CN102205111B

CN102205111B - 杨树菇半乳糖凝集素在制备抗hiv感染药物中的用途

Info

Publication number: CN102205111B
Application number: CN 201110130425
Authority: CN
Inventors: 孙慧; 李雅木; 陈义杰; 姜帅; 尹亚琳
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2011-05-19
Filing date: 2011-05-19
Publication date: 2013-01-23
Anticipated expiration: 2031-05-19
Also published as: CN102205111A

Abstract

本发明公开了杨树菇半乳糖凝集素在制备抗HIV感染药物中的用途。本发明通过大量的实验发现，真菌凝集素AAL（SEQIDNo.2）可有效抑制HIV对C8166细胞的侵染，能特异性激活CD4⁺T淋巴细胞的活性，而对CD8⁺T淋巴细胞无影响,具有很强的抑制HIV侵染和刺激CD4⁺T淋巴细胞增殖的活性，很好地满足了艾滋病治疗中的降低病毒载量和增加CD4⁺细胞的治疗指标，可用以预防或治疗HIV感染。本发明还公开了与杨树菇半乳糖凝集素特异性结合的抗体以及编码该杨树菇半乳糖凝集素的核苷酸在预防或治疗HIV感染中的用途。

Description

杨树菇半乳糖凝集素在制备抗HIV感染药物中的用途

技术领域

本发明涉及真菌凝集素的一种新的药理用途，尤其涉及从真菌杨树菇(Agrocybe aegerita)中分离到的半乳糖凝集素在预防或治疗人免疫缺陷病毒(HIV)感染的药理用途，属于杨树菇半乳糖凝集素的药理用途领域。

背景技术

从HIV-1病毒被鉴定到2008年的25年中，大约有2500万人死于艾滋病。世界卫生组织(World Health Organization)2008年统计结果，全球大概有3320万的人口感染了人免疫缺陷病毒(HIV)，预计在2008到2010年之间将会有4500万新的感染者出现。2009年2月18日中国卫生部发布艾滋病疫情报告，至2009年底，中国存活的艾滋病毒携带者和病人大约为74万，2008年前3季度在中国共有6897人死于艾滋病，其首次超过肺结核和狂犬病，成为中国死亡率最高的传染病。据统计，在中国艾滋病毒感染增长速度为每年30％，艾滋病的预防、控制和治疗的局势非常严峻。

人免疫缺陷病毒(HIV)侵染CD4⁺淋巴细胞，在CD4⁺淋巴细胞中复制，杀死CD4⁺淋巴细胞，使CD4⁺淋巴细胞的数量开始下降，最后出现免疫系统的衰竭伴随HIV的数量在血液中升高。出现HIV抗体及CD4⁺细胞低于200个/mL诊断为AIDS。CD4⁺细胞的缺少使严重感染的发生增加。免疫缺陷的患者不能抵御通常对正常人无害的感染因子，这些机会感染和其它病理过程最终导致患者的死亡。在艾滋病的治疗中，降低病毒载量、增加CD4⁺细胞数目是治疗是否成功的关键指标。

对HIV感染人群进行抗病毒治疗的方案中，1996年出现的高效抗逆转录病毒疗法(highly active antiretroviral therapy，HAART)(俗称“鸡尾酒疗法”，即：一种非核苷类逆转录酶抑制剂或蛋白酶抑制剂+两种核苷或核苷酸类逆转录酶抑制剂)，是目前首选的药物治疗方式。然而HAART并不能减轻所有出现的病症，病人需要持续服药，停药后会出现反弹。由于，所有的抗HIV药物最终都会引起病毒的耐药突变，并且每种药物都有不同程度的副作用，寻找抗HIV的新型药物仍然是当前HIV治疗和研究的重要任务。

基于对艾滋病毒(HIV)结构和侵染周期(吸附、融合、脱壳、逆转录、整合、DNA复制、转录、蛋白质翻译、成熟和出芽等十个步骤)的深入研究，人们寻找了多个抗HIV的药物靶点，并且成功研发了多种抗HIV药物。FDA批准的抗HIV药物有六大类：核苷类逆转录酶抑制剂、非核苷类逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、融合抑制剂、进入抑制剂和整合酶抑制剂。

