KR101673195B1 - 구멍장이 버섯 유래의 시알산 결합 특이적인 재조합 렉틴 - Google Patents
구멍장이 버섯 유래의 시알산 결합 특이적인 재조합 렉틴 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101673195B1 KR101673195B1 KR1020130140154A KR20130140154A KR101673195B1 KR 101673195 B1 KR101673195 B1 KR 101673195B1 KR 1020130140154 A KR1020130140154 A KR 1020130140154A KR 20130140154 A KR20130140154 A KR 20130140154A KR 101673195 B1 KR101673195 B1 KR 101673195B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- oligosaccharide
- lectin
- gal
- sialic acid
- residue
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
- C07K14/375—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from Basidiomycetes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
- C07K14/42—Lectins, e.g. concanavalin, phytohaemagglutinin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/848—Escherichia
- Y10S435/849—Escherichia coli
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Botany (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 Escherichia coli PSL1b 균주(기탁번호: KCTC12507BP) 또는 Pichia pastoris PSL1b 균주(기탁번호:KCTC12500BP)로 부터 시알산 당사슬에 특이적으로 결합하는 구멍장이(Polyporus squamosus) 버섯 유래의 PSL1b 재조합 렉틴을 생산하는 방법 및 이로부터 생산된 렉틴을 제공함으로써, 시알산 당사슬에 특이적으로 결합하는 재조합 렉틴을 포함하는 시알산 당사슬을 갖는 당단백질, 당펩타이드, 당지질, 당전구체 또는 올리고당의 측정, 검출용 조성물 또는 키트의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 시알산 당사슬에 선택적 결합을 하는 구멍장이(Polyporus squamosus)버섯 유래의 렉틴을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 이종 숙주에서 발현시킨 활성형의 렉틴 단백질, 상기의 단백질을 생산하는 재조합 형질전환체, 및 이를 이용하여 시알산 당사슬을 포함한 당단백질, 당펩타이드, 당지질, 올리고당 또는 이와 유사한 당사슬 구조를 갖는 생물학적 물질을 측정하는 방법에 관한 것이다.
시알산(Sialic acid, Neu5Ac)은 9개의 탄소를 갖는 알파-케토알도닉산 으로 종종 당단백질, 당지질, 올리고당 등의 당사슬이 포함된 당전구체의 비환원형의 말단에 위치한 당이다. 시알산은 당사슬 전구체(glycoconjugate)의 말단에 위치한 당으로, 지금까지 자연계에서 약 80여종 이상의 시알산이 부가된 당쇄 전구체들이 발견되었다. 시알산은 포유류에 있어서 세포간 상호작용, 세포 내의 시그널을 결정하는 전구체의 역할, 당단백질의 안정화 등 세포 내의 생물학적 현상에 중요한 역할을 한다. 특히, 생체 내의 시알산은 병원체 감염시 최초 인지되는 당쇄 중의 하나로 알려져 있으며(Sasisekharan and Myette, 2003, Am . Sci . 91, 432; Vimr and Lichtensteiger, 2002, Trends Microbiol . 10, 254), 세포표면에 존재하는 시알산은 병원 미생물 자체에서도 면역 회피 반응이나 세포 보호를 위한 캡슐 형태의 다당성 올리고당을 구성하는 성분으로 알려져 있다(Vimr et al., 2004, Microbiol . Mol. Biol . Rev . 68, 132). 화학구조상으로 시알산은 두번째 탄소의 아노머릭(anomeric) 위치에 연결되어 있는 카복실 그룹, 세 번째 탄소의 디옥시(deoxy), 그리고 여섯 번째 탄소에 분기되어 있는 글리세롤 구조를 포함하는 복잡한 화학구조를 이루고 있다. 특히 시알산을 포함하고 있는 당사슬의 시알산화 글라이코컨쥬게이트(sialoglycoconjugate) 구조에 있어 시알산은 알파(2,3)-, 알파(2,6)-, 알파(2,8)-, 알파(2,9)-결합으로 다른 당들과 결합을 하며, 또한 시알산당의 수산화 잔기가 O-아세틸(O-acetyl), O-포스페이트(O-phosphate), O-설페이트(O-sulfate), O-메틸(O-methyl) 그룹으로 치환되어 있어 더욱 복잡한 화학 구조를 구성한다고 알려져 있다. 따라서 이러한 구조적 복잡성으로 인하여 정확하게 시알산이 포함된 당사슬 구조를 측정하기가 용이하지 않다. 최근에 첨단 기술의 발전으로 질량분석기, 핵자기공명분광기 등을 기반한 분석기술의 발전으로 시알산을 포함한 당사슬의 분석이 정확하게 이루어지고 있으나, 시료가 소량인 바이오 샘플 특수성과 분석을 위한 시료 준비의 복잡성 등의 문제로 분석 준비에 아직 많은 시간이 소요되는 단점을 안고 있다(Cohen and Varki, 2010, OMICS 14, 455; Alley et al. 2013, Chem . Rev . 113, 2668).
이러한 복잡한 시알산 당사슬의 구조를 간편하게 측정하기 위하여, 당사슬과 당사슬에 선택적인 결합을 하는 단백질인 렉틴을 이용하여 당사슬의 구조를 측정하려는 기술이 개발되고 있다 (Vanderschaeghe et al., 2010, Biol . Chem . 391, 149; Hsu and Mahal, 2009, Curr . Opin . Chem . Biol . 13, 427). 렉틴(Lectin)은 미생물에서 고등동물에 이르기까지 존재하는 당사슬에 결합할 수 있는 단백질의 하나로, 생명체에 있어 당사슬과의 특이적인 결합을 통해 protein quality control, host-pathogen interaction, cell-cell communication, inflammation, immune response, cancer progression, development등 다양한 생명현상에 관여한다 (Lam and Ng, 2011. Appl . Microbiol . Biotechnol . 89, 45). 렉틴은 multivalent, 효소의 활성을 포함하지 않고, 항체의 성격을 포함하지 않는 단백질로, 19세기말 러시아의 Sillmark에 의해 최초로 Ricinus communis에서 분리된 이후, 현재까지 Concanavlain A (ConA)를 비롯하여 40여종의 렉틴이 연구 및 다양한 용도로 사용되고 있다. 지금까지 개발되어 있는 렉틴은 다양한 천연소재로부터 분리, 정제되어 시알산(Neu5Ac, Neuraminic acid), 갈락토즈(Gal, galactose), N-아세틸갈락토사민(N-GalNAc, N-acetylgalactosamine), 퓨코즈(Fuc, Fucose), 만노즈(Man, Mannose), 글루코스(Glc, glucose)의 기본 모노머를 측정할 수 있는 렉틴이 보고되고 있다(Lehmann et al., 2006, Cell . Mol . Life Sci . 63, 1331; Singh et al., 2010 Crit . Rev . Biotechnol . 30, 99; Kajiwara et al., 2010, Microbes Environ . 25, 152).
하지만, 알파(alpha), 베타(beta)-결합(linkage)을 갖는 당사슬(glycoconjugate)의 구조상 다양성과 당사슬 체인 구성 시 모노머 간의 결합 조합(combination)의 다양성, 또한 α-/β-linkage 및 combination으로 경우 수백, 수천종 이상의 다양한 당사슬의 구조가 이론적으로 자연계에 존재하지만 이를 측정할 수 있는 현재까지 개발된 렉틴의 경우 그 수가 적어 다양한 당사슬을 측정하는데 한계가 있다고 할 수 있다. 특히, 시알산(Neu5Ac) 당사슬을 측정할 수 있는 Maackia amurensis(MAA), Sambucus nigra(SNA), Limulus polyphemus 렉틴이 있으나, 해당 렉틴의 경우 시알산 당사슬의 화학적 특이성인 α2,3-, α2,6-, α2,8-결합을 정확하게 구분하지 못할뿐더러, 시알산이 결합하고 있는 Gal, GalNAc 등을 인지하여 결합하기 때문에 nonspecific binding으로 인한 시그널을 보이는 단점이 있다. 따라서, 신규 시알산 결합 특이적인 렉틴 개발이 요구되고 있다.
구멍장이버섯(Polyporus squamosus) 유래의 렉틴은 해당 버섯의 자실체(fruiting body)로 부터 β-galactosyl-Synsorb 컬럼, DEAE-Sephacel 이온 교환컬럼을 이용하여 분리 정제되었으며, 크기가 약 28 kDa이며, Neu5Acα(2,6)Galβ1,4)Glc/GlcNAc의 당사슬에 선택적인 결합을 하는 것으로 알려져 있다(Mo et al., 2000, J. Biol . Chem . 275, 10623). 해당 렉틴의 부분적인 아미노산 서열을 기초로 제작된 프라이머를 이용하여 RACE(rapid amplification of cDNA ends) 방법으로 구멍장이버섯으로 부터 확보된 cDNA 서열은 858 bp와 876 bp의 염기서열을 갖는 두개의 이소렉틴(isolectin) PSL1a와 PSL1b을 코딩하는 단백질로 확인되었으며, 이들은 각각 이론적으로 31.04 kDa과 31.998 kD의 크기를 갖는 단백질로 추정된다 (Tateno et al. 2004, Biochem . J. 382, 667). 이중 PSL1a 렉틴을 코딩하는 염기서열은 대장균에서 발현되어 활성형 재조합 단백질로 분리정제 되어 그 특성이 규명되었으며, 최근에는 인간형의 인플루엔자 수용체(human-type influenza receptor) Neu5Acα(2,6)Galβ(1,4)GlcNAc와의 복합체로 PSL1a 렉틴의 3차원 단백질 구조가 규명되었다(Tateno et al. 2004, Biochem . J. 382, 667; Kadirvelraj et al., 2011, Glycobiology 21, 973). 하지만, 현재까지 PSL1b 렉틱을 코딩하는 염기서열이 대장균에서 비활성형 단백질로 생성되어 그 특성을 규명할 수 없는 실정이다(Tateno et al. 2004, Biochem . J. 382, 667).
