CN108359000B - 一种改造的杨树菇凝集素蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

一种改造的杨树菇凝集素蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

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CN108359000B CN201810460830.0A CN201810460830A CN108359000B CN 108359000 B CN108359000 B CN 108359000B CN 201810460830 A CN201810460830 A CN 201810460830A CN 108359000 B CN108359000 B CN 108359000B
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Abstract

本发明公开了一种改造的杨树菇凝集素蛋白及其制备方法和应用。属于生物技术领域。通过将AAL‑2的6个CRD全部置换成完全相同的CRD，得到改造蛋白。经CFG糖谱表明，与AAL2相比，改造蛋白MUT‑AAL2和MUT‑1‑AAL2保留了单糖GlcNAc结合活性，但对细胞膜和细胞质中的糖结合活性有很大改变：对检测的7种细胞，AAL2都可以结合，但改造蛋白都不能结合；当细胞透化后，突变蛋白则都可以结合，说明突变蛋白仅识别细胞质内的糖结构而不识别细胞膜上的糖结构。结果表明改造后的重组蛋白与原始AAL2相比有更强的糖结合特异性。因此本发明改造蛋白在识别GlcNAc末端的糖结构具有更大的应用潜力。

Description

一种改造的杨树菇凝集素蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基因改造的杨树菇凝集素蛋白MUT-AAL2及其制备方法和在糖研究领域的应用。
背景技术
凝集素是一类对糖特异结合的蛋白，广泛存在于细菌，真菌，植物和动物中。凝集素对于生物体抗击外在的危害有着重要作用，很多研究表明，凝集素有一定的毒性。在1888年，俄国科学家从蓖麻中提取了一种蛋白，可以对红细胞产生凝集，所以称之为蓖麻凝集素。至此之后，凝集素的研究正式拉开了帷幕。开始的研究主要集中植物中，发现了一系列来自于不同植物的凝集素，列伴刀豆凝集素(Con A)：最早大规模提纯的一种凝集素，麦胚凝集素(WGA)等等。后来科学家在细菌、真菌，动物以及人体内都发现了这类蛋白质。在人体内，存在很多与免疫相关的凝集素，例如Galectin家族，C-type lectins和Siglecs家族等。
根据凝集素的结合糖的不同，我们可以将凝集素分为七类：1)识别葡萄糖(Glucose)，例如香蕉凝集素；2)识别甘露糖(Mannose)，例如Con A、LCA；3)识别N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)，例如WGA，PVL；4)识别N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，例如SBA；5)识别半乳糖(Gal)，例如RCA I；6)识别岩藻糖(Fucose),例如UEA-I；7)识别唾液酸(Sialic acid)，例如SNA。自然界就存在7种单糖，复杂糖结构都是有这些单糖合成而来，同时单糖之间存在不同的连接方式。正是由于糖结构的组成多样性以及连接的多样性，产生了复杂多样的糖结构异构体。
在肿瘤发生过程中，肿瘤细胞的表面或者肿瘤病人的血清都有很多糖结构发生了变化。已经有文献报道，在肺癌病人血清中，唾液酸的修饰明显增多；在胰腺癌、结肠癌以及胃癌等癌症病人血清中，唾液酸化的Lewis A结构增多。同时Bisecting GlcNAc糖结构发生在很多肿瘤中，而正常细胞很少会有这种糖基化修饰。
AAL-2(Agrocybe aegerita lectin-2)是本课题组从杨树菇里提取的一种凝集素(杨树菇凝集素AAL-2及其编码基因、其制备方法和应用，ZL201110218000.5)，AAL-2的氨基酸序列和AAL-2结晶的结果显示，AAL2是一个规则的螺旋桨结构，称之为β-propeller。β-propeller由7个高度均一的结构域组成，每个结构域是由4个反平行的β-strands组成的β-sheet。按照序列的顺序四个β折叠片走向呈现一个“W”形状，因此，每个结构域被称为一个W-motif，从末端的结构域向后依次命名为W I-W VII。如图1序列可知，AAL-2有6个CRD(糖结合域)，每个W-motif拥有一个，W I除外。CRD(糖结合域)由两部分组成，W-modif之间的连接部分和下一个W-Modif内β2和β3之间的loop区的氨基酸。各个W-motif的叠合说明每个CRD的序列和结构相似性很大，但不完全相同。ITC结果表明AAL-2对GlcNAc单糖有很高的亲和力。同时通过美国CFG糖谱测序表明，AAL-2能够特异性的优先结合以GlcNAc为末端的糖(Ren XM et al，Structural Basis of Specific Recognition of Non-ReducingTerminal N-Acetylglucosamine by an Agrocybe aegerita Lectin.PLos ONE.2015；10(6):e0129608)。因此，为了进一步提高杨树菇凝集素AAL-2的特异性，很有必要对其进行进一步的深入研究，从而确定AAL-2的CRD中哪些位点是与GlcNAc结合的关键点。