在中国，以中草药辅助HAART方法进行艾滋病治疗是目前非常重要的治疗途径并取得了很多成绩。中药不仅具有直接抗HIV的活性，还可以保护和重建机体的免疫系统，即起到扶正祛邪的功能。

药用真菌在中国的中医药中占有重要地位。真菌入药在中国已有两千多年历史，自二千多年前的东汉，世界上第一部药物专著《神农本草经》中就记载了灵芝、茯苓、猪苓、雷丸等真菌的药效。明代李时珍的《本草纲目》、清初汪昂的《本草备要》中药用真菌都是重要的部分。现代刘波编著的《中国药用真菌》、应建浙等人编著的《中国药用真菌图鉴》记载了几百种药用真菌，它们具有抗病毒、降低胆固醇、降血压、抗血小板凝集等多种药理活性，特别是它们的广谱抗病毒、抗肿瘤活性最为引人注目。但是对其中抗病毒有效成分的研究十分有限，目前报道的药用真菌抗HIV活性成分主要有蛋白类、多糖类、小分子类和其它类。

公开号为“CN1693463A”、发明名称为“一种真菌半乳糖凝集素蛋白活性的多肽、其编码序列及制备方法和应用”的中国发明专利申请公开了一种从杨树菇中分离得到的半乳糖凝集素(其氨基酸序列为SEQ IDNo.2所示，编码该半乳糖凝集素的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示)，该发明专利申请的说明书中公开了所述半乳糖凝集素具有抗肿瘤及抗烟草花叶病毒的活性。迄今为止，未有任何文献报道杨树菇半乳糖凝集素具有抗人免疫缺陷病毒感染的药理用途。

发明内容

本发明的主要目的是提供从真菌杨树菇中分离得到的半乳糖凝集素AAL的一种新的药理用途。

本发明的主要目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明通过大量的药理实验发现，从真菌杨树菇中分离得到的真菌凝集素AAL具有抑制HIV侵染的作用，可抑制HIV对C8166细胞的侵染，能特异性激活CD4⁺T淋巴细胞的活性，而对CD8⁺T淋巴细胞无影响，具有很强的抑制HIV侵染和刺激CD4⁺T淋巴细胞增殖的活性，很好地满足了艾滋病治疗中的降低病毒载量和增加CD4⁺细胞的治疗指标，可将其用以预防或治疗HIV感染或提高人体免疫力。

本发明中所述的“真菌凝集素AAL”是从真菌杨树菇中分离得到凝集素AAL，其氨基酸序列优选为SEQ ID No.2所示，编码该真菌凝集素AAL的核苷酸序列优选为SEQ ID No.1所示。

所述的“真菌凝集素AAL”可以按照公开号为“CN1693463A”、发明名称为“一种真菌半乳糖凝集素蛋白活性的多肽、其编码序列及制备方法和应用”的中国发明专利申请说明书中所公开的方法制备得到真菌凝集素AAL，也可以通过多肽化学合成、DNA重组技术等方式制备得到，这些方法都是本领域普通技术人员所熟练掌握。

与所述“真菌凝集素AAL”能够特异性相结合的抗体也可用于制备成预防或治疗HIV感染的药物或疫苗，其中，所述的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。所述的抗体可通过本领域普通技术人员所熟悉的技术制备得到，例如：将纯化的真菌凝集素AAL蛋白免疫动物诱导获得多克隆抗体，或者是通过杂交瘤融合技术制备得到所述的单克隆抗体。

此外，还可将编码真菌凝集素AAL的核苷酸与合适的病毒载体可操作性的相连接得到适合在人体内表达的基因治疗药物，用于预防或治疗HIV感染；其中，所述的“病毒载体”指包含病毒基因组的感染性或减毒病毒；优选的，本发明所述的病毒载体优选为腺病毒载体、逆转录或以腺伴随病毒2(AAV2)为基础的病毒载体，更优选为痘病毒载体。将编码所述真菌凝集素AAL的核酸插入到所述病毒载体中获得重组病毒载体的方法是本领域技术人员所习知。

