RU2513692C1 - Штамм вируса иммунодефицита человека 1-го типа ив710 субтипа а резистентный к антиретровирусным препаратам для диагностических и вакцинных препаратов - Google Patents
Штамм вируса иммунодефицита человека 1-го типа ив710 субтипа а резистентный к антиретровирусным препаратам для диагностических и вакцинных препаратов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2513692C1 RU2513692C1 RU2012139682/10A RU2012139682A RU2513692C1 RU 2513692 C1 RU2513692 C1 RU 2513692C1 RU 2012139682/10 A RU2012139682/10 A RU 2012139682/10A RU 2012139682 A RU2012139682 A RU 2012139682A RU 2513692 C1 RU2513692 C1 RU 2513692C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- hiv
- subtype
- human immunodeficiency
- preparations
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к штамму вируса иммунодефицита человека, принадлежащему к субтипу А, и может быть использовано в вирусологии, медицине и биотехнологии. Представленный штамм вируса иммунодефицита человека I-го типа ИВ710 депонирован в Государственной коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития России под номером 1188. Штамм обладает стабильной репродуктивной активностью. Инфекционный титр составляет 3,5-4,0 lg ТЦД 50. Штамм является моделью для изучения антивирусной активности химиопрепаратов нового поколения, а также для создания вакцинных препаратов. 1 ил., 4 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к области вирусологии и биотехнологии и может быть использовано для получения диагностических и экспериментальных вакцинных препаратов.
С появлением антиретровирусной терапии (АРВ-терапия) ВИЧ-инфекция стала не фатальным, но хроническим заболеванием. Однако от 50 до 70% пациентов, получавших АРВ-терапию, не чувствительны к действию антиретровирусных лекарств [1]. В настоящее время возрастает количество сообщений о появлении новых штаммов, резистентных к действию антиретровирусных препаратов, несмотря на попытки по предотвращению их появления [2]. Одна из причин их появления - неоптимальная терапия антиретровирусными препаратами, поскольку ВИЧ-инфекция характеризуется экстремальной генетической дивергентностью вирусной популяции. Варианты вирусов постоянно эволюционируют и способны уклоняться от иммунного ответа хозяина, приобретая измененный клеточный тропизм и представляя лекарственно устойчивые варианты. При этом гетерогенность ВИЧ-1 популяции в инфицированном индивидууме может неравномерно распределяться внутри организма [3]. В настоящее время практически все данные по резистентности штаммов ВИЧ-1 получены на субтипе вируса В, циркулирующем в странах Западной Европы, Северной Америки и Австралии [4]. Информация же по субтипу А, преобладающему на большей части территории РФ и территории бывших советских республик [5, 6], фактически отсутствует. В связи с этим особую важность для изучения химиопрепаратов нового поколения и создания вакцинных препаратов приобретает применение штаммов вируса, которые принадлежат к субтипу, эндемичному для территории РФ.
Задача изобретения - получение штамма вируса иммунодефицита человека, принадлежащего к субтипу А и резистентного к антивирусному действию химиопрепаратов класса нуклеозидных аналогов, ненуклеозидных аналогов и ингибиторов протеазы, широко применяющихся в лечении ВИЧ-инфекции.
Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в использовании его для изучения антивирусного действия химиопрепаратов нового поколения и для создания вакцины.
Штамм вируса иммунодефицита человека I-го типа ИВУ 10 субтипа А, резистентный к антиретровирусным препаратам (АРВ-препараты), для диагностических и вакцинных препаратов хранится в коллекции вирусов НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН и депонирован в Государственной коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития России под номером 1188 от 16.01.12 и имеющий нуклеотидную последовательность гена pol, приведенную на фигуре 1.
Штамм вируса выделен из лимфоцитов периферической крови больного СПИДом. При получении штамма использованы методы сокультивации лимфоцитов больного с лимфоцитами крови здорового донора, стимулированных митогеном, а также с человеческими перевиваемыми клеточными линиями.
Репродукция
Штамм ВИЧ-1 ИВ710 реплицируется в лимфоцитах периферической крови, а также в лимфобластоидных клеточных культурах МТ-4 и Jurkat. Репродукция вируса сопровождается характерным цитопатическим действием и синицитиобразованием. Штамм может поддерживаться длительное время при пассировании на клеточных линиях. Через 5-6 дней после инфицирования клеток вируссодержащей культуральной жидкостью инфицированная клеточная взвесь замораживается и после размораживания и осветления при 1000 об/мин вносится к свежим неинфицированным клеткам в соотношении 1:10.