发明内容
为了进一步提高杨树菇凝集素AAL-2的特异性，本发明通过改造杨树菇凝集素AAL-2的基因，获得成功表达的杨树菇凝集素MUT-AAL2及其衍生蛋白，并用于特异识别GlcNAc为末端的糖结构。
本发明的第一方面，提供一种改造的杨树菇凝集素，所述改造的杨树菇凝集素是将AAL-2的氨基酸序列SEQ ID NO：1的6个糖结合域，即CRD第一部分即W-modif之间的连接部分置换成完全相同的氨基酸序列DFGX1X2X3GWX4X5X6X7H，其中，X1-7为20种氨基酸的任意一种，同时，将CRD第二部分即下一个W-modif内β2和β3之间的loop区的第一个氨基酸都改造为E；或者，置换后的CRD第一部分序列为DFGX1X2X3X4GWX5X6X7X8H，其中，X1-8为20种氨基酸的任意一种，第二部分即下一个W-modif内β2和β3之间的loop区的第一个氨基酸都置换为D。
优选地，提供一种改造的杨树菇凝集素，所述改造的杨树菇凝集素为：
1)MUT-AAL2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
或
2)SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的6个糖结合域，即CRD的第一部分即W-modif之间的连接部分的氨基酸序列均为DFGVQQGWTVSKH，将CRD第二部分即下一个W-modif内β2和β3之间的loop区的第一个氨基酸都改造为E，其余氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一段氨基酸序列而获得的仍具有SEQ ID NO:2所示蛋白质功能的衍生序列；
或
3)SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的6个CRD的第一部分即W-modif之间的连接部分的氨基酸序列均为DFGVQQGWTVSKH，第二部分即下一个W-modif内β2和β3之间的loop区的第一个氨基酸都改造为E，其余氨基酸序列与SEQ ID NO:2的同源性在90％以上，且具有SEQID NO:2所示蛋白质功能的氨基酸序列构成的蛋白质。
进一步地，所述的杨树菇凝集素MUT-AAL2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
优选地，提供一种改造的杨树菇凝集素，所述改造的杨树菇凝集素为：
1)MUT-1-AAL2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
或
2)SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的6个糖结合域，即CRD的第一部分即W-modif之间的连接部分的氨基酸序列均为DFGYDAGGWRLDRH，CRD第二部分即下一个W-modif内β2和β3之间的loop区的第一个氨基酸都改造为D，其余氨基酸序列经取代、缺失和/或添加一段氨基酸序列而获得的仍具有SEQ ID NO:3所示蛋白质功能的衍生序列；
或
3)SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的6个CRD的第一部分即W-modif之间的连接部分的氨基酸序列均为DFGYDAGGWRLDRH，CRD第二部分即下一个W-modif内β2和β3之间的loop区的第一个氨基酸都改造为D，其余氨基酸序列与SEQ ID NO:3的同源性在90％以上，且具有SEQ ID NO:3所示蛋白质功能的氨基酸序列构成的蛋白质。
进一步地，所述的杨树菇凝集素MUT-1-AAL2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
本发明第二方面，提供一种改造杨树菇凝集素的制备方法，包括如下步骤：
(1)将AAL-2的6个CRD完全置换成序列相同的CRD，置换后的序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5，合成MUT-AAL2基因或MUT-1-AAL2基因；
(2)构建改造的杨树菇凝集素重组质粒：将MUT-AAL2基因或MUT-1-AAL2基因分别插入到载体pET-30a的NdeI和HindIII限制酶切位点上；
(3)构建含有MUT-AAL2基因或MUT-1-AAL2基因的重组表达菌株：将重组质粒转化到克隆菌DH5α中提取质粒，最后转化到表达菌BL21(DE3)中，形成BL21-MUT-AAL2或BL21-MUT-1-AAL2基因；
(4)凝集素蛋白MUT-AAL2或MUT-1-AAL2的制备：取单克隆在LB培养基中过夜扩大培养，然后以1：100比例将表达菌转入到60ml新鲜的LB培养基中培养7h，随后转入到6L LB培养基培养3h使表达菌生长到对数期即OD值达到0.6-1.0，最后经1mM IPTG 16℃诱导表达12h，4000rpm离心30min，用100ml PBS重悬沉淀，超声破碎后12000rpm离心30min，将上清过0.22μm滤膜后上样于预先用PBS平衡好的GlcNAc-Sepharose 6B亲和层析柱，然后用PBS洗涤1h，最后用200mM GlcNAc洗脱，收集洗脱峰，用ddH2O超滤，随后冻干，得到MUT-AAL2蛋白或MUT-1-AAL2蛋白。
