CN112724220B - 海葵多肽Ap-TxⅠ及其制备方法与应用 - Google Patents

海葵多肽Ap-TxⅠ及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供海葵多肽Ap‑TxⅠ及其制备方法与应用。本发明利用高通量转录组学从套膜海葵(Aiptasia pallida)中发现海葵多肽Ap‑TxⅠ，其序列为SGACAEICVHRCIPSCNFACCVAR，形成3个二硫键。采用多肽固相合成法(SPPS)合成线性肽Ap‑TxⅠ，经二硫键定向氧化法获得后含3个二硫键的氧化肽Ap‑TxⅠ(二硫键方式C1‑C6，C2‑C5，C3‑C4)，再采用高效液相色谱纯化。本发明合成的多肽Ap‑TxⅠ具有高效杀虫效果，且对哺乳动物毒性小，可为研发新型、高效、安全生物杀虫剂奠定良好基础。

Description

海葵多肽Ap-TxⅠ及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及天然药物技术领域，特别涉及海葵多肽Ap-TxⅠ及其制备方法与应用。
背景技术
近年来，随着化学农药的滥用，农业污染问题日益严重，直接威胁农业生态安全和农业可持续发展，进而带来食品安全问题影响人类健康。如何解决农业环境危机和生态安全问题迫在眉睫，由此对新型、高效、安全生物杀虫剂的需求非常迫切。目前，捕食昆虫的动物通常能分泌多肽类毒素，其通过昆虫的特异性离子通道或受体而起到毒杀和捕获猎物，但其对哺乳动物的毒性很小或无毒副作用。其中，已有文献报道的有海葵、芋螺、蝎子、蜘蛛和捕食性螨等均能够分泌多肽类毒素。因此，开展从海葵等海洋有毒生物资源中寻找杀虫活性多肽已成为高效安全杀虫剂研究的热点之一。
海葵(Sea anemone)又名海菊花，属于刺细胞动物门珊瑚虫纲，是原始的后生海洋动物，在全球已记录海葵目1100余种，分属于50科约400属。中国的海葵品种约占世界的1/10，广泛分布在温热带和热带海域。海葵触手上具有刺细胞能够分泌毒液捕食鱼、贝类、桡足类、甲壳类动物以及蠕虫，其毒液中富含各种多肽毒素成分，是重要的海洋药物资源。黄海葵为沿海地区的一味中药，全体入药，其性味为咸、平，归肝，脾和大肠经。《中华本草》和《中国药用动物志》记载海葵具有收敛固涩、燥湿杀虫等功效，中医用来治疗脱肛、痔疮、绕虫病等。《青岛中草药手册》记载治蛲虫病：将海葵1块塞入肛门，每晚1次，连用1周。现代药理学研究也表明，海葵多肽毒素具有杀虫、抗肿瘤、降压、抗菌、镇痛和神经抑制的作用。急需探索具有高效杀虫的海葵多肽。
发明内容
鉴于此，本发明提出海葵多肽Ap-TxⅠ及其制备方法与应用，海葵多肽Ap-TxⅠ具有高效杀虫效果。
本发明的技术方案是这样实现的：
海葵多肽Ap-TxⅠ，其氨基酸序列为
SGACAEICVHRCIPSCNFACCVAR，具有6个半胱氨酸，形成3个二硫键。
本发明提供海葵多肽Ap-TxⅠ的制备方法，包括以下步骤：
(1)取王树脂，用二氯甲烷浸泡；
(2)加入哌啶脱除9-芴甲氧羰基，然后用N，N-二甲基甲酰胺洗涤；
(3)加入Fmoc-L-丙氨酸、1-羟基苯并三唑、N,N'-二异丙基碳二亚胺，用N，N-二甲基甲酰胺作为溶剂，反应0.8-1.5h；再重复步骤(2)、(3)；得到反应后的树脂；
(4)将反应后的树脂用体积比为93-95：5-7的三氟乙酸和二氯甲烷混合溶液切割8-12min，重复2-4次；
(5)将步骤4得到的树脂用N，N-二甲基甲酰胺浸泡，用三乙胺调节pH值为7.8-8.2，搅拌氧化反应8-16h；
(6)将步骤5得到的树脂用93-97v/v％三氟乙酸水溶液切割2～3h，乙醚沉降得到产物A；
(7)将步骤6得到的产物A，冻干，溶解到18-22v/v％乙腈水溶液，用碳酸氢铵调节pH值为7～8，搅拌氧化反应8-16h，得到产物B；
(8)将步骤7得到的产物B，溶解到18-22v/v％乙腈水溶液，用碘醇溶液滴加到溶液里，得到产物C，纯化、干燥，得目标产品。
进一步的，步骤(1)，所述浸泡的时间为8-12min；步骤(2)，所述脱除的时间为15-25min。
进一步的，步骤(3)，Fmoc-L-丙氨酸、1-羟基苯并三唑、N,N'-二异丙基碳二亚胺的摩尔比为1：1：1，Fmoc-L-丙氨酸与王树脂的摩尔质量比mol/kg为1：1。