이에, 본 발명자들은 시알산에 선택적으로 결합하는 이소렉틴 PSL1b을 이종 숙주에서 활성형 재조합 단백질로 수득하기 위하여 노력한 결과, 이소렉틴 PSL1b렉틴 단백질을 코딩하는 화학적으로 합성된 폴리뉴클레오티드를 대장균 및 효모의 이종 숙주 시스템에 도입하여 활성형 신규 재조합 렉틴 단백질을 획득하였으며, 상기 신규 재조합 렉틴 단백질은 시알산 당사슬을 포함하는 당단백질, 당지질, 올리고당등 다양한 당사슬 구조를 갖는 단백질, 당사슬 화합물의 측정, 미생물 모니터링 및 당사슬을 매개로 일어나는 생명현상 규명 등 광범위한 분야에 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 알파(2,6)-결합을 갖는 시알산에 선택적 결합을 하는 재조합 렉틴을 제공하는 것으로, 대장균 또는 효모에서 활성형의 재조합 렉틴 단백질을 수득하기 위해 화학적으로 합성된 해당 렉틴 단백질을 암호화하는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기의 폴리뉴클레오티드에서 전사, 번역되는 서열번호 2의 폴리펩티드를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기의 알파(2,6)-결합을 갖는 시알산에 선택적 결합을 하는 재조합 렉틴의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기의 형질 전환체로부터 재조합 렉틴 단백질의 정제 방법을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 또 다른 목적은 상기의 재조합 렉틴을 이용하여 시알산 당사슬을 포함하는당단백질을 측정하기 위한 렉틴 블롯에 이용하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 알파(2,6)시알산에 특이적으로 결합하는 렉틴을 암호화하는 서열번호 1의 염기 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 제 1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 제 3항의 발현벡터로 형질전환시킨 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 제 3항의 발현벡터로 형질전환시킨 박테리아 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은
a) 본 발명에 따른 박테리아 형질전환체를 배양하는 단계; 및
b) 본 발명에 따른 단계 a)의 배양물로부터 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 알파(2,6)시알산에 특이적으로 결합하는 재조합 렉틴의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 제조된 알파(2,6)시알산에 특이적으로 결합하는 재조합 렉틴을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 5의 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 발현벡터로 형질전환시킨 효모 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은
a) 본 발명에 따른 효모 형질전환체를 배양하는 단계; 및
b) 본 발명에 따른 단계 b)의 배양물로부터 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 알파(2,6)시알산에 특이적으로 결합하는 재조합 렉틴의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 방법으로 제조된 알파(2,6)시알산에 특이적으로 결합하는 재조합 렉틴을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 9의 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 알파(2,6)시알산 당사슬에 특이적으로 결합하는 재조합 렉틴 PSL1b 단백질을 생산하는, 수탁번호 KCTC12507BP로 기탁된 재조합 대장균(Escherichia coli) 균주를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 알파(2,6)시알산 당사슬에 특이적으로 결합하는 재조합 렉틴 PSL1b 단백질을 생산하는, 수탁번호 KCTC12500BP로 기탁된 재조합 효모(Polyporus squamosus) 균주를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은
a) 본 발명에 따른 균주를 배양하는 단계; 및
b) 상기 단계 b)의 배양물로부터 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 알파(2,6)시알산에 특이적으로 결합하는 재조합 렉틴의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 방법으로 제조된, 알파(2,6)시알산에 특이적으로 결합하는 재조합 렉틴을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 알파(2,6)시알산 당사슬에 특이적으로 결합하는 렉틴을 포함하는 당단백질, 당펩타이드, 당지질, 당전구체 또는 올리고당의 측정 또는 정량용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은
a) 본 발명에 따른 재조합 렉틴에 피검 시료를 접촉하는 단계; 및
b) 본 발명에 따른 재조합 렉틴에 결합된 당단백질, 당펩타이드, 당지질, 당전구체 또는 올리고당을 분석하는 단계를 포함하는, 시알산 당사슬을 포함하는 당단백질, 당펩타이드, 당지질, 당전구체 또는 올리고당으로 구성된 시알산화 당사슬(conjugated)의 측정 또는 정량 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은
a) 본 발명에 따른 재조합 렉틴에 피검 시료를 접촉하는 단계; 및
b) 본 발명에 따른 재조합 렉틴에 결합된 세포, 박테리아 또는 바이러스를 분석하는 단계를 포함하는, 시알산 당사슬을 갖는 세포주, 박테리아 또는 바이러스의 측정 또는 정량 방법을 제공한다.
본 발명은 알파(2,6) 결합 시알산 당사슬을 포함한 당단백질에 특이적으로 결합하는 구멍장이(Polyporus squamosus) 버섯 유래의 이소렉틴(isolectin) PSL1b 균주의 활성형 재조합 렉틴 단백질에 관한 것으로, Escherichia coli PSL1b 균주(기탁번호: KCTC12507BP) 또는 Pichia pastoris PSL1b 균주(기탁번호:KCTC12500BP)로부터 시알산 당사슬에 특이적으로 결합하는 구멍장이(Polyporus squamosus) 버섯 유래의 재조합 렉틴을 생산하는 방법 및 이로부터 생산된 렉틴을 제공함으로써, 시알산 당사슬을 갖는 당단백질, 당펩타이드, 당지질, 당전구체 또는 올리고당을 상기의 렉틴을 이용하여 측정할 수 있으며, 또한 시알산 당사슬을 갖는 세포, 박테리아 및 바이러스의 측정 또는 검출용 조성물 또는 키트의 유효성분으로 사용될 수 있다.
도 1은 대장균에서 화학적으로 합성된 구멍장이버섯 유래의 알파(2,6) 시알산에 선택적으로 결합하는 재조합 렉틴 PSL1b 단백질을 발현하는 플라스미드 pET-PSL1b 8xHis를 모식화한 도이다.
도 2는 효모에서 화학적으로 합성된 구멍장이 유래의 알파(2,6) 시알산에 선택적으로 결합하는 재조합 렉틴 PSL1b 단백질을 발현하는 플라스미드 pPICZα-PSL1b 8xHis를 모식화한 도이다.
도 3은 SDS-PAGE 분석을 통해 대장균에서 생산된 재조합 렉틴을 확인한 도이다.
도 4는 SDS-PAGE 분석을 통해 효모에서 생산된 재조합 렉틴을 확인한 도이다.
도 5는 렉틴 블랏을 이용하여 알파(2,6) 시알산전이효소(α2,6-sialyltransferase)에 의해 비시알산화페투인(asialofetuin)에 시알산이 부가된 시알산화 당단백질을 재조합 렉틴 PSL1b으로 알파(2,6) 시알산 당사슬을 측정한 것을 나타낸 도이다.
도 2는 효모에서 화학적으로 합성된 구멍장이 유래의 알파(2,6) 시알산에 선택적으로 결합하는 재조합 렉틴 PSL1b 단백질을 발현하는 플라스미드 pPICZα-PSL1b 8xHis를 모식화한 도이다.
도 3은 SDS-PAGE 분석을 통해 대장균에서 생산된 재조합 렉틴을 확인한 도이다.
도 4는 SDS-PAGE 분석을 통해 효모에서 생산된 재조합 렉틴을 확인한 도이다.
도 5는 렉틴 블랏을 이용하여 알파(2,6) 시알산전이효소(α2,6-sialyltransferase)에 의해 비시알산화페투인(asialofetuin)에 시알산이 부가된 시알산화 당단백질을 재조합 렉틴 PSL1b으로 알파(2,6) 시알산 당사슬을 측정한 것을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 알파(2,6)시알산에 특이적으로 결합하는 렉틴을 암호화하는 서열번호 1의 염기 서열로 구성된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 제 1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 제 3항의 발현벡터로 형질전환시킨 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 제 3항의 발현벡터로 형질전환시킨 박테리아 형질전환체를 제공한다.
상기 박테리아는 스타필로코코스 에우리우스(Staphylococcus aureus), 대장균(E. coli), 바실러스 세레우스(B. cereus), 살모넬라 타이피뮤림(Salmonella typimurium), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) 및 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나, 대장균(E. coli)이 더 바람직하다.
