CN1194092C

CN1194092C - 一种水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因及其表达与应用

Info

Publication number: CN1194092C
Application number: CNB031265677A
Authority: CN
Inventors: 徐安龙; 杨彦臻; 彭立胜; 于萃玲; 卫剑文; 杨文利
Original assignee: National Sun Yat Sen University
Current assignee: National Sun Yat Sen University
Priority date: 2003-05-15
Filing date: 2003-05-15
Publication date: 2005-03-23
Anticipated expiration: 2023-05-15
Also published as: CN1451747A

Abstract

本发明公开了一种新的水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因，以及该基因的表达及其在抑制蛋白酶水解中的应用；本发明的基因所编码的蛋白为131个氨基酸组成的前体蛋白，包括18个氨基酸的信号肽和113个氨基酸的成熟蛋白，其中成熟蛋白的分子量为12，800道尔顿；该成熟蛋白具有其独特的酶结合位点Ser⁹⁷-Trp⁹⁸；纯化的重组蛋白对木瓜蛋白酶具有明显的抑制作用，以竞争性抑制的方式与蛋白酶形成1∶1的复合物，抑制常数K_i＜0.5nM。

Description

一种水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因及其表达与应用

技术领域

本发明涉及一种新基因，特别是一种水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因；本发明还涉及该基因的表达及其编码的蛋白对木瓜蛋白酶的抑制作用。

背景技术

蛋白酶抑制剂是对蛋白水解酶有抑制活性的一种水分子蛋白质，普遍存在于植物、动物和微生物中。在脊椎动物体内，蛋白酶抑制剂是免疫系统的组成部分，通过其活性中心与蛋白酶结合形成稳定的复合体而起作用。无脊椎动物中的蛋白酶抑制剂研究较少，值得注意的是，其体内不存在免疫系统，所以蛋白酶抑制剂的作用更不容忽视。蛋白酶抑制剂是依据其作用的蛋白酶类型来分类的，主要分为：抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等的丝氨酸蛋白酶抑制剂；对木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶等起作用的半胱氨酸蛋白酶抑制剂；抑制胃蛋白酶等的羧基蛋白酶抑制剂和对胶原酶起作用的金属蛋白酶抑制剂等。蛋白酶抑制剂作为新型药物显示出了广阔的应用前景，而且已在医学上得到了应用。

半胱氨酸蛋白酶抑制剂在多种有机体中具有不同的生理功能，主要保护组织和细胞免受由内源和外源半胱氨酸蛋白酶引起的不必要的蛋白质水解。在哺乳动物体内，半胱氨酸蛋白酶抑制剂参与多种病理反应，如细胞凋亡、激素的合成和分解、病毒与细菌感染以及多种神经系统疾病，与长期记忆、轴终端神经阻断、膜蛋白断裂、细胞骨架改性及神经肽新陈代谢等均直接相关。此外，半胱氨酸蛋白酶抑制剂还能抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。在农作物病虫害的防治方面，半胱氨酸蛋白酶抑制剂通过破坏昆虫肠道内的蛋白水解酶活性，明显抑制昆虫的生长发育，并能有效阻止病毒和寄生虫的入侵，在植物对害虫和病原体的侵染防御系统中有十分重要的作用。目前，半胱氨酸蛋白酶抑制剂已成为研究抗肿瘤、抗风湿、抗菌、抗病毒、抗原虫等寄生虫感染以及治疗多种神经系统疾病药物的重要研究方向。

半胱氨酸蛋白酶抑制剂是单一链蛋白，至少由100～200个氨基酸残基组成，存在与功能相关的保守序列基元。根据分子量大小、二硫键的数目、亚细胞定位和一级结构的特征主要分为三种类型：

第一类Stefins：包括Stefins A、B等，有大约100个氨基酸残基组成，分子量约为11000道尔顿，没有二硫键，也没有信号肽；为胞内蛋白。不含糖基化位点。

第二类Cystatin：包括人类Cystatin C、D、S、SN和SA等，由120个左右的氨基酸残基组成，分子量在13,000至14,000道尔顿之间，至少含有两个特征性的二硫键，有信号肽，属于分泌蛋白。不含糖基化位点。cystatin C在不同组织和体液中含量丰富，它是所有已知的cystatins中最有潜力的抑制剂。