进一步的，步骤(5)、(7)，所述搅拌的时间12h。
进一步的，步骤(6)，所述三氟乙酸水溶液的体积浓度均为95％。
进一步的，步骤(7)、(8)，乙腈水溶液的体积浓度均为20％，产物A和乙腈水溶液的体积比为1：0.9-1.1，产物B和乙腈水溶液的体积比为1：0.9-1.1。
进一步的，步骤(8)，所述碘醇溶液由碘和甲醇按质量体积比g/ml为0.3：1制得。
本发明的海葵多肽Ap-TxⅠ在制备杀虫剂中的应用。进一步，所述虫为黄粉虫。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本研究利用高通量转录组学从套膜海葵(Aiptasia pallida)中发现海葵多肽Ap-TxⅠ，其序列为SGACAEICVHRCIPSCNFACCVAR，具有6个半胱氨酸形成3个二硫键。采用多肽固相合成法(SPPS)合成线性肽Ap-TxⅠ，经二硫键定向氧化法获得后含3个二硫键的氧化肽Ap-TxⅠ(二硫键方式C1-C6，C2-C5，C3-C4)，再采用高效液相色谱纯化后进行质谱鉴定。合成的多肽Ap-TxⅠ分别以MTT法测试对昆虫细胞的抑制效果，昆虫注射法测试对黄粉虫杀虫作用。本发明获得高效杀虫效果而且对哺乳动物毒性小的海葵多肽，可为研发新型、高效、安全生物杀虫剂奠定基础，可以很好应用于制备杀虫剂。
附图说明
图1A、图1B、图1C海葵多肽Ap-TxⅠ氧化折叠过程中的质谱鉴定。
图2 HPLC分析氧化肽Ap-TxⅠ。
图3海葵多肽Ap-TxⅠ抑制昆虫细胞sf9生长效果。测试组对比于对照组，*表示具有显著性差异(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。
图4海葵多肽Ap-TxⅠ对黄粉虫的杀虫作用。实验组对比于阴性对照组，*表示具有显著性差异(**p<0.01；***p<0.001)。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例使用材料与仪器:
(1)材料
色谱级三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA)和色谱级乙腈(Acetonitrile，ACN)购自Thermo Fisher Scientific公司；Vydac分析型C18柱(5μm，4.6mm×250mm)及制备型C18柱(10μm，22mm×250mm)购自上海宸乔生物科技有限公司；质粒抽提试剂盒等常规分子生物学试剂购自天根生物工程有限公司。
(2)仪器
CEM全自动微波多肽合成仪(LibertyBlue，美国)；反相高效液相色谱(Agilent，美国)；三重四极杆液相色谱质谱联用仪(岛津，日本)；台式冻干机(赛飞，中国)；酶标仪(MR-96A，深圳迈瑞)。
实施例-海葵多肽Ap-TxⅠ的合成
(1)称取王树脂Fmoc-Arg(pbf)-oh-wang resin 2g，SD＝0.3mmol/g，用二氯甲烷(DCM)泡10min；
(2)加入约6g的20wt％哌啶脱除9-芴甲氧羰基(FMOC)20min，取少量树脂茚三酮检测，显色。然后用DMF洗涤5次，每次1min；
(3)加入2mmol的Fmoc-L-丙氨酸(Fmoc-Ala-OH)，2mmol 1-羟基苯并三唑(HOBT)，2mmol N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)，用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)作为溶剂反应1h，反应结束取少量树脂茚三酮检测无色即可，再重复2，3步骤，得到下面产物：SGAC(acm)AEIC(trt)VHRC(mmt)IPSC(mmt)NFAC(trt)C(acm)VAR-WANG RESIN；
(4)将上面得到的树脂用体积比为6：94的三氟乙酸(TFA)和二氯甲烷(DCM)切割10min，重复3次，得到SGAC(acm)AEIC(trt)VHRCIPSCNFAC(trt)C(acm)VAR-WANG RESIN；