본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 본 발명자들은 구멍장이(Polyporus squamosus) 버섯 유래의 재조합 렉틴 단백질을 생산하기 위하여, 미국생물정보센터(National center for Biotechnology Information, NCBI, accession no. AB120707)의 쿼리 서열(query sequence)을 사용하여 유사한 유전자 서열 후보를 탐색하였으며, 디엔에이 2.0(DNA 2.0, 미국)사에서 본 발명에 따른 탐색 된 서열을 바탕으로 해당 유전자를 이종숙주 시스템에서 최적 발현시키기 위해 코돈 최적화 및 RNA 2차 구조 최적화 등을 통하여 구아닌과 시토신의 함량이 44.7%인 879 bp 폴리뉴클레오티드를 화학적으로 합성하였다. 본 발명에 따른 합성된 폴리뉴클레오티의 서열과 이로부터 전사 및 번역되어 생성되는 폴리펩티드는 서열번호 1과 서열번호 2와 같다. 구멍장이버섯 유래의 렉틴 PSL1b를 코딩하는 야생형 유전자와 화학적으로 합성한 유전자(표 1 참조) 및 코돈의 변화(표 2참조)를 나타내었다. 그런 다음, 확인된 폴리뉴클레오티드 유전자 정보를 바탕으로 렉틴 단백질을 대장균 발현 벡터에 클로닝을 하기 위하여 프라이머 서열번호 3 및 서열번호 4를 제작하였다(표 3 참조). 유전자 서열이 확인된 재조합 플라스미드 pET-PSL1b 8xHis(도 1 참조)는 재조합 렉틴 PSL1b 단백질의 생산을 위하여 최종적으로 대장균(Escherichia coli) BL21-CodonPlus(DE3)-RIL에 형질 전환시켰으며, 본 발명에 따른 재조합 렉틴 PSL1b을 발현하는 재조합 균주 Escherichia coli PSL1b는 2013년 11월 1일 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(KCTC12507BP). 또한, 상기에서 확인된 폴리뉴클레오티드 유전자 정보를 바탕으로 렉틴 단백질을 효모 발현 벡터에 클로닝을 하기 위하여 프라이머를 서열번호 7 및 서열번호 8(표 4 참조)로 제작하였다. 유전자 서열이 확인된 재조합 플라스미드 pPICZα-PSL1b 8xHis(도 2참조)는 재조합 렉틴 PSL1b 단백질 생산을 위하여, 최종적으로 피키아 패스토리스(Pichia pastoris) X-33에 형질 전환시켰으며, 본 발명에 따른 재조합 렉틴 PSL1b을 발현하는 재조합 균주 Pichia pastoris PSL1b는 2013년 10월 7일 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(KCTC12500BP). 본 발명에 따른 재조합 대장균들을 배양한 뒤, 원심분리기를 통해 상기 배양액에서 세포를 수득하였다. 수득한 세포에서 재조합 렉틴을 분리하기위하여 HisTrapTM FF 칼럼 크로마토그래피를 수행한 결과, 재조합 렉틴을 용출하였다. 본 발명에 따른 용출된 재조합 렉틴을 좀더 순수하게 분리하기 위하여 Superose 12 칼럼 크로마토그래피를 수행한 결과, 단백질 크기에 따라 용출되었으며 이때, 용출된 단백질은 아미콘 울트라 센트리푸갈 필터(Amicon®Ultra Centrifugal filter) 10K을 이용하여 농축시켰다. 상기 방법에 따라 수득한 조효소 용액을 SDS-PAGE를 이용하여 분리한 후, 코마시에 브릴리언트 블루(Coommassie Brilliant Blue)로 염색하였으며 Precision Plus ProteinTM Standards(Bio-Rad, USA) 단백질을 표준 단백질로 사용하여 상기 정제된 렉틴 단백질의 순도 및 크기를 분석한 결과, 대장균에서 분리 정제된 재조합 PSL1b 단백질의 크기는 약 32 kDa으로 확인되었다(도 3 참조). 아울러, 효모에서 재조합 렉틴을 정제하기 위하여, 본 발명에 따른 방법으로 제작한 형질전환된 재조합 효모 균주를 배양하여 배양액을 수득하였다. 상기 방법으로 제조된 효모 배양액으로부터 효모 세포와 배양 배지를 분리하기 위하여 원심 분리를 수행하였으며 침전물을 제거하고 상등액을 수득하였다. 상기 수득한 조효소액에서 재조합 렉틴을 정제하기 위하여 HisTrapTM FF 칼럼 크로마토그래피를 수행한 결과, 재조합 렉틴을 용출시켰다. 이때 용출된 단백질은 아미콘 울트라 센트리푸갈 필터(Amicon®Ultra Centrifugal filter) 10K을 이용하여 농축시켰다. 상기 방법을 사용하여 수득한 조효소 용액을 SDS-PAGE를 이용하여 분리한 후, 코마시에 브릴리언트 블루(Coommassie Brilliant Blue)로 염색하였으며 Precision Plus ProteinTM Standards(Bio-Rad, USA) 단백질을 표준 단백질로 사용하여 정제된 렉틴 단백질의 순도 및 크기를 분석한 결과, 효모에서 분리 정제된 재조합 PSL1b 단백질 크기는 대장균에서 분리된 단백질과 비교하였을 때, 효모에서 분리 정제된 재조합 PSL1b 단백질 크기가 약 40 kDa으로 조금 크게 확인되었으며, 이는 해당 렉틴 서열이 포함하고 있는 잠재적인 3개의 N-결합 글라이코실레이션에 의한 사이즈 증가로 추정하였다(도 4 참조). 또한, 상기 방법으로 분리된 단백질의 선택적 결합력을 확인하기 위하여, 렉틴 블랏을 수행한 결과, N-결합 당사슬의 기본 구조인 Neu5Ac α(2,6) Galβ(1,4)GlcNAc와 O-결합 당사슬 Neu5Ac α(2,6)Galβ(1,3)[GalNA, Neu5Acα(2,6)Galβ(1,3)[Neu5Ac α(2,6)Galβ(1,4)GalNAβ(1,6)]의 당사슬을 포함하는 페투인에서는 렉틴 블랏의 시그널은 관찰하였으나, 음성 대조군인 비시알산화페토인의 Galβ(1,4)GlcNAc의 비시알산화 N-당사슬과 Galβ(1,3), GlcNA, Galβ(1,3)[Galβ(1,4)GalNA β(1,6)]의 당사슬을 포함하는 단백질과 알파(2,3)시알산을 포함하는 페투인(소혈청유래, bovine serum fetuin)에서는 렉틴블랏 시그널이 확인되지 않았다(도 5 참조).
따라서, 본 발명의 알파(2,6) 결합 시알산 당사슬을 포함한 당단백질에 특이적으로 결합하는 구멍장이(Polyporus squamosus) 버섯 유래 이소렉틴(isolectin) PSL1b의 활성형 재조합 렉틴 단백질에 관한 것으로, Escherichia coli PSL1b 균주(기탁번호: KCTC12507BP) 또는 Pichia pastoris PSL1b 균주(기탁번호:KCTC12500BP)로부터 구멍장이(Polyporus squamosus) 버섯 유래의 시알산 당사슬에 특이적으로 결합하는 재조합 렉틴을 생산하는 방법 및 이로부터 생산된 렉틴을 제공함으로써, 시알산 당사슬을 갖는 당단백질, 당펩타이드, 당지질, 당전구체 또는 올리고당을 상기의 렉틴을 이용하여 측정할 수 있으며, 또한 시알산 당사슬을 갖는 세포, 박테리아 및 바이러스의 측정 또는 검출용 조성물 또는 키트의 유효성분으로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은
a) 본 발명의 박테리아 형질전환체를 배양하는 단계; 및
b) 본 발명의 단계 a)의 배양물로부터 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 알파(2,6)시알산에 특이적으로 결합하는 재조합 렉틴의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 제조된 알파(2,6)시알산에 특이적으로 결합하는 재조합 렉틴을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 5의 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드를 제공한다.
상기 폴리펩티드는 전체 아미노산 서열에서 C-말단 부위에 8개의 히스티딘(histidine) 잔기를 포함하는 것을 특징으로하는 폴리펩티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 발현벡터로 형질전환시킨 효모 형질전환체를 제공한다.
상기 효모는 피키아(Pichia), 사카로마이세스(Saccharomyces), 클루베로마이세스(Kluyveromyces), 야로위아(Yallowia), 한세눌라(Hansenula) 및 캔디다(Candida)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나, 피키아(Pichia)가 더 바람직하다.
또한, 본 발명은
a) 본 발명의 효모 형질전환체를 배양하는 단계; 및
b) 본 발명에 따른 단계 b)의 배양물로부터 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 알파(2,6)시알산에 특이적으로 결합하는 재조합 렉틴의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 방법으로 제조된 알파(2,6)시알산에 특이적으로 결합하는 재조합 렉틴을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 9의 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성된 폴리펩티드.
상기 폴리펩티드는 전체 아미노산 서열에 있어서, N-말단에 세포 분비 발현을 위한 시그널 시퀀스를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 알파(2,6)시알산 당사슬에 특이적으로 결합하는 재조합 렉틴 PSL1b 단백질을 생산하는, 수탁번호 KCTC12507BP로 기탁된 재조합 대장균(Escherichia coli) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 알파(2,6)시알산 당사슬에 특이적으로 결합하는 재조합 렉틴 PSL1b 단백질을 생산하는, 수탁번호 KCTC12500BP로 기탁된 재조합 효모(Polyporus squamosus) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은
a) 본 발명에 따른 균주를 배양하는 단계; 및
b) 본 발명에 따른 단계 b)의 배양물로부터 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 알파(2,6)시알산에 특이적으로 결합하는 재조합 렉틴의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 방법으로 제조된, 알파(2,6)시알산에 특이적으로 결합하는 재조합 렉틴을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 렉틴을 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 당사슬 구조에 결합하는 것을 특징으로 하는 렉틴을 제공한다;
NeuAc(α2→6)가 Gal 잔기 또는 Glc 잔기에 부가된 시알산화 당사슬;
NeuAc(α2→6)가 Gal(β1→4)Glc 잔기 또는 Glc(β1→4)Glc 잔기에 부가된 시알산화 당사슬;
NeuAc(α2→6)가 Gal(β1→4)GlcNac 잔기 또는 Gal(β1→3)GlcNac 잔기에 부가된 시알산화 당사슬;
NeuAc(α2→6)가 Gal(β1→3)[αFuc(1→4)]GlcNac 잔기에 부가된 시알산화 당사슬; 및
NeuAc(α2→6)가 Gal(β1→4)[αFuc(1→3)]GlcNac 잔기에 부가된 시알산화 당사슬.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 렉틴을 포함하는 알파(2,6)시알산 당사슬을 포함하는 당단백질, 당펩타이드, 당지질, 당전구체 또는 올리고당의 측정 또는 정량용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 분리 정제해낸 렉틴의 30 kDa 내지 60 kDa범위의 크기를 갖으며 알파(2,6) 시알산 당사슬에 선택적 결합을 하는 재조합 렉틴 PSL1b 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 렉틴을 이용하여, 알파(2,6)시알산 당사슬을 포함하는 시알산 당사슬을 표면에 갖는 세포주, 박테리아 또는 바이러스의 모니터링, 측정 또는 정량용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은
a) 본 발명에 따른 재조합 렉틴에 피검 시료를 접촉하는 단계; 및
b) 상기 렉틴에 결합된 당단백질, 당펩타이드, 당지질, 당전구체 또는 올리고당을 분석하는 단계를 포함하는, 시알산 당사슬을 포함하는 당단백질, 당펩타이드, 당지질, 당전구체 또는 올리고당으로 구성된 시알산화 당사슬(conjugated)의 측정 또는 정량 방법을 제공한다.
