CN117024550B - 一种紫点海葵多肽毒素hc-g01及其合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种紫点海葵多肽毒素HC‑G01及其合成方法，涉及多肽毒素技术领域，本发明从已发现的紫点海葵多肽库中筛选出可能具有活性的短肽HC‑G01进行化学合成并探究其存在的生物活性，通过同源比对法在已建立的海葵毒素多肽库中对大量海葵毒素进行初步筛选找到拟具有活性的多肽毒素后，用Fmoc固相合成法合成毒素HC‑G01的线性肽，经碘氧化法氧化折叠成具有活性的多肽毒素，将两个二硫键连接成功的氧化肽经高效液相色谱仪HPLC制备纯化且质谱鉴定正确后采用注射法、热板法和DPPH清除自由基的方法依次验证其对斑马鱼的致死性、镇痛和抗氧化活性，成功合成了含有两个二硫键且具有天然构型的氧化肽HC‑G01。

Description

一种紫点海葵多肽毒素HC-G01及其合成方法

技术领域

本发明涉及多肽毒素技术领域，具体为一种紫点海葵多肽毒素HC-G01及其合成方法。

背景技术

关于海葵的化学成分的研究始于20世纪70年代，而国内对海葵的研究起步相对较晚。我国是在1980年有关单位民间普查时发现沿海渔民用海葵治病的情况，然后进行了一系列药理实验，发现海葵毒素确实具有高价值的生物活性，才逐步开始了对海葵毒素的研究。但其实早在我国古代就已发现和应用其药理活性了，据《中华本草》和《中国药用动物志》记载，海葵具有收敛固涩、燥湿杀虫等功效，中医用来治疗脱肛、痔疮、蛲虫病等。海葵能镇静、止咳、降压、抗凝、抗菌、抗癌、兴奋平滑肌，甚至还有“通乳下奶”作用。民间还常用鲜海葵治疗痔疮、蛲虫病、体癣等，具有较好的疗效。

岩沙海葵毒素是已知非蛋白毒素中毒性最强烈的毒素，中毒部位主要发生在神经系统和心脏，可引起心脏和呼吸功能的衰竭，但它同时也具有很高的抗癌活性和很强的溶血作用，是已知最有效且有特异性的细胞膜活性剂。来自黄海葵的Ap-A和Ap-B是具有强心作用、增强收缩心肌作用的典型代表，其活性远强于毒毛旋花苷，是具潜力的抗心功能衰竭候选药物。目前Ap类强心多肽正用于开发充血性心力衰竭和肌无力的治疗。据研究调查，将生活在热带和亚热带水域的彩色地毯海葵（Stichodactyla haddoni）中的肽毒素通过蛋白测序和cDNA克隆，分离到了具有麻痹蟹活性的SHTX I-III和具有蟹致死活性的SHTX IV四种肽毒素，并鉴定了它们的一级结构。SHTXI和II是具有钾通道毒性的新型毒素，SHTX III被证实具有抑制胰蛋白酶的作用，其抗胰蛋白酶活性为203 IU/mg，是具有钾通道毒性的kunitz型蛋白酶抑制剂。

而现有技术中对于已发现的紫点海葵多肽库中具有活性的短肽的生物活性探究较为贫瘠，无法基于紫点海葵多肽库进行有效合成，而少有的合成多肽毒素缺乏对于医用性研究，因此亟需一种紫点海葵多肽毒素来解决此类问题。

发明内容

（一）解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种紫点海葵多肽毒素HC-G01及其合成方法，解决现有技术中存在的无法基于紫点海葵多肽库进行有效合成，而少有的合成多肽毒素缺乏对于医用性研究的问题。

（二）技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现，本发明提供了一种紫点海葵多肽毒素HC-G01，其序列为QSCPRCHRRDHFGKCRKLDPCPD，二硫键的连接方式C1-C3和C2-C4。