(5)将步骤4得到的树脂用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)侵泡，用三乙胺调节pH值为8，搅拌氧化12h；
(6)将步骤5得到的树脂用95v/v％三氟乙酸(TFA)水溶液切割2～3h，乙醚沉降，得到SGAC(acm)AEICVHRC*IPSC*NFACC(acm)VAR，形成了二硫键C3-C4的多肽(Ap-TxⅠ-C3-C4)，经质谱鉴定分子量为2653.992(见图1A)，即得产物A；
(7)将步骤6得到的产物A，用冷冻干燥机冻干，称取200mg，溶解到200ml20v/v％乙腈水溶液，用碳酸氢铵调节pH值为7～8，搅拌氧化12h，得到SGAC(acm)AEIC*VHRC*IPSC*NFAC*C(acm)VAR，形成第二对二硫键C2-C5(Ap-TxⅠ-C2-C5)，经质谱鉴定分子量为2651.992(见图1B)，即得产物B；
(8)将步骤7得到的产物B，称取100mg，溶解到100ml20v/v％乙腈水溶液，用高浓度碘(300mg碘溶于50ml甲醇)，滴加到溶液里，并质谱确认形成最后一对二硫键，得到SGAC*AEIC*VHRC*IPSC*NFAC*C*VAR(Ap-TxⅠ-C1-C6)，经质谱鉴定分子量为2507.992(见图1C)，即得产物C，用HPLC纯化得到纯品，冻干成粉末。
结果分析：
多肽的合成和氧化折叠：先形成了二硫键C3-C4的多肽(Ap-TxI-C3-C4)，经质谱鉴定分子量为2653.992Da(见图1A)。再形成第二对二硫键C2-C5(Ap-TxI-C2-C5)，经质谱鉴定分子量为2651.992Da(见图1B)。将最后一对二硫键C1-C6(Ap-TxI-C1-C6)，分子量为2507.992Da(见图1C)，即氧化肽。线性肽Ap-TxI的理论分子量为2513.992Da，氧化肽的分子量为2507.992，两者相差为6Da，证明其正确形成3个二硫键。
氧化肽的分离纯化：采用制备型HPLC对氧化肽Ap-TxⅠ进行分离纯化，纯化后再利用分析型HPLC进行分析，结果如图2所示，氧化肽Ap-TxⅠ的洗脱时间为10.492min，根据峰面积计算其纯度为90.688％。
实施例2海葵多肽Ap-TxⅠ的杀虫试验
为了验证本发明的海葵多肽Ap-TxⅠ的杀虫效果，采用MTT法和昆虫注射法进行试验，数据均采用软件GraphPad Prism6进行统计和处理，对照组和实验组间的数据采用t检验分析，*表示差异显著(p<0.05)，**表示差异极显著(p<0.01)。
1.MTT法
1.1试验方法：采用昆虫细胞sf9进行MTT实验，具体步骤参照吴小英等发表文献“芋螺毒素ImI的化学合成及其杀虫活性研究”。简单描述如下：将昆虫细胞sf9数量约为103个接种到96孔板中，培养4h后分别加入0.1nM、0.25nM、0.5nM、0.75和1.0nM浓度的海葵多肽Ap-TxⅠ，每个浓度设置3个复孔，以空白实验组作为阴性对照。
1.2结果分析：通过MTT法测试海葵多肽Ap-TxⅠ对昆虫细胞sf9的抑制作用。实验结果(图3)表明，与对照组(0.7％NaCl溶液)相比，实验组均具有显著性差异。海葵多肽Ap-TxⅠ对昆虫细胞的抑制效果具有剂量效应，经计算半数有效量为0.2nM。
2.昆虫注射法
2.1试验方法：选用体重约180mg的黄粉虫进行昆虫注射法，具体步骤参照吴小英等发表文献“芋螺毒素ImI的化学合成及其杀虫活性研究”。简单描述如下：用0.7％NaCl将海葵多肽Ap-TxⅠ溶解至2.5nM、5nM、10nM、15nM和20nM，分别注射5μl至黄粉虫腹部。以无液体注射黄粉虫作为空白对照，5μl 0.7％NaCl溶液注射黄粉虫作为阴性对照组。
2.2结果分析：实验结果如图4所示，空白对照和阴性对照组的黄粉虫死亡率均为0，表明采用注射法来评价海葵多肽Ap-TxⅠ的杀虫效果是可行的。黄粉虫的死亡率均随着海葵多肽Ap-TxⅠ的剂量增加而增加，与对照组相比均具有显著性差异。高剂量20nM海葵多肽Ap-TxⅠ对昆虫的死亡率达到71.7％，经软件计算半数致死剂量为11.7nM。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 海南医学院