또한, 본 발명에 따른
a) 본 발명에 따른 재조합 렉틴에 피검 시료를 접촉하는 단계; 및
b) 상기 렉틴에 결합된 세포, 박테리아 또는 바이러스를 분석하는 단계를 포함하는, 시알산 당사슬을 갖는 세포주, 박테리아 또는 바이러스의 측정 또는 정량 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 구멍장이(Polyporus squamosus) 버섯 유래의 재조합 렉틴 단백질 생산을 위한 유전자 합성
구멍장이(Polyporus squamosus) 버섯 유래의 재조합 렉틴 단백질을 생산하기 위하여, 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 구멍장이 버섯 유래의 렉틴 유전정보 서열은 미국생물정보센터(National center for Biotechnology Information, NCBI, accession no. AB120707)의 쿼리 서열(query sequence)을 사용하여 유사한 유전자 서열 후보를 탐색하였다. 디엔에이 2.0(DNA 2.0, 미국)사에서 상기 탐색 된 서열을 바탕으로 해당 유전자를 이종숙주 시스템에서 최적 발현시키기 위해 코돈 최적화 및 RNA 2차 구조 최적화 등을 통하여 구아닌과 시토신의 함량이 44.7%인 879 bp 폴리뉴클레오티드를 화학적으로 합성하였다. 상기 합성된 폴리뉴클레오티의 서열과 이로부터 전사 및 번역되어 생성되는 폴리펩티드는 서열번호 1과 서열번호 2와 같다. 구멍장이버섯 유래의 렉틴 PSL1b를 코딩하는 야생형 유전자와 화학적으로 합성한 유전자의 물리적, 화학적 변화는 하기 [표1]에 나타내었으며, 코돈의 변화는 하기 [표2]에 나타낸 바와 같다.
<실시예 2> 대장균에서 구멍장이(Polyporus squamosus) 버섯 유래의 재조합 렉틴 생산을 위한 클로닝 및 형질전환 균주 제작
대장균에서 구멍장이 버섯 유래의 재조합 렉틴을 생산하기 위하여, 효소중합반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>에 기재된 방법으로 확인된 폴리뉴클레오티드 유전자 정보를 바탕으로 상기 <실시예 1>에 기재된 렉틴 단백질을 대장균 발현 벡터에 클로닝을 하기 위하여 프라이머를 제작하였다. 제작한 프라이머는 하기 [표 3]에 나타낸 바와 같이, 서열번호 3 및 서열번호 4와 같다. 화학적으로 합성한 폴리뉴클레오티드를 주형으로 효소중합반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하였다. 상기 렉틴 유전자를 코딩하는 897 유전자 PCR 증폭 조건은 변성(denaturation, 94℃, 30초), 어닐링(annealing , 52℃, 30초), 확장(Extention, 72℃, 1분 20초) 35 사이클을 수행하였다. 상기 증폭된 유전자를 DNA 분리정제키트(QIAGEN PCR purification kit, Valencia, CA, USA)를 이용해 순수정제 하였다. 상기 순수 정제된 유전자와 대장균에서 해당 유전자를 클로닝 할 벡터 pET39b(Novagen, USA)를 적절한 제한효소로 처리한 후, 다시 제한 효소로 처리된 유전자 단편을 아가로즈 젤에서 분리하고 상기 동일한 정제 키트를 이용하여 정제하였다. 상기 정제된 유전자 단편을 pET39b 클로닝 벡터와 함께 접합(ligation) 시킨 후, 대장균 DH5α에 형질전환시켰다. 플라스미드를 형질 전환된 대장균으로 부터 분리하여 DNA 시퀀싱을 수행하였다(제노텍, 대전, 대한민국). 상기와 같은 방법을 수행하여 최종 제작된 재조합 플라스미드는 pET-PSL1b 8xHis로 명명하였다(도 1). 상기 발현 벡터에 클로닝 하여 대장균 내에서 생산되는 재조합 렉틴 단백질을 코딩하는 909 bp(서열번호 5)는 서열번호 6로 기술되는 총 302개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하고 있으며, C-말단 부분에 8개의 히스티딘(histidine) 아미노산 서열이 있어 재조합 렉틴 단백질을 IMAC 컬럼을 통해 용이하게 분리될 수 있다. 유전자 서열이 확인된 재조합 플라스미드 pET-PSL1b 8xHis는 재조합 렉틴 PSL1b 단백질의 생산을 위하여 최종적으로 대장균(Escherichia coli) BL21-CodonPlus(DE3)-RIL에 형질 전환시켰으며, 상기 재조합 렉틴 PSL1b을 발현하는 재조합 균주 Escherichia coli PSL1b는 2013년 11월 1일 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(KCTC12507BP).
| 서열번호 | 서열 |
| 서열번호 3 | 5'-ttttttttCATATGagTTTCGAGGGACATGGAATCTAC-3' |
| 서열번호 4 | 5'-ttaaCTCGAGGAACAAtCCAAAATATGCTTTATAAC-3' |
<실시예 3> 효모에서 구멍장이(Polyporus squamosus) 버섯 유래의 재조합 렉틴 생산을 위한 클로닝 및 형질전환 균주 제작
효모에서 구멍장이(Polyporus squamosus) 버섯 유래의 재조합 렉틴 생산을 하기 위하여 효소중합반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 1>에 기재된 방법으로 확인된 폴리뉴클레오티드 유전자 정보를 바탕으로 상기 <실시예 1>에 기재된 렉틴 단백질을 효모 발현 벡터에 클로닝을 하기 위하여 프라이머를 제작하였다. 제작된 프라이머는 하기 [표 4]에 서열번호 7 및 서열번호 8로 나타내었다. 화학적으로 합성한 폴리뉴클레오티드를 주형으로 주형으로 효소중합반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하였다. 상기 렉틴 유전자를 코딩하는 915 bp 유전자 PCR 증폭 조건은 변성(denaturation, 94℃, 30초), 어닐링(annealing , 52℃, 30초), 확장(Extention, 72℃, 1분) 40 사이클을 수행하였다. 상기 증폭된 유전자를 DNA 분리정제키트(QIAGEN PCR purification kit, Valencia, CA, USA)를 이용해 순수정제 하였다. 상기 정제된 유전자와 효모인 피키아 패스토리스(Pichia pastoris) 에서 해당 유전자를 클로닝 할 pPICZα(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 벡터를 적절한 제한효소로 처리한 후, 다시 제한 효소로 처리된 상기 유전자 단편을 아가로즈 젤에서 분리하여 상기 기재된 동일한 정제 키트로 정제하였다. 상기 정제된 유전자의 단편을 pPICZα 클로닝 벡터와 함께 접합(ligation) 시킨 후, 대장균(Escherichia coli) DH5α에 형질전환시켰다. 플라스미드를 형질 전환된 대장균으로부터 분리하여 DNA 시퀀싱을 수행하였다(제노텍, 대전, 대한민국). 최종적으로 제작된 재조합 플라스미드는 pPICZα-PSL1b 8xHis로 명명하였다(도 2). 상기 발현 벡터에 클로닝하여 피키아 패스토리스 효모 내에서 생산되는 재조합 렉틴 단백질을 코딩하는 1,173 bp(서열번호 9)는 서열번호 8로 기술되는 총 390개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열(서열번호 10)을 코딩하고 있으며, N-말단 89개 아미노산을 포함하는 시그널펩타이드, C-말단 부분에 8개의 히스티딘(histidine) 아미노산 서열이 있어 재조합 렉틴 단백질을 IMAC 컬럼을 통해 용이하게 분리하였다. 유전자 서열이 확인된 재조합 플라스미드 pPICZα-PSL1b 8xHis는 재조합 렉틴 PSL1b 단백질 생산을 위하여 최종적으로 피키아 패스토리스(Pichia pastoris) X-33에 형질 전환시켰으며, 상기의 재조합 렉틴 PSL1b을 발현하는 재조합 균주 Pichia pastoris PSL1b는 2013년 10월 7일 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁하였다(KCTC12500BP).
| 서열번호 | 서열 |
| Pp_PS1b-F(서열번호 7) | 5'-AGAATTCTCTTTCGAGGGACATGGAATCTAC-3' |
| Pp_PSL1b-R(서열번호 8) | 5'-AATCTAGATCAGTGATGGTGATGGTGATGGTGATGGAAC AAcCCAAAATATGCTTTATAAC-3' |
<
실시예
4>
대장균에서
재조합 렉틴 정제
<4-1> 재조합 대장균 균주 배양
상기 <실시예 2>에 기재된 방법으로 제작한 재조합 대장균들을 항생제가 포함된 루리아-베르타니(Luria-Bertani, LB) 배지(트립톤 10 g/L, 효모추출물 5 g/L, 염화나트륨 10 g/L)에서 37℃로 10 시간 이상 동안 전배양 하였다. 재조합 대장균의 전배양액을 100분의 1 부피 비로 다시 LB 배지에 접종하였으며, 37℃, 600 nm에서 흡광도가 0.6 내지 0.8이 될 때까지 본 배양한 후, 트랜스-시알리다아제 발현을 하기위해 이소프로필-베타-티오갈락토피라노사이드(isopropyl-βD-thiogalactopyranoside, IPTG)를 최종 1.0 mM이되게 첨가한 후, 30℃에서 6시간 동안 더 배양하였으며, 원심분리기를 통해 상기 배양액에서 세포를 수득하였다.
<4-2>
HisTrap
TM
FF
칼럼 크로마토그래피를 이용하여 재조합 렉틴 분리
상기 실시예 <4-1>에 기재된 방법으로 수득한 균체에서 재조합 렉틴을 분리하기위하여, HisTrapTM FF 칼럼 크로마토그래피를 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <4-1>에 기재된 방법으로 수득한 균체에 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.6)을 사용하여 3번 세척한 후, 동일 완충용액을 첨가하여 15분 동안 음파처리(sonication)하여 세포를 파쇄하였다. 상기 제조된 세포추출물에서 파쇄되지 않은 균체와 비용해성 단백질을 제거하기 위하여, 10,000 rpm에서 30분 동안 원심분리를 한 후 침전된 세포 잔해물을 제거하였다. 그런 다음, 아머샴파마시아 액타 에프피엘시 시스템(Amersham-Pharmacia FPLC system, GE-Healthcare, USA)을 이용하여 10 mM 이미다졸(imidazole)과 0.25 M 염화나트륨(NaCl)이 함유되어 있는 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 8.0)을 사용하여 평형화시킨 HisTrapTM FF 칼럼(0.7×2.5 cm)에 세포추출물을 주입하고, 상기와 같이 동일한 완충용액을 20배 부피로 세척한 다음, 500 mM 이미다졸과 0.25 M 염화나트륨이 함유되어 있는 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 8.0)으로 이미다졸을 10 mM에서 500 mM까지 점차 증가시키면서 재조합 렉틴을 용출시켰다. 이때 용출 속도는 분당 1 ml, 분획 튜뷰당 0.5 mL로 하였으며, 단백질 피크가 나타나는 분획을 모아 용출된 단백질은 아미콘 울트라 센트리푸갈 필터(Amicon®Ultra Centrifugal filter) 10K을 이용하여 농축시켰다.