本发明第三方面，提供杨树菇凝集素MUT-AAL2或MUT-1-AAL2在鉴定以N-乙酰葡萄糖胺为末端的糖结构的用途。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的凝集素蛋白MUT-AAL2在CFG糖谱结果表明，与AAL-2相比，MUT-AAL2对以GlcNAc为末端的糖结构有更强的特异性。本发明凝集素蛋白MUT-AAL2或MUT-1-AAL2与AAL2相比丧失了结合细胞表面的活性，因此MUT-AAL2或MUT-1-AAL2在识别GlcNAc末端的糖结构方面具有更大的应用潜力。
附图说明
图1为改造AAL-2的技术路线，框代表CRD，星号代表CRD的保守序列。
图2为MUT-AAL2经过GlcNAc纯化后的SDS-PAGE结果。
图3为AAL-2和MUT-AAL2的糖谱数据经过均一化处理后的对比结果，以各个组最大吸光值在10％以下为0。
A是具体AAL2和MUT-AAL2结合糖的糖谱差异；B图为AAL2和MUT-AAL2的结合差异的糖结构。
图4为MUT-AAL2一系列突变的表达。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
本实验所涉及的分子生物学方法为常规方法，为本领域人员所熟知。本发明中未详细阐述的内容请参见《分子克隆实验指南》，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔等主编。
本发明针对ZL 201110218000.5中的杨树菇凝集素AAL-2的基因进行改造。
【实施例1】AAL-2的基因改造
AAL2结晶结果显示，AAL2是一个规则的螺旋桨结构，称之为β-propeller。β-propeller由7个高度均一的W-modif结构域组成。如图1序列可知，每一个W-modif由四个β折叠组成，每个CRD(糖结合域)由W-modif之间的连接部分和下一个W-modif内的β2和β3之间的loop区的氨基酸，通过比较不同凝集素的序列发现，特异性好的凝集素往往有多个CRD，并且CRD之间序列高度相似，所以为了进一步提高AAL2的特异性，我们将AAL2的6个CRD进行基因改造，置换成统一CRD(序列为DFGVQQGWTVSKH(相隔19个氨基酸)E)，命名为MUT-AAL2，技术策略如图1所示。所有改造的基因序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
【实施例2】MUT-AAL2的克隆与表达
将MUT-AAL2基因通过NdeI和HindIII限制酶切位点插入到pET-30a上，将重组质粒转化到克隆菌DH5α中提取质粒，最后转化到表达菌BL21(DE3)中，挑取单克隆在1ml LB培养基中过夜扩大培养，然后以1：100菌液比例转入到60ml LB(分4个10ml，4个5ml试管培养基)培养基中培养7h，随后转入到6L(4个1.5L培养基)的LB培养基中，扩大培养3h使OD值达到0.6-1.0，然后加入IPTG使终浓度为1mM，16℃，160rpm诱导12h。
【实施例3】MUT-AAL2的分离纯化
将6L菌液4000rpm离心30min，去上清，用100ml 0.01M PBS将沉淀重悬混匀。超声破碎，功率为200W，破碎10s，停10s，共90次。破碎完毕后12000rpm离心30min收集上清蛋白样，过0.22μm滤膜除去不溶物。开始上样于预先已经用PBS平衡好的GlcNAc-Sepharose 6B亲和层析柱，上完样后，用PBS洗涤层析柱直到蛋白检测仪所测值不再变化，大约需要1h，最后用200mM GlcNAc(用PBS配置)进行洗脱，收集洗脱峰，开始用10K超滤管超滤，多次离心用ddH2O置换洗脱buffer，最后冻干蛋白。结果显示改造得到大量MUT-AAL2蛋白。跑胶结果如图2。层析柱用ddH2O洗涤后用20％乙醇保存。
【实施例4】AAL2和MUT-AAL2糖谱分析
本实验交由美国CFG(Consortium for Functional Glycomics)完成，将609个糖结构固定芯片上，每个糖结构有6个重复孔，然后孵育biotin标记的MUT-AAL2，最后孵育识别biotin的荧光二抗，测吸光值，结果如图3。MUT-AAL2识别GlcNAc末端的糖结构与AAL2相比更少，同时MUT-AAL2与GalNAcβ1-3GalNAc、Neu5Acα2-6GlcNAcβ1-4GlcNAc和Neu5Acα2-6GlcNAc-β-4GlcNAcβ1-4GlcNAc的结合力大大下降，综合而言MUT-AAL2的特异性更高。【实施例5】MUT-AAL2的基因突变研究
对MUT-AAL2的序列进行进一步突变研究，所有突变如图4所示，基因突变具体如下：
1)在MUT-AAL2的N端或者C端带上his标签；
2)对MUT-AAL2前19个氨基酸进行缺失突变；
3)将MUT-AAL2的6个CRD换成序列(DFGYDAGGWRLDRH(相隔19个氨基酸)D))，命名MUT-1-AAL2；
