CN1693463A - 一种真菌半乳糖凝集素蛋白活性的多肽、其编码序列及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种真菌半乳糖凝集素蛋白活性的多肽、其编码序列及制备方法和应用。该分离蛋白质的编码序列具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列至少70％同源性序列，和一种分离的多肽，其具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少80％同源性序列，由该核苷酸序列编码的多肽及所述多肽的制备方法，和这些多核苷酸和多肽在医药和农业中的应用。本发明中涉及的蛋白质具有抗肿瘤活性，抗植物病毒活性。在开发抗肿瘤药物，植物保护等方面有很大的应用价值。

Description

一种真菌半乳糖凝集素蛋白活性的多肽、其编码序列 及制备方法和应用

                        技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，本发明涉及真菌杨树菇(Agrocybeaegerita)半乳糖凝集素(杨树菇半乳糖凝集素)基因序列。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽及其制备方法，同时还涉及多肽在医药、抗肿瘤、农业、抗植物病毒中的应用。

                        背景技术

杨树菇(Agrocybe aegerita)隶属于真菌门、担子菌纲、伞菌目、粪锈伞科、田蘑属。又名柱状田头菇、杨树菇、茶薪菇、柳松茸等。富含人体必需的八种氨基酸，其中赖氨酸高达1.75％，其营养价值超过香菇、金针菇等其他食用菌，同时又具有独特的药用价值，民间常用于抗癌、降压，治疗胃冷、肾炎、水肿等有独特疗效，有″中华神菇″之美誉，但其中的药理成分并不明确，本发明中涉及的杨树菇半乳糖凝集素是我们首次发现的重要药理成分。

半乳糖凝集素(Galectin)是一类对半乳糖苷(galactoside)特异结合的蛋白质家族，从真菌到哺乳动物等各种生物体内都发现了它们的存在。Galectin具有两条特征：1)与半乳糖苷特异结合；2)有保守的糖结合区域(carbohydraterecongnition domain，CRD)。

目前在哺乳动物中已发现了14种Galectin，并按照其进入Genome Data Base的先后顺序进行统一编号命名为Galectin 1-14(以下简称Gal 1-14)。已有多篇文献就Gal的结构，功能和表达调控等问题进行了综述。它们广泛分布于动物的多种组织和器官中，包括正常的组织(胸腺，淋巴结，前列腺，脾，发育中的脑，肠，肺，胎盘，内皮细胞，皮肤，心脏，嗅觉神经细胞，肝脏，肾脏，骨骼肌，平滑肌，睾丸等)和病理组织(甲状腺癌，直肠癌，卵巢癌，黑色素瘤，纤维肉瘤，淋巴瘤等)中都有表达。它们在真核生物机体发育，分化，维持免疫稳态，细胞-细胞黏附，细胞-介质互作，生长调节，凋亡，RNA剪切和肿瘤转移等多种生理过程中发挥重要作用。

其他物种中的galectin的研究相对较少。从鸟类，两栖类、鱼、蠕虫和海绵等其他物种中也相继分离了几种Galectins，从真菌中仅分离了3种galectin，即CCL-I，CCL-II以及ACG。CCL-I，CCL-II利用半乳糖亲和层析柱分离蛋白，克隆基因分析分离得到的蛋白属于galectin家族。而ACG被发现具有凝血功能，经氨基酸全序列测定，分析是galectin家族成员。3种真菌galectin在其他药理的、生理的功能上都没有任何研究。

                        发明内容

本发明的一个目的在于提供一种多肽核苷酸序列，该序列能编码上述杨树菇半乳糖凝集素多肽序列。该序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸1-474位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严谨条件下与SEQ IDNO.1中从核苷酸1-474位的核苷酸序列杂交。70％的同源基因可以通过突变试剂盒进行突变，或者通过插入，缺失等基因操作获得。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列，最佳地，该序列具有SEQ ID NO.1中从核苷酸1-474位的核苷酸序列。该序列是首次克隆，根据该序列可以设计引物，通过PCR或RT-PCR的方法大量扩增该核苷酸序列，连接于表达载体，生产杨树菇半乳糖凝集素。