第三类kininogens：高分子量单链胞浆蛋白，N端有三个类似于cystatain C功能结构域的糖基化位点，具有抑制活性。

在蛋白结构方面，目前研究最多的是人的半胱氨酸蛋白酶抑制剂和鸡的卵清蛋白酶抑制剂。研究发现，第一类和第二类蛋白酶抑制剂虽然在序列上存在差异，但是在二级结构以及三级结构上都有很大的相似性。分子的主体由五个反平行的β片层围绕着中心的α螺旋所组成。不同的是第二类的抑制剂还存在另一个小的α螺旋但不参与酶的作用。

半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族存在着三个非常保守的与酶起直接作用的区域，它们相互作用形成契形结构插入酶的活性位点，与酶形成稳定的复合物：

1、位于氨基端Gly-Aln残基以及之前的肽链片断。研究发现，以Aln起始的半胱氨酸蛋白酶抑制剂其活性比具有N端肽链的抑制剂活性降低10000倍。结构分析表明，Gly之前的残基是不规则排列的，自由延伸至溶液中，有利于酶的攻击。而Gly的高度保守是由于维持分子活性结构的需要。Gly-Aln残基在抑制剂-酶复合体结构中，与酶的活性位点非常靠近。

2、位于分子中央的QVVAG发卡环结构。在三级结构中，它与氨基端序列相毗邻，具有高度疏水的侧链，与酶的疏水侧链发生相互作用。作用位点在酶活性位点以外。部分氨基酸的改变，对抑制剂活性的影响不大。

3、靠近C末端高度保守序列Pro-Trp。这两个残基具有高度的疏水侧链，与酶发生直接的相互作用。

在特殊条件下，如高浓度、高温、低pH值，以及特定位点的突变，能使半胱氨酸蛋白酶抑制剂形成寡聚体。该寡聚体仍保持与单体高度相似的二级结构。

水母属于腔肠动物门，是较原始的多细胞动物，身体由内外两胚层组成，具有组织分化及原始神经系统。其特征是有许多触手环绕于口周围，有刺丝细胞(Nematocysts)，受到刺激后以刺丝射入其它生物体，释放毒液而致中毒，往往引起严重的皮肤损伤，肌痉挛，肌无力，呼吸困难，肺水肿，血管充血，末梢血管收缩，意识丧失，甚至造成呼吸衰竭，心肌抑制而致死。水母的触手和刺丝囊中存在大量毒性蛋白质，通过蛋白质的分离纯化已从多种水母中提取出许多具有致死、溶血、心脏毒性、神经毒性、肝细胞毒性、肾毒性或皮肤毒性的毒素蛋白。水母在传统中药中，有清热解毒、软坚散结、降压、抑菌、抗衰老的功效，可用于治疗高血压、气管炎、哮喘、胃溃疡、中枢神经系统疾病等，并可作为神经组织的活性物质和组织胺释放剂。

目前，国内外尚无对水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂的研究报道，对我国特有的水母资源进行研究，发现新的有应用前景的水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂，进行基因重组、表达、定点突变、结构和功能研究，具有很重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因；

本发明的另一目的在于提供上述基因的表达；

本发明的另一目的在于提供上述基因编码的蛋白对木瓜蛋白酶的抑制作用。

本发明所选择的水母为霞水母(Cyanea capillata)，采自广西壮族自治区钦州港附近海域。

本发明构建了霞水母触手cDNA文库：首先分离水母触手，提取总RNA，然后按Clontech公司SMART^TM cDNA LibraryConstruction Kit说明书的操作进行，获得双链cDNA，最后将双链cDNA连接到改造的质粒载体pcDNA3.0上并转化E.coli，从而构建成霞水母触手的cDNA文库。

本发明通过对霞水母触手的cDNA文库克隆的序列测定，从中得到了编码霞水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂的cDNA克隆，命名为Cystatin J。这个cDNA序列编码131个氨基酸的前体蛋白，包括18个氨基酸的信号肽和113个氨基酸的成熟蛋白。成熟蛋白具有独特的酶结合位点Set⁹⁷-Trp⁹⁸，分子量为12,800道尔顿，目前，所有已报道的半胱氨酸蛋白酶抑制剂均具有高度保守的酶结合位点Pro-Trp，该位点具有高度的疏水侧链，而由亲水的Set取代疏水的Pro，这在半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族中尚属首次报道；此外，这也是第一次在水母中发现半胱氨酸蛋白酶抑制剂。成熟蛋白具有第二类半胱氨酸蛋白酶抑制剂的典型特征。