<4-3>
Superose
12 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 재조합 단백질 분리
상기 실시예 <4-2>에 기재된 방법으로 HisTrapTM FF 컬럼을 사용하여 분리한 재조합 단백질을 좀더 순수하게 분리하기 위하여, Superose 12 칼럼 크로마토그래피를 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <4-2>에 기재된 방법으로 분리된 재조합 단백질을50 mM Tris-HCl 완충용액으로(pH 8.0)로 평형시킨 Superose 12 컬럼(1.0×30 cm) (GE-Healthcare, USA)에 주입하고, 상기와 같이 동일한 완충용액을 분당 1 ml로 하여 단백질 크기에 따라 단백질을 용출하였으며, 단백질의 피크가 나타나는 분획을 모아 용출된 단백질은 아미콘 울트라 센트리푸갈 필터(Amicon®Ultra Centrifugal filter) 10K을 이용하여 농축시켰다.
<4-4>
SDS
-
PAGE
분석을 통한 렉틴 단백질 확인
상기 실시예 <4-3>에서 기재된 방법으로 좀더 순수하게 분리된 재조합 단백질을 확인하기 위하여, SDS-PAGE 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <4-3>에서 기재된 방법으로 수득한 조효소 용액을 SDS-PAGE를 이용하여 분리한 후, 코마시에 브릴리언트 블루(Coommassie Brilliant Blue)로 염색하였으며 Precision Plus ProteinTM Standards(Bio-Rad, USA) 단백질을 표준 단백질로 사용하여 상기 정제된 렉틴 단백질의 순도 및 크기를 분석하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 대장균에서 분리 정제된 재조합 PSL1b 단백질의 크기는 약 32 kDa으로 확인되었다(도 3).
<
실시예
5>
효모에서
재조합 렉틴 정제
<5-1> 재조합 효모 균주의 배양
상기 <실시예 3>에 기재된 방법으로 제작한 형질전환된 재조합 효모 균주를 YDP 복합배지(Yeast extract 10 g/L, Bactopeptone 20 g/L, Dextrose 20 g/L)에서 30℃ 24 시간 이상 전배양 하였다. 상기 재조합 효모균주의 전배양액을 100분의 1 부피 비로 1.5 L의 본 배양 배지에 접종하였다. 본배양 배지 조성은 다음과 같다(1 리터 당): 50 mL glycerol, 833 mL 증류수, 0.9 g CaSO4, 14.67 g K2SO4, 11.67 g MgSO4·7H2O, 9 g (NH4)2SO4, 167 mL Hexametaphosphate solution(150g hexametaphosphate per 1 L distilled water), 4 mL trace element solution. 본 배양은 2 리터 자 발효기(Jar fermentor, 코바이오텍, 대한민국)를 이용하여 수행했으며, 공기주입량을 0.3vvm, 1,000 rpm, pH 4.8~6.4, 30℃에서 효모를 배양하였다. 배양 중 pH 조절은 10%(v/v) 인산용액과 암모니아수로 적정한 pH를 유지하였다. 효모 세포를 배양 배지 내의 글리세롤(glycerol) 함량이 5 g/L 미만이 될 때까지 배양한 후, 렉틴 단백질의 발현을 위해서 5 mL 메탄올을 주입하였다. 일정 시간 마다 배양 배지의 메탄올 함량을 모니터링 하였으며, 메탄올 함량이 1 g/L 미만으로 떨어질 때마다 추가로 동량의 메탄올을 주입하였으며, 최초로 메탄올을 주입한 후, 48시간 이후에 배양액을 수득하였다.
<5-2> 효소세포와 배양 배지 분리
상기 실시예 <5-1>에 기재된 방법으로 제조된 효모 배양액으로부터 효모 세포와 배양 배지를 분리하기 위하여, 원심분리를 수행하였다.
구체적으로, A1000S-4S 로터가 장착된 SUPRA 22K 원심분리기(한일과학, 대한민국)를 4℃에서, 7,000 rpm, 30분 동안 원심분리를 수행하였으며, 침전된 효모 세포를 제거하고 상등액을 수득하였다. 상기 수득된 상등액을 교반 시키면서 고상 상태 황산암모늄(ammonium sulfate)을 포화농도로 80%가 되도록 천천히 주입하였다. 황산암모늄이 첨가된 상등액을 4℃에서 12시간 이상 교반한 후, 다시 원심분리기를 사용하여 4℃에서, 7,000 rpm로 1시간 동안 원심분리를 수행하여 상등액을 제거하고 침전물을 수득하였다. 침전물은 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 8.0)으로 용해시킨 후, Slide-A-Lyzer®dialysis Cassette(Thermo Sciencetific, Rockford, USA)에 주입하여 상기에 기재된 동일 완충액 5 L에서 재조합 단백질이 포함된 조효소액을 투석시켰다. 12시간 이상 투석시킨 상기 조효소액을 A500S-6N 로터가 장착된 SUPRA 22K 원심분리기(한일과학, 대한민국)를 4℃에서, 12,000 rpm으로 30분 동안 수행하여 침전물을 제거하고 상등액을 수득하였다.
<5-3>
HisTrap
TM
FF
칼럼 크로마토그래피를 이용하여 재조합 단백질 분리
상기 실시예 <5-2>에 기재된 방법으로 수득한 조효소액에서 재조합 렉틴을 정제하기 위하여 하기와 같은 방법을 수행하였다.
구체적으로, 아머샴파마시아 액타 에프피엘시 시스템(Amersham-Pharmacia FPLC system, GE-Healthcare, USA)을 이용하여 10 mM 이미다졸(imidazole)과 0.25 M 염화나트륨(NaCl)이 포함되어 있는 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 8.0)으로 평형화시킨 HisTrapTM FF 칼럼(0.7×2.5 cm)에 조효소액을 주입하고, 상기와 같이 동일한 완충용액을 20배 부피로 세척한 다음, 500 mM 이미다졸과 0.25 M 염화나트륨이 포함되어 있는 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 8.0)으로 이미다졸을 10 mM에서 500 mM까지 점차 증가시키면서 재조합 렉틴을 용출시켰다. 이때 용출 속도는 분당 1 ml, 분획 튜뷰당 0.5 mL로 하였으며 단백질의 피크가 나타나는 분획을 모아 용출된 단백질은 아미콘 울트라 센트리푸갈 필터(Amicon®Ultra Centrifugal filter) 10K을 이용하여 농축시켰다.
<5-4>
SDS
-
PAGE
분석을 통하여 재조합 단백질 확인
상기 실시예 <5-3>에 기재된 방법으로 수득한 조효소 용액을 확인하기 위하여, SDS-PAGE 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <5-3>에 기재된 방법으로 수득한 조효소 용액을 SDS-PAGE를 이용해 분리한 후, 코마시에 브릴리언트 블루(Coommassie Brilliant Blue)로 염색하였으며 Precision Plus ProteinTM Standards(Bio-Rad, USA) 단백질을 표준 단백질로 사용하여 정제된 렉틴 단백질의 순도 및 크기를 분석하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 효모에서 분리 정제된 재조합 PSL1b 단백질 크기는 대장균에서 분리된 단백질과 비교하였을 때, 효모에서 분리 정제된 재조합 PSL1b 단백질 크기가 약 40 kDa으로 조금 크게 확인되었으며, 이는 해당 렉틴 서열이 포함하고 있는 잠재적인 3개의 N-결합 글라이코실레이션에 의한 사이즈 증가로 추정하였다.
<
실시예
6> 렉틴
블랏을
이용한 시알산
당사슬
포함 당단백질의 측정
상기 실시예 <5-4>에 기재된 방법으로 분리된 단백질의 선택적 결합력을 확인하기 위하여, 렉틴 블랏을 수행하였다.
구체적으로, 시알산 당사슬이 부가되지 않은 비시알산화 당단백질과 CMP-N-acetylneuraminic acid(CMP-Neu5Ac)를 α(2,6)-시알산전이 효소[α(2,6)-sialyltransferase]와 반응시켜 시알산화가 이루어진 당단백질을 렉틴블랏을 수행하여 측정하였다. in vitro 시알화 반응을 수행하기 위하여, α(2,6)-시알산전이 효소 단백질이 발현된 세포추출액을 이용하여 시알화 수용체 비시알산화페투인 1 mg/mL, 시알산 공여체 CMP-Neu5Ac 0.5 mg/mL, 10 mM MnCl2 및 1% Triton X-100, 0.02 Unit TEV(Tobacco Etch Virus) 프로테아제를 PBS(phosphate buffered saline)와 혼합하여 25°C에서 6 내지 12 시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, in vitro 시알화 반응을 통해 합성된 시알화된 비시알산화페투인의 시알산 결합을 렉틴 블랏 분석을 수행하여 시알산의 부가 여부를 측정하였다. 비알산화 페투인과 시알산화된 페투인이 포함된 각각의 단백질 용액을 5×램리 버퍼(Laemmli buffer)와 혼합하여 10분 동안 가열한 후, 8% SDS-PAGE 겔로 전기영동하여 단백질을 분리하였다. 상기 분리된 SDS-PAGE 겔 상의 단백질을 Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell (Bio-Rad, USA)을 이용하여 15 V에서 1시간 동안 니트로셀룰로스(nitrocellulose) 멤브레인에 트랜스퍼(transfer) 하고 난 뒤, 이를 3% 소혈청알부민(bovine serum albumin; BSA)이 포함된 PBS(phosphate saline buffer), PBST 및 0.5% Tween에 첨가하여 1 시간 동안 블로킹(blocking) 하였다. 그 후, 비오틴(biotin)이 컨쥬게이션된 상기 재조합 렉틴 단백질 1 mg/mL이 포함되어 있는 3% BSA-PBS에 막을 넣어 상온에서 4 시간 동안 배양하였다. 이때 사용한 상기 재조합 렉틴 단백질의 바이오틴화(biotinylation) 컨쥬게이션은 항 바이오틴화 키트(Antibody Biotinylation Kit, Genomine 대한민국)를 사용하여 수행하였다. 렉틴과 멤브레인을 배양한 후, 상기 멤브레인을 PBST로 10 분 동안 6회 세척한 하였고, 0.2 mg/mL 호스라디시 페록시다제(Horrseradish peroxidase, HRP)-컨쥬게이션된(conjugated) 항-비오틴 항체(anti-biotin antibody, 1:500, Sigma-Aldrich)과 한 시간 동안 반응시켰다. 그런 다음, 상기와 동일한 방법으로 막을 PBST로 10 분 동안 6회 세척하여, ECL 키트(GE Healthcare, USA)로 시알화된 단백질을 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, N-결합 당사슬의 기본 구조인 Neu5Ac α(2,6) Galβ(1,4)GlcNAc와 O-결합 당사슬 Neu5Ac α(2,6)Galβ(1,3)[GalNA, Neu5Acα(2,6)Galβ(1,3)[Neu5Ac α(2,6)Galβ(1,4)GalNAβ(1,6)]의 당사슬을 포함하는 페투인에서는 렉틴 블랏의 시그널은 관찰하였으나, 음성 대조군인 비시알산화페토인의 Galβ(1,4)GlcNAc의 비시알산화 N-당사슬과 Galβ(1,3), GlcNA, Galβ(1,3)[Galβ(1,4)GalNA β(1,6)]의 당사슬을 포함하는 단백질과 알파(2,3)시알산을 포함하는 페투인(소혈청유래, bovine serum fetuin)에서는 렉틴블랏 시그널이 확인되지 않았다(도 5).