本发明的另一个目的在于提供一种真菌半乳糖凝集素蛋白活性的多肽，具有多种活性：抗肿瘤活性，抗植物病毒活性，在医药、农业上具有广泛的应用价值。该半乳糖凝集素是报道的第一个具有抗肿瘤、抗病毒活性的半乳糖凝集素。

本发明还涉及一种杨树菇半乳糖凝集素多肽的制备方法，该方法是构建原核表达载体，利用亲和层析方法纯化杨树菇半乳糖凝集素，该方法简便，成本低廉。

本发明还涉及一种真菌半乳糖凝集素蛋白活性的多肽在作为制备或预防肿瘤疾病药中的应用。它可以抑制多种肿瘤细胞(直肠癌，宫颈癌，胃癌，白血病细胞)的生长，杀死肿瘤细胞，对肿瘤细胞的抑制作用优于临床应用的化疗药物阿霉素效果，该半乳糖凝集素有开发成抗肿瘤药物的潜力。

本发明还涉及一种真菌半乳糖凝集素蛋白活性的多肽在抗植物病毒(烟草花叶病，TMV)中的应用。该半乳糖凝集素对植物病毒(烟草花叶病，TMV)有很好的抗性，可以作为抗烟草花叶病毒的农药，该半乳糖凝集素的基因可以作为一种抗病毒的基因资源，用于选育抗病毒的植物品种。

为了实现上述任务，本发明采用以下技术措施：

本发明的一个目的是提供一种新的核苷酸序列，该序列编码一种新的杨树菇半乳糖凝集素。在本发明中，真菌杨树菇半乳糖凝集素的cDNA核苷酸序列是以杨树菇总RNA或mRNA为模板，通过RT-PCR方法得到的。具体方法如下：杨树菇菌种为福建省三明研究所提供的栽培种3号，取杨树菇的新鲜菌丝或子实体，提取总RNA或mRNA为模板(市售的提取RNA和mRNA试剂盒，如Clontech，Promega，Stratagene等公司产品，按照说明书操作)，合成逆转录引物5’gac cac gcg tat cga tgt cga ctl6(a/c/g)3’，进行逆转录得到cDNA第一链。根据杨树菇半乳糖凝集素测定的N端序列，设计简并引物5’ccc aag ctt ca(a/g)ggcgtc aac at(t/c)ta(t/c)aa(t/c)at3’为正向引物，以5’gac cac gcg tat cga tgt cga c3’为反向引物，以上述cDNA第一链为模板，进行PCR，获得635bp的目的片段，将此片段克隆测序，得到SEQ ID NO.1的全长cDNA序列。

本发明所要求保护的与上述cDNA序列至少有70％的同源性的基因可以通插入，缺失、突变等基因操作获得。如可以在设计PCR引物时，在SEQ ID NO.1提供的序列基础上，可以任意进行插入，缺失和突变的引物合成，用该引物进行PCR，则可以得到至少有70％同源性的基因。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列，最佳地，该序列具有SEQ ID NO.1中1-474位的核苷酸序列。根据SEQ ID NO.11-474位的核苷酸序列，设计引物，引物通常为包含1-20位核苷酸序列，和与457-474位互补的核苷酸序列，通过PCR或RT-PCR的方法大量扩增该核苷酸序列。

本发明要求保护的杨树菇半乳糖凝集素活性的多肽可用如下方法生产。该方法包括：以下具体的操作按照常规实验条件，如《分子克隆实验手册》(第三版)【J.萨姆布鲁克等编著，2003，北京：科学出版社】中所述的条件进行。

1)提取杨树菇的总RNA或mRNA为模板，通过RT-PCR得到cDNA第一链，

以此链为PCR模板，扩增得到序列为SEQ ID NO.1所示的全长序列；

2)获得与cDNA至少有70％同源性的基因序列：在SEQ ID NO.1的1-474序列基础上，根据需要，以其中的任意一段序列(一般为20-40bp，也可以长达100bp)为PCR引物，有目的的在引物合成时引入碱基的插入，缺失和突变，用该引物与SEQ ID NO.1中设计酶切位点的两端序列(454-474序列，或454-474互补序列，或1-20序列，或1-20互补序列)为一对引物，进行PCR扩增可以在原序列中有目的的引入碱基的插入，缺失和突变，得到与cDNA至少有70％同源性的基因序列。