本发明还提供上述紫点海葵多肽毒素HC-G01的合成方法，包括以下步骤：

步骤1、将取代率为0.337 mmol/g的Amide-AM树脂2754.19mg，用二氯甲烷浸泡10min后，再依次用DMF和DCM洗涤，以二甲基甲酰胺作为助溶剂；

步骤2、加入用30ml助溶剂溶解的Oxyma 4.26g、量取3ml活化剂DIC和20ml哌啶分别用助溶剂稀释到40ml和100ml，按照序列分别称取精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸带Acm、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、半胱氨酸2.73g、0.66g、0.71g、0.37g、0.18g、0.75g、0.22g、0.57g、0.24g、0.54g、0.24g、0.50g，用助溶剂溶解，以Acm作为半胱氨酸的保护基，通过CEM全自动微波多肽自动合成仪将氨基酸从羧基端到氨基端合成树脂肽：QSC(Acm) PRCHRRDHFGKC(Acm)RKLDPCPD；

步骤3、以三氟乙酸﹕乙二胺四乙酸﹕三异丙基硅烷﹕水= 95.0%﹕2.0%﹕2.0%﹕1.0%的比例配制切割液；

步骤4、将上述得到的树脂肽去掉废液，用二氯甲烷洗涤3次，倒入离心管中，按照每20 mg树脂肽加入1 mL切割液的配比于40℃下切割40 min，过滤掉树脂；

步骤5、滤液逐滴加入20倍体积的-20℃冰乙醚中形成沉淀，以12000 rpm、0℃离心5 min弃上层乙醚清液，重复此操作洗涤3次，即得到粗品多肽；

步骤6、将粗品多肽进行柱色谱分离纯化，流动性A为乙腈、B为纯水，以5 mL/min的流速，5%-50%乙腈梯度洗脱45 min，检测波长为220 nm，经反复纯化后-80℃冷冻干燥，得到纯线性肽；

步骤7、在通风橱内，用分析天平称取10 mg线性肽溶解于1 mL 50%的甲醇-水，完全溶解后加9 mL的乙酸，混合均匀且呈透明澄清，然后边搅拌边滴加以纯甲醇为溶媒的10mg/mL的碘液，至出现淡黄色且不褪色时立即停止滴加，再继续搅拌一分钟后，第一对二硫键形成，整个过程均在避光条件下进行；

步骤8、将氧化折叠完成形成一对二硫键的肽液加等体积的50 mmol/L的盐酸溶液，再加入余下的以纯甲醇为溶媒的10 mg/mL的碘液，搅拌90 min，即形成第二个二硫键，反应完成后，边搅拌边向溶液中加入适量L(+)-抗坏血酸来中和过量碘，褐色溶液随即逐渐褪至无色，猝灭反应；

步骤9、将上述的线性肽、氧化折叠好的氧化肽都进行质谱鉴定。

（三）有益效果

本发明提供了一种紫点海葵多肽毒素HC-G01及其合成方法。具备以下有益效果：

通过同源比对法在已建立的海葵毒素多肽库中对大量海葵毒素进行初步筛选找到拟具有活性的多肽毒素后，用Fmoc固相合成法合成毒素HC-G01的线性肽，经碘氧化法氧化折叠成具有活性的多肽毒素，将两个二硫键连接成功的氧化肽经高效液相色谱仪（HPLC）制备纯化且质谱鉴定正确后采用注射法、热板法和DPPH清除自由基的方法依次验证其对斑马鱼的致死性、镇痛和抗氧化活性，成功合成了含有两个二硫键且具有天然构型的氧化肽HC-G01。

此多肽毒素的多活性筛选实验表明，HC-G01对斑马鱼有一定的毒性，其半数致死量LD50为21.06 mg/kg；对小鼠有一定的镇痛作用，其半数有效量ED50为23.79 mg/kg；在DPPH清除自由基活性实验中表现良好，其肽液浓度为5 mg/mL的清除率即可达到90%以上，从海葵多肽库中筛选并合成的HC-G01表现出的有价值的活性是对斑马鱼致死性、镇痛和抗氧化，为新药研发和探索海葵毒素作用靶点提供更多数据。

