CN102816222A - 鸡柔嫩艾美耳球虫ma2基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鸡柔嫩艾美耳球虫MA2基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用。EtMA2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或者是SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等活性的蛋白。本发明还公开了EtMA2膜外功能域蛋白（EtMA2-Outsidedomain），其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，或者是SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等活性的蛋白。EtMA2蛋白和EtMA2膜外功能域蛋白可应用于制备抗艾美耳球虫药物，通过免疫EtMA2膜外功能域蛋白，能有效控制鸡体感染柔嫩艾美耳球虫病，大大降低养鸡场抗球虫药的使用量，有效控制鸡球虫病。

Description

鸡柔嫩艾美耳球虫 MA2 基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及鸡柔嫩艾美耳球虫MA2蛋白（EtMA2蛋白）的膜外功能域蛋白（EtMA2-Outside domain）及其编码基因、含有该基因的载体、重组菌株及其应用；还涉及鸡柔嫩艾美耳球虫MA2蛋白及其编码基因、含有该基因的载体、重组菌株及其应用。

背景技术

鸡球虫病是一种严重危害集约化养鸡业、世界性流行的寄生虫病，在无预防措施或预防失败（如因抗药性问题致药物无效）的情况下，鸡发病率可达30%-100%，致死率可高达80%。全球每年因球虫病引起的经济损失超过35亿美元以上，我国因球虫病所致养鸡业的经济损失估计可高达35亿元人民币以上。

目前，世界公认的鸡球虫有7种：柔嫩艾美耳球虫（E.tenella），毒害艾美耳球虫（E.necatrix），巨型艾美耳球虫（E.maxima），堆型艾美耳球虫（E.acervulina），布氏艾美耳球虫（E.brunette），早熟艾美耳球虫（E.praecox），和缓艾美耳球虫（E.mitis），其中柔嫩艾美耳球虫主要侵害盲肠，是毒力最强、危害最大的鸡球虫，也是研究最多的虫种。

长久以来，国内外鸡球虫病的预防一直采用 “在饲料中添加抗球虫药、实行以饲料厂为中心控制环节”的技术方法，但该方法已遭遇到球虫抗药性的严峻挑战，在某些地区甚至已到无药可用的困难境地。免疫控制技术作为一种“新型的 (novel)可持续的(sustainable) ”的球虫病控制方法已得到越来越多的应用。尽管以鸡球虫病活卵囊疫苗为主要技术载体的免疫控制技术正在逐步推广应用，但这类疫苗完全以鸡体作为唯一制苗载体，普遍存在生产成本高、保存运输困难、接种使用后对鸡体生长有明显抑制、散毒危险和难以质量控制等几乎不可逾越的障碍。

因此，开发新药或新型分子疫苗是球虫病研究的主要方向，然而迄今为止，人们对艾美耳球虫的药物靶标分子或候选疫苗分子都知之甚少。

顶膜抗原（Apical Membrane Antigen，AMA）是一种在顶复门原虫中高度保守的微线分泌蛋白，可以和棒状体分泌的颈部蛋白共同形成“运动结合体（Moving Junction）”，共同完成虫体与宿主细胞的粘附作用, 是协助虫体进入宿主细胞的关键物质。

近几年，通过对鸡球虫基因文库和蛋白质组的研究，开始对鸡球虫 AMA1 有所了解，但目前为止未有系统性研究的报道。Ng 等在对柔嫩艾美耳球虫的子孢子和裂殖子的 cDNA 文库比较研究时发现，子孢子阶段有一条 EST 序列（基因登陆号：BG589）与 AMA1 具有相似性，而在裂殖子文库中未找到相同的 EST 序列。在Bromley等的蛋白组学研究中发现，柔嫩艾美耳球虫不只一种顶膜抗原，并且出现在不同的发育阶段，所以分析可能这些蛋白分别在不同的入侵阶段发挥着类似的作用。Blake 等利用基因图谱法对球虫中免疫力最强的巨型艾美耳球虫保护性抗原进行筛选，将两株具有不同生物学特性的巨型艾美耳球虫在鸡体内进行杂交后的基因组，与柔嫩艾美耳球虫的基因组进行比对，结果发现与 AMA1 具有同源性的抗原可以优先刺激机体产生免疫力，可以优先作为疫苗和药物开发的研究靶标。本课题组在对广东株柔嫩艾美耳球虫裂殖子cDNA的克隆时，获得了多个类似顶膜抗原的基因，分别对其功能进行研究，发现其中一种蛋白MA2可以有效预防鸡体感染鸡球虫病。而迄今为止，尚无任何其他关于该蛋白对艾美耳球虫免疫保护性的研究。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种鸡柔嫩艾美耳球虫MA2蛋白（EtMA2蛋白）。