3)酶切步骤2得到的序列，酶切原核表达载体pET28(市售，Novagen公司，也可以用市售的其他的各种表达载体)，连接酶切后的cDNA序列和表达载体pET28b，构建重组表达载体pET28-杨树菇半乳糖凝集素；

4)将步骤3中得到的重组表达载体转化大肠杆菌宿主细胞BL21(市售，Novagen公司，可以根据所用的表达载体选择匹配的宿主细胞)，形成表达杨树菇半乳糖凝集素蛋白的重组细胞；

5)将步骤4中得到的重组细胞在37℃培养过夜获得饱和培养物；将50μL饱和培养物接种于5mL含氨苄青霉素100μg/mL的培养基中，于37℃培养2小时。取1mL培养物转移至微量离心管中。加异丙基硫代半乳糖苷IPTG至终浓度为1m mol/L，对培养物进行诱导，诱导10小时。

6)利用Ni²⁺亲和层析法纯化蛋白，分离，纯化步骤5中在重组细胞中诱导表达的多肽。

按照《凝集素》【孙册等编著，1986，北京：科学出版社】中提供的血凝集活性和糖抑制活性实验，可以检验本发明要求保护的多肽的活性。纯度检测可以用SDS-PAGE方法检测。

本发明要求保护的杨树菇半乳糖凝集素活性的多肽可以抑制多种肿瘤细胞(直肠癌，宫颈癌，胃癌，白血病细胞)的生长，杀死肿瘤细胞。基本纯的该半乳糖凝集素多肽或其变异形式可以开发成抗肿瘤药物。该半乳糖凝集素对植物病毒(烟草花叶病，TMV)有很好的抗性，基本纯的该半乳糖凝集素多肽或其变异形式可以作为抗烟草花叶病毒的农药，该半乳糖凝集素的编码序列可以作为一种抗病毒的基因资源，用于选育抗病毒的植物品种。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与细胞中伴随的蛋白质分开。

在本发明中，术语“杨树菇半乳糖凝集素蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有杨树菇半乳糖凝集素蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中1-474位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的编码框1-474位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1中1-474位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。该术语还包括能在中度严谨条件下，更佳地在高度严谨条件下能与SEQ ID NO.1中核苷酸1-474位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该术语还包括与SEQ IDNO.1中从核苷酸1-474位核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有杨树菇半乳糖凝集素功能蛋白的SEQ ID NO.2中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常以120个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。如实施例2中，构建的表达载体转录的核苷酸序列在SEQ ID NO.1核苷酸5’端插入120个核苷酸，表达产物保持原蛋白的抗肿瘤活性。

在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC方法测量多肽的纯度。

在本发明中，术语“杨树菇半乳糖凝集素蛋白多肽”指具有杨树菇半乳糖凝集素蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽，该术语还包括具有与杨树菇半乳糖凝集素相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为40个以内，较佳地为20个以内，更佳地为10个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。如实施例2中，构建的表达载体表达的重组蛋白在SEQ ID NO.2序列的N端增加了40个氨基酸，表达产物保持原蛋白的抗肿瘤活性。该术语还包括杨树菇半乳糖凝集素蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与杨树菇半乳糖凝集素DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗杨树菇半乳糖凝集素多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含杨树菇半乳糖凝集素多肽的可溶性片段。通常，该片段具有杨树菇半乳糖凝集素多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

本发明还提供杨树菇半乳糖凝集素蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然杨树菇半乳糖凝集素多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可以通过定点诱变法或其他分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化，如那些在多肽的合成和加工中和进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

本发明还包括杨树菇半乳糖凝集素多肽编码序列的反义序列。这种反义序列可以用于抑制细胞内杨树菇半乳糖凝集素的表达。

本发明还包括一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有杨树菇半乳糖凝集素多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码杨树菇半乳糖凝集素的核酸分子。