解决了现有技术中心存在的无法基于紫点海葵多肽库进行有效合成，而少有的合成多肽毒素缺乏对于医用性研究的问题。

附图说明

图1为本发明紫点海葵多肽毒素HC-G01的合成方法流程图；

图2为本发明海葵多肽毒素HC-G01的线性肽的质谱鉴定图；

图3为本发明海葵多肽毒素HC-G01的氧化折叠的质谱鉴定图；

图4为本发明海葵多肽毒素HC-G01的第二步氧化折叠的质谱鉴定图；

图5为本发明HPLC分析线性肽和氧化肽HC-G01图；

图6为本发明HPLC分析第二步氧化折叠氧化肽HC-G01图；

图7为本发明注射各浓度HC-G01肽液24 h内斑马鱼的死亡率图；

图8为本发明海葵多肽毒素HC-G01对小鼠的镇痛效果图；

图9为本发明海葵多肽HC-G01对DPPH的清除自由基能力图；

图10为本发明海葵多肽毒素HC-G01和SHTX Ⅰ的序列比对图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

请参阅图1-图10，本发明提供一种紫点海葵多肽毒素HC-G01，其序列为QSCPRCHRRDHFGKCRKLDPCPD，二硫键的连接方式C1-C3和C2-C4。

本发明还提供一种紫点海葵多肽毒素HC-G01的合成方法，该方法包括：

S1、材料与方法，在紫点海葵多肽数据库中挑选出了两条与 SHTX-Ⅰ具有相似半胱氨酸模式的、具有两对二硫键的多肽序列进行化学合成，其序列为QSCPRCHRRDHFGKCRKLDPCPD，二硫键的连接方式C1-C3和C2-C4，如图10所示。用Fmoc固相合成法合成毒素HC-G01的线性肽，采用定点氧化法将两个二硫键连接成功的氧化肽经高效液相色谱仪（HPLC）制备纯化，通过质谱鉴定正确后进行各项多活性实验；

S2、实验材料包括：色谱级三氟乙酸（Trifluoroacetic acid，TFA ）和色谱级乙腈（Acetonitrile，ACN）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；盐酸、甲醇、乙酸、氢氧化钠、L(+)-抗坏血酸和DCM购自西陇科学股份有限公司；TIPS和DMF购自上海易恩化学科技有限公司；DIC、TFA（分析纯）购自上海麦克林生化科技有限公司；碘、TFA（色谱纯）、甲醇和乙腈购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醚购自成都市科隆化学品有限公司；Vydac分析型C18柱（5 μm，4. 6 mm × 250 mm）购自上海宸乔生物科技有限公司；制备型Pursuit XRsC18 色谱柱（5 μm, 21.2×250 mm）购自安捷伦科技有限公司；DPPH清除自由基能力检测试剂盒购自北京兰杰柯科技有限公司。

实验仪器包括：反相高效液相色谱（Agilent，美国）；三重四极杆液相色谱质谱联用仪（岛津，日本）；冷冻高速离心机（CR22GIII，日本日立）；酶标仪（MR-96A， 深圳迈瑞）；Centrifuge Z 216 MK 低温离心机（贺默，中国）；低温冷冻干燥机（贺帆，中国）；P3500 半制备液相色谱仪（依利特，中国）；多功能酶标仪（伯腾，美国）；全自动微波多肽合成仪（CEM，美国）。

