CN117924453A - 一种甘露糖特异性凝集素重组植物蛋白的制备方法及应用 - Google Patents
一种甘露糖特异性凝集素重组植物蛋白的制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种甘露糖特异性凝集素重组植物蛋白的制备方法及应用。该方法包括：(1)将含有编码甘露糖特异性凝集素重组植物蛋白的碱基序列与载体连接构建重组蛋白表达载体；(2)将表达载体转化至原核细胞并在合适的培养条件诱导重组蛋白的表达；(3)分离甘露糖特异性凝集素重组植物蛋白。本发明通过原核表达得到的甘露糖特异性凝集素重组植物蛋白能够提升海绵体组织中NO/cGMP的水平，恢复氧化损伤海绵体内皮细胞的活力，提高雄性勃起功能，进而提高雄性生殖功能。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地涉及一种甘露糖特异性凝集素重组植物蛋白的制备方法及应用。
背景技术
勃起功能障碍(erectile dysfunction，ED)是最常见的一种男性性功能障碍，是指阴茎持续不能达到或维持足够的勃起以完成满意性生活，病程3个月以上。ED主要分为精神心理性ED和器质性ED两种。ED的发生与多种危险因素有密切的相关性，包括发病率占人口10％以上的老龄化、糖尿病、肥胖、吸烟、高血压、心血管疾病、抑郁、脊髓损伤等。
目前医学界常用的治疗勃起功能障碍的药物有5-型磷酸二酯酶抑制剂和5-羟色胺再摄取抑制剂，在治疗的同时也会伴有一些副作用，5-型磷酸二酯酶抑制剂可能导致头晕头痛、腹泻、阴茎异常勃起等，5-羟色胺再摄取抑制剂属于具有抗焦虑的精神病类药物，它可以导致头晕头痛、心悸恶心、嗜睡、不射精、低血压等。
ED已成为常见慢性病，严重危害男性生殖健康，降低生活质量，影响家庭和谐。因此，目前亟需一种预防、改善或治疗勃起功能障碍的药物。
发明内容
为解决现有技术中的至少部分问题，本发明提供一种甘露糖特异性凝集素(Mannose specific lectin, MSL)重组蛋白及其制备方法和应用。具体地，本发明包括以下内容。
本发明的第一方面，提供一种甘露糖特异性凝集素重组植物蛋白或其活性片段的制备方法，其包括：
(1) 将含有编码甘露糖特异性凝集素重组植物蛋白的碱基序列与载体连接构建重组蛋白表达载体；
(2) 将所述表达载体转化至原核细胞并在合适的培养条件诱导重组蛋白的表达；
(3) 分离甘露糖特异性凝集素重组植物蛋白。
在某些实施方案中，根据本发明所述的甘露糖特异性凝集素重组植物蛋白或其活性片段的制备方法，其中，编码所述重组植物蛋白的核酸分子具有(I)或(II)所示的核苷酸序列：
(I) 与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少90％同源性，且具有相同功能的核苷酸序列；
(II) SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的替换和/或缺失和/或添加获得的且具有相同功能的核苷酸序列。
在某些实施方案中，根据本发明所述的甘露糖特异性凝集素重组植物蛋白或其活性片段的制备方法，其中，编码所述甘露糖特异性凝集素重组蛋白的核酸分子包括经密码子优化得到的编码序列。
在某些实施方案中，根据本发明所述的甘露糖特异性凝集素重组植物蛋白或其活性片段的制备方法，其中，编码所述重组植物蛋白的核酸分子具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明的第二方面，提供根据本发明所述的方法得到的重组植物蛋白在制备促进或提高生殖功能的药物中的应用。
本发明的第三方面，提供根据本发明所述的方法得到的重组植物蛋白在制备提升海绵体组织中NO水平的药物中的应用。
本发明的第四方面，提供根据本发明所述的方法得到的重组植物蛋白在制备提升海绵体组织中cGMP水平的药物中的应用。
本发明的第五方面，提供根据本发明所述的方法得到的重组植物蛋白在制备恢复氧化损伤海绵体内皮细胞活力的药物中的应用。
本发明制备的Mannose specific lectin重组蛋白或其活性片段能够提升海绵体组织中NO/cGMP的水平，恢复氧化损伤海绵体内皮细胞的活力，提高雄性勃起功能，进而提高雄性生殖功能。
附图说明
图1 示出了pET-30a (+)-MSL-His载体图谱。
图2 示出了pET-30a (+)-MSL-His重组质粒双酶切验证电泳图，其中，Lane M：KBLadder；Lane 1：plasmid；Lane 2：plasmid digested by Smal and HindⅢ。