본 발명은 알파2,6 시알산에 선택적으로 결합을 하는 PSL1b 렉틴을 재조합 단백질 형태로 대량 수득하기 위하여, PSL1b 렉틴 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 화학적으로 합성한 후, 상기 유전자를 이종숙주에 도입하여 재조합 대장균 균주 Escherichia coli PSL1b(KCTC12507BP)와 Pichia pastoris PSL1b (KCTC12500BP)를 제작하여 해당 재조합 렉틴을 활성형 단백질로 생산, 분리 및 정제하는 것으로써, 시알산 당사슬에 특이적으로 결합하는 재조합 렉틴을 포함하는 시알산 당사슬을 갖는 당단백질, 당펩타이드, 당지질, 당전구체 또는 올리고당의 측정, 검출용 조성물 및 키트 또는 시알산 당사슬에 특이적으로 결합하는 재조합 렉틴을 포함하는 시알산 당사슬을 갖는 세포, 박테리아 및 바이러스의 측정 또는 검출용 조성물 또는 키트의 유효성분으로 사용될 수 있다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
<120> The Recombinant Sialic Acid-Specific Binding Lectin, PSL1b, from
the Mushroom Polyporus squamosus
<130> 13p-11-22
<160> 10
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 879
<212> DNA
<213> synthesis gene sequence
<400> 1
atgtctttcg agggacatgg aatctaccat atccctcatg cccacgtagc taacatccga 60
atggctttag caaatagggg ctctggtcag aatggaactc cagtgattgc ttgggactcc 120
aataatgatg cctttgatca catgtggctg gtcgagccca caggagaagc agatacttac 180
acaatacaca acgtttcaac tggtacttat atggacgtca ctgctagcgc tgttgctgat 240
aacacaccaa ttatcggtta tcaaaggacc ggtaacgata accaaaagtg gattatctcg 300
caggttcaaa ctgacggtgg tgatcgtcct tggaagattc agtgcaaagc tacaggcact 360
tttgccacgc tgtactccgg tggtggtagc ggaacagcta ttgttggatg gagacttgtg 420
aatagtaacg gtaatcaaga ctgggttttc caaaaattgt cacaaacttc tgttaatgtg 480
cacgctacat tacttgcatg tggagcaact gttggtcaag actttaagaa ttacctgtac 540
gacggtttgt acctagtctt gccaagagat agaatcagtg ctatatggaa ggcatcaggt 600
ttgggagaga ctgctagacg tgatggtatc tacgattccg acgaatttgc tatgaccttc 660
aaatctgccg ctgcaacttg gggtaaggaa aatttcaaag ctgacggatt cgccattttg 720
tgtggtatga tgttcggtac gaaagcatcc accaatagac atgcatataa ctgggtggtc 780
gagagaggat cgttttccac agtaacattt ttcgaacctc agaatggtac ctattcagat 840
gacgcttggg gttataaagc atattttggc ttgttctga 879
<210> 2
<211> 292
<212> PRT
<213> polypeptide from synthesis gene
<400> 2
Met Ser Phe Glu Gly His Gly Ile Tyr His Ile Pro His Ala His Val
1 5 10 15
Ala Asn Ile Arg Met Ala Leu Ala Asn Arg Gly Ser Gly Gln Asn Gly
20 25 30
Thr Pro Val Ile Ala Trp Asp Ser Asn Asn Asp Ala Phe Asp His Met
35 40 45
Trp Leu Val Glu Pro Thr Gly Glu Ala Asp Thr Tyr Thr Ile His Asn
50 55 60
Val Ser Thr Gly Thr Tyr Met Asp Val Thr Ala Ser Ala Val Ala Asp
65 70 75 80
Asn Thr Pro Ile Ile Gly Tyr Gln Arg Thr Gly Asn Asp Asn Gln Lys
85 90 95
Trp Ile Ile Ser Gln Val Gln Thr Asp Gly Gly Asp Arg Pro Trp Lys
100 105 110
Ile Gln Cys Lys Ala Thr Gly Thr Phe Ala Thr Leu Tyr Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Thr Ala Ile Val Gly Trp Arg Leu Val Asn Ser Asn Gly
130 135 140
Asn Gln Asp Trp Val Phe Gln Lys Leu Ser Gln Thr Ser Val Asn Val
145 150 155 160
His Ala Thr Leu Leu Ala Cys Gly Ala Thr Val Gly Gln Asp Phe Lys
165 170 175
Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Leu Tyr Leu Val Leu Pro Arg Asp Arg Ile
180 185 190
Ser Ala Ile Trp Lys Ala Ser Gly Leu Gly Glu Thr Ala Arg Arg Asp
195 200 205
Gly Ile Tyr Asp Ser Asp Glu Phe Ala Met Thr Phe Lys Ser Ala Ala
210 215 220
Ala Thr Trp Gly Lys Glu Asn Phe Lys Ala Asp Gly Phe Ala Ile Leu
225 230 235 240
Cys Gly Met Met Phe Gly Thr Lys Ala Ser Thr Asn Arg His Ala Tyr
245 250 255
Asn Trp Val Val Glu Arg Gly Ser Phe Ser Thr Val Thr Phe Phe Glu
260 265 270
Pro Gln Asn Gly Thr Tyr Ser Asp Asp Ala Trp Gly Tyr Lys Ala Tyr
275 280 285
Phe Gly Leu Phe
290
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> EcPS1bF Ecoli primer1
<400> 3
ttttttttca tatgagtttc gagggacatg gaatctac 38
<210> 4
<211> 36
<212> DNA
<213> EcPSL1bR ecoli primer 2
<400> 4
ttaactcgag gaacaatcca aaatatgctt tataac 36
<210> 5
<211> 909
<212> DNA
<213> polynucleotide of ecoli expression lectin
<400> 5
atgagtttcg agggacatgg aatctaccat atccctcatg cccacgtagc taacatccga 60
atggctttag caaatagggg ctctggtcag aatggaactc cagtgattgc ttgggactcc 120
aataatgatg cctttgatca catgtggctg gtcgagccca caggagaagc agatacttac 180
acaatacaca acgtttcaac tggtacttat atggacgtca ctgctagcgc tgttgctgat 240
aacacaccaa ttatcggtta tcaaaggacc ggtaacgata accaaaagtg gattatctcg 300
caggttcaaa ctgacggtgg tgatcgtcct tggaagattc agtgcaaagc tacaggcact 360
tttgccacgc tgtactccgg tggtggtagc ggaacagcta ttgttggatg gagacttgtg 420
aatagtaacg gtaatcaaga ctgggttttc caaaaattgt cacaaacttc tgttaatgtg 480
cacgctacat tacttgcatg tggagcaact gttggtcaag actttaagaa ttacctgtac 540
gacggtttgt acctagtctt gccaagagat agaatcagtg ctatatggaa ggcatcaggt 600
ttgggagaga ctgctagacg tgatggtatc tacgattccg acgaatttgc tatgaccttc 660
aaatctgccg ctgcaacttg gggtaaggaa aatttcaaag ctgacggatt cgccattttg 720
tgtggtatga tgttcggtac gaaagcatcc accaatagac atgcatataa ctgggtggtc 780
gagagaggat cgttttccac agtaacattt ttcgaacctc agaatggtac ctattcagat 840
gacgcttggg gttataaagc atattttgga ttgttcctcg agcaccacca ccaccaccac 900
caccactaa 909
<210> 6
<211> 302
<212> PRT
<213> ecoli expression protein polypeptide sequence
<400> 6
Met Ser Phe Glu Gly His Gly Ile Tyr His Ile Pro His Ala His Val
1 5 10 15
Ala Asn Ile Arg Met Ala Leu Ala Asn Arg Gly Ser Gly Gln Asn Gly
20 25 30
Thr Pro Val Ile Ala Trp Asp Ser Asn Asn Asp Ala Phe Asp His Met
35 40 45
Trp Leu Val Glu Pro Thr Gly Glu Ala Asp Thr Tyr Thr Ile His Asn
50 55 60
Val Ser Thr Gly Thr Tyr Met Asp Val Thr Ala Ser Ala Val Ala Asp
65 70 75 80
Asn Thr Pro Ile Ile Gly Tyr Gln Arg Thr Gly Asn Asp Asn Gln Lys
85 90 95
Trp Ile Ile Ser Gln Val Gln Thr Asp Gly Gly Asp Arg Pro Trp Lys
100 105 110
Ile Gln Cys Lys Ala Thr Gly Thr Phe Ala Thr Leu Tyr Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Thr Ala Ile Val Gly Trp Arg Leu Val Asn Ser Asn Gly
130 135 140
Asn Gln Asp Trp Val Phe Gln Lys Leu Ser Gln Thr Ser Val Asn Val
145 150 155 160
His Ala Thr Leu Leu Ala Cys Gly Ala Thr Val Gly Gln Asp Phe Lys
165 170 175
Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly Leu Tyr Leu Val Leu Pro Arg Asp Arg Ile
180 185 190
Ser Ala Ile Trp Lys Ala Ser Gly Leu Gly Glu Thr Ala Arg Arg Asp
195 200 205
Gly Ile Tyr Asp Ser Asp Glu Phe Ala Met Thr Phe Lys Ser Ala Ala
210 215 220
Ala Thr Trp Gly Lys Glu Asn Phe Lys Ala Asp Gly Phe Ala Ile Leu
225 230 235 240
Cys Gly Met Met Phe Gly Thr Lys Ala Ser Thr Asn Arg His Ala Tyr
245 250 255
Asn Trp Val Val Glu Arg Gly Ser Phe Ser Thr Val Thr Phe Phe Glu
260 265 270