本发明通过设计一对特异引物，将编码霞水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂成熟蛋白的核苷酸序列用PCR方法从pcDNA3.0载体上扩增出来，克隆到原核融合表达载体pETTrx上，构建成表达质粒pETTrx-Cystatin J并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)。经过对培养时间、培养温度、诱导时间等条件的摸索和优化，融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的30％以上，并且大部分以可溶形式存在。

本发明还摸索和优化了重组Trx-Cystatin J蛋白的肠激酶酶切条件，通过对酶切时间、酶切温度、酶终浓度等条件的摸索，可达到50％以上的酶切效率。

本发明还摸索和优化了重组Cystatin J蛋白的纯化条件，通过Ni²⁺螯合层析、肠激酶酶切和阳离子交换层析，可得到纯度达95％以上的重组Cystatin J蛋白。

本发明构建了Cystatin J水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂成熟蛋白编码序列的表达质粒pETTrx-Cystatin J，由该表达质粒载体经Kpn I/Not I双酶切，可得到342bp的片段，即为水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂Cystatin J成熟肽编码序列。

本发明的表达质粒载体的复制方法：参照Sambrook(Sambrook，et al.1989，Molecular cloing.Cold Spring HarborLabroratory Press.USA)方法，按CaCl₂法在E.Coli.DH5α或BL21(DE3)菌株中转化质粒，用含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基转化细菌，碱法提取质粒。

本发明获得的重组水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂具有明显的木瓜蛋白酶抑制活性。以竞争性抑制的方式与蛋白酶形成1∶1的复合物，抑制常数K_i＜0.5nM。

本发明获得的重组Cystatin J蛋白，在4℃条件下，抑制活性在pH4-11范围内均保持在80％以上，pH5～8之间活性最高；在中性pH值条件下，当温度高于50℃时，抑制活性呈下降趋势。Arrhenius曲线显示该重组蛋白的热变性Ea值为5.14kcal/mol。

附图说明

图1为霞水母触手总RNA电泳结果；

图2为霞水母触手双链cDNA电泳结果；

图3为霞水母触手cDNA文库总质粒、PCR检测和SfiI酶切电泳结果；

图4为霞水母触手cDNA文库重组子的PCR检测电泳结果；

图5为含基因Cystatin J的重组质粒pETTrx-Cystatin J表达质粒构建；

图6为霞水母Cystatin J基因的PCR产物电泳结果；

图7为含基因Cystatin J的pETTrx-Cystatin J表达质粒酶切和PCR鉴定电泳结果；

图8为重组Cystatin J蛋白表达的SDS-PAGE；

图9为重组Cystatin J蛋白纯化的SDS-PAGE；

图10为重组Cystatin J蛋白对木瓜蛋白酶抑制作用的效价曲线；

图11为重组Cystatin J蛋白对木瓜蛋白酶的Dixon曲线；

图12为重组Cystatin J蛋白抑制活性的温度稳定性(一)；

图13为重组Cystatin J蛋白抑制活性的温度稳定性(二)；

图14为重组Cystatin J蛋白的Arrhenius曲线；

图15为重组Cystatin J蛋白抑制活性的pH值稳定性；

其中图1中，M：1kb DNA ladder(Promega公司)；1：霞水母触手dsDNA；

图3中，M：1kb DNA ladder(Promega公司)；1：文库总质粒的SfiI酶切结果；2：文库总质粒的PCR结果；3：文库总质粒；

图4中，M：1kb DNA ladder(Promega公司)；1-21：文库重组子的PCR检测；

图6中，M：1kb DNA marker(NEB公司)；1：霞水母CystatinJ基因的PCR产物；

图7中，M：1kb DNA marker(NEB公司)；1：pETTrx-CystatinJ的Kpn I/Not I双酶切；2：pETTrx-Cystatin J的PCR鉴定；