本发明还提供了一种预防或治疗HIV感染的药物组合物，该药物组合物由预防或治疗上有效量的真菌凝集素AAL与药学上可接受的载体组成。所述载体包括但不限于：葡萄糖、盐水、甘油、乙醇、蒸馏水等；所述的药物组合物可以按照常规的药物制剂方法制备成注射剂或口服制剂。例如，可以用生理盐水或含有葡萄糖的水溶液为载体将真菌凝集素AAL制备成注射制剂，通过静脉注射，单次或多次快速注射或静脉注射；或按照常规的口服制剂方法将真菌凝集素AAL制备成口服制剂，例如：肠溶胶囊、结肠定位胶囊、微球、纳米粒等各种口服制剂。

本发明药物组合物的给药量是治疗或预防上的有效量，具体剂量应参考给药途径和病人健康状况等因素，作为参考：每天约3-120微克(真菌凝集素AAL)/Kg体重，优选为30-35微克(真菌凝集素AAL)/Kg体重。

本发明术语“HIV”为本领域技术人员所已知的任何HIV组、亚型株或分离株，可以是HIV-1或HIV-2；其中，HIV-1可分成9种亚型，HIV-2可分成5种亚型，它们均包含在本发明的范围之内。

本发明所述的“疫苗”是一种化合物，可以是诱导特定免疫应答的蛋白、核酸或载体。

附图说明

图1真菌凝集素AAL对C8166细胞的毒性及对HIV感染的抑制活性实验结果。

图2真菌凝集素AAL在不同加药时间对病毒复制的影响实验结果。

图3真菌凝集素AAL对感染细胞和未感染细胞形成合胞体的抑制实验结果。

图4真菌凝集素AAL刺激Balb/c小鼠CD4⁺T淋巴细胞增殖的实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实验例1真菌凝集素AAL抗HIV感染的活性实验

抗HIV实验包括细胞毒实验和抗HIV复制实验。

细胞毒性实验(MTT法检测)：培养C8166细胞(中科院武汉病毒所)于96孔板中(3×10⁴/孔)，用不同浓度(1.25nM，6.25nM，30nM，150nM，750nM)的真菌凝集素AAL(SEQ ID No.2)分别处理C8166细胞，每个浓度重复3孔，37℃，5％CO₂培养，温育4天后，细胞的存活率用MTT法检测。引起细胞减少50％的药物浓度为CC50。

HIV复制抑制试验：与细胞毒性试验平行，HIV复制抑制试验由p24抗原捕获ELISA实验检测。C8166细胞接种HIV-1_LAI(该病毒来自中科院病毒研究所)，病毒感染复数MOI＝0.058，37℃，1.5小时。然后PBS洗涤，除去多余病毒，将细胞加入96孔板(3×10⁴/孔，96孔板)，再加入不同浓度(0.1nM，0.5nM，2.5nM，12.5nM，62.5nM)的药物真菌凝集素AAL(SEQ ID No.2)。叠氮胸苷(AZT)和IDV(硫酸茚地那韦)作为阳性对照。4天后收集上清，用0.5％triton X-100失活病毒。上清液稀释3倍，加入包被p24单抗的ELISA平板，37℃温育1小时。用PBST洗涤5次，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗P24抗体，37℃孵育1小时，然后用PBST洗涤5次，加入邻苯二胺(OPD)反应液显色。加入硫酸终止反应，在490nm读数。计算半抑制浓度EC50，计算选择指数CC50/EC50。

从图1和表1的实验结果中可以看出，真菌凝集素AAL对C8166细胞毒性的半致死剂量(CC50)是50nM，而对HIV感染的半抑制浓度是2.87nM，选择指数为17.28，实验结果表明，真菌凝集素AAL(SEQ ID No.2)能有效抑制HIV感染，有开发成抗HIV药物的潜力。

表1AAL对C8166细胞的毒性及对HIV感染的抑制活性

样品名	CC₅₀(nM)	EC₅₀(nM)	SI
				方法	MTT法	ELISA检测p24	CC₅₀/EC₅₀
AAL	50	2.87	17.28
				AZT^a		11.39
IDV^a		28.31