图3 示出了MSL蛋白在BL21(DE3)表达的SDS-PAGE(左)和Western blot(右)分析，其中，Lane M1：Protein marker；Lane M2：Western blot Protein marker；Lane PC1：BSA(1 μg)；Lane PC2：BSA (2 μg)；Lane NC：未诱导的全细胞；Lane 1：15℃诱导16 h的全细胞；Lane 2：37℃诱导4 h的全细胞；Lane NC1：未诱导的细胞裂解上清；Lane 3：15℃诱导16h的细胞裂解上清；Lane 4：37℃诱导4 h的细胞裂解上清；Lane NC2：未诱导的细胞裂解沉淀；Lane 5：15℃诱导16 h的细胞裂解沉淀；Lane 6：37℃诱导4 h的细胞裂解沉淀。用于Western blot的抗体为anti-His抗体(GenScript, Cat.No.A00186)。
图4 示出了MSL蛋白在Rosetta™2(DE3)表达的SDS-PAGE(左)和Western blot(右)分析，其中，Lane M1：Protein marker；Lane M2：Western blot Protein marker；LanePC1：BSA (1 μg)；Lane PC2：BSA (2 μg)；Lane NC：未诱导的全细胞；Lane 1：15℃诱导16 h的全细胞；Lane 2：37℃诱导4 h的全细胞；Lane NC1：未诱导的细胞裂解上清；Lane 3：15℃诱导16 h的细胞裂解上清；Lane 4：37 ℃诱导4 h的细胞裂解上清；Lane NC2：未诱导的细胞裂解沉淀；Lane 5：15℃诱导16 h的细胞裂解沉淀；Lane 6：37℃诱导4 h的细胞裂解沉淀。用于Western blot的抗体为anti-His抗体(GenScript, Cat.No.A00186)。
图5 示出了不同洗脱体积下重组蛋白的SDS-PAGE电泳图。
图6 示出了重组蛋白电泳图，其中，Lane M1：DNA Marker；Lane M2：DNA Marker；BSA：2.00 μg；R：还原条件。
图7 示出了免疫荧光技术分析MCECs纯度(放大倍数：100×)。
图8 示出了MSL重组蛋白提高H2O2诱导的MCECs氧化损伤模型细胞活力，其中，####P<0.0001 vs. Control；**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001 vs. H2O2。
图9 示出了MSL重组蛋白对肾阳虚大鼠海绵体组织中NO水平的影响(n=10)，其中，与对照组相比，####P<0.0001；与模型组相比，**P<0.01，****P<0.0001。
图10 示出了MSL重组蛋白对肾阳虚大鼠海绵体组织中cGMP水平的影响(n=10)，其中，与对照组相比，###P<0.001；与模型组相比，**P<0.01，****P<0.0001。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
制备方法
本发明的一个方面，提供甘露糖特异性凝集素(本文有时简称为“MSL”)重组植物蛋白或其活性片段的制备方法。本文所用术语“蛋白”、“肽”和“多肽”可以互换使用，其是指通过酰胺键连接的多个共价连接的氨基酸残基。“蛋白”还包括通过化学或酶催化的反应引入的翻译后修饰，可以理解，该术语可以包含蛋白的变体或片段。
任何适合的MSL蛋白均可用于本发明，所述的MSL蛋白包括全长的MSL蛋白或其生物活性片段。本文中，MSL蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持MSL蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持MSL蛋白的50％的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持MSL蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。
在一个优选的实施方案中，本发明的MSL蛋白分离或纯化自植物。在另一个优选的实施方案中，所述的MSL蛋白也可以是人工制备的，比如根据常规的基因工程重组技术生产的重组MSL蛋白。
本发明的蛋白或多肽在C-末端和/或N-末端可以具有共价修饰。它们也可以采取各种形式(例如天然，融合体，糖基化，非糖基化，脂质化，非脂质化，磷酸化，非磷酸化，肉豆蔻酰基化，非肉豆蔻酰基化，单体，多聚，颗粒等)而存在。
