链(A2):5’(T/C)TT(T/C)TT(A/G)CA(A/G)CA CCA(A/C/T/G)CC 3’
每50μl PCR反应体积加入1μl cDNA单链作为模板,PCR扩增,电泳检测,发现在150bp附近出现预期的特异性扩增带(见图2),回收此带。实施例二 重组海葵神经毒素基因序列的测定和分析
将回收的电泳产物连接至T载体,转化DH5α大肠杆菌,挑选重组克隆测序。一共测定了17个克隆,Blast同源分析表明,其中有8个是神经毒素基因序列,这8个毒素基因长度都是141bp,编码1个长度为47个氨基酸的毒素蛋白,这个毒素蛋白编号为海葵毒素-su,它和已报导的海葵神经毒素蛋白的氨基酸序列不完全相同,是1个新的毒素蛋白。
目前,已报导的海葵神经毒素有20多种,氨基酸数目介于46-49(另外还有几个毒素的氨基酸残基介于27-31,称短链神经毒素),其中12个氨基酸保守。根据它们的氨基酸序列又可分为两个亚类,以Ap-A、Ap-B为代表,属第一亚类;以Sh I、Rp I为代表,属第二亚类。两个亚类之间,氨基酸序列的同源性为30%左右,而属同一个亚类的毒素蛋白,氨基酸序列之间的同源性超过60%,我们所发现的这个毒素蛋白属于第一亚类。用Clustalw分析软件,对这个毒素蛋白和Ap-A类的几个毒素蛋白进行多序列比较,结果如下:
Ap-A         GVSCLCDSDGPSVRGNTLSGTLWLYPSGCPSGWHNCKAHGPTIGWCCKQ
Ap-B         GVPCLCDSDGPRPRGNTLSGILWFYPSGCPSGWHNCKAHGPNIGWCCKK
海葵毒素-su  GVACLCDSDGPSVRGNTLSGTLWLA--GCPSGWHNCKAHGPTIGWCCKQ
Ap-C         GVPCLCDSDGPSVRGNTLSGILWLA--GCPSGWHNCKAHGPTIGWCCKQ
AsV          GVPCLCDSDGPSVRGNTLSGILWLA--GCPSGWHNCKKHKPTIGWCCK-
             ** ********  :****** :*.   **********: :*.******“*”表示相同;“:”表示差异较小;“.”表示差异明显;空格表示完全不同
从上图可以看出,海葵毒素-su与Ap-C非常相似,它们之间只是第3位和21位两个氨基酸的差异。与Ap-C的Blast分析结果表明,海葵毒素-su和Ap-C的同源性分别是97%。另外,它们和As V的序列也很接近,Blast分析结果显示,海葵毒素-su和As V的同源性分别是91%。
在PCR扩增反应中,用普通的Taq酶会出现约10-4的错配,由于目的片段较小,PCR的循环数不超过30个,降低了错误参入的概率,从实验结果来看,这个序列在多个克隆中出现了,说明PCR的结果有较高的可信度。实施例三 重组海葵神经毒素表达质粒的构建
依据su基因的两端序列合成一对引物,上游引物含Kpn I和Prescission Protease切割位点,下游引物含BamH I切割位点。上游引物(B1):5’CGG  GGT ACC  CTG GAA GTT CTG TTC CAG GGG CCC GGG GTT
                     Kpn I       Precision  Protease  site
          CCG TGT TTG TGT GAC3’下游引物(B2):5’CGC  GGA TCC TTA TTA CTT CTT GCA GCA CCA GCC AAT G3’
                 BamH I
以含su基因的pGEM-T Easy质粒为模板,B1、B2为引物PCR扩增,得到特异扩增的单一条带,产物大小在200bp左右。PCR扩增产物先以Kpn I/BamH I的组合克隆到BSK质粒上构建成BSK-su,然后以Kpn I/Not I的组合克隆到原核融合表达载体pPETTRX上。克隆载体和表达载体分别用Kpn I/BamH I和Kpn I/Not I进行双酶切鉴定(酶切结果见图8)。克隆载体和表达载体中的外源基因经测序鉴定正确。所设计的上游引物中含Pre-scission蛋白酶切割位点,以便切除融合伴侣TRX。实施例四  重组海葵神经毒素融合蛋白的表达