图8中，M：marker；1：37℃总菌体；2：37℃超声上清；3：37℃超声沉淀；4：25℃总菌体；5：25℃超声上清；6：25℃超声沉淀；7：含空载的总菌对照；

图9中，M：marker；1：重组Trx-cystatin J融合蛋白经Ni²⁺螯合层析的500mM咪唑洗脱峰；2：重组Trx-cystatin J融合蛋白肠激酶酶切产物；3：酶切产物经阳离子交换层析的100mMNaCl洗脱峰；4：酶切产物经阳离子交换层析的150mM NaCl洗脱峰。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明，将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例一霞水母触手cDNA文库的构建

霞水母触手总RNA的提取参照Gibcol BRL公司的TRIZOL^LS试剂说明书进行；cDNA的合成按Clontech公司SMART^TM cDNALibrary Construction Kit说明书操作。

采用TRIZOL^LS试剂提取的触手总RNA经1％甲醛变性胶电泳检测可见如图1的清晰的28S、18S两条rRNA条带，表明总RNA完整性良好。采用SMART^TM cDNA Library Construction Kit合成的cDNA在1％的琼脂糖凝胶上电泳，结果呈现均匀的分布，如图2所示，大小在200bp到5kb的范围内，主要集中在2kb以下的区域，表明cDNA的完整性良好。将cDNA插入质粒载体pcDNA3上构建成cDNA文库，文库克隆数为5.1×10⁶。提取总文库质粒进行酶切和PCR分析，如图3所示，结果表明cDNA插入片段大小落在200bp-2kb的范围内，平均长度为650bp。挑取454个克隆提取质粒，酶切和PCR鉴定表明超过98％的克隆为重组子，如图4所示，表明该cDNA表达文库具有较好的质量。

实施例二霞水母触手cDNA文库的克隆、序列测定和分析

挑选霞水母触手cDNA文库的克隆，按Vitagene 96-easyplasmid Mini-prep Kit的方法提取质粒DNA。以T7通用引物为测序引物，采用自动测序仪ABI Prism 3700 sequencer(Perkin-Elmer)对2153个随机cDNA序列进行了5’端测序。所得序列经聚类、去除载体序列以及Blast X分析，结果表明霞水母触手cDNA文库包含的基因多种多样，其中半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的丰度最高，有68个cDNA序列，命名为Cystatin J，水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因编码131个氨基酸的蛋白，如序列表所示，其中包括18个氨基酸残基的信号肽和113个氨基酸残基的成熟蛋白，成熟蛋白具有第二类半胱氨酸蛋白酶抑制剂的典型特征。成熟蛋白的分子量为12,800道尔顿，具有独特的酶结合位点Ser⁹⁷-Trp⁹⁸。

实施例三重组霞水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂表达质粒的构建

根据Cystatin J基因编码的成熟蛋白两端序列和原核融合表达载体pETTrx的多酶切位点，合成一对引物，序列如下：

上游引物，5’GCT GAA TTC GGT ACC CTA

CTT CCT GGC GGA ATA AGA CG 3’

单下划线部分为Kpn I酶切序列，双下划线为肠激酶酶切序列下游引物，5’CGT GCG GCC GC AGC TCG GAG GCA TTTTGT 3’

单下划线部分为Not I酶切序列，双下划线为终止密码子：

PCR扩增、基因克隆皆按常规方法进行。PCR产物约450bp如图6所示，编码113个氨基酸残基。将目的基因克隆到原核融合表达载体pETTrx上，构建成表达质粒pETTrx-Cystatin J。构建的详细过程见图5。经酶切鉴定和测序分析表明克隆的基因为目的基因，如图7所示。

实施例四重组霞水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂的表达

将表达质粒pETTrx-Cystatin J转化大肠杆菌BL21(DE3)。含目的基因的工程菌在37℃剧烈振荡培养至O.D.₆₀₀＝0.6～0.8时，转入25℃培养并加入终浓度为0.1mM的IPTG，诱导8小时。收集菌体，SDS-PAGE电泳分析表明，基因工程菌经诱导后有明显的特异表达产物带，融合蛋白Trx-Cystatin J的分子量与预测值26kD相符，如图8所示。在此条件下重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的30％以上，基本上处于可溶的状态。