本发明的另一个目的在于提供编码上述EtMA2蛋白的基因。

本发明的目的在于提供一种EtMA2膜外功能域蛋白（EtMA2-Outside domain）。

本发明的另一个目的在于提供编码上述EtMA2膜外功能域蛋白的基因。

本发明的另一个目的在于提供含有EtMA2蛋白基因或EtMA2膜外功能域蛋白基因的克隆载体。

本发明的另一个目的在于提供一种EtMA2膜外功能域蛋白的制备方法。

本发明的另一个目的在于提供EtMA2蛋白和/或EtMA2膜外功能域蛋白在制备抗艾美耳球虫药物中的应用。

本发明所采用的技术方案是：

鸡柔嫩艾美耳球虫MA2蛋白（EtMA2蛋白），其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或者是SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等活性的蛋白。

编码权利上述EtMA2蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

EtMA2膜外功能域蛋白（EtMA2-Outside domain），其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，或者是SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等活性的蛋白。

编码上述EtMA2膜外功能域蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

一种克隆载体，含有EtMA2蛋白的编码基因或EtMA2膜外功能域蛋白的编码基因。

一种表达载体，含有EtMA2蛋白的编码基因或EtMA2膜外功能域蛋白的编码基因。

生产EtMA2膜外功能域蛋白的方法，包括将上述的表达载体导入宿主细胞中，表达得到EtMA2膜外功能域蛋白。

EtMA2蛋白或EtMA2膜外功能域蛋白在制备抗艾美耳球虫药物中的应用。

本发明的有益效果在于：

通过免疫EtMA2膜外功能域蛋白（EtMA2-Outside domain），能有效控制鸡体感染柔嫩艾美耳球虫病，大大降低养鸡场抗球虫药的使用量，有效控制鸡球虫病。

附图说明

图1是E.tenella裂殖子总RNA电泳结果；

图2是EtMA2基因全长ORF的PCR扩增鉴定结果（M：DL 2000 Marker；6： EtMA2的PCR产物）；

图3是 EtMA2的菌液PCR鉴定结果（M：DL 2000 Marker；2-3：EtMA2阳性菌）；

图4是 EtMA2信号肽切割位点分析图；

图5是 EtMA2膜外结构域位点分析图；

图6 是EtMA2-Outside domain的PCR产物电泳图（M. DL 2000 Marker；1-2：EtMA2-Outside domain PCR产物）；

图7是EtMA2-Outside domain的菌液PCR鉴定电泳图（M. DL 2000 Marker；1-2：EtMA2-Outside domain 菌液PCR结果）

图8是pColdI-EtMA2-Outside domain表达产物SDS-PAGE电泳分析图（M.蛋白质分子质量标准，1-6.纯化的融合蛋白，7.Western blot）。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等都采用常规的方法，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版) (Sambrook J, Russell DW，Janssen K, Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)。及《现代分子生物学实验技术》（卢圣栋主编，第2版, 北京:中国协和医科大学出版社, 1999）。

实施例 1

1 EtMA2基因序列的克隆

1.1 PCR引物设计：根据预测的E.tenella棒状体颈部蛋白Et MA2基因的cDNA序列用Premier Primer 5.0软件设计，上海英骏生物工程公司合成：

上游引物MA2F：5’ ATGTGGGGGCAAAACCAGCG 3’（SEQ ID NO:5）；

下游引物MA2R：5’ TTACTGCTGGTCGTAATTCGCGTCT 3’ （SEQ ID NO:6）。

1. 2 广东株E.tenella裂殖子（由广东省农业科学院兽医研究所寄生生物研究室保存）的分离和纯化：方法参照《鸡球虫病学》（索勋，李国清主编，北京:中国农业大学出版社，1997.）。

1.3 E.tenella裂殖子总RNA的提取：方法参照Invitrogen公司的TRIZOL LS^® Reagent试剂盒说明书。分光光度计测定RNA浓度为1µg/ml；电泳结果显示分共为28S，18S和5S等3个大小不同的片段，条带清晰（如图1）。

1.4 RT-PCR扩增EtMA2全长ORF序列

以上述步骤抽提的E.tenella裂殖子的总RNA作为模板，用Takara公司的PrimeScript^TM1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒合成cDNA；以cDNA为模板，MA2F，MA2R为引物，TaKaRa LA Taq^TM酶进行PCR扩增，反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，72℃延伸10min，35个循环。产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果扩增获得一条约1800bp的片段（见图2）。将PCR产物纯化回收后按试剂盒说明书连接至pMD18-T载体（Takara公司），再将连接产物转化入E.coli DH５α感受态细胞，得到E.coli DH5α（pMD18-T- EtMA2）。在Amp抗性平板上生长的白色菌落为可疑重组子，挑单菌落培养，以菌液为模板，以引物EtMA2F，EtMA2R进行菌液PCR扩增，获得大小约为1800bp的条带（见图3）。阳性菌送上海生工生物工程公司测序，EtMA2序列全长为1839bp，如SEQ ID NO:1所示。