克隆纯化过程和MUT-AAL2完全相同。结果显示MUT-AAL2的一系列的突变体都可以结合GlcNAc，都可以通过偶联GlcNAc的亲和柱纯化出来。MUT-1-AAL2的CRD和MUT-AAL2的CRD高度同源，MUT-1-AAL2和MUT-AAL2的CRD保留了CRD的核心氨基酸DFGX1X2X3GWX4X5X6X7H或DFGX1X2X3X4GWX5X6X7X8H，所以其中的加粗部分氨基酸DFG、GW、H在识别GlcNAc中有重要作用。
【实施例6】MUT-AAL2及其一系列基因突变产物的细胞结合研究
首先所有的蛋白样品用biotin标记，20μg/ml标记的蛋白样品与不同的细胞(1×106/100μL)4℃孵育1h，用PBS清洗3次，100g离心10min，用100μL PBS重悬细胞。开始孵育识别biotin的FITC标记的链亲合素，室温30min，PBS清洗3次后过300目尼龙布，流式检测细胞表面的结合情况。检测细胞内部染色情况，首先将细胞用4％多聚甲醛固定，随后用10％Triton X-100透化处理，后面步骤一样。结果如表1，AAL2可以结合所有检测的细胞表面，MUT-AAL2不能结合细胞表面，但结合细胞内部。细胞膜表面有着复杂的糖结构，MUT-AAL2失去了结合细胞表面的能力，但保留了结合细胞质糖基的能力，说明MUT-AAL2与AAL2相比有更强的特异性。同时MUT-AAL2的一系列突变对细胞膜和细胞质中的糖基结合与MUT-AAL2一致，说明在CRD以外的多个区域的突变没有影响到其对GlcNAc结合的高度特异性。
表1
Figure GDA0002583115230000071
+代表结合，-代表不结合。
MUT-AAL2的突变体包括：MUT-N-His-AAL2；MUT-C-His-AAL2；MUT-Δ19-AAL2；MUT-1-AAL2。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 一种改造的杨树菇凝集素蛋白及其制备方法和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 407
<212> PRT
<213> 杨树菇(Agrocybe aegerita)
<400> 1
Met Thr Ser Asn Val Ile Thr Gln Asp Leu Pro Ile Pro Val Ala Ser
1 5 10 15
Arg Gly Phe Ala Asp Ile Val Gly Phe Gly Leu Asp Gly Val Val Ile
20 25 30
Gly Arg Asn Ala Val Asn Leu Gln Pro Phe Leu Ala Val Lys Asn Phe
35 40 45
Ala Gln Asn Ala Gly Gly Trp Leu Thr Thr Lys His Val Arg Leu Ile
50 55 60
Ala Asp Thr Thr Gly Thr Gly Lys Gly Asp Ile Val Gly Phe Gly Asn
65 70 75 80
Ala Gly Val Tyr Val Ser Val Asn Asn Gly Lys Asn Thr Phe Ala Asp
85 90 95
Pro Pro Lys Met Val Ile Ala Asn Phe Gly Tyr Asp Ala Gly Gly Trp
100 105 110
Arg Val Glu Lys His Leu Arg Tyr Leu Ala Asp Ile Arg Lys Ile Gly
115 120 125
Arg Ala Asp Ile Ile Gly Phe Gly Glu Lys Gly Val Leu Val Ser Arg
130 135 140
Asn Asn Gly Gly Leu Asn Phe Gly Pro Ala Thr Leu Val Leu Lys Asp
145 150 155 160
Phe Gly Tyr Asp Ala Gly Gly Trp Arg Leu Asp Arg His Leu Arg Phe
165 170 175
Leu Ala Asp Val Thr Gly Asn Gly His Leu Asp Ile Val Gly Phe Gly
180 185 190
Asp Lys His Val Phe Ile Ser Arg Asn Asn Gly Asp Gly Thr Phe Ala
195 200 205
Pro Ala Lys Ser Val Ile Asp Asn Phe Cys Ile Asp Ala Gly Gly Trp
210 215 220
Lys Ile Gly Asp His Pro Arg Phe Val Ala Asp Leu Thr Gly Asp Gly
225 230 235 240
Thr Ala Asp Ile Ile Gly Cys Gly Lys Ala Gly Cys Trp Val Ala Leu
245 250 255
Asn Asn Gly Gly Gly Val Phe Gly Gln Val Lys Leu Val Ile Asn Asp
260 265 270