Pro Gln Asn Gly Thr Tyr Ser Asp Asp Ala Trp Gly Tyr Lys Ala Tyr
275 280 285
Phe Gly Leu Phe Leu Glu His His His His His His His His
290 295 300
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> PpPS1bF primer 1
<400> 7
agaattctct ttcgagggac atggaatcta c 31
<210> 8
<211> 61
<212> DNA
<213> PpPSL1bR primer 2
<400> 8
aatctagatc agtgatggtg atggtgatgg tgatggaaca acccaaaata tgctttataa 60
c 61
<210> 9
<211> 1173
<212> DNA
<213> polynucleotide of pichia pastoris expression lectin
<400> 9
atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60
ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120
tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180
aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240
tctctcgaga aaagagaggc tgaagctgaa ttctctttcg agggacatgg aatctaccat 300
atccctcatg cccacgtagc taacatccga atggctttag caaatagggg ctctggtcag 360
aatggaactc cagtgattgc ttgggactcc aataatgatg cctttgatca catgtggctg 420
gtcgagccca caggagaagc agatacttac acaatacaca acgtttcaac tggtacttat 480
atggacgtca ctgctagcgc tgttgctgat aacacaccaa ttatcggtta tcaaaggacc 540
ggtaacgata accaaaagtg gattatccgt caggttcaaa ctgacggtgg tgatcgtcct 600
tggaagattc agtgcaaagc tacaggcact tttgccacgc tgtactccgg tggtggtagc 660
ggaacagcta ttgttggatg gagacttgtg aatagtaacg gtaatcaaga ctgggttttc 720
caaaaattgt cacaaacttc tgttaatgtg cacgctacat tacttgcatg tggagcaact 780
gttggtcaag actttaagaa ttacctgtac gacggtttgt acctagtctt gccaagagat 840
agaatcagtg ctatatggaa ggcatcaggt ttgggagaga ctgctagacg tgatggtatc 900
tacgattccg acgaatttgc tatgaccttc aaatctgccg ctgcaacttg gggtaaggaa 960
aatttcaaag ctgacggatt cgccattttg tgtggtatga tgttcggtac gaaagcatcc 1020
accaatagac atgcatataa ctgggtggtc gagagaggat cgttttccac agtaacattt 1080
ttcgaacctc agaatggtac ctattcagat gacgcttggg gttataaagc atattttggc 1140
ttgttccatc accatcacca tcaccatcac tga 1173
<210> 10
<211> 390
<212> PRT
<213> pichia pastoris protien polypeptide sequnce
<400> 10
Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln
20 25 30
Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe
35 40 45
Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu
50 55 60
Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val
65 70 75 80
Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Glu Phe Ser Phe Glu Gly His
85 90 95
Gly Ile Tyr His Ile Pro His Ala His Val Ala Asn Ile Arg Met Ala
100 105 110
Leu Ala Asn Arg Gly Ser Gly Gln Asn Gly Thr Pro Val Ile Ala Trp
115 120 125
Asp Ser Asn Asn Asp Ala Phe Asp His Met Trp Leu Val Glu Pro Thr
130 135 140
Gly Glu Ala Asp Thr Tyr Thr Ile His Asn Val Ser Thr Gly Thr Tyr
145 150 155 160
Met Asp Val Thr Ala Ser Ala Val Ala Asp Asn Thr Pro Ile Ile Gly
165 170 175
Tyr Gln Arg Thr Gly Asn Asp Asn Gln Lys Trp Ile Ile Arg Gln Val
180 185 190
Gln Thr Asp Gly Gly Asp Arg Pro Trp Lys Ile Gln Cys Lys Ala Thr
195 200 205
Gly Thr Phe Ala Thr Leu Tyr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Ala Ile
210 215 220
Val Gly Trp Arg Leu Val Asn Ser Asn Gly Asn Gln Asp Trp Val Phe
225 230 235 240
Gln Lys Leu Ser Gln Thr Ser Val Asn Val His Ala Thr Leu Leu Ala
245 250 255
Cys Gly Ala Thr Val Gly Gln Asp Phe Lys Asn Tyr Leu Tyr Asp Gly
260 265 270
Leu Tyr Leu Val Leu Pro Arg Asp Arg Ile Ser Ala Ile Trp Lys Ala
275 280 285
Ser Gly Leu Gly Glu Thr Ala Arg Arg Asp Gly Ile Tyr Asp Ser Asp
290 295 300
Glu Phe Ala Met Thr Phe Lys Ser Ala Ala Ala Thr Trp Gly Lys Glu
305 310 315 320
Asn Phe Lys Ala Asp Gly Phe Ala Ile Leu Cys Gly Met Met Phe Gly
325 330 335
Thr Lys Ala Ser Thr Asn Arg His Ala Tyr Asn Trp Val Val Glu Arg
340 345 350
Gly Ser Phe Ser Thr Val Thr Phe Phe Glu Pro Gln Asn Gly Thr Tyr
355 360 365
Ser Asp Asp Ala Trp Gly Tyr Lys Ala Tyr Phe Gly Leu Phe His His
370 375 380
His His His His His His
385 390
Claims (27)
- 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되고, 하기 알파(2,6) 결합 시알산 당사슬을 모두 포함한 당단백질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 구멍장이 버섯(Polyporus squamosus) 유래 이소렉틴(isolectin) PSL1b의 활성형 재조합 렉틴:
NeuAc(α2→6)가 Gal 잔기 또는 Glc 잔기에 부가된 시알산화 당사슬;
NeuAc(α2→6)가 Gal(β1→4)Glc 잔기 또는 Glc(β1→4)Glc 잔기에 부가된 시알산화 당사슬;
NeuAc(α2→6)가 Gal(β1→4)GlcNac 잔기 또는 Gal(β1→3)GlcNac 잔기에 부가된 시알산화 당사슬;
NeuAc(α2→6)가 Gal(β1→3)[αFuc(1→4)]GlcNac 잔기에 부가된 시알산화 당사슬; 및
NeuAc(α2→6)가 Gal(β1→4)[αFuc(1→3)]GlcNac 잔기에 부가된 시알산화 당사슬.
- 제1항에 있어서, 상기 렉틴을 암호화하는 염기서열은 서열번호 1로 구성되는 것을 특징으로 하는 활성형 재조합 렉틴.
- 제1항의 활성형 재조합 렉틴을 암호화하는 서열번호 1의 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터로 형질전환시킨 박테리아 형질전환체.
- 제3항에 있어서, 상기 박테리아는 스타필로코코스 에우리우스(Staphylococcus aureus), 대장균(E. coli), 바실러스 세레우스(B. cereus), 살모넬라 타이피뮤림(Salmonella typimurium), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica) 및 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
- 제1항의 활성형 재조합 렉틴을 암호화하는 서열번호 1의 염기서열로 구성된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터로 형질전환시킨 효모 형질전환체.
- 제 5항에 있어서, 상기 효모는 피키아(Pichia), 사카로마이세스(Saccharomyces), 클루베로마이세스(Kluyveromyces), 야로위아(Yallowia), 한세눌라(Hansenula) 및 캔디다(Candida)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 효모 형질전환체.
- 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성되고, 하기 알파(2,6) 결합 시알산 당사슬을 모두 포함하는 당단백질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 구멍장이 버섯(Polyporus squamosus) 유래 이소렉틴(isolectin) PSL1b의 활성형 재조합 렉틴:
NeuAc(α2→6)가 Gal 잔기 또는 Glc 잔기에 부가된 시알산화 당사슬;
NeuAc(α2→6)가 Gal(β1→4)Glc 잔기 또는 Glc(β1→4)Glc 잔기에 부가된 시알산화 당사슬;
NeuAc(α2→6)가 Gal(β1→4)GlcNac 잔기 또는 Gal(β1→3)GlcNac 잔기에 부가된 시알산화 당사슬;
NeuAc(α2→6)가 Gal(β1→3)[αFuc(1→4)]GlcNac 잔기에 부가된 시알산화 당사슬; 및
NeuAc(α2→6)가 Gal(β1→4)[αFuc(1→3)]GlcNac 잔기에 부가된 시알산화 당사슬.
- 제7항에 있어서, 상기 렉틴을 암호화하는 염기서열은 서열번호 5로 구성되는 것을 특징으로 하는 활성형 재조합 렉틴.
- 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 발현벡터를 포함하고, 제7항의 활성형 재조합 렉틴 PSL1b 단백질을 생산하는, 수탁번호 KCTC 12507BP로 기탁된 재조합 대장균(Escherichia coli PSL1b) 균주.
- 서열번호 10의 아미노산 서열로 구성되고, 하기 알파(2,6) 결합 시알산 당사슬을 모두 포함하는 당단백질에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 구멍장이 버섯(Polyporus squamosus) 유래 이소렉틴(isolectin) PSL1b의 활성형 재조합 렉틴:
NeuAc(α2→6)가 Gal 잔기 또는 Glc 잔기에 부가된 시알산화 당사슬;
NeuAc(α2→6)가 Gal(β1→4)Glc 잔기 또는 Glc(β1→4)Glc 잔기에 부가된 시알산화 당사슬;
NeuAc(α2→6)가 Gal(β1→4)GlcNac 잔기 또는 Gal(β1→3)GlcNac 잔기에 부가된 시알산화 당사슬;
NeuAc(α2→6)가 Gal(β1→3)[αFuc(1→4)]GlcNac 잔기에 부가된 시알산화 당사슬; 및
NeuAc(α2→6)가 Gal(β1→4)[αFuc(1→3)]GlcNac 잔기에 부가된 시알산화 당사슬.