1.5 序列的分析

利用在线Translate tool（http://www.expasy.ch/tools/dna.html）翻译EtMA2序列，推测出其氨基酸序列（SEQ ID NO：2）。 利用信号肽在线分析软件SignalP 4.0 Server分析EtMA2信号肽，利用跨膜结构域在线分析软件TMHMM Server v. 2.0分析EtMA2氨基酸序列。

2 EtMA2 膜外功能域蛋白（ EtMA2 -Outside domain ）的制备

2.1 EtMA2-Outside domain的扩增

扩增引物：

EtMA2-Outside domainF：

5’ GGCGGATCCGGCGTCAAAGTTCAGCAGCAGCAGC 3’（SEQ ID NO:7）

EtMA2-Outside domain R：

5' GGCAAGCTTTTAGTTGTTATTTTCTCCTTCTTGTTCT 3'（SEQ ID NO:8）

在引物的上游序列中分别引入BamHⅠ酶切位点，在下游引物引入HindIII酶切位点；并分别加“GGC”3个碱基以保证内切酶发挥作用。以上引物均由广东英俊生物技术公司合成。

以E.coli DH5α（pMD18-T-EtMA2）为模板，建立如下PCR反应扩增EtMA2-Outside domain的序列：

PCR反应程序：

94℃预变性5min→94℃变性30s→55℃退火30sec→72℃延伸2min→72℃延伸10min→4℃；共35个循环。

将PCR产物用以1%琼脂糖凝胶于100V电泳1h后，紫外检测仪下观察结果（图6）。产物大小约为1500bp，与预期的产物大小一致。

用DNA胶回收试剂盒回收目的片段，并进行酶切反应（表2）：

37℃孵育3h后，以1%琼脂糖凝胶于100V电泳1h后，用DNA胶回收试剂盒回收酶切后的目的片段。

2.2表达载体的处理

取一E.coli表达载体新鲜菌落分别接种于10ml LB液体培养基（含100μg/ml氨苄青霉素），37℃振荡培养12h后，用小量质粒制备试剂盒抽提质粒；建立如下酶切反应，酶切质粒：

37℃孵育3h后，将样品以1%琼脂糖凝胶100V电泳1h。用DNA胶回收试剂盒回收酶切后的质粒；

2.3酶切载体与酶切片段的连接：

酶切后的EtMA2-Outside domain与pCold I按表4组成建立连接反应，构建pCold I-EtMA2-Outside domain重组表达载体。

2.4 连接产物转化E.coli DH5α (CaCl₂法)

（1）取一新鲜培养的E.coli DH 5α单菌落，接种于一个含有10 mL LB的液体培养基，37℃振荡培养过夜。

（2）取过夜培养的菌液1 mL接种于100 mL的LB液体培养基中，剧烈振摇2 h（300r/min）至OD₆₀₀=0.4。

（3）将细菌转移到一个无菌的预冷的50 mL离心管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0 ℃。

（4）于4 ℃以4 100 r/min离心10 min回收细胞。

（5）弃掉培养液，将管倒置1 min。

（6）每50 mL初始培养液用30 mL用冰预冷的0.1 mol/L CaCl₂-MgCl₂溶液重悬每份细胞沉淀。

（7）于4℃以4 100 r/min离心10 min回收细胞。

（8）弃掉培养液，将管倒置1 min。

（9）每50 mL初始培养物用2 mL预冷的0.1 mol/L CaCl₂重悬每份细胞沉淀。

（10）从用CaCl₂制备的感受态细胞悬液中吸取200 μL转移到1 mL的离心管中，每管加入连接产物5 μL，冰浴30 min。

（11）将离心管放入预加温至42 ℃水浴中，静置90 s。

（12）快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2 min。

（13）每管加800 μL SOC培养基，于37℃缓慢振摇培养温育45 min。

（14）将培养物涂布于LB琼脂平板（含100 μg/mL Amp），将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平皿，37 ℃过夜培养（约12～16 h）。

2.5 PCR法鉴定转化克隆

挑取一些菌落分别接种于10ml LB培养基中（含100μg/ml氨苄青霉素），37℃振荡过夜培养后，取培养物建立如下PCR反应筛选阳性克隆：

PCR反应程序：同上。

取PCR反应产物10μl，以1%琼脂糖凝胶于100V电泳1h后，紫外检测仪下观察结果（图7）。

取PCR鉴定为阳性的克隆送上海英骏生物技术公司进行重组质粒的测序，分析重组质粒中外源基因的阅读框架是否改变，结果显示扩增所获得序列与预获得序列完全匹配，且正确插入pColdI载体。