Phe Gly Thr Asp Lys Gly Trp Gln Ala Ala Lys His Pro Arg Phe Ile
275 280 285
Ala Asp Leu Thr Gly Asn Gly Arg Gly Asp Val Val Gly Phe Gly Asn
290 295 300
Ala Gly Val Tyr Val Ala Leu Asn Asn Gly Asp Gly Thr Phe Gln Ser
305 310 315 320
Ala Lys Leu Val Leu Lys Asp Phe Gly Val Gln Gln Gly Trp Thr Val
325 330 335
Ser Lys His Arg Arg Phe Val Val Asp Leu Thr Gly Asp Gly Cys Ala
340 345 350
Asp Ile Ile Gly Phe Gly Glu Lys Glu Thr Leu Val Ser Tyr Asn Asp
355 360 365
Gly Lys Gly Asn Phe Gly Pro Val Lys Ala Leu Thr Asn Asp Phe Ser
370 375 380
Phe Ser Gly Gly Lys Trp Ala Pro Glu Thr Thr Val Cys Trp Met Ala
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<211> 403
<212> PRT
<213> 杨树菇(Agrocybe aegerita)
<400> 2
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385 390 395 400
Ser Arg His
<210> 3
<211> 409
<212> PRT
<213> 杨树菇(Agrocybe aegerita)
<400> 3
Met Thr Ser Asn Val Ile Thr Gln Asp Leu Pro Ile Pro Val Ala Ser
1 5 10 15
Arg Gly Phe Ala Asp Ile Val Gly Phe Gly Leu Asp Gly Val Val Ile
20 25 30
Gly Arg Asn Ala Val Asn Leu Gln Pro Phe Leu Ala Val Lys Asp Phe
35 40 45
Gly Tyr Asp Ala Gly Gly Trp Arg Leu Asp Arg His Val Arg Leu Ile
50 55 60
Ala Asp Thr Thr Gly Thr Gly Lys Gly Asp Ile Val Gly Phe Gly Asp
65 70 75 80
Ala Gly Val Tyr Val Ser Val Asn Asn Gly Lys Asn Thr Phe Ala Asp
85 90 95
Pro Pro Lys Met Val Ile Ala Asp Phe Gly Tyr Asp Ala Gly Gly Trp
100 105 110
Arg Leu Asp Arg His Leu Arg Tyr Leu Ala Asp Ile Arg Lys Ile Gly
115 120 125
Arg Ala Asp Ile Ile Gly Phe Gly Asp Lys Gly Val Leu Val Ser Arg
130 135 140
Asn Asn Gly Gly Leu Asn Phe Gly Pro Ala Thr Leu Val Leu Lys Asp
145 150 155 160
Phe Gly Tyr Asp Ala Gly Gly Trp Arg Leu Asp Arg His Leu Arg Phe
165 170 175
Leu Ala Asp Val Thr Gly Asn Gly His Leu Asp Ile Val Gly Phe Gly
180 185 190
Asp Lys His Val Phe Ile Ser Arg Asn Asn Gly Asp Gly Thr Phe Ala
195 200 205
Pro Ala Lys Ser Val Ile Asp Asp Phe Gly Tyr Asp Ala Gly Gly Trp
210 215 220
Arg Leu Asp Arg His Pro Arg Phe Val Ala Asp Leu Thr Gly Asp Gly
225 230 235 240
Thr Ala Asp Ile Ile Gly Cys Gly Asp Ala Gly Cys Trp Val Ala Leu
245 250 255
Asn Asn Gly Gly Gly Val Phe Gly Gln Val Lys Leu Val Ile Asn Asp
260 265 270
Phe Gly Tyr Asp Ala Gly Gly Trp Arg Leu Asp Arg His Pro Arg Phe
275 280 285
Ile Ala Asp Leu Thr Gly Asn Gly Arg Gly Asp Val Val Gly Phe Gly
290 295 300