- 제10항에 있어서, 상기 렉틴을 암호화하는 염기서열은 서열번호 9로 구성되는 것을 특징으로 하는 활성형 재조합 렉틴.
- 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 발현벡터를 포함하며 제10항의 활성형 재조합 렉틴 PSL1b 단백질을 생산하는 수탁번호 KCTC 12500BP로 기탁된 재조합 효모(Pichia Pastoris PSL1b) 균주.
- 제 1항, 제 7항 또는 제 10항 중 어느 한 항의 재조합 렉틴을 이용하는 알파(2,6)시알산 당사슬을 포함하는 당단백질, 당펩타이드, 당지질, 당전구체 또는 올리고당의 측정 또는 정량용 키트.
- 제 1항, 제 7항 또는 제 10항 중 어느 한 항의 재조합 렉틴을 포함하는 알파(2,6)시알산 당사슬을 포함하는 시알산 당사슬을 표면에 갖는 세포주, 박테리아 또는 바이러스의 모니터링, 측정 또는 정량용 키트.
- a) 제 1항, 제 7항 또는 제 10항 중 어느 한 항의 재조합 렉틴에 피검 시료를 접촉하는 단계; 및
b) 상기 렉틴에 결합된 당단백질, 당펩타이드, 당지질, 당전구체 또는 올리고당을 분석하는 단계를 포함하는, 시알산 당사슬을 포함하는 당단백질, 당펩타이드, 당지질, 당전구체 또는 올리고당으로 구성된 시알산화 당사슬(conjugated)의 측정 또는 정량 방법.
- a) 제 1항, 제 7항 또는 제 10항 중 어느 한 항의 재조합 렉틴에 피검 시료를 접촉하는 단계; 및
b) 상기 렉틴에 결합된 세포, 박테리아 또는 바이러스를 분석하는 단계를 포함하는, 시알산 당사슬을 갖는 세포주, 박테리아 또는 바이러스의 측정 또는 정량 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020130140154A KR101673195B1 (ko) | 2013-11-18 | 2013-11-18 | 구멍장이 버섯 유래의 시알산 결합 특이적인 재조합 렉틴 |
| JP2016531684A JP6262345B2 (ja) | 2013-11-18 | 2014-11-14 | シアル酸結合に特異的なアミヒラタケ由来組み換えレクチン |
| US15/037,637 US10281460B2 (en) | 2013-11-18 | 2014-11-14 | Polyporus squamosus-derived recombinant lectin specific for sialic acid linkage |
| PCT/KR2014/010973 WO2015072785A1 (ko) | 2013-11-18 | 2014-11-14 | 구멍장이 버섯 유래의 시알산 결합 특이적인 재조합 렉틴 |
| EP14861999.2A EP3072970B1 (en) | 2013-11-18 | 2014-11-14 | Polyporus squamosus-derived recombinant lectin specific for sialic acid linkage |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020130140154A KR101673195B1 (ko) | 2013-11-18 | 2013-11-18 | 구멍장이 버섯 유래의 시알산 결합 특이적인 재조합 렉틴 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20150057167A KR20150057167A (ko) | 2015-05-28 |
| KR101673195B1 true KR101673195B1 (ko) | 2016-11-07 |
Family
ID=53057654
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020130140154A KR101673195B1 (ko) | 2013-11-18 | 2013-11-18 | 구멍장이 버섯 유래의 시알산 결합 특이적인 재조합 렉틴 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10281460B2 (ko) |
| EP (1) | EP3072970B1 (ko) |
| JP (1) | JP6262345B2 (ko) |
| KR (1) | KR101673195B1 (ko) |
| WO (1) | WO2015072785A1 (ko) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017091030A1 (ko) * | 2015-11-25 | 2017-06-01 | 한국생명공학연구원 | 헬리시움 에리나세우스 버섯 유래의 코어 1 o-결합 글리칸에 특이적으로 결합하는 렉틴 및 이의 용도 |
| KR101871802B1 (ko) * | 2017-12-21 | 2018-06-28 | 한국생명공학연구원 | 스테레움 힐슈튬 버섯 유래의 다중 퓨코실화 n-결합 글라이칸에 특이적으로 결합하는 렉틴 및 이의 용도 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993018782A1 (en) | 1992-03-20 | 1993-09-30 | Cor Therapeutics, Inc. | Glycosylation-mediated inhibition of factor x |
| US20100292453A1 (en) | 2002-08-20 | 2010-11-18 | Genitrix Llc | Lectin compositions and methods for modulating an immune response to an antigen |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5330897A (en) * | 1989-04-27 | 1994-07-19 | South Alabama Medical Science Foundation | Sialic acid binding lectin of protozoan origin |
| DE19819846B4 (de) | 1998-05-05 | 2016-11-24 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Multivalente Antikörper-Konstrukte |
| WO2006091942A2 (en) | 2005-02-24 | 2006-08-31 | Lifescan, Inc. | Methods of expressing, purifying and characterizing concanavalin a, mutants thereof, and sensors including the same |
| KR101054672B1 (ko) * | 2008-06-12 | 2011-08-08 | 중앙대학교 산학협력단 | 재조합 당단백질의 당쇄 말단 시알산 함유량 분석 방법 |
-
2013
- 2013-11-18 KR KR1020130140154A patent/KR101673195B1/ko active IP Right Grant
-
2014
- 2014-11-14 WO PCT/KR2014/010973 patent/WO2015072785A1/ko active Application Filing
- 2014-11-14 EP EP14861999.2A patent/EP3072970B1/en active Active
- 2014-11-14 JP JP2016531684A patent/JP6262345B2/ja active Active
- 2014-11-14 US US15/037,637 patent/US10281460B2/en active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993018782A1 (en) | 1992-03-20 | 1993-09-30 | Cor Therapeutics, Inc. | Glycosylation-mediated inhibition of factor x |
| US20100292453A1 (en) | 2002-08-20 | 2010-11-18 | Genitrix Llc | Lectin compositions and methods for modulating an immune response to an antigen |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Biochem. J., Vol.382, pp.667-675(2004.11.)* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US10281460B2 (en) | 2019-05-07 |
| EP3072970A4 (en) | 2016-09-28 |
| EP3072970B1 (en) | 2019-03-27 |
| WO2015072785A1 (ko) | 2015-05-21 |
| KR20150057167A (ko) | 2015-05-28 |
| JP2016537980A (ja) | 2016-12-08 |
| US20160290997A1 (en) | 2016-10-06 |
| JP6262345B2 (ja) | 2018-01-17 |
| EP3072970A1 (en) | 2016-09-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101891649B1 (ko) | 신규 푸코실트랜스페라제 및 그 적용 | |
| US20230357742A1 (en) | Novel recombinant factor c and method for producing the same, and method for measuring endotoxin | |
| US20140087395A1 (en) | Method for distinguishing between species within the genus staphilococcus | |
| WO2006093088A1 (ja) | 新規ポリペプチドおよびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにそれらの利用 | |
| KR101673195B1 (ko) | 구멍장이 버섯 유래의 시알산 결합 특이적인 재조합 렉틴 | |
| KR101695741B1 (ko) | 헬리시움 에리나슘 버섯 유래의 시알산 결합 특이적인 렉틴 | |
| KR101842226B1 (ko) | 헬리시움 에리나세우스 버섯 유래의 코어 1 o-결합 글리칸에 특이적으로 결합하는 렉틴 및 이의 용도 | |
| KR101457514B1 (ko) | 우렁쉥이(멍게) 유래의 시알산 전이효소 및 이를 이용한 시알화 복합당질 합성 방법 | |
| WO2020040257A1 (ja) | 改変ホスホリラーゼを利用したラクト－Ｎ－ビオースＩまたはガラクト－Ｎ－ビオースのβグリコシドの酵素合成法 | |
| JP4781851B2 (ja) | αＮ−アセチルグルコサミニル結合を加水分解する新規な糖質加水分解酵素 | |
| CN108359000B (zh) | 一种改造的杨树菇凝集素蛋白及其制备方法和应用 | |
| JP5233347B2 (ja) | 組換ヤナギマツタケ・ガレクチン | |
| CN113088505B (zh) | 多糖裂解酶编码基因04147在制备重组桃胶多糖水解酶中的应用 | |
| JP2021177713A (ja) | デアミノノイラミン酸特異的シアリダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸及びその利用 | |
| JP7343890B2 (ja) | シアリダーゼ活性を有する酵素剤及びその利用 | |
| JP7353616B2 (ja) | 糖鎖結合性新規タンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチド | |
| KR101871802B1 (ko) | 스테레움 힐슈튬 버섯 유래의 다중 퓨코실화 n-결합 글라이칸에 특이적으로 결합하는 렉틴 및 이의 용도 | |
| RU2698460C1 (ru) | Способ получения рекомбинантной в-1,4-галактозидазы bgaa из streptococcus pneumoniae | |
| CN109609535A (zh) | 一种大肠杆菌β半乳糖苷酶受体的原核表达载体 | |
| JPWO2016136984A1 (ja) | エンドｍ変異体、及びｎ結合型糖鎖含有化合物又はｎ結合型糖鎖含有蛋白質の製造方法 | |
| JP3752223B2 (ja) | ハリエニシダ由来のレクチンタンパク質をコードする遺伝子、その遺伝子がコードするタンパク質及びその製造方法 | |
| WO2015072786A1 (ko) | 헬리시움 에리나슘 버섯 유래의 시알산 결합 특이적인 렉틴 | |
| KR20100087060A (ko) | 효모 표면 발현된 코리네박테리움 디프테리아 유래 트랜스-시알리다아제 및 이를 이용한 시알산 전구체 제조방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E90F | Notification of reason for final refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20191008 Year of fee payment: 4 |