本发明还包括检测杨树菇半乳糖凝集素核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合，较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于杨树菇半乳糖凝集素多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间，引物长度一般为20-50个核苷酸。

另一方面，本发明还包括对杨树菇半乳糖凝集素或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于杨树菇半乳糖凝集素基因产物或片段。较佳地，指那些能与杨树菇半乳糖凝集素基因产物或片段结合但不识别和结合与其他非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制杨树菇半乳糖凝集素蛋白的分子，也包括那些并不影响杨树菇半乳糖凝集素蛋白的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的杨树菇半乳糖凝集素基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传过程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的杨树菇半乳糖凝集素基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达杨树菇半乳糖凝集素或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的抗体包括能阻断杨树菇半乳糖凝集素功能的抗体以及不影响杨树菇半乳糖凝集素功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用杨树菇半乳糖凝集素基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与杨树菇半乳糖凝集素基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(如E.coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

本发明的优点和效果：

本发明中提供的杨树菇半乳糖凝集素核苷酸序列和蛋白质序列是一种新的半乳糖凝集素的基因和蛋白质序列，未见报道。在已报道的半乳糖凝集素中，核苷酸序列与杨树菇半乳糖凝集素基因同源性最高的是CCL-I，CCL-II(Coprinuscinereus lectin)，同源性仅为30％，与杨树菇半乳糖凝集素蛋白质序列同源性最高的是ACG(Agrocybe cylindracea galectin)，同源性为87％，但ACG没有得到核苷酸序列。到目前为止，已发现的半乳糖凝集素都没有报道抗肿瘤、抗病毒活性。因此，本发明的优点是“新”——本发明是一种新的，第一个报道具有抗肿瘤活性、抗植物病毒活性的半乳糖凝集素，可以应用在医药领域和农业领域。

本发明中涉及的蛋白质具有很强的抗肿瘤活性，和很强的抗植物病毒活性。在相同的浓度下，对SGC-7901和HeLa细胞的抑制效果优于临床使用的化疗药物阿霉素；对SW480，MGC80-3，BGC-823，S-180等多种肿瘤细胞与化疗药物阿霉素有相似的抑制率。因此，该蛋白及其基因在开发抗肿瘤药物方面将有很大的应用价值。

该蛋白对烟草花叶病毒也有很强的抗性，浓度达到25μg/mL时，对烟草花叶病毒的抑制率为47.3％。该蛋白可以作为抗烟草花叶病毒农药应用；该蛋白的基因可以作为一种抗植物病毒的基因资源，在抗烟草花叶病毒植物育种中有很大的应用价值。

                        附图说明

图1为一种pET28-杨树菇半乳糖凝集素的构建示意图。图中aal为杨树菇半乳糖凝集素的基因，pGEM-aal为aal的保存质粒，以EcoR I单酶切该质粒，使aal基因片段释放；同时以EcoR I单酶切表达载体pET28b，使其由环状成为线状，并以小牛碱性磷酸酶(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase，CIAP)处理，使载体去磷酸化。再由连接酶连接aal基因片段和线状表达载体pET28b，使aal插入pET28b的多克隆位点，完成pET28-杨树菇半乳糖凝集素表达载体的构建。

                       具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验条件，《分子克隆实验手册》(第三版)【J.萨姆布鲁克等编著，2003，北京：科学出版社】中所述的条件进行，或按照制造厂商所建议的条件。

编码杨树菇半乳糖凝集素核苷酸序列的制备方法，杨树菇半乳糖凝集素多肽制备方法，应用实施例，抗体制备实施例，抗肿瘤实施例，抗植物病毒实施例。

实施例1

杨树菇半乳糖凝集素的cDNA克隆和测序：本实施例中得到一新的cDNA序列，是前人未报道过的。

1.引物扩增

以杨树菇总RNA为模板，用寡核苷酸A：5’gac cac gcg tat cga tgt cga ctl6(a/c/g)3’为逆转录引物进行逆转录，得到cDNA的第一链，以寡核苷酸B(根据N端氨基酸设计的简并引物)：5’ccc aag ctt ca(a/g)ggc gtc aac at(t/c)ta(t/c)aa(t/c)at3’为正向引物，寡核苷酸C：5’gac cac gcg tat cga tgt cga c3’为反向引物，进行PCR，PCR条件为95℃起始10min，进入三步循环(95℃ 1min，53℃ 1min，72℃ 2min共30个循环)，最后72℃延伸10min。20μL反应体系包含：1μg cDNA，0.2mMdNTP，20pM正向引物和反向引物，2μL 10×buffer，1μL Taq酶和1.5mM MgCl₂。PCR产物为一635bp目的片段。