2.6 pColdI-EtMA2-Outside domain在表达菌中的诱导表达

（1）将鉴定为阳性的新鲜单个重组菌落接种10ml LB培养基（含100μg/ml氨苄青霉素），37℃振荡培养过夜以获得饱和培养物，抽提重组质粒，转化入表达菌E.coli Rosetta（DE3）。挑取单克隆接种10ml LB培养基（含100μg/ml氨苄青霉素），37℃振荡培养过夜以获得饱和培养物；

（2）取过夜培养物，按1：100接种于500mL含有Amp(100μg/ml)的LB培养液，重组菌的接种液16℃培养；

（3）当培养物OD₆₀₀值达到0.6左右时，取1ml未诱导的培养物转移至一离心管中，迅速在室温下以10000×g离心1min，弃上清液，细菌沉淀用适量1×SDS凝胶加样缓冲液中，100℃加热5min备用；

（4） 剩余的培养物加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导表达， 16℃培养组过夜诱导培养。诱导结束后，根据各组OD600的值，分别取与诱导前相同细菌数的菌液，离心后4℃保存。

各重组菌落用IPTG诱导表达后经SDS-PAGE分析，在16℃条件下，使用终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导，16h后pColdI-EtMA2-Outside domain重组质粒在E.coli Rosetta（DE3）中有目的蛋白表达（图8）。

2.7表达产物的处理

将诱导结束的培养液分别5500r/min离心15分钟，弃上清夜。菌体用20mL，0.1M Tris-HCL(pH7.4)的缓冲液(含50μL 100mM的PSMF)重悬，-20℃冻存过夜。冻存过夜的裂解液，冰浴解冻后用超声波裂解破碎；4℃ 9000r/min离心20分钟，取上清保存，沉淀用20mL，0.1M Tris-HCL(pH7.4)缓冲液(含50μL 100mM的PSMF)重悬保存。诱导前、诱导后的菌体及裂解后的上清、沉淀经OD₆₀₀值换算后等量加样进行SDS-PAGE电泳，由BandScan软件分析目的蛋白的表达量，结果显示100mL菌液可以获得约25mg目的蛋白。表达产物经NTA Agarose纯化。

2.8 蛋白的纯化

Ni-NTA柱纯化表达的可溶性蛋白，参照《分子克隆实验指南》的方法进行，纯化在4℃层析柜中进行。

（1）在10mL的可溶性蛋白中加入5mL 50%的Ni-NTA琼脂后置于4℃ 轻柔混匀1h；

（2）把可溶性蛋白-Ni-NTA琼脂混合物加入到底部封住的纯化柱中；

（3）移去底部的盖子，收集液体；

（4）用含10mM imidazole的Wash Buffer洗涤纯化柱四次，每次10mL，同时分别收集每次的洗涤液；

（5）用含250mM imidazole的Elution Buffer洗涤纯化柱四次，每次2mL，同时分别收集每次的洗脱液；

（6）SDS-PAGE GEL电泳检测蛋白纯化效果，结果显示纯化后条带单一，分子量大小与预测大小一致（图8）。

2.9 重组蛋白的免疫印迹（Western blot）分析

将重组EtMA2-Outside domain蛋白采用免疫印迹（Western blot）方法进行免疫活性鉴定。一抗为鼠源his单克隆抗体（Sigma公司），二抗为羊抗鼠IgG-HRP（Sigma公司）。结果见图8。结果显示鼠源his单克隆抗体能够识别本发明表达的重组EtMA2-Outside domain蛋白，证明得到的蛋白是EtMA2-Outside domain重组蛋白。

3 动物保护性实验

3.1 材料：

球虫卵囊：柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)广东株孢子化卵囊，由广东省农业科学院兽医研究所保存，使用前在无球虫雏鸡体内复壮。

雏鸡：岭南黄雏鸡，由广东省农业科学院畜牧研究所提供，饲养于已消毒的专用动物房内；鸡笼和所用器皿均严格消毒，自由采食和饮用纯净水；实验前观察雏鸡有无临床症状及连续2d检查粪便有无球虫卵囊，备用。

饲料：由广东省新南都饲料有限公司定制育雏料，不含任何抗球虫药物。

3.2实验方法：

分组：按实验分组及处理将200只岭南黄雏鸡饲养至10日龄，逐只称重，淘汰弱雏和体重过大者，将剩余雏鸡随机分成5组，每组30只，并适当调整使每组雏鸡总体重大致相等。

处理：

EtMA2-Outside domain重组蛋白的乳化： 取2.8纯化后所得的EtMA2 -Outside domain重组蛋白与弗氏佐剂（FCA）按照1：1的比例混匀；用7号针头注射器反复抽吸至滴于水上5min内不扩散为止。