来源于其它物种的MSL蛋白均包含于本发明中，特别是那些与MSL蛋白具有同源性的蛋白。如本文所用，术语“同源性”是指聚合物分子，例如，在核酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或在多肽分子之间的总体相关性。通常，术语“同源性”意味着两个分子之间的进化关系。因此，两个同源的分子将具有共同的进化祖先。在本发明的背景下，术语同源性包括同一性和相似性。
“同源性”可使用本领域已知的方法(诸如，序列比较算法)确定，当在比较窗口上以最大一致性比较和对齐时，两个或多个序列具有指定百分比的在指定区域上相同的核苷酸。两个序列之间的“同源性”百分比可以使用BLASTP算法版本2.2.2(Altschul,StephenF.,Thomas L.Madden,Alejandro A. Jinghui Zhang,Zheng Zhang,Webb Miller,和DavidJ.Lipman(1997),“Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of proteindatabase search programs”,Nucleic Acids Res.)使用默认参数来确定。
在一些实施方案中，如果分子中至少25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96%，97%，98%，99％或100%的单体是相同的(完全相同的单体)或相似(保守置换)，聚合物分子被认为是彼此“同源的”。术语“同源的”必然是指至少两个序列(多核苷酸或多肽序列)之间的比较。
本发明中，编码MSL重组蛋白、MSL蛋白的变体或片段的核酸分子具有与SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列具有至少90％同源性的核苷酸序列，例如与根据SEQ ID NO.1的核苷酸序列具有至少95%、优选至少96%、还优选至少97%、更优选至少98%、更优选至少99%，更优选至少99.9%同源性的核酸序列，并且具有上述同源性序列的核酸分子与SEQ ID NO.1所示的核酸分子具有相同功能。
在某些实施方案中，编码MSL重组蛋白的核酸分子具有与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的替换和/或缺失和/或添加获得的核苷酸序列，并且具有上述序列的核酸分子与SEQ ID NO.1所示的核酸分子具有相同功能。
本文中，术语“替换”是指由不同的核苷酸替换一个或多个核苷酸。“缺失”是指在核苷酸序列中一个或多个核苷酸的缺失。“插入”或“添加”是指在核苷酸序列中的改变导致与天然存在的分子相比，一个或多个核苷酸的增加。
本发明中核酸分子包括经密码子优化得到的编码序列。密码子是指信使RNA分子中每相邻的三个核苷酸为一组，在蛋白质合成时，其代表某一种氨基酸的规律。“密码子优化”旨在包括在不改变氨基酸序列的情况下对重组核酸的密码子组成进行改变。
在一个优选的实施方案中，编码MSL重组蛋白的核酸分子具有SEQ ID NO.1所示的核酸序列。
本发明所用术语“核酸”旨在包括任何长度的核苷酸的聚合形式，其含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物，其包括DNA、RNA和DNA/RNA杂合物，其还包括DNA或RNA类似物，诸如含有修饰的骨架(例如肽核酸(PNA)或硫代磷酸酯)或修饰的碱基的那些。因此，本发明的核酸包括DNA、cDNA、mRNA、重组核酸等。
一旦分离获得了本发明所述蛋白的编码序列，就可以采用重组技术来大批量地获得该蛋白。示例性的方法是将其编码基因克隆至载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到。
在一个优选的实施方案中，本发明的制备方法包括：
(1) 将编码MSL重组蛋白的碱基序列与载体连接构建重组蛋白表达载体；
(2) 将所述重组载体转化至原核细胞并诱导MSL重组蛋白的表达；
(3) 纯化MSL重组蛋白。
本发明的载体还可包含与所述核酸分子的序列可操作地连接的表达调控序列，以便于蛋白的表达。所述的“可操作地连接”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连接于编码序列。载体可以是例如经设计以在宿主细胞中表达核苷酸序列的表达载体，或经设计以产生重组病毒或病毒样颗粒的病毒载体。