Инфекционный титр вируса определяли по 50% тканевой цитопатической дозе вируса на модели вышеуказанных клеточных культур в сравнении со штаммом-аналогом ВИЧ-1 LAV, который является первым изолятом ВИЧ-1, выделенным от больного СПИДом [7]. Продуктивная активность штамма составляет 3,5-4,0 lg ТЦД50 (таблица 1). Более низкий инфекционный титр штамма ИВ710 по сравнению со штаммом-аналогом объясняется тем, что штамм LAV был выделен от больного, не получавшего АРВ-терапию.
Антигенные свойства
ВИЧ-1 относится к семейству Retroviridae, род Lentivirus. Вирусы этой подгруппы являются оболочечными РНК-содержащими вирусами с размером частиц около 100-150 нм. В составе частиц обнаруживают не менее 6 основных структурных антигенов, обладающих иммуногенными свойствами, которые могут быть выявлены в инфицированных клетках с помощью различных иммунологических и вирусологических методов.
Иммунофлюресценция. Исследование штамма ИВ710 методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием сыворотки больного СПИДом, содержащей антитела к ВИЧ-1, показало наличие антигенов ВИЧ-1 в 30-35% инфицированных клеток.
Иммуноблот. Исследование в иммуноблоте штамма ИВ710 показало, что вирус обладает антигенными детерминантами, характерными для ВИЧ-1: 120/160, 65, 55, 41,31, 24,17 кД (таблица 2).
Субтипирование. Генетический анализ области, кодируемой геном ро1, проведенный с помощью субтипспецифических праймеров (CCAAAGGTTAAACAATGG, TTAGATTCTTAAATGGCTCC), подходящих для изучения вариантов ВИЧ-1, циркулирующих на территории России, показал, что данный штамм вируса относится к субтипу А.
Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.
Пример 1. Сравнительное исследование инфекционной активности штаммов ВИЧ-1 LAV и ИВ710.
Исследование инфекционной активности штаммов ВИЧ проводили на модели лимфобластоидных клеток МТ-4 и Jurkat в пластиковой 24-луночной панели (Costar, США). Клетки инфицировали вирусом в дозе 0,01 инфекционных единиц на клетку. Далее инкубировали культуры клеток при 37°С в течение 1 часа и дважды отмывали. После этого к культуре клеток добавляли питательную среду RPMI-1640 с 10% сыворотки эмбрионов коров (производства Sigma) и 100 мкг/мл гентамицина (конечная концентрация клеток 400000 клеток/мл). Учет результатов противовирусной активности производили по жизнеспособности клеток путем окрашивания клеток красителем трипановым синим на 6-7 сутки. За титр вируса принимали величину, обратную его максимальному разведению, вызывающему как минимум двухкратное превышение показателя гибели клеток по сравнению с контролем. Результаты исследования представлены в Таблице 1.
Установлено, что титр штамма ИВ 710 составляет 3,5-4,0 lg ТЦД 50 (цитотоксических доз), что является довольно высоким титром, учитывая, что вирус выделен от больного, получавшего АРВ-терапию. Данный инфекционный титр позволяет успешно инфицировать лимфобластоидные клеточные культуры с целью дальнейшей наработки инфекционного материала.
Пример 2. Диагностика антител к белкам ВИЧ-1 методом иммуноблота. Материал для исследования антител к ВИЧ-1 представлен 8 сыворотками, полученными от ВИЧ-инфицированных лиц и содержащими анти-ВИЧ антитела. Сыворотки были предварительно охарактеризованы в коммерческой тест-системе фирмы «Биорад» (США). В качестве антигена использован штамм ИВУ 10 и штамм-аналог ВИЧ-1 LAV.
Выявление антител к ВИЧ-1 проводили с помощью нитроцеллюлозных стрипованных мембран (стрип) с нанесенными на них антигенами ВИЧ-1 фирмы «Биорад» (США). Готовую стрипованную мембрану предварительно замачивали на 5 мин в фосфатно-солевом буфере с твином (ФСБ-Т). Сыворотку крови в количестве 20 мкл разводили в 1 мл ФСБ-Т, содержащего 0,5% БСА (бычий сывороточный альбумин), и вносили в лунку со стрипом. После инкубации в течение 1 час при комнатной температуре и отмывки ФСБ-Т вносили конъюгат, разведенный в 1 мл ФСБ-Т. Далее снова проводили инкубацию в течение 1 час при комнатной температуре и после отмывки ФСБ-Т вносили 1 мл раствора тетраметилбензидина (ТМБ) в цитратно-фосфатном буфере (ЦФБ). Затем инкубировали в темноте до появления четких полос в контрольном стрипе. Реакцию останавливали 1 н. серной кислотой. После промывки стрипа дистиллированной водой его высушивали при комнатной температуре и визуально проводили учет результатов.