将pETTRX-su转化大肠杆菌BL21(DE3)。基因工程菌超声裂解上清液经SDS-PAGE电泳分析表明,菌体经诱导后有明显的特异表达产物带,分子量与用软件PROTEIN ANALYSIS预测的理论值18.5kD相符(图5)。
经过对培养时间,诱导浓度,温度等条件的摸索:菌体扩大培养不同时间后诱导表达比较),基因工程菌的培养条件为:接单菌落于50ml氨卞抗性LB培养基中,37℃,250rpm培养过夜,取过夜培养物20ml接种于2L的氨卞抗性LB培养基中,37℃,250rpm培养至OD600=0.6(扩大培养约2h),加入100mM IPTG和20%葡萄糖至终浓度分别为1mM和0.2%,25℃,250rpm诱导培养10h后离心收获菌体。经SDS-PAGE电泳分析分析表明,在此条件下海葵毒素-su融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的20%以上,基本上处于可溶状态(见10)。实施例五  重组海葵神经毒素融合蛋白的纯化及成熟蛋白的获得
将收获的总菌体用TE(pH8.0)洗涤,再用Tis(50mM,pH7.0)悬浮,超声处理后,裂解上清液经Ni2+ Chelating Sepharose亲和色谱层析一步纯化,经SDS-PAGE分析和薄层扫描分析表明融合蛋白的纯度达到80%(图5)。以1L基因工程菌培养物为材料,最终获得约100mg纯化的融合蛋白。
为了提高重组蛋白的得率和浓度,简化实验步骤,缩短对重组蛋白的处理时间,在用Ni2+亲和色谱层析纯化重组蛋白时,我们采用一步法进行纯化。根据载体质粒pETTRX所表达的外源蛋白与Ni2+亲和柱的结合能力较强的特点,我们选用了较简化的洗脱条件:50mMTris,500mMNaCl,pH7.0(A液);50mMTris,500mMNaCl,pH6.0(B液);50mM咪唑,50mMTris,500mMNaCl,pH6.0(C液);100mM咪唑,50mMTris,500mMNaCl,pH6.0(D液);150mM咪唑,50mMTris,500mMNaCl,pH6.0(E液)。重组海葵毒素-su蛋白在D液和E液被洗脱下来(图6)。从SDS-PAGE结果来判断分离效果最好的部分。
利用Folin-酚法测定重组PLA2的蛋白浓度,收获浓度在0.7mg/ml以上的洗脱液,加入Precision Protease进行切割,用SDS-PAGE检测酶切结果,可明显看到5kD附近代表成熟su的谱带(图5)。将反应液用Ni2+ Chelating Sepharose亲和色谱层析柱纯化(条件同前),收获含成熟海葵毒素-su的穿流液,并用Sephadex G-50进一步纯化(洗脱液为PBS),便得纯度在95%以上的成熟重组海葵海葵毒素-su(图7)。实验一  急性毒性实验(LD50)
体重20±2g的NIH小鼠60只,随机分为6组,每组10只,雌雄各半,其中5组为给药组,1组为对照组。腹腔注射给药,1小时内,小鼠出现发呆、抽搐等中毒症状,继续观察7天,用Bliss法计算小鼠的半致死量。结果显示,重组su蛋白对小鼠的半数致死量(LD50)为1.4mg/kg。实验二  重组su蛋白对大鼠离体心房的强心实验
重组su的生物活性参照Shibata(Shibata S,Norton T R.J PharmSci,1976,65(9):1368)的方法,采用大鼠离体心房进行检测。结果发现,重组su具有增强大鼠心肌收缩的能力。对心肌收缩力增强的程度用以下方法计算:心房收缩增加百分率=(给药后的心房收缩幅度-给药前的心房收缩幅度)/给药前的心房收缩幅度×100%,重组su能明显增强大鼠离体心房的收缩能力,与毒K(毒毛旋花子甙K)比较,其作用更强(数据见表1)。表1 重组su对大鼠离体心房增强收缩结果(n=7~9 x±s)
剂量分组        给药后对离体心房收缩增加百分率(%)