本发明的宿主细胞优选为原核细胞，可用于本发明的原核宿主细胞的实例包括但不限于大肠杆菌、枯草杆菌等，例如可以是大肠杆菌细胞(E.coli)，如大肠杆菌HMS174(DE3)、或BL21(DE3)。
在一个优选的实施方案中，重组表达载体通过酶切位点NheI和HindIII连接所述植物MSL编码序列和原核表达载体pET-30a (+)获得。
本发明，合适的培养条件不特别限定，本领域技术人员可以根据所选择的原核细胞容易的确定培养过程中的温度、转速以及培养基等条件。
用途
本发明还提供MSL重组蛋白或其活性片段在制备促进或提高生殖功能的药物中的应用。经本发明原核表达后的MSL重组植物蛋白具有生物活性以及相应的生物功能。
在具体的实施方案中，促进或提高生殖功能包括但不限于预防或治疗勃起功能障碍、提升海绵体组织中NO水平、提升海绵体组织中cGMP水平和/或恢复氧化损伤海绵体内皮细胞活力。
本发明使用的术语“预防或治疗”指的是在疾病或机能紊乱发生之前或之后改善这种状况。与同等条件下未经治疗的参照组相比，按照任何标准技术来衡量，这种缓解或预防程度至少是5％、10％、20％、40％、50％、60％、80％、90％、95％或100％。在本发明中，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防治性措施，其目的是预防或减缓(减少)不期望发生的生理改变或紊乱。有益的或期望的临床结果包括但不限于以下无论是可检测还是不可检测的结果，包括症状的缓解、疾病程度的减小、疾病状态的稳定、疾病状态的改善或缓和以及减轻(无论是部分还是全部)。需要治疗的包括那些已经患有病症或紊乱的人，以及那些容易患有病症或紊乱的人，或者那些需要预防该病症或紊乱的人。
实施例
1. 实验方法
1.1 实验动物
C57BL/6小鼠：购自亿斯实验动物技术有限公司，SPF级，22-24 g，合格证编号：SCSK(吉)2018-0007。
SD大鼠：购自亿斯实验动物技术有限公司，SPF级，180-200 g，合格证编号：SCSK(吉)2018-0007。
1.2 重组表达氨基酸序列及载体图谱
本发明合成了植物来源的MSL编码序列，按照大肠杆菌蛋白表达体系进行了密码子优化，C端添加His标签，合成并构建在pET-30a (+)载体上(酶切位点为NheI/HindIII)，构建策略见图1。
Mannose specific lectin(MSL)重组蛋白编码序列如SEQ ID NO.1所示：
ATGGATGCCATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTGTTTGTCTCTCCCAGCATGGCTGATTTCATCCTGTACAGCGGCGAGAGCCTGAGAAGCGGACAGGCTCTGTACAGAGGCTCCTACACATTCATTATGCAGAATGACTGCAACCTGGTGCTGTACGATAATGGCAAGGCCATCTGGGCCAGCGGCACAAATGGCAGAGGCTCTGGATGTTACTGTGCCATGCAGAGCGATGGCAATCTGGTGGTGTACACAAGCAATAATAACGCCGTGTGGGCCAGCAACACCAACGTGGGACAGGGACACTACGTGTGTATCCTGCAGAAGGACAGGAACGTGGTCATCTATGGCGGCGCCAGGTGGGCTACAAATACCAACACAGTGGGCGTGTCCGGCGGCATGTTTATCGAGTCCAAGGCCACAATCTTCGGCAGCCTGCCCGCTAACGAGACAACAGCTGAGGCCAAGGCCGCCAGAATCAGCATGGTGGTGAACAAGCACCACCACCACCATCACTGA。
1.3 重组质粒扩增
按照引物设计原则设计正向引物和反向引物，PCR扩增目的序列，扩增体系如表1所示，扩增程序如表2所示，PCR扩增后的电泳结果如图2所示。
表1 PCR扩增体系
表2 PCR扩增程序
1.4 载体质粒酶切
pET-30a (+)载体用NheI/HindIII进行酶切，酶切体系如表3所示。
表3 双酶切体系
以上酶切体系混匀后置于37℃水浴锅中反应30-60 min，然后进行切胶回收。
1.5 重组质粒构建
将切胶回收的载体与目的片段进行重组酶连接，50℃反应15-20 min，反应体系如表4所示。
表4 重组酶连接反应体系
1.6 转化