S3、HC-G01合成：

a.称取取代率0.337 mmol/g的Amide-AM树脂2754.19mg，用二氯甲烷DCM浸泡时长为10 min后，再依次用DMF和DCM洗涤；

b.加入用30ml助溶剂溶解的Oxyma 4.26g、量取3ml活化剂DIC和20ml哌啶分别用助溶剂稀释到40ml和100ml，按照序列分别称取精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸带Acm、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、半胱氨酸2.73g、0.66g、0.71g、0.37g、0.18g、0.75g、0.22g、0.57g、0.24g、0.54g、0.24g、0.50g，用助溶剂溶解，以Acm作为半胱氨酸的保护基，通过CEM全自动微波多肽自动合成仪将氨基酸从羧基端到氨基端合成树脂肽：QSC(Acm) PRCHRRDHFGKC(Acm)RKLDPCPD；

c.以三氟乙酸TFA﹕乙二胺四乙酸EDTA﹕三异丙基硅烷TIPS﹕水= 95.0%﹕2.0%﹕2.0%﹕1.0%的比例配制切割液；

d.将上述得到的树脂肽去掉废液，用二氯甲烷洗涤3次，倒入离心管中，按照每20mg树脂肽加入1 mL切割液的配比于40℃下切割40 min，过滤掉树脂；

e.滤液逐滴加入20倍体积的-20℃冰乙醚中形成沉淀，以12000 rpm、0℃离心5min弃上层乙醚清液，重复此操作洗涤3次，即得到粗品多肽；

f.再将粗品多肽进行柱色谱分离纯化（流动性A为乙腈、B为纯水），以5 mL/min的流速，5%-50%乙腈梯度洗脱45 min，检测波长为220 nm。经反复纯化后-80℃冷冻干燥，即得到较纯的线性肽；

j.在通风橱内，用分析天平称取10 mg线性肽溶解于1 mL 50%的甲醇-水，完全溶解后加9 mL的乙酸，混合均匀且呈透明澄清，然后边搅拌边滴加以纯甲醇为溶媒的10 mg/mL的碘液（配制碘液时需用锡纸包裹避光），至出现淡黄色且不褪色时立即停止滴加，再继续搅拌一分钟后，第一对二硫键形成，注意整个过程均在避光条件下进行；

k.将氧化折叠完成形成一对二硫键的肽液加等体积的50 mmol/L的盐酸溶液，再加入余下的以纯甲醇为溶媒的10 mg/mL的碘液（约2 mL），搅拌90 min，即形成第二个二硫键。反应完成后，边搅拌边向溶液中加入适量L(+)-抗坏血酸来中和过量碘，褐色溶液随即逐渐褪至无色，猝灭反应。

S4、将上述的线性肽、氧化折叠好的氧化肽都进行质谱鉴定：

进行斑马鱼的致死性实验，实验选用3-4个月的成年斑马鱼作为实验动物（体长2.5±0.5 cm，体重在250-300 mg之间），实验前均正常喂食。以0.7%的生理盐水作为溶剂，称取适量纯化冻干后的氧化肽，分别溶解配制成浓度为25 mg/kg、20 mg/kg、15 mg/kg、10mg/kg和5 mg/kg的肽液。设置三个大组，分别是空白组（不做任何处理）、实验组（注射肽液）和对照组（注射0.7%生理盐水），每一个大组做3组平行实验，每一个小组6条，即每一个大组需要18条斑马鱼。按体重每100 mg注射1 uL，使用微量尖头注射器取样后从下腹部注射进鱼体内，观察24小时内的死亡情况，以长时间翻肚和无呼吸体征评估死亡。

S4、进行实验模拟

进行小鼠热板镇痛实验，随机选取健康且体重在18-22 g左右的KM雌性小鼠，采取热板法评估多肽液的镇痛效果，通过热板对小鼠足部产生热刺激，从而使小鼠产生疼痛反应，即出现舔后足、频繁抬脚或跳跃的异常反应。

首先需要在随机挑选出的雌鼠间进行筛选，将小鼠置于温度55℃±0.5℃的金属热板上，测定其疼痛反应出现的时间，共测定2次，每次间隔5 min。若出现疼痛反应的时间在10 s至30 s之间，则视为合格，一共需要筛选出54只小鼠。然后称取适量的多肽冻干粉，溶于PBS缓冲液（磷酸缓冲盐溶液）中，配制成50 mg/kg、40 mg/kg、30 mg/kg、25 mg/kg、20mg/kg、10 mg/kg和5 mg/kg浓度的多肽液，以PBS做阴性对照、50 mg/kg的曲马多做阳性对照，设置三大组，分别是给药组、阴性对照组和阳性对照组，其中给药组按多肽液浓度又分为7个小组。将这些筛选合格的小鼠随机分到这9个小组中，一组6只，按小鼠体重以10 uL/g给药，腹腔注射样品，记录给药时间。