实施例五重组霞水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂的纯化

诱导后的菌体通过超声破菌，离心取上清。超声缓冲液为50mM Tris-HCl，pH8.0，含100mM NaCl。超声上清经过Ni²⁺螯合层析可获得纯度在90％以上的融合蛋白。在Ni²⁺螯合层析中用到的溶液有：平衡缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8.0，含100mM NaCl.)、洗脱液1(50mM Tris-HCl，pH7.0，含100mMNaCl.)、洗脱液2(50mM Tris-HCl，pH7.0，含100mM NaCl，150mM咪唑)和洗脱液3(50mM Tris-HCl，pH7.0，含100mMNaCl，500mM咪唑)。

洗脱后的融合蛋白用肠激酶在4℃条件下酶切4小时。酶切缓冲液为50mM Tris-HCl，pH7.5，含100mM NaCl。

酶切产物通过阳离子交换层析可获得纯度在95％以上的重组蛋白，如图9所示。在阳离子交换层析中用到的溶液有：平衡缓冲液(50mM PB，pH6.3)、洗脱液1(50mM PB，pH7.0，含100mM NaCl)、洗脱液2(50mM PB，pH7.0，含150mM NaCl)。

实施例六重组霞水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂效价的测定

将木瓜蛋白酶与不同摩尔比的重组水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂在反应缓冲液中作用10分钟。反应缓冲液为20mM PB，pH6.2，含0.5mM EDTA，0.06mM β巯基乙醇and 2mM半胱氨酸。然后加入pH6.2，含1M NaCl，0.4mM EDTA和2mM半胱氨酸的BAEE溶液。具有活性的木瓜蛋白酶能水解BAEE产生酸，因此可以根据加入BAEE溶液后的产酸量来计算木瓜蛋白酶与抑制剂作用后的剩余活性。结果表明，随着重组水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂的增多，木瓜蛋白酶的活性明显下降，当二者摩尔比达到1∶1时，木瓜蛋白酶完全失活，如图10所示。

实施例七重组霞水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂对木瓜蛋白酶抑制常数K_i的测定

在不同底物(BAEE)浓度下，作出重组水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂对木瓜蛋白酶的抑制曲线——Dixon曲线，如图11所示。该曲线表明，该重组蛋白是以与底物竞争的方式抑制木瓜蛋白酶的活性，根据曲线的交点坐标可以得出重组抑制剂对木瓜蛋白酶的抑制常数K_i小于0.5nM。

实施例八重组霞水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂的温度稳定性

将重组霞水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂置于20～90℃温浴10分钟，然后立即冰浴，并测定其剩余的抑制活性。结果表明，重组蛋白的抑制活性在20～40℃均保持稳定，当温度大于50℃时活性开始下降，到90℃时活性下降到原始活性的27％，如图12所示。

此外，将重组霞水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂分别于4℃，30℃，60℃和90℃放置5分钟至72小时，然后测定重组蛋白对木瓜蛋白酶的剩余抑制活性。结果表明，重组蛋白在4℃时非常稳定，在30℃放置72小时后活性仍保持原始活性的82％，而在60℃和90℃活性下降较快，如图13所示。计算重组霞水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂的失活常数(K_inact)，4℃时为0；30℃时为4.17×10^-5/min；60℃时为1.26×10^-3/min；90℃时为1.52×10^-2/min。Arrhenius曲线说明了开氏温度与重组蛋白失活常数之间的关系，如图14所示，由曲线可知，重组蛋白的活化能(Ea)为10.28kcal/mol。

实施例九重组霞水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂的pH稳定性

将重组霞水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂置于4℃，分别在pH3～13条件下放置24小时，然后用200mM PB缓冲液将pH调至6.2，测定重组蛋白对木瓜蛋白酶的剩余抑制活性。结果表明，重组蛋白在pH5～8之间具有良好的稳定性；在pH4以及pH9～11条件下，抑制活性仍保持原始活性的80％以上；而当pH小于3或pH大于13时，抑制活性明显降低，如图15所示。

序列表

<110>中山大学

<120>一种水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因及其表达与应用

<140>

<141>

<160>2

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>575

<212>DNA

<213>霞水母(Cyanea capillata sp)