从超低温冰箱中取出BL21(DE3)和Rosetta™ 2(DE3)感受态细胞，置于冰上融化。加入质粒(100 ng)，轻轻吹吸充分混匀，冰上放置30 min，水浴锅42℃热激90 s。冰上放置3min，加入100 μL室温LB液体培养基，在摇床中37℃，200 rpm震荡培养60 min。将菌液混匀后涂至卡那霉素抗性平板上，将平板倒置，37℃培养过夜。转化后的平板挑菌，收集克隆菌液送测序公司测序，验证重组质粒的准确性。
1.7 MSL重组蛋白小试表达
分别挑取3个单克隆，分别接种到4 mL含有50 μg/mL卡那霉素的LB试管中，在摇床中37℃、200 rpm震荡培养。当OD600达到0.6-0.8时，向2个试管中分别加入0.5 mM IPTG，15℃培养16 h和37℃培养4 h，最后一支试管为阴性参照。利用SDS-PAGE和Western blot检测蛋白质的表达和溶解度。
1.8 MSL重组蛋白样品准备
取450 μL培养基离心后的沉淀，重悬于300 μL裂解缓冲液(50 mM Tris-Hcl，150mM NaCl，5% glycerol，pH 8.0)，超声裂解1 min。
1.8.1 全菌样品
取100 μL裂解液，与50μL 5x loading buffer混合均匀，100℃加热10 min，15000rpm离心5 min。
1.8.2 上清和包涵体样品
取剩余200 μL裂解液，15000 rpm离心10 min，分别取上清和沉淀。混合90 μL 5xloading buffer到180 μL上清，作为上清样品。用150 μL 5x loading buffer重悬沉淀，作为包涵体样品。100℃加热10 min后，15000 rpm离心5 min，待上样。用SDS-PAGE和Westernblot检测全菌、上清、包涵体样品。
1.9 MSL重组蛋白纯化
取包涵体样品，buffer复溶后用0.45 μm滤膜抽滤。通过His亲和层析柱进行蛋白纯化。步骤如下：(1)用5-10倍buffer平衡柱子；(2)将样品以2 mL/min的速度流穿层析柱；(3)用不同洗脱进行洗脱；(4)将洗脱下来的样品分别进行SDS-PAGE电泳，分析是否有目的蛋白。收集经洗脱的蛋白，用SDS-PAGE和Western blot检测目的蛋白纯度。
1.10 基于Matrigel 3D培养体系分离培养小鼠海绵体内皮细胞MCECs
取8周龄C57BL/6小鼠脱颈处死，酒精棉球对其下腹部消毒。用镊子、手术剪做下腹部切口，剥开腹部筋膜及包皮腺，露出海绵体组织。用手术剪分离海绵体置于含10%双抗的HBSS中，镜下除去尿道及神经血管束，获得干净的海绵体组织，在含10%双抗的PSB中清洗3次。利用精细手术剪剪成1-2 mm3小块，置于预冷的24孔板底，每孔2块切块。每孔补加200 μL含50 ng/ml VEGF的Matrigel基质胶包被切块，培养小鼠海绵体内皮细胞(mousecavernous endothelial cells，MCECs)并诱导其增殖。于37℃、5% CO2培养箱中培养14天至长满孔底80%。吸除培养基，每孔加200 μL Dispase酶于培养箱中消化1 h。加入等体积10mM EDTA终止消化，离心后沉淀即为细胞。将获得的MCECs置于预先包被0.2%明胶的培养皿中，补加完全培养基进行培养。2-3代进行后续实验。
1.11 MCECs的纯度鉴定
利用免疫荧光法对MCECs的纯度进行鉴定。取密度为5*105cells/mL的MCECs在6孔板内做细胞爬片处理。贴壁24 h后，吸除培养基，用预冷的PBS洗3次。每孔加4%多聚甲醛500μL室温固定15 min，预冷的PBS洗3次。每孔加500 μL含5%山羊血清的0.5% Triton X-100通透液，室温放置30 min。吸除封闭液，加入一抗(PECAM-1：内皮细胞标记物，1:20；Desmin：平滑肌细胞标记物，1:200)，4℃孵育过夜。回收一抗，预冷的PBS洗3次。加入Alexa Fluor 488标记的羊抗兔IgG及Alexa Fluor 594标记的羊抗大鼠IgG室温孵育1 h，预冷的PBS洗3次。滴加DAPI试剂染细胞核，室温避光5 min，预冷的PBS洗3次。滴加荧光淬灭剂的封片液，并进行封片。荧光显微镜下观察并拍照，Image Pro Plus图像软件分析MCECs纯度。
1.12 细胞活力检测
MCECs细胞以密度2×104/mL铺于96孔板中，贴壁后吸出旧培养基，加入M199基础培养基饥饿培养24 h。各组分别加入不同浓度的MSL重组蛋白(100、25、6.25、1.56 μg/mL)，继续培养24 h。加入0.5 mmol/L H2O2造氧化损伤模型，培养时间2 h。细胞活力由CCK-8法检测得到：细胞培养结束后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37℃孵育1 h，用酶标仪在A450处测量吸光度值。