于14、21日龄分别两次经胸部肌肉注射免疫岭南黄鸡慢大鸡。28日龄分别经口感染5×10⁴个新鲜的E.tenella孢子化卵囊。每天观察并记录鸡群的精神状况、采食量、粪便情况等；对死亡雏鸡称重，剖检，若为柔嫩艾美耳球虫感染引起死亡则病变记分为+4分；所有雏鸡于感染后第7天逐只称重，剖检，进行盲肠病变记分；最后计算各组雏鸡的增重和饲料报酬。具体的实验分组如下表：

药效判定方法及标准抗球虫指数(ACI)按美国默克公司推荐的公式计算：ACI=(相对增重率+存活率)一(卵囊值+病变值)；相对增重率=(实验组增重÷空白对照组增重)×100％；存活率=(各组存活雏鸡数÷各组雏鸡总数)×100％。病变按五级记分：①无卵囊，盲肠正常，为0分；②有卵囊，盲肠黏膜稍增厚，有少量散在出血或少量血样肠内容物，为+1分；③有卵囊，盲肠黏膜增厚，有明显出血或明显血样肠内容物，为+2分；④有卵囊，盲肠黏膜增厚，有大量凝血块或血样肠芯，为+3分；⑤雏鸡因球虫病死亡或有大量卵囊，盲肠外观呈酱油色(或小肠中部有点状坏死灶，黏膜面呈绯红色)，肠管明显肿大，内容物形成明显的血样肠芯，为+4分。组内病变值=每组平均病变记分×20。药效判定标准是ACI<120为无效，120—160为弱效，160—180为中效，180以上为强效。卵囊值由盲肠内容物克卵囊数(OPG)换算而来。

实验结果：

临床症状观察：

接种柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊的红对照组第2天，病鸡出现精神沉郁，呆立，食欲减退；第5天出现明显血便，随后血便逐渐减少，小剂量免疫组有部分鸡只拉血便，高、中剂量免疫组鸡体精神良好，未出现血便。