在给药后30 min、60 min、90 min、120 min、180 min、240 min、300 min这7个时间点测量小鼠的痛阈值（即小鼠从放到热板上到出现疼痛行为的时间，若置于热板上60 s内仍未出现疼痛反应，应及时拿出小鼠并均视为60 s），比较给药组、阴性对照组、阳性对照组的小鼠痛阈值的差异，计算痛阈提高百分率。

进行DPPH清除自由基实验，先称取制备纯化好的紫点海葵多肽冻干粉末10 mg，分别加入1 mL去离子水，配成10 mg/mL的肽液，再将其稀释成1 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL和7.5 mg/mL，总共配好五个浓度梯度的多肽样品，此外还需要不加多肽只有去离子水的样品作为空白组，即肽液浓度为0 mg/mL。

DPPH自由基清除能力试剂盒中的工作液粉剂临用前将粉剂甩落瓶底后加入19 mL无水乙醇充分溶解，制备成工作液。空白管中加150 μL的80%甲醇和150 μL的工作液混匀，对照管中加150 μL多肽溶液和150 μL 80%甲醇混匀，测定管中加150 μL多肽溶液和150 μL的工作液混匀，每一个浓度都需要对应的测定管和对照管。混匀后用锡纸包裹，置于暗处避光反应30 min，12000 rpm、室温条件下离心5 min。提前预热酶标仪30 min，检测波长设置为517 nm，用移液枪分别吸取离心完的上清液200 μL到96孔板中，测定各管的吸光度值。

DPPH清除自由基实验需要随机抽取三批不同时间制备纯化的多肽进行实验，即设置3组平行重复实验，以减少误差存在。同一浓度分别记A空白、A对照、A测定，根据公式计算各浓度样品的清除率。

；

数据均采用软件GraphPad Prism8进行统计和处理，对照组和实验组间的数据采用t检验分析，*表示实验组对于阴性对照组的显著性差异（*p < 0.01, **p < 0.001, ***p < 0.0001,****p＜0.00001）。

根据实验结果可以看出，将合成的粗品肽经HPLC纯化为较纯的线性肽，经质谱鉴定分子量2897.0556 Da，如图2所示。然后在小量碘的存在下，使未被Acm保护的半胱氨酸巯基脱氢，形成第一对二硫键，即使游离的巯基成键而不影响被Acm保护的巯基。经质谱鉴定分子量为2895.0404 Da，如图3所示。第二步氧化折叠是在氧化折叠成功的基础上进行，即在余下有Acm保护的半胱氨酸上形成。这需要大量碘存在且条件较第一步激烈，脱去保护基形成第二个二硫键。经质谱鉴定分子量为2750.4232 Da，如图4所示。第二步氧化折叠完成的氧化肽用HPLC纯化得到纯品，经质谱鉴定纯度超过90%，冻干成粉末。线性肽HC-G01的实际分子量为2897.0556 Da，第一对二硫键连接成功的氧化肽的分子量为2895.0404 Da，两者相差约为2 Da，刚好为脱落的巯基氢的质量。而第二对二硫键连接成功的氧化肽的分子量为2750.4232 Da，与线性肽相差约146 Da，与氧化折叠的氧化肽相差约144 Da，正好为保护基Acm的质量，这证明其2个二硫键正确连接。

采用分析型HPLC对氧化肽HC-G01的线性肽、氧化折叠的氧化肽和第二步氧化折叠的氧化肽进行分析，发现第一步氧化肽较线性肽出峰的保留时间提前而第二步氧化肽则延后，如图5所示。