Asp Ala Gly Val Tyr Val Ala Leu Asn Asn Gly Asp Gly Thr Phe Gln
305 310 315 320
Ser Ala Lys Leu Val Leu Lys Asp Phe Gly Tyr Asp Ala Gly Gly Trp
325 330 335
Arg Leu Asp Arg His Arg Arg Phe Val Val Asp Leu Thr Gly Asp Gly
340 345 350
Cys Ala Asp Ile Ile Gly Phe Gly Asp Lys Glu Thr Leu Val Ser Tyr
355 360 365
Asn Asp Gly Lys Gly Asn Phe Gly Pro Val Lys Ala Leu Thr Asn Asp
370 375 380
Phe Ser Phe Ser Gly Gly Lys Trp Ala Pro Glu Thr Thr Val Cys Trp
385 390 395 400
Met Ala Asn Leu Asp Ser Ser Arg His
405
<210> 4
<211> 1212
<212> DNA
<213> 杨树菇(Agrocybe aegerita)
<400> 4
atgaccagca acgtcatcac gcaggatctg cctatcccag tcgcatctcg tggtttcgct 60
gatatcgtgg gtttcggtct ggatggtgtc gtcatcggtc gcaacgcagt aaacctgcag 120
ccattcctgg cagttaaaga ctttggtgtg caacagggtt ggaccgtaag caagcacgtg 180
cgtctgatcg cagatacgac tggtacgggt aaaggtgaca tcgtgggctt cggtgaagct 240
ggtgtgtacg tgtctgtgaa caacggcaag aacacctttg ccgacccgcc gaagatggtt 300
atcgctgact tcggtgtgca gcaaggttgg actgtttcta aacatctgcg ctacctggca 360
gacatccgta agatcggtcg tgctgacatc atcggctttg gtgagaaagg tgtgctggtg 420
tcccgtaaca acggtggtct gaacttcggt ccggctactc tggttctgaa agacttcggc 480
gttcagcagg gctggacggt tagcaaacac ctgcgctttc tggctgatgt tactggtaac 540
ggtcacctgg atatcgtcgg tttcggcgag aaacacgtct tcatctcccg taataatggt 600
gacggcacct tcgcgccggc caaatccgtt attgacgatt tcggtgttca gcaaggctgg 660
accgtttcca agcatccgcg ctttgttgct gacctgaccg gtgacggtac tgcagatatt 720
attggttgtg gcgaagccgg ctgttgggtt gccctgaata acggcggtgg cgtattcggc 780
caggttaaac tggttattaa cgactttggc gtgcagcagg gttggaccgt atccaaacac 840
ccgcgtttca ttgcggatct gaccggcaac ggtcgtggtg acgttgttgg cttcggcgaa 900
gcgggtgtat atgttgcgct gaacaatggc gatggtacct tccagtctgc gaaactggta 960
ctgaaagatt tcggcgtgca gcagggctgg actgtaagca aacatcgtcg tttcgttgtg 1020
gacctgactg gcgacggctg cgcggacatt attggctttg gcgaaaaaga aaccctggta 1080
tcttacaacg atggcaaagg caacttcggc ccggttaaag cgctgaccaa cgatttctcc 1140
tttagcggcg gcaaatgggc gccggaaacc accgtatgct ggatggcgaa cctggattct 1200
tctcgccact aa 1212
<210> 5
<211> 1230
<212> DNA
<213> 杨树菇(Agrocybe aegerita)
<400> 5
atgaccagca acgtcatcac gcaggacctg ccaatcccag tggcttctcg tggtttcgca 60
gatatcgtgg gtttcggtct ggacggtgtg gttatcggtc gtaacgctgt caacctgcag 120
ccgttcctgg cagttaaaga cttcggttac gacgcgggtg gctggcgcct ggatcgtcat 180
gtacgtctga ttgcagatac taccggtact ggtaaaggcg acatcgtggg cttcggtgac 240