实验例2真菌凝集素AAL对病毒复制的影响实验

在C8166细胞感染HIV-1_LAI病毒后不同时间(0小时，1小时，2小时，4小时，8小时，16小时，24小时)加入真菌凝集素AAL(SEQ ID No.2)，按实验例1中方法检测病毒复制。接种病毒的感染复数MOI＝0.05，药物终浓度6.25nM，300ul培养体系。以叠氮胸苷(AZT)作为阳性对照。实验结果见图2。实验结果表明，真菌凝集素AAL加入时间对病毒的抑制趋势与AZT相似，但在相同浓度下，真菌凝集素AAL抑制HIV复制效果要优于AZT。

实验例3真菌凝集素AAL对慢性感染细胞与未感染细胞融合形成合胞体的抑制实验

为了检测真菌凝集素AAL(SEQ ID No.2)对慢性感染C 8166细胞与未感染C8166细胞形成合胞体的抑制作用，感染细胞与不同浓度AAL(SEQ IDNo.2)(0.2nM，1nM，5nM，25nM，125nM，625nM)孵育1h，洗涤去除多余的AAL，然后在培养体系中加入未感染细胞，其中感染细胞与未感染细胞比例为1∶8。共培养36h后观察细胞，对合胞体进行计数。

实验结果见图3。从实验结果可见，真菌凝集素AAL对合胞体形成抑制，EC50为1.73nM。

实验例4真菌凝集素AAL特异刺激小鼠CD4⁺T淋巴细胞增殖实验

取Balb/C雄性小鼠，尾静脉注射真菌凝集素AAL(SEQ ID No.2)(2.5mg/Kg)，6h后处死小鼠，分离脾脏淋巴细胞，用荧光标记的抗体(FITC-antiCD4，PE-antiCD8)染色细胞，流式细胞仪检测细胞数量。

实验结果见图4。A图是CD4⁺T淋巴细胞增殖情况及其统计结果；B图为CD8⁺T淋巴细胞增殖情况及其统计结果。实验结果表明，用真菌凝集素AAL尾静脉注射，可以刺激Balb/C小鼠的CD4⁺T淋巴细胞异常增殖，而对CD8⁺T淋巴细胞增殖没有影响。

<110> 武汉大学

<120> 杨树菇半乳糖凝集素在制备抗HIV感染药物中的用途

<130> dqpt0026

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 635

<212> DNA

<213> Agrocybe aegerita

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cagggcgtca acatctataa catcagtgcc gggaccagcg tcgacctcgc tgctcctgtt 60

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gaagtgtgta gttatgtgct aaaaaaaaaa aaaaa 635

<210> 2

<211> 158

<212> PRT

<213> Agrocybe aegerita

<400> 2

Gln Gly Val Asn Ile Tyr Asn Ile Ser Ala Gly Thr Ser Val Asp Leu

1 5 10 15

Ala Ala Pro Val Thr Thr Gly Asp Ile Val Thr Phe Phe Ser Ser Ala

20 25 30

Leu Asn Leu Asn Ala Gly Ala Gly Asn Pro Asn Asn Thr Thr Leu Asn

35 40 45

Leu Phe Ala Glu Asn Gly Ala Tyr Leu Leu His Ile Ala Phe Arg Leu

50 55 60

Gln Glu Asn Val Ile Ile Phe Asn Ser Arg Gln Pro Asp Gly Pro Trp

65 70 75 80

Leu Val Glu Gln Arg Val Ser Asp Val Ala Asn Gln Phe Ala Gly Ile

85 90 95

Asp Gly Lys Ala Met Val Thr Val Phe Asp His Gly Asp Lys Tyr Gln

100 105 110

Val Val Ile Asn Glu Lys Thr Val Ile Gln Tyr Thr Lys Gln Ile Ser

115 120 125

Gly Leu Thr Leu Ser Leu Ser Tyr Asn Ala Thr Glu Glu Thr Ser Ile

130 135 140

Phe Ser Thr Val Val Glu Ala Val Thr Tyr Thr Gly Leu Ala

145 150 155

Claims

1.真菌凝集素AAL在制备预防或治疗人免疫缺陷病毒感染的药物中的用途；所述真菌凝集素AAL的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。

2.编码真菌凝集素AAL的核苷酸在制备治疗或预防人免疫缺陷病毒感染药物中的用途；所述核苷酸为SEQ ID No.1所示。

3.真菌凝集素AAL在制备提高人体免疫力的药物中的用途；所述真菌凝集素AAL的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。