采用制备型HPLC对第二步氧化折叠的氧化肽HC-G01进行分离纯化，纯化后再利用分析型HPLC进行分析，结果如图6所示，氧化肽HC-G01的洗脱时间为17.025 min，根据峰面积计算其纯度超过90%。

进行斑马鱼的致死实验，在腹腔注射肽液24 h，斑马鱼的死亡情况如图7所示。空白对照和阴性对照组的斑马鱼死亡率均为0，表明采用注射法来评价多肽HC-G01对斑马鱼的毒性效果是可行的。结果可明显看到多肽浓度和死亡率呈正相关，随着浓度增加死亡率也上升，肽液25 mg/kg的最大死亡率超过80%，经计算其半数致死量LD50为21.06 mg/kg，说明HC-G01 对斑马鱼有一定的毒性，此处A1表示注射各浓度HC-G01肽液24 h内斑马鱼的死亡率，A2表示HC-G01对斑马鱼毒性反应的LD50；*表示实验组对于阴性对照组的显著性差异（*p < 0.01, **p < 0.001, ***p < 0.0001,****p＜0.00001）。

进行小鼠热板镇痛实验，小鼠注射HC-G01多肽液的镇痛效果见图8。结果显示，腹腔注射曲马多90 min达到峰值后，最大镇痛效率超过120%，说明阳性对照组曲马多能显著增大小鼠的痛阈值。注射HC-G01多肽液的最大镇痛效率在120 min到达峰值后缓慢下降，其半数有效量ED50=23.79 mg/kg，说明HC-G01有一定的镇痛效果。此外，图中可明显看出HC-G01多肽的镇痛时效较同浓度的曲马多长，此处B1表示注射各浓度HC-G01肽液对小鼠的镇痛效果，B2表示HC-G01对斑马鱼毒性反应的ED50；*表示实验组对于阴性对照组的显著性差异（*p < 0.01, **p < 0.001, ***p< 0.0001,****p＜0.00001）。

DPPH清除自由基实验，实验结果见图9，可明显看出HC-G01肽液的自由基清除能力与其浓度呈现正相关，随着浓度的增加，清除率也呈上升趋势。其中HC-G01肽液浓度在1-2.5 mg/mL的上升速度最快而后渐缓，在肽液浓度达5 mg/mL时，清除率超过90%，最大可达96.51%，而在浓度为5 mg/mL之后的清除率基本不变，实验表明HC-G01具有显著的抗衰老、抗氧化的能力，此处C1表示注射各浓度HC-G01肽液对DPPH的清除自由基能力，C2表示HC-G01清除自由基能力的ED50；*表示实验组对于阴性对照组的显著性差异（*p < 0.01, **p< 0.001, ***p < 0.0001,****p＜0.00001）。

通过实验从紫点海葵多肽毒素数据库中挑选出的拟具有活性且只含两对二硫键的较短肽，利用Fmoc固相合成法从氨基酸开始化学合成相应的线性肽，经氧化纯化后的多肽进行活性筛选确定HC-G1存在的抗氧化、镇痛、对斑马鱼具有致死性的生物活性。

通过斑马鱼致死实验得出，HC-G01是对斑马鱼具有毒性的，其半数致死量LD50为21.06 mg/kg，而在小鼠镇痛实验中，其半数有效量ED50为23.79 mg/kg。半数致死量以功效评价斑马鱼转换人用剂量的方法换算得人用剂量为12.636 g/天（此时以60 kg的成年人为准），而半数有效量参考徐叔云教授主编的《药理学实验方法学》中人与小鼠的用药剂量换算公式得人用剂量为2.62 mg/kg。都以60 kg成年人为参照，镇痛剂量为0.16 g/60 kg，致死剂量为12.636 g/天，若都为一天一次用药，则其安全范围是0.16 g-12.636 g。说明HC-G01低浓度镇痛，高浓度致死，安全范围良好。

在进行DPPH清除自由基实验中，可看出HC-G01肽液浓度到5 mg/mL时，清除率超过了90%，其1.966 mg/mL的肽液就能使清除率达到