抗球虫指数：结果见表7。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

<110> 广东省农业科学院兽医研究所

<120> 鸡柔嫩艾美耳球虫MA2基因、载体、重组菌株和蛋白及其应用

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1839

<212> DNA

<213> E.tenella

<400> 1

atgtgggggc aaaaccagcg ccaggcagcg gcgctgctgc tcatttcttc tttacttttc 60

ttcaactccg aagtctctgc gggcgtcaaa gttcagcagc agcagcagca gcagcaaagc 120

agcccttccc ccttgcagag agcgcccgca gagagctttt ccgcgatgga tcaaacagca 180

gcagcagcgc tagagatgct gcagctgcag cagcagcagc agcagcagca gcaggagcag 240

caggaagctg aaaagttgaa ttcaaacaac ttcctggcca ctgcatcgcc acatgctgtc 300

tctacactgc aaacagaaag tcaaaatcct tggctgtcgg gagctctgaa gacattcaca 360

agcaagttca atatcccggt tgttcacggt tctggggtgt acgtggacct cgggaaaacg 420

agttccggat accgccagcc gggaggactc tgtccagttt ttgggaaata tattaaaatt 480

gaaaagcaaa attcaaatta caaaactttt ctcgaagact ttccagtttc gggatcttcc 540

gaaaggcctt tgcccggagg attcaacttg gcgtatgtca ccagcagcgg acgcgccttt 600

tctccggttg ccgattcttt cctcgtggat gcttttggct tgacggggcc atcggacccg 660

atatctcgct gcgcgaagta cagctacttg atggagcccc ggaagccagg aacaaatggc 720

acttttgatt acaagttgcc ttttgtttac gacgcagcag caaaaagctg cttcgtgctg 780

cacgtcagca tgcagaagct cactggcagc agatattgct cctcgaacgg gacccccgct 840

ggcctctttt ggccctgctt ccgccccgcc aaaagcgcct cagcttcgac ccatcttgtc 900

tatggctctg ggcaaatggg cgcagaccca gaggcttgga aaaagaagtg cccctcgaga 960

gccgtgaagg acgcggtgtt cggacagtgg ggggtggggg gctgcacggc gttggcggcg 1020

aactcttcgg gtgtacgtac actgcaagtt gcatacaaaa gcaaatgttg ggaaactctt 1080

tttgacttct ctgctcctga cgaagctgtt gcttccaacc ccgacaactg ggactccatt 1140

tggcctacgc tcgacagcag cgcctccgtc tcagcgggag ttgggcaaaa ctacgccaac 1200

ttcttcccca gcagctccgg gccagggggg acttgtgtta tttttgctgc tgtaccctct 1260

tgcttcctga gggcccccgg gcacacagcc tacacctcag tgggttcttt ggcggaggag 1320

gccctcccgg actccgcgcc ggggggcccc ccctcttctg ggggcggggg gggcccccag 1380

gagccccagg ggccccagga gccccagccg gggggccccg aacccgaacc cagccccgaa 1440

cccagccccg aacccggaga gcccggcagc ggcgaaggag ggggggaaga gggggaaaca 1500

aatcctccaa aagagcctca agaagagcct tccttgccgc ctgaagaggg gggaggtcaa 1560

gaagaaaaac aagaacaaga aggagaaaat aacaactggg ctattgctgg aggtgttgtg 1620

gggggcctaa ttttgctggc agcagtagca gcgggtgctg tcttctacac aaaaaaaccc 1680

tcgagccagg cccaagatag ccacgtggtg attgtggaag agcatggcac tggcggaggg 1740

gccggaagaa ctccttcgga ggccaacgtc agtttggaag agtccttttg gagaggcgac 1800

ggggaaggcc tcatagacgc gaattacgac cagcagtaa 1839

<210> 2

<211> 612

<212> PRT

<213> E.tenella

<400> 2

Met Trp Gly Gln Asn Gln Arg Gln Ala Ala Ala Leu Leu Leu Ile Ser

1 5 10 15

Ser Leu Leu Phe Phe Asn Ser Glu Val Ser Ala Gly Val Lys Val Gln

20 25 30

Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Ser Ser Pro Ser Pro Leu Gln Arg Ala

35 40 45

Pro Ala Glu Ser Phe Ser Ala Met Asp Gln Thr Ala Ala Ala Ala Leu

50 55 60

Glu Met Leu Gln Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Glu Gln

65 70 75 80

Gln Glu Ala Glu Lys Leu Asn Ser Asn Asn Phe Leu Ala Thr Ala Ser

85 90 95

Pro His Ala Val Ser Thr Leu Gln Thr Glu Ser Gln Asn Pro Trp Leu

100 105 110

Ser Gly Ala Leu Lys Thr Phe Thr Ser Lys Phe Asn Ile Pro Val Val

115 120 125

His Gly Ser Gly Val Tyr Val Asp Leu Gly Lys Thr Ser Ser Gly Tyr

130 135 140

Arg Gln Pro Gly Gly Leu Cys Pro Val Phe Gly Lys Tyr Ile Lys Ile

145 150 155 160

Glu Lys Gln Asn Ser Asn Tyr Lys Thr Phe Leu Glu Asp Phe Pro Val

165 170 175

Ser Gly Ser Ser Glu Arg Pro Leu Pro Gly Gly Phe Asn Leu Ala Tyr

180 185 190

Val Thr Ser Ser Gly Arg Ala Phe Ser Pro Val Ala Asp Ser Phe Leu

195 200 205

Val Asp Ala Phe Gly Leu Thr Gly Pro Ser Asp Pro Ile Ser Arg Cys

210 215 220

Ala Lys Tyr Ser Tyr Leu Met Glu Pro Arg Lys Pro Gly Thr Asn Gly

225 230 235 240

Thr Phe Asp Tyr Lys Leu Pro Phe Val Tyr Asp Ala Ala Ala Lys Ser

245 250 255

Cys Phe Val Leu His Val Ser Met Gln Lys Leu Thr Gly Ser Arg Tyr

260 265 270

Cys Ser Ser Asn Gly Thr Pro Ala Gly Leu Phe Trp Pro Cys Phe Arg

275 280 285

Pro Ala Lys Ser Ala Ser Ala Ser Thr His Leu Val Tyr Gly Ser Gly

290 295 300

Gln Met Gly Ala Asp Pro Glu Ala Trp Lys Lys Lys Cys Pro Ser Arg

305 310 315 320

Ala Val Lys Asp Ala Val Phe Gly Gln Trp Gly Val Gly Gly Cys Thr

325 330 335

Ala Leu Ala Ala Asn Ser Ser Gly Val Arg Thr Leu Gln Val Ala Tyr

340 345 350

Lys Ser Lys Cys Trp Glu Thr Leu Phe Asp Phe Ser Ala Pro Asp Glu

355 360 365

Ala Val Ala Ser Asn Pro Asp Asn Trp Asp Ser Ile Trp Pro Thr Leu

370 375 380

Asp Ser Ser Ala Ser Val Ser Ala Gly Val Gly Gln Asn Tyr Ala Asn

385 390 395 400

Phe Phe Pro Ser Ser Ser Gly Pro Gly Gly Thr Cys Val Ile Phe Ala

405 410 415

Ala Val Pro Ser Cys Phe Leu Arg Ala Pro Gly His Thr Ala Tyr Thr

420 425 430

Ser Val Gly Ser Leu Ala Glu Glu Ala Leu Pro Asp Ser Ala Pro Gly

435 440 445

Gly Pro Pro Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Pro Gln Glu Pro Gln Gly