Результаты исследований представлены в Таблице 2. В результате проведенных исследований установлено, что антиген штамма ИВ710 позволяет выявлять антитела ко всем основным структурным белкам ВИЧ-1 и, следовательно, может быть использован для изучения сероконверсии лиц, инфицированных ВИЧ-1, а также для изучения противовирусного действия химиопрепаратов и создания вакцины против ВИЧ.
Пример 3. Исследование наличия резистентности к химиопрепаратам класса нуклеозидных, ненуклеозидных аналогов и ингибиторов протеазы.
Для проверки отсутствия противовирусного действия препаратов были взяты азитотимидин и эпивир (нуклеозидные аналоги, ингибирующие действие обратной транскриптазы), вирамун (ненуклеозидный аналог, ингибирующий действие обратной транскриптазы) и криксиван (ингибитор протеазы) в максимальной концентрации 20 мкг/мл. В качестве вирусного контроля был взят штамм-аналог ВИЧ-1 LAV. Противовирусное действие препарата оценивалось по жизнеспособности лимфобластоидных клеток человека (Таблица 3) и по уровню антигена вируса (р24) в культуральной жидкости (Таблица 4). Исследование противовирусной активности препаратов в отношении ВИЧ проводили на модели лимфобластоидных клеток МТ-4 в пластиковой 24-луночной панели (Costar, США). К клеткам добавляли исследуемый препарат и инфицировали вирусом в дозе 0,01 инфекционных единиц на клетку. Инкубировали культуры клеток при 37°С в течение 1 часа и дважды отмывали. После этого к культуре клеток добавляли питательную среду RPMI-1640 с 10% сыворотки эмбрионов коров (производства Sigma) и 100 мкг/мл гентамицина (конечная концентрация клеток 400000 клеток/мл). Далее смена среды производилась на 2-3 день культивирования. При смене среды старая среда полностью удалялась, клетки отмывались свежей средой RPMI-1640 без сыворотки, после чего добавлялась свежая питательная среда (конечная концентрация клеток 400000 клеток/мл). Учет результатов противовирусной активности производили по жизнеспособности клеток путем окрашивания клеток красителем трипановым синим. Методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческого иммуноферментного набора фирмы Биорад (США) проводили определение антигена вируса в культуральной жидкости согласно инструкции изготовителя. Результаты учитывали с помощью фотометра "Multiscan" при длине волны 630 нм.
В результате проведенных исследований установлено, что при внесении в культуру клеток, инфицированных штаммом ИВ710, химиопрепаратов различного класса, не наблюдается противовирусного эффекта, что свидетельствует о лекарственной резистентности данного штамма. Следовательно, данный штамм может быть использован для изучения противовирусного действия химиопрепаратов нового поколения, а также для вакцинных препаратов.
Таблица 1 | ||||
Сравнительное исследование инфекционной активности штаммов ВИЧ-1 LAV и ИВ710 на модели клеток МТ-4 и Jurkat | ||||
Титр, lg ТЦД 50 | Штаммы ВИЧ-1 (модель клеток МТ-4) | Штаммы ВИЧ-1 (модель клеток Jurkat) | ||
LAV | ИВ710 | LAV | ИВ710 | |
6,0 | 3,5 | 6,0 | 4.0 |
Таблица 2 | ||||||||
Исследование штамма ИВ710 методом иммуноблота | ||||||||
Штамм | Выявленные антитела | |||||||
Контроль (LAV) | 160 | 120 | 65 | 55 | 41 | 31 | 24 | 17 |
ИВ710 | 160 | 120 | 65 | 55 | 41 | 31 | 24 | 17 |
Таблица 3 | |||||
Сравнительное исследование противовирусной активности химиопрепаратов в культуре лимфобластоидных клеток человека, инфицированных штаммами ИВ710 и LAV по цитопатическому действию | |||||
Контроль клеток | Контроль вируса (LAV) | ИВ710 | |||
AZT 20 мкг/мл | Вирамун 20 мкг/мл | Эпивир 20 мкг/мл | Криксиван 20 мкг/мл | ||
98* | 18 | 17 | 18 | 25 | 26 |
* - процент жизнеспособных клеток |
Таблица 4 | |||||
Сравнительное исследование противовирусной активности химиопрепаратов в культуре лимфобластоидных клеток человека, инфицированных штаммами ИВ710 и LAV методом иммуноферментного анализа | |||||
Контроль клеток | Контроль вируса (LAV) | ИВ710 | |||
AZT 20 мкг/мл | Вирамун 20 мкг/мл | Эпивир 20 мкг/мл | Криксиван 20 мкг/мл | ||
0,098* | 1,988 | 1,393 | 1,394 | 1,399 | 1,331 |
* оптическая плотность |
Источники информации
1. Hirsch M.S., Gunthard H.F., Schapiro J.M et al. Antiretroviral drug resistance testing in adult HIV-1 infection: 2008 recommendations of an international AIDS society-USA panel // Clin. Infect. Dis. - 2008. - Vol.47. - P. 266-285.