(g/ml)      1min           3min             5min毒K(2)          -4.00±8.00    80±112.5        95.33±53.11高剂量su(20)    203.92±101.2  318.03±131.25   310.7±147.73中剂量su(10)    31.84±44.34   275.53±84.63    343.5±160.53低剂量su(5)     18.89±24.24   216.67±84.16    272.22±86.16
               序列表1.一般信息
(i)申请人:北京博奥环宇生物技术有限公司
(ii)发明名称:海葵神经毒素基因的克隆、表达以及生物活性
(iii)序列数目:2序列号:1
序列长度:415
序列类型:碱基对
链    数:双链
拓 扑 学:直链状
序列种类:DNA
起源生物:侧花海葵(Anthopleura sp)株名:大肠菌BL21(DE3)序列特征:
表示特征的记号:有正确的读码框
决定位置:起始、终止密码子
决定特征的方法:实验
存在位置:ATG,117位;TAA,261位
TTCTTCCAGG TCTCCCATTT TAATATAGCA AGGCCTAGGG CGTATCTAGG  50
ATTTTGAGTA GGGGGAGCAC AAATTAAAGA AGATGCACCT GTGAGGGGGG  100
TCACAGAATC TTAAAG  ATG GGA GTA GCA TGC CTG TGC GAC AGT  143
                   Met Gly Val Ala Cys Leu Cyc Asp Ser
GAC GGC CCG AGC GTG AGA GGC AAT ACC TTG TCA GGG ACA CTC 185
Asp Gly Pro Ser Val Arg Gly Asn Thr Leu Set Gly Thr Leu
TGG CTG GCC GGC TGC CCA TCC GGT TGG CAT AAC TGC AAG GCC 227
Trp Leu Ala Gly Cys Pro Ser Gly Trp His Asn Cys Lys Ala
CAT GGA CCG ACC ATT GGC TGG TGC TGT AAG CAG TAA  GATCTC 270
His Gly Pro Thr Ile Gly Trp Cyc Cyc Lys Gln stop
CTGCCCATCA GAGCCAAGAC TAGCATCTTA GTCAAGTCAT TCATTAGAAT  320
AATGTAGTAA AAGCATGCAT TCAATAAAAA CTAATAATTA GCATTAAAAT  370
CAATGATTAA ATT GTAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAA       415
                                 adoptor

Claims (11)

1.一种如序列表中序列号码1所示核苷酸序列的DNA。
2.一种如序列表中序列号码1所示氨基酸序列的蛋白质。
3.一种重组载体,该重组载体包括如权利要求1所述的核苷酸序列。
4.一种含有如权利要求3所述的重组载体的原核细菌。
5.如权利要求4所述的原核细菌,其特征在于所述的原核细菌是大肠杆菌。
6.如权利要求3所述的重组载体,其特征在于所述载体是以硫氧环蛋白为融合伴体,中间插入6个His的亲和标记位点及蛋白酶3C识别位点的高效表达载体pETTRX-su。
7.如权利要求3所述载体,其特征在于该载体使所述DNA在大肠杆菌中以胞内可溶的形式表达,其表达量为100~120mg/L。
8.如权利要求3所述重组载体,其特征在于由该重组载体的表达产物超音裂解液经过Ni-Chelating亲和柱层析,蛋白酶3C切割和凝胶过滤可得到纯度在95%以上的性质稳定的成熟蛋白,得率为10~15mg/L。
9.一种用作引物的DNA片段,其由权利要求1所述核苷酸序列的一部分序列组成。
10.一种含有如权利要求2所述蛋白的预防或治疗心血管系统疾病的药物制剂。
11.如权利要求2所述的蛋白在制备预防和治疗心血管系统疾病的药物中的应用。
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