1.13 肾阳虚模型的构建及给药
50只雄性SD大鼠，体重180-200 g，随机分成5组，即对照组、模型组、MSL低剂量组(0.6 mg/kg MSL)、MSL高剂量组(0.9 mg/kg MSL)、阳性对照组(0.9 mg/kg山药蛋白DP1，经实验室分离纯化获得)。大鼠适应环境一周后，连续灌胃25 mg/kg氢化可的松(HCT)10天，构建肾阳虚模型。模型建立后，对照组与模型组给予蒸馏水，其余三组分别给予不同的药物连续治疗10天(给药浓度由预实验结果确认)。
1.14 勃起功能检测
末次给药后，将大鼠放入透明观察笼内，适应环境10 min。皮下注射100 μg/kg阿扑吗啡(apomorphine，APO)溶液(以含0.2 mg/mL的维生素Ｃ的生理盐水为溶剂，配制浓度40 μg/mL)，通过兴奋中枢多巴胺受体使大鼠阴茎勃起，观察30 min内大鼠勃起潜伏期并计算勃起率(勃起率%=每组大鼠勃起只数/每组大鼠总数×100)。阴茎末端完全暴露记为一次勃起。
1.15 生化指标检测
利用ELISA法检测大鼠海绵体中一氧化氮(nitric oxide，NO)和环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)水平。大鼠麻醉后，取海绵体存于液氮中，待用。依ELISA检测试剂盒说明书检测大鼠海绵体中NO或cGMP水平，用酶标仪在450 nm处测量吸光度值。
1.16 统计学分析
实验结果以平均值±标准差(means±SD)表示。使用GraphPad Prism v6.0软件，通过one-way ANOVA及Tukey-Kramer分析组间差异。*P表示差异具有统计学意义。
2. 实验结果
2.1 pET-30a (+)-MSL-His重组质粒双酶切验证
重组表达pET-30a (+)-MSL-His的双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析结果如图2所示。
2.2 pET-30a (+)-MSL-His重组蛋白表达
通过SDS-PAGE和Western blot检测结果显示目的蛋白在BL21(DE3)和Rosetta™2(DE3)中有明显表达。最佳表达条件为15℃诱导16 h，表达水平约为15 mg/L，可溶比<1%。
2.3 pET-30a(+)-MSL-His重组蛋白纯化
重组蛋白按照不同程序洗脱后的蛋白电泳结果见图5。结果可知，在Lane 13(PBS，10% Glycerol，0.2% SDS，pH 7.4)条件下，重组蛋白表达纯度高、稳定性好。
进一步用SDS-PAGE和Western Blot电泳检测重组蛋白纯度，结果见图6。所得纯化蛋白纯度>90%，浓度为4.58 mg/mL。
2.4 免疫荧光技术分析MCECs纯度
为了鉴定原代细胞的真实属性，验证分离方法是否可行，免疫荧光技术是目前检测原代细胞类型和纯度最常用的分析方法。在阴茎海绵体中除内皮细胞外，平滑肌细胞含量最丰富，因此本实验以血小板和内皮细胞粘附分子(PECAM-1)标记阳性细胞MCECs，以肌肉组织肿瘤表达的结蛋白(Desmin)标记小鼠海绵体平滑肌细胞(mouse cavernous smoothmuscle cells，MCSMCs)作为阴性对照，分析所得原代细胞的类型及MCECs纯度。结果可知，MCECs阳性率能达到90%以上(图7)。
2.5 MSL重组蛋白提高H2O2诱导的MCECs氧化损伤模型细胞活力
采用CCK-8法考察MSL重组蛋白干预氧化损伤MCECs细胞后细胞活力的变化。结果如图8所示，与Control组相比，H2O2作用2 h后细胞活力显著降低。给与药物干预后，100 μg/ml MSL对氧化损伤MCECs细胞的恢复作用最为显著(P<0.0001)。后续实验以100 μg/ml作为MSL的最佳作用浓度。
2.6 MSL重组蛋白对大鼠肾阳虚证的影响
由表5可知，HCT造模10天后大鼠出现畏寒、抱团、毛发干枯和弓背等症，并伴随体质量降低(P<0.0001)，表明大鼠出现肾阳虚证。给药10天后，与模型组相比，MSL低、高剂量组大鼠畏寒、抱团、毛发干枯和弓背等现象均显著缓解；体质量均显著增加(P<0.0001)；其中MSL高剂量组与阳性对照组作用效果相近。以上结果表明MSL对HCT诱导所致的大鼠肾阳虚证具有改善作用。
表5 MSL重组蛋白对肾阳虚大鼠体质量的影响(n=10)