2.克隆测序

根据该pGEMT载体的操作手册，将该扩增片段克隆到pGEM载体上，构建质粒pGEM-杨树菇半乳糖凝集素，进行测序，共635bp，详细序列见SEQ ID NO.1，其中1-474为编码氨基酸序列的开放阅读框序列。

根据得到的cDNA序列翻译出杨树菇半乳糖凝集素的氨基酸序列，共158个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO.2。

实施例2

杨树菇半乳糖凝集素在大肠杆菌中的表达、纯化：本实施例中可以得到大量表达、纯化的蛋白质样品。

首先EcoRI单酶切pGEM-杨树菇半乳糖凝集素载体，释放杨树菇半乳糖凝集素片段，同时用EcoRI消化pET28b质粒，用CIAP酶处理线性化了的质粒pET28b半个小时，回收杨树菇半乳糖凝集素片段和目的质粒，根据回收的量进行连接反应，构建原核表达载体pET28b-杨树菇半乳糖凝集素，如图1所示。

按照前述的原核表达方法，根据不同时间诱导表达重组杨树菇半乳糖凝集素的结果，选择优化时间，大量表达。利用Ni柱纯化重组杨树菇半乳糖凝集素，表达量约为7mg/L。

实施例3

杨树菇半乳糖凝集素抗体的制备：该实施例可以获得杨树菇半乳糖凝集素的多克隆抗体，用于检测杨树菇半乳糖凝集素。

将天然蛋白和实施例2中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组蛋白用层析法进行分离后备用，也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100ug/0.2mL乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化同样抗原，对小鼠以50-100ug/0.2mL的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行3次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外结合杨树菇半乳糖凝集素基因翻译产物的能力加以评估(Western方法)。

实施例4

杨树菇半乳糖凝集素对肿瘤细胞和荷瘤小鼠肿瘤组织的抑制作用：本实施例中杨树菇半乳糖凝集素抑制检测的7种肿瘤细胞株，证实杨树菇半乳糖凝集素具有广普抗肿瘤作用；抑制荷S-180肉瘤小鼠的肿瘤组织生长，延长荷瘤小鼠的生存时间，证实杨树菇半乳糖凝集素对荷瘤动物的肿瘤组织有抑制生长作用。

1.杨树菇半乳糖凝集素在体外对肿瘤细胞株的抑制作用

本实施例检测了杨树菇半乳糖凝集素对7种肿瘤细胞株(SW480，HeLa，SGC-7901，MGC80-3，BGC-823，HL-60 and S-180)生长的抑制活性。所有的肿瘤细胞株在RPMI1640培养基(其中包含10％的胎牛血清，100mg/mL链霉素和100U/mL的青霉素)中培养。将不同浓度的杨树菇半乳糖凝集素(以培养基配制成5，10，50，100ug/mL)加入肿瘤细胞中，温育24小时后，用MTT方法检测杨树菇半乳糖凝集素对肿瘤细胞生长的抑制作用。检测结果如表1中所示。杨树菇半乳糖凝集素对所检测的肿瘤细胞株有很好的抑制作用，对SGC-7901和HeLa细胞的抑制效果优于化疗药物阿霉素，在SW480，MGC80-3，BGC-823，S-180等多种肿瘤细胞中表现出与化疗药物阿霉素在相同的浓度下具有相似的抑制率。