gctggtgttt acgtcagcgt gaacaatggc aagaacacct tcgctgaccc gccgaagatg 300
gttattgcgg actttggtta cgatgcaggt ggttggcgtc tggaccgtca cctgcgttac 360
ctggcagata ttcgtaagat cggtcgcgcg gacatcatcg gcttcggcga caaaggtgtg 420
ctggtgtctc gtaacaacgg tggtctgaac ttcggtccgg caactctggt gctgaaagat 480
ttcggctacg acgctggcgg ttggcgcctg gatcgtcatc tgcgctttct ggctgatgtt 540
actggcaacg gtcacctgga tatcgttggc tttggtgaca aacacgtctt catctcccgt 600
aataacggcg acggcacgtt cgccccggcc aaatccgtta tcgacgactt cggctatgac 660
gctggtggtt ggcgtctgga tcgccaccct cgctttgtag cagatctgac tggtgacggc 720
accgcggata ttattggttg tggtgacgca ggttgctggg tagctctgaa taacggtggc 780
ggtgtattcg gtcaagttaa actggtcatc aacgactttg gctatgacgc cggcggttgg 840
cgtctggacc gtcatccgcg tttcattgcc gacctgaccg gtaacggtcg tggcgatgtt 900
gttggtttcg gcgatgctgg cgtttacgtt gcgctgaaca acggcgatgg taccttccag 960
tccgcgaaac tggttctgaa agatttcggc tacgatgcgg gcggctggcg cctggatcgt 1020
caccgccgct ttgttgtaga cctgacgggc gatggctgtg cggacattat cggctttggc 1080
gataaagaga ccctggtatc ttataacgat ggcaaaggta acttcggccc ggtgaaagcg 1140
ctgaccaatg atttctcctt tagcggcggc aaatgggcgc cggaaaccac cgtatgctgg 1200
atggccaacc tggactcttc tcgtcactaa 1230

Claims (6)

1.一种改造的杨树菇凝集素，其特征在于，所述改造的杨树菇凝集素为MUT-AAL2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种改造的杨树菇凝集素的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示。
3.一种改造的杨树菇凝集素，其特征在于，所述改造的杨树菇凝集素为MUT-1-AAL2，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4.一种改造的杨树菇凝集素的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示。
5.一种权利要求1或3所述的改造的杨树菇凝集素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将AAL-2的6个CRD完全置换成序列相同的CRD，置换后的序列如SEQ ID NO:4或SEQID NO:5，合成MUT-AAL2基因或MUT-1-AAL2基因；
（2）构建改造的杨树菇凝集素重组质粒：将MUT-AAL2基因或MUT-1-AAL2基因分别插入到载体pET-30a的NdeI和HindIII限制酶切位点上；
（3）构建含有MUT-AAL2基因或MUT-1-AAL2基因的重组表达菌株：将重组质粒转化到克隆菌DH5α中提取质粒，最后转化到表达菌BL21（DE3）中，形成BL21-MUT-AAL2或BL21-MUT-1-AAL2基因；
（4）凝集素蛋白MUT-AAL2或MUT-1-AAL2的制备：挑取单克隆在LB培养基中过夜扩大培养，然后以1：100比例将表达菌转入到60ml新鲜的 LB培养基中培养7h，随后转入到6L LB培养基培养3h使表达菌生长到对数期即OD值达到0.6-1.0，最后经1mM IPTG 16℃诱导表达12h，4000rpm离心30min，用100ml PBS重悬沉淀，超声破碎后12000rpm离心30min，将上清过0.22μm滤膜后上样于预先用PBS平衡好的GlcNAc- Sepharose 6B亲和层析柱，然后用PBS洗涤1h，最后用200mM GlcNAc洗脱，收集洗脱峰，用ddH2O超滤，最后冻干，得到MUT-AAL2蛋白或MUT-1-AAL2蛋白。
6.权利要求1或3所述的改造的杨树菇凝集素在鉴定以N-乙酰葡萄糖胺为末端的糖结构的用途。
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