<220>

<221>CDS

<222>(60)..(455)

<220>

<221>sig_peptide

<222>(60)..(113)

<220>

<221>mat_peptide

<222>(114)..(455)

<220>

<221>polyA_site

<222>(545)..(575)

<400>1

ggactatcta cttgtatcaa gcttctagtg gaactaccag gaagacatca acttacaaa 59

atg cat ctt tat ctt tgt gtc ctt gta tgc ctg tcc att ggc atg gca 107

Met His Leu Tyr Leu Cys Val Leu Val Cys Leu Ser Ile Gly Met Ala

-15 -10 -5

aat tgt cta ctt cct ggc gga ata aga cga atg aca gac gaa gaa ata 155

Asn Cys Leu Leu Pro Gly Gly Ile Arg Arg Met Thr Asp Glu Glu Ile

-1 1 5 10

cag aat gat gaa att ctt ctc act ggt gtt gaa ttt gct gtt gat aaa 203

Gln Asn Asp Glu Ile Leu Leu Thr Gly Val Glu Phe Ala Val Asp Lys

15 20 25 30

tac aac agt gac aca aat tca aga ctg att gca acg aat gtc att agt 251

Tyr Asn Ser Asp Thr Asn Ser Arg Leu Ile Ala Thr Asn Val Ile Ser

35 40 45

gca acc gtt caa gtt gtt gct gga ttc aag tac aat gct ctc att gaa 299

Ala Thr Val Gln Val Val Ala Gly Phe Lys Tyr Asn Ala Leu Ile Glu

50 55 60

tta cgt cct cgt ctt tgc gta caa gat cca aaa acg aag atc gct act 347

Leu Arg Pro Arg Leu Cys Val Gln Asp Pro Lys Thr Lys Ile Ala Thr

65 70 75

tgt cca cta aga atg aat tta cca aca aaa tgc tca ttt acg ttc ctc 395

Cys Pro Leu Arg Met Asn Leu Pro Thr Lys Cys Ser Phe Thr Phe Leu

80 85 90

tac cag tca tgg gta ccg caa aag tat tca atg ttg agc aca aaa tgc 443

Tyr Gln Ser Trp Val Pro Gln Lys Tyr Ser Met Leu Ser Thr Lys Cys

95 100 105 110

ctc cga gct tga acaataattt tatcatattc tattttaatg taaagcataa 495

Leu Arg Ala

gcttaataat atgatggtct gttgctttaa tcgaaaaata gacaaacaca taaaaaaaaa 555

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 575

<210>2

<211>131

<212>PRT

<213>霞水母(Cyanea capillata sp)

<400>2

Met His Leu Tyr Leu Cys Val Leu Val Cys Leu Ser Ile Gly Met Ala

1 5 10 15

Asn Cys Leu Leu Pro Gly Gly Ile Arg Arg Met Thr Asp Glu Glu Ile

20 25 30

Gln Asn Asp Glu Ile Leu Leu Thr Gly Val Glu Phe Ala Val Asp Lys

35 40 45

Tyr Asn Ser Asp Thr Asn Ser Arg Leu Ile Ala Thr Asn Val Ile Ser

50 55 60

Ala Thr Val Gln Val Val Ala Gly Phe Lys Tyr Asn Ala Leu Ile Glu

65 70 75 80

Leu Arg Pro Arg Leu Cys Val Gln Asp Pro Lys Thr Lys Ile Ala Thr

85 90 95

Cys Pro Leu Arg Met Asn Leu Pro Thr Lys Cys Ser Phe Thr Phe Leu

100 105 110

Tyr Gln Ser Trp Val Pro Gln Lys Tyr Ser Met Leu Ser Thr Lys Cys

115 120 125

Leu Arg Ala

130

Claims

1、一种水母半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因，核苷酸序列如序列表所示。

2、权利要求1所述基因编码的蛋白，其特征在于该蛋白具有独特的酶结合位点Ser⁹⁷-Trp⁹⁸，分子量为12,800道尔顿。

3、一种表达质粒载体，其特征在于是由权利要求1所述的基因与原核融合表达载体pETTrx构建而成。

4、权利要求2所述的蛋白在制备木瓜蛋白酶水解抑制剂中的应用。