<120> 海葵多肽Ap-TxⅠ及其制备方法与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> PRT
<213> 套膜海葵(Aiptasia pallida)
<400> 1
Ser Gly Ala Cys Ala Glu Ile Cys Val His Arg Cys Ile Pro Ser Cys
1 5 10 15
Asn Phe Ala Cys Cys Val Ala Arg
20

Claims (10)

1.海葵多肽Ap-TxⅠ，其特征在于，
其氨基酸序列为SGACAEICVHRCIPSCNFACCVAR，形成3个二硫键，二硫键方式为C1-C6，C2-C5，C3-C4的多肽。
2.根据权利要求1所述的海葵多肽Ap-TxⅠ的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取王树脂Fmoc-Arg(pbf)-oh -wang resin，用二氯甲烷浸泡；
(2)加入哌啶脱除9-芴甲氧羰基，然后用N，N-二甲基甲酰胺洗涤；
(3)加入Fmoc-L-丙氨酸、1-羟基苯并三唑、 N,N'-二异丙基碳二亚胺，用N，N-二甲基甲酰胺作为溶剂，反应0.8-1.5h；再重复步骤（2）、（3），得到SGAC(acm)AEIC(trt)VHRC(mmt)IPSC(mmt)NFAC(trt)C(acm)VAR-WANG RESIN，即得到反应后的树脂；
(4)将反应后的树脂用体积比为5-7：95-93的三氟乙酸和二氯甲烷混合溶液切割8-12min ，重复2-4次，得到SGAC(acm)AEIC(trt)VHRCIPSCNFAC(trt)C(acm)VAR-WANG RESIN；
(5)将步骤4得到的树脂用N，N-二甲基甲酰胺浸泡，用三乙胺调节pH值为7.8-8.2，搅拌氧化反应8-16h；
(6)将步骤5得到的树脂用93-97v/v%三氟乙酸水溶液切割2~3 h，乙醚沉降，得到SGAC(acm)AEICVHRC*IPSC*NFACC(acm)VAR，形成二硫键C3-C4的多肽，即得产物A；
(7)将步骤6得到的产物A，冻干，溶解到18-22v/v%乙腈水溶液，用碳酸氢铵调节pH值为7~8，搅拌氧化反应8-16 h，得到SGAC(acm)AEIC*VHRC*IPSC*NFAC*C(acm)VAR，形成第二对二硫键C2-C5，即得到产物B；
(8)将步骤7得到的产物B，溶解到18-22v/v%乙腈水溶液，用碘醇溶液滴加到溶液里，得到SGAC*AEIC*VHRC*IPSC*NFAC*C*VAR，形成最后一对二硫键C1-C6，即得到产物C，纯化、干燥，得目标产品。
3.根据权利要求2所述的海葵多肽Ap-TxⅠ的制备方法，其特征在于，步骤（1），所述浸泡的时间为8-12min；步骤（2），所述脱除的时间为15-25min。
4.根据权利要求2所述的海葵多肽Ap-TxⅠ的制备方法，其特征在于，步骤（3），Fmoc-L-丙氨酸、1-羟基苯并三唑、 N,N'-二异丙基碳二亚胺的摩尔比为1：1：1，Fmoc-L-丙氨酸与王树脂的摩尔质量比mol/kg为1：1。
5.根据权利要求2所述的海葵多肽Ap-TxⅠ的制备方法，其特征在于，步骤（5）、（7），所述搅拌的时间12h。
6.根据权利要求2所述的海葵多肽Ap-TxⅠ的制备方法，其特征在于，步骤（6），所述三氟乙酸水溶液的体积浓度均为95%。
7.根据权利要求2所述的海葵多肽Ap-TxⅠ的制备方法，其特征在于，步骤（7）、（8），乙腈水溶液的体积浓度均为20%，产物A和乙腈水溶液的体积比为1：0.9-1.1，产物B和乙腈水溶液的体积比为1：0.9-1.1。
8.根据权利要求2所述的海葵多肽Ap-TxⅠ的制备方法，其特征在于，步骤（8），所述碘醇溶液由碘和甲醇按质量体积比g/ml为0.3：1制得。
9.根据权利要求1所述的海葵多肽Ap-TxⅠ在制备杀虫剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述虫为黄粉虫。
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