2. Shafer R.W., Rhee S.Y., Bennett D.E. Consensus resistance mutations for epidemiological surveillance: basic principles and potential controversies // Antivir. Ther. - 2008. - Vol.13. - P. 59-68.
3. Choudhury В., Pillay D., Taylor S. P. Analysis of HIV-1 variation in blood and semen during treatment and treatment interruption // J. Med. Virol. - 2002. - Vol.68. - P. 467-472.
4. Spira S., Wainberg M.A., Loemba H. et al. Impact of clade diversity on HIV-1 virulence, antiretroviral drug sensitivity and drug resistance // J. Antimicrob. Chem. - 2003. - V.51. - P. 229-240.
5. Bobkov A.F., Kazennova E.V., Selimova L.M. et al. Temporal trends in the HIV-1 epidemic in Russia: predominance of subtype A // J. Med. Virol. - 2004. - V.74. - P.191-196.
6. Nosik M., Ryzhov К., Kravtchenko A. et al. Genotypic Analyses of HIV in antiretroviral drug-naive patients from Moscow and Moscow Region, Russia// 6th IAS Conference on HIV Pathogenesis, Treatment and Prevention, 17-20 July 2011, Rome, Italy, Abs.CDA002.
7. Barre-Sinoussi F., Mugeyre M., Dauguet C. Isolation of a T-lymphotropic retroviruses from a patient at risk for AIDS // Science. - 1983. - Vol.220. - P.868-871.
Claims (1)
- Штамм вируса иммунодефицита человека I-го типа ИВ710 субтипа А, резистентный к антиретровирусным препаратам, для диагностических и вакцинных препаратов, депонированный в Государственной коллекции вирусов ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Минздравсоцразвития России под номером 1188 и имеющий нуклеотидную последовательность гена pol, приведенную на фигуре 1.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2012139682/10A RU2513692C1 (ru) | 2012-09-18 | 2012-09-18 | Штамм вируса иммунодефицита человека 1-го типа ив710 субтипа а резистентный к антиретровирусным препаратам для диагностических и вакцинных препаратов |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2012139682/10A RU2513692C1 (ru) | 2012-09-18 | 2012-09-18 | Штамм вируса иммунодефицита человека 1-го типа ив710 субтипа а резистентный к антиретровирусным препаратам для диагностических и вакцинных препаратов |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2012139682A RU2012139682A (ru) | 2014-03-27 |
RU2513692C1 true RU2513692C1 (ru) | 2014-04-20 |
Family
ID=50342612
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2012139682/10A RU2513692C1 (ru) | 2012-09-18 | 2012-09-18 | Штамм вируса иммунодефицита человека 1-го типа ив710 субтипа а резистентный к антиретровирусным препаратам для диагностических и вакцинных препаратов |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2513692C1 (ru) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2046138C1 (ru) * | 1992-07-31 | 1995-10-20 | Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии Научно-производственного объединения "Вектор" | Штамм вируса иммунодефицита человека i типа, используемый для приготовления диагностических тест-систем |
RU2121502C1 (ru) * | 1996-08-01 | 1998-11-10 | Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Госкомсанэпиднадзора РФ | Штамм hominis immunodeficiti virus (hiv-i) вич-1 /россия/гм-12-95 (ru 1295) субтипа в для диагностических и вакцинных препаратов |
RU2420575C1 (ru) * | 2010-01-18 | 2011-06-10 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Штамм a1.ru.09ru2240 вируса иммунодефицита человека 1 типа субтипа а, используемый для диагностики и изучения эффективности лечебно-профилактических и вакцинных препаратов |
-
2012
- 2012-09-18 RU RU2012139682/10A patent/RU2513692C1/ru active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2046138C1 (ru) * | 1992-07-31 | 1995-10-20 | Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии Научно-производственного объединения "Вектор" | Штамм вируса иммунодефицита человека i типа, используемый для приготовления диагностических тест-систем |