注：与对照组相比，####P<0.0001；与模型组相比，**P<0.01，****P<0.0001。
2.7 MSL重组蛋白对大鼠勃起功能的影响
由表6可知，与对照组比较，模型组大鼠勃起潜伏期显著延长(P＜0.0001)，勃起率显著降低(P＜0.0001)。与模型组比较，MSL组大鼠勃起潜伏期显著降低(P＜0.05，P＜0.01)，勃起率显著增加(P＜0.05)，且呈剂量依赖。其中MSL高剂量组与阳性对照组作用效果相近。以上结果表明MSL可提高肾阳虚大鼠勃起功能。
表6 MSL重组蛋白对肾阳虚大鼠勃起功能的影响(n=10)
注：与对照组相比，###P<0.001，####P<0.0001；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。
2.8 MSL重组蛋白对大鼠海绵体组织中NO和cGMP水平的影响
勃起生理机制研究表明，非肾上腺素非胆碱能神经末梢和阴茎海绵体内皮细胞在一氧化氮合酶的催化下释放NO，由细胞膜快速扩散入平滑肌细胞内，激活鸟苷酸环化酶，使cGMP合成增加，通过一系列级联反应诱发阴茎勃起。因此，NO/cGMP信号通路是衡量阴茎海绵体勃起功能的关键信号通路。利用ELISA法检测对NO和cGMP水平的影响。结果由图9、图10可知，与对照组比较，模型组大鼠阴茎海绵体组织中NO、cGMP水平均显著降低(P＜0.001或P＜0.0001)。与模型组比较，MSL组大鼠勃阴茎海绵体组织中NO、cGMP水平均显著升高(P＜0.01或P＜0.0001)，且呈剂量依赖。其中MSL高剂量组与阳性对照组作用效果相近。以上结果表明，MSL可增强肾阳虚大鼠海绵体中NO/cGMP信号传导。
最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应对理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或对其中部分技术特征进行等同替换。而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种甘露糖特异性凝集素重组植物蛋白或其活性片段的制备方法，其特征在于，包括：
(1) 将含有编码甘露糖特异性凝集素重组植物蛋白的碱基序列与载体连接构建重组蛋白表达载体；
(2) 将所述表达载体转化至原核细胞并在合适的培养条件诱导重组蛋白的表达；
(3) 分离甘露糖特异性凝集素重组植物蛋白。
2.根据权利要求1所述的甘露糖特异性凝集素重组植物蛋白或其活性片段的制备方法，其特征在于，编码所述重组植物蛋白的核酸分子具有(I)或(II)所示的核苷酸序列：
(I) 与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少90％同源性，且具有相同功能的核苷酸序列；
(II) SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经过一个或几个核苷酸的替换和/或缺失和/或添加获得的且具有相同功能的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的甘露糖特异性凝集素重组植物蛋白或其活性片段的制备方法，其特征在于，编码所述甘露糖特异性凝集素重组蛋白的核酸分子包括经密码子优化得到的编码序列。
4. 根据权利要求3所述的甘露糖特异性凝集素重组植物蛋白或其活性片段的制备方法，其特征在于，编码所述重组植物蛋白的核酸分子具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
5. 根据权利要求1所述的甘露糖特异性凝集素重组植物蛋白或其活性片段的制备方法，其特征在于，所述重组蛋白表达载体通过酶切位点NheI和HindIII连接所述植物MSL编码序列和原核表达载体pET-30a (+)获得。
6.根据权利要求1-5任一项所述的方法得到的重组植物蛋白在制备促进或提高生殖功能的药物中的应用。
7.根据权利要求1-5任一项所述的方法得到的重组植物蛋白在制备预防或治疗勃起功能障碍的药物中的应用。
8.根据权利要求1-5任一项所述的方法得到的重组植物蛋白在制备提升海绵体组织中NO水平的药物中的应用。
9.根据权利要求1-5任一项所述的方法得到的重组植物蛋白在制备提升海绵体组织中cGMP水平的药物中的应用。
10.根据权利要求1-5任一项所述的方法得到的重组植物蛋白在制备恢复氧化损伤海绵体内皮细胞活力的药物中的应用。
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