    表1 杨树菇半乳糖凝集素在体外对肿瘤细胞的抑制作用

Cell line	[AAL](μg/ml)	Inhibition  ratio(％)
							5	10	50	100	Adriamycin(100μg/ml)
		SW480SGC-7901HeLaMGC80-3BGC-823HL-60S-180		44.7569.0634.1435.0035.1010.6019.01	51.1071.2150.0048.4048.1022.1022.17	68.7872.2364.5261.8060.8037.6446.33						82.6073.9867.7467.7067.4042.7968.50	80.6665.8840.8664.4064.0069.1269.44

2.杨树菇半乳糖凝集素对荷瘤小鼠肿瘤组织的生长抑制作用

在本实施例中，采用BALB/c小鼠(7周，20克)，在腋窝皮下接种0.1mL小鼠骨肉瘤细胞S-180(1.18×10⁸cells/mL)，接种3天后，瘤内注射杨树菇半乳糖凝集素(以生理盐水溶解1.67mg/mL，注射0.06mL)0.1mg/只小鼠，对照注射生理盐水。此后，隔天注射。在接种肿瘤20天后处死小鼠。切下肿瘤称重，计算抑制率。抑制率(％)＝[(C-T)/C]×100％(C是对照组平均肿瘤重量，T为治疗组肿瘤的平均重量)。结果如表2所示。杨树菇半乳糖凝集素对处理的小鼠的肿瘤的抑制率可达36.36％，并且延长了荷瘤小鼠的寿命。

   表2 杨树菇半乳糖凝集素对荷S-180瘤小鼠肿瘤的抑制作用

Treatment	Death ratio	Inhibition ratio
			0.06ml of 1.67mg/ml AAL0.06ml of 0.9％ NaCl(control)	10％50％	36.36％

实施例5

杨树菇半乳糖凝集素的抗植物病毒作用：本实施例中杨树菇半乳糖凝集素对烟草花叶病毒有很好的抑制作用，可以作为一种抗病毒农药被开发，其编码序列可作为抗植物病毒基因资源应用于抗植物病毒作物品种的选育。

用半叶法检测杨树菇半乳糖凝集素对植物病毒(TMV)的抑制活性：0.01M PBS(PH7.2)为反应缓冲液，烟草花叶病毒普通株10μg/mL与杨树菇半乳糖凝集素(25，50，100，200μg/mL)等体积混合，以0.01M PBS(PH7.2)为对照分别接种于心叶烟的左右半叶，48小时后计数左右半叶片的枯斑数目，计算抑制比率：抑制率％＝(1-杨树菇半乳糖凝集素处理的枯斑数/对照枯斑数)×100％，实验结果如表3所示。杨树菇半乳糖凝集素对TMV有很好的抑制作用。

表3 杨树菇半乳糖凝集素在心叶烟(Nicotiana glutinosa)上对TMV的抑制作用

Concentration of AAVP(μg·ml-1)	Inhibition ratio(％)
		2550100200	47.362.578.784.3

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明分上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110>武汉大学

<120>一种真菌半乳糖凝集素蛋白活性的多肽、其编码序列及制备方法和应用

<130>一种真菌半乳糖凝集素蛋白活性的多肽、其编码序列及制备方法和应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>635