RU2121502C1 (ru) * | 1996-08-01 | 1998-11-10 | Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Госкомсанэпиднадзора РФ | Штамм hominis immunodeficiti virus (hiv-i) вич-1 /россия/гм-12-95 (ru 1295) субтипа в для диагностических и вакцинных препаратов |
RU2420575C1 (ru) * | 2010-01-18 | 2011-06-10 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Штамм a1.ru.09ru2240 вируса иммунодефицита человека 1 типа субтипа а, используемый для диагностики и изучения эффективности лечебно-профилактических и вакцинных препаратов |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
BARRE-SINOUSSI F. ET AL. Isolation of a T-Lymphotropic Retrovirus from a Patient at Risk for Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS) // Science, New Series, vol. 220, no. 4599, 1983, pp. 868-871. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2012139682A (ru) | 2014-03-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US11612649B2 (en) | HIV pre-immunization and immunotherapy | |
Balasubramaniam et al. | Immune control of HIV | |
Haigwood et al. | Passive immune globulin therapy in the SIV/macaque model: early intervention can alter disease profile | |
US20210121561A1 (en) | Methods of producing cells resistant to hiv infection | |
Van Rompay et al. | 9-[2-(Phosphonomethoxy) propyl] adenine therapy of established simian immunodeficiency virus infection in infant rhesus macaques | |
Saksena et al. | Reservoirs of HIV-1 in vivo: implications for antiretroviral therapy | |
US20200384021A1 (en) | Hiv immunotherapy with no pre-immunization step | |
Mikovits et al. | In vitro infection of primary and retrovirus-infected human leukocytes by human foamy virus | |
Schneweis et al. | Graded cytopathogenicity of the human immunodeficiency virus (HIV) in the course of HIV infection | |
RU2513692C1 (ru) | Штамм вируса иммунодефицита человека 1-го типа ив710 субтипа а резистентный к антиретровирусным препаратам для диагностических и вакцинных препаратов | |
Stephens et al. | Significance of macrophage tropism of SIV in the macaque model of HIV disease | |
EP1425391A1 (fr) | Procede de vaccination therapeutique, peptides mutes de la transcriptase inverse de vih et leur utilisation a des fins de vaccination et en diagnostic | |
Machuca et al. | HIV type 2 primary isolates induce a lower degree of apoptosis" in vitro" compared with HIV type 1 primary isolates | |
HUSCH et al. | CD3, CD8 double-positive cells from HIV-1-infected chimpanzees show group-specific inhibition of HIV-1 replication | |
RU2513693C1 (ru) | Штамм вируса иммунодефицита человека 1-го типа ив742 субтипа а для диагностических и вакцинных препаратов | |
RU2520814C2 (ru) | Штамм вируса иммунодефицита человека 1-го типа ив741 субтипа ае для диагностических и вакцинных препаратов | |
RU2520813C2 (ru) | Штамм вируса иммунодефицита человека 1-го типа ив735 субтипа в для диагностических и вакцинных препаратов | |
RU2457244C1 (ru) | Штамм hominis immunodeficiti virus (hiv-1) вич-1/россия/(316ru) для приготовления диагностических, профилактических препаратов и для оценки противовирусной активности различных соединений | |
EA034813B1 (ru) | Штамм вируса иммунодефицита человека i-го типа ив748 субтипа а для диагностических и вакцинных препаратов | |
WO2000045844A1 (en) | Use of hydroxyurea and a reverse transcriptase inhibitor to induce autovaccination by autologous hiv | |
JP2001097885A (ja) | ネコ・レトロウイルスワクチン、およびその調製方法 | |
Mubin et al. | Molecular biology of viruses | |
Roukaerts | Genotyping of local feline immunodeficiency virus (FIV) isolates and characterization of FIV replication in peripheral blood mononuclear cells | |
Babalola | The strengths, weaknesses, opportunities and threats (SWOT) analysis of HIV Type–1 | |
WO1999060988A9 (en) | Combination therapy for treatment of fiv infection |