450 455 460

Pro Gln Glu Pro Gln Pro Gly Gly Pro Glu Pro Glu Pro Ser Pro Glu

465 470 475 480

Pro Ser Pro Glu Pro Gly Glu Pro Gly Ser Gly Glu Gly Gly Gly Glu

485 490 495

Glu Gly Glu Thr Asn Pro Pro Lys Glu Pro Gln Glu Glu Pro Ser Leu

500 505 510

Pro Pro Glu Glu Gly Gly Gly Gln Glu Glu Lys Gln Glu Gln Glu Gly

515 520 525

Glu Asn Asn Asn Trp Ala Ile Ala Gly Gly Val Val Gly Gly Leu Ile

530 535 540

Leu Leu Ala Ala Val Ala Ala Gly Ala Val Phe Tyr Thr Lys Lys Pro

545 550 555 560

Ser Ser Gln Ala Gln Asp Ser His Val Val Ile Val Glu Glu His Gly

565 570 575

Thr Gly Gly Gly Ala Gly Arg Thr Pro Ser Glu Ala Asn Val Ser Leu

580 585 590

Glu Glu Ser Phe Trp Arg Gly Asp Gly Glu Gly Leu Ile Asp Ala Asn

595 600 605

Tyr Asp Gln Gln

610

<210> 3

<211> 1515

<212> DNA

<213> E.tenella

<400> 3

ggcgtcaaag ttcagcagca gcagcagcag cagcaaagca gcccttcccc cttgcagaga 60

gcgcccgcag agagcttttc cgcgatggat caaacagcag cagcagcgct agagatgctg 120

cagctgcagc agcagcagca gcagcagcag caggagcagc aggaagctga aaagttgaat 180

tcaaacaact tcctggccac tgcatcgcca catgctgtct ctacactgca aacagaaagt 240

caaaatcctt ggctgtcggg agctctgaag acattcacaa gcaagttcaa tatcccggtt 300

gttcacggtt ctggggtgta cgtggacctc gggaaaacga gttccggata ccgccagccg 360

ggaggactct gtccagtttt tgggaaatat attaaaattg aaaagcaaaa ttcaaattac 420

aaaacttttc tcgaagactt tccagtttcg ggatcttccg aaaggccttt gcccggagga 480

ttcaacttgg cgtatgtcac cagcagcgga cgcgcctttt ctccggttgc cgattctttc 540

ctcgtggatg cttttggctt gacggggcca tcggacccga tatctcgctg cgcgaagtac 600

agctacttga tggagccccg gaagccagga acaaatggca cttttgatta caagttgcct 660

tttgtttacg acgcagcagc aaaaagctgc ttcgtgctgc acgtcagcat gcagaagctc 720

actggcagca gatattgctc ctcgaacggg acccccgctg gcctcttttg gccctgcttc 780

cgccccgcca aaagcgcctc agcttcgacc catcttgtct atggctctgg gcaaatgggc 840

gcagacccag aggcttggaa aaagaagtgc ccctcgagag ccgtgaagga cgcggtgttc 900

ggacagtggg gggtgggggg ctgcacggcg ttggcggcga actcttcggg tgtacgtaca 960

ctgcaagttg catacaaaag caaatgttgg gaaactcttt ttgacttctc tgctcctgac 1020

gaagctgttg cttccaaccc cgacaactgg gactccattt ggcctacgct cgacagcagc 1080

gcctccgtct cagcgggagt tgggcaaaac tacgccaact tcttccccag cagctccggg 1140

ccagggggga cttgtgttat ttttgctgct gtaccctctt gcttcctgag ggcccccggg 1200

cacacagcct acacctcagt gggttctttg gcggaggagg ccctcccgga ctccgcgccg 1260

gggggccccc cctcttctgg gggcgggggg ggcccccagg agccccaggg gccccaggag 1320

ccccagccgg ggggccccga acccgaaccc agccccgaac ccagccccga acccggagag 1380

cccggcagcg gcgaaggagg gggggaagag ggggaaacaa atcctccaaa agagcctcaa 1440

gaagagcctt ccttgccgcc tgaagagggg ggaggtcaag aagaaaaaca agaacaagaa 1500

ggagaaaata acaac 1515

<210> 4

<211> 505

<212> PRT

<213> E.tenella

<400> 4

Gly Val Lys Val Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Ser Ser Pro Ser

1 5 10 15

Pro Leu Gln Arg Ala Pro Ala Glu Ser Phe Ser Ala Met Asp Gln Thr

20 25 30

Ala Ala Ala Ala Leu Glu Met Leu Gln Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln

35 40 45

Gln Gln Gln Glu Gln Gln Glu Ala Glu Lys Leu Asn Ser Asn Asn Phe

50 55 60

Leu Ala Thr Ala Ser Pro His Ala Val Ser Thr Leu Gln Thr Glu Ser

65 70 75 80

Gln Asn Pro Trp Leu Ser Gly Ala Leu Lys Thr Phe Thr Ser Lys Phe

85 90 95

Asn Ile Pro Val Val His Gly Ser Gly Val Tyr Val Asp Leu Gly Lys

100 105 110

Thr Ser Ser Gly Tyr Arg Gln Pro Gly Gly Leu Cys Pro Val Phe Gly

115 120 125

Lys Tyr Ile Lys Ile Glu Lys Gln Asn Ser Asn Tyr Lys Thr Phe Leu

130 135 140

Glu Asp Phe Pro Val Ser Gly Ser Ser Glu Arg Pro Leu Pro Gly Gly

145 150 155 160

Phe Asn Leu Ala Tyr Val Thr Ser Ser Gly Arg Ala Phe Ser Pro Val

165 170 175

Ala Asp Ser Phe Leu Val Asp Ala Phe Gly Leu Thr Gly Pro Ser Asp

180 185 190

Pro Ile Ser Arg Cys Ala Lys Tyr Ser Tyr Leu Met Glu Pro Arg Lys

195 200 205

Pro Gly Thr Asn Gly Thr Phe Asp Tyr Lys Leu Pro Phe Val Tyr Asp

210 215 220

Ala Ala Ala Lys Ser Cys Phe Val Leu His Val Ser Met Gln Lys Leu

225 230 235 240

Thr Gly Ser Arg Tyr Cys Ser Ser Asn Gly Thr Pro Ala Gly Leu Phe

245 250 255

Trp Pro Cys Phe Arg Pro Ala Lys Ser Ala Ser Ala Ser Thr His Leu

260 265 270

Val Tyr Gly Ser Gly Gln Met Gly Ala Asp Pro Glu Ala Trp Lys Lys

275 280 285

Lys Cys Pro Ser Arg Ala Val Lys Asp Ala Val Phe Gly Gln Trp Gly

290 295 300

Val Gly Gly Cys Thr Ala Leu Ala Ala Asn Ser Ser Gly Val Arg Thr

305 310 315 320

Leu Gln Val Ala Tyr Lys Ser Lys Cys Trp Glu Thr Leu Phe Asp Phe

325 330 335

Ser Ala Pro Asp Glu Ala Val Ala Ser Asn Pro Asp Asn Trp Asp Ser

340 345 350

Ile Trp Pro Thr Leu Asp Ser Ser Ala Ser Val Ser Ala Gly Val Gly

355 360 365

Gln Asn Tyr Ala Asn Phe Phe Pro Ser Ser Ser Gly Pro Gly Gly Thr

370 375 380

Cys Val Ile Phe Ala Ala Val Pro Ser Cys Phe Leu Arg Ala Pro Gly

385 390 395 400

His Thr Ala Tyr Thr Ser Val Gly Ser Leu Ala Glu Glu Ala Leu Pro

405 410 415

Asp Ser Ala Pro Gly Gly Pro Pro Ser Ser Gly Gly Gly Gly Gly Pro

420 425 430

Gln Glu Pro Gln Gly Pro Gln Glu Pro Gln Pro Gly Gly Pro Glu Pro

435 440 445

Glu Pro Ser Pro Glu Pro Ser Pro Glu Pro Gly Glu Pro Gly Ser Gly

450 455 460

Glu Gly Gly Gly Glu Glu Gly Glu Thr Asn Pro Pro Lys Glu Pro Gln

465 470 475 480

Glu Glu Pro Ser Leu Pro Pro Glu Glu Gly Gly Gly Gln Glu Glu Lys

485 490 495

Gln Glu Gln Glu Gly Glu Asn Asn Asn

500 505

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 5

atgtgggggc aaaaccagcg 20

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 6

ttactgctgg tcgtaattcg cgtct 25

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 7

ggcggatccg gcgtcaaagt tcagcagcag cagc 34

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 8

ggcaagcttt tagttgttat tttctccttc ttgttct 37

Claims (10)

1.鸡柔嫩艾美耳球虫MA2蛋白（EtMA2蛋白），其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或者是SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等活性的蛋白。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

4.EtMA2膜外功能域蛋白（EtMA2-Outside domain），其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，或者是SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰且具有同等活性的蛋白。

5.编码权利要求4所述蛋白的基因。

6.根据权利要求5所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

7.一种克隆载体，含有权利要求2、3、5或6所述的基因。

8.一种表达载体，含有权利要求2、3、5或6所述的基因。

9.生产EtMA2膜外功能域蛋白的方法，包括将权利要求8所述的表达载体导入宿主细胞中，表达得到EtMA2膜外功能域蛋白。

10.权利要求1或4所述的蛋白在制备抗艾美耳球虫药物中的应用。

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