<212>DNA

<213>杨树菇

<400>1

cagggcgtca acatctataa catcagtgcc gggaccagcg tcgacctcgc tgctcctgtt   60

accactggcg acattgtcac tttcttctcc tcagcgctca acctcaacgc gggcgcaggg  120

aacccaaaca acaccacgct gaacctattc gccgaaaatg gcgcatacct cctccacatc  180

gccttccgcc tccaagagaa tgtaattatc ttcaacagtc gccagcccga tgggccgtgg  240

ctcgtcgagc agcgtgtatc tgacgtcgca aatcaattcg ccgggattga tgggaaggcc  300

atggtgacgg tgttcgacca cggcgacaag tatcaggtag tgataaatga gaagacggtg  360

attcagtaca cgaagcaaat ctcgggtctg acattgagcc tctcctataa tgcaacggaa  420

gagacttcca tattctccac cgtggtcgaa gcggtgacat acacgggttt ggcgtagatt  480

ccgcgacatc ggaaggctag ggactgccag gccaagctag tagtaatcaa agaaaatgtc  540

gttcattccc catcaggtca gaaacaaagt cgaatgtaca gtagtctttt cagcaatgca  600

gaagtgtgta gttatgtgct aaaaaaaaaa aaaaa                             635

<210>2

<211>158

<212>PRT

<213>杨树菇

<400>2

Gln Gly Val Asn Ile Tyr Asn Ile Ser Ala Gly Thr Ser Val Asp Leu

1               5                   10                  15

Ala Ala Pro Val Thr Thr Gly Asp Ile Val Thr Phe Phe Ser Ser Ala

            20                  25                  30

Leu Asn Leu Asn Ala Gly Ala Gly Asn Pro Asn Asn Thr Thr Leu Asn

        35                  40                  45

Leu Phe Ala Glu Asn Gly Ala Tyr Leu Leu His Ile Ala Phe Arg Leu

    50                  55                  60

Gln Glu Asn Val Ile Ile Phe Asn Ser Arg Gln Pro Asp Gly Pro Trp

65                  70                  75                  80

Leu Val Glu Gln Arg Val Ser Asp Val Ala Asn Gln Phe Ala Gly Ile

                85                  90                  95

Asp Gly Lys Ala Met Val Thr Val Phe Asp His Gly Asp Lys Tyr Gln

            100                 105                 110Val Val Ile Asn Glu Lys Thr Val Ile Gln Tyr Thr Lys Gln Ile Ser

       115                 120                 125Gly Leu Thr Leu Ser Leu Ser Tyr Asn Ala Thr Glu Glu Thr Ser Ile

   130                 135                 140Phe Ser Thr Val Val Glu Ala Val Thr Tyr Thr Gly Leu Ala

   145                 150                 155

Claims (9)

1、一种分离的编码真菌半乳糖凝集素蛋白的核苷酸序列，其具有与SEQ IDNO.1所示核苷酸序列至少70％同源性的序列。

2、一种分离的多肽，其具有与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少80％同源性的序列。

3、一种真菌半乳糖凝集素蛋白活性的多肽制备方法，它包括下列步骤：

A、提取杨树菇的总RNA或mRNA为模板，通过RT-PCR得到cDNA第一链，以此链为PCR模板，扩增得到序列为SEQ ID NO.1所示的全长序列；

B.在SEQ ID NO.1的1-474序列基础上，根据需要，以其中的任意一段序列为PCR引物，有目的的在引物合成时引入碱基的插入，缺失和突变，用该引物进行PCR扩增可以在原序列中有目的的引入碱基的插入，缺失和突变，得到与SEQ ID NO.1的1-474序列至少有70％同源性的基因序列；

C、酶切步骤B得到的序列和原核表达载体，构建重组表达载体；

D、将步骤C中得到的重组表达载体转化大肠杆菌宿主细胞，形成表达杨树菇半乳糖凝集素蛋白的重组细胞；

E、将步骤D中得到的重组细胞在37℃培养过夜获得饱和培养物，将50μL饱和培养物接种于5mL含氨苄青霉素100μg/mL的培养基中，于37℃培养2小时，取1mL培养物转移至微量离心管中，加异丙基硫代半乳糖苷IPTG至终浓度为1m mol/L，对培养物进行诱导，诱导10小时；

F、利用Ni²⁺亲和层析法纯化蛋白，分离，纯化步骤E中在重组细胞中表达的多肽。

4、一种真菌半乳糖凝集素蛋白活性的多肽在制备预防直肠癌药物中的应用。

5、一种真菌半乳糖凝集素蛋白活性的多肽在制备预防宫颈癌药物中的应用。

6、一种真菌半乳糖凝集素蛋白活性的多肽在制备预防胃癌药物中的应用。

7、一种真菌半乳糖凝集素蛋白活性的多肽在制备预防白血病药物中的应用。

8、一种真菌半乳糖凝集素蛋白活性的多肽在制备预防烟草花叶病毒药中的应用。

9、一种真菌半乳糖凝集素蛋白活性多肽的编码序列在抗烟草花叶病毒植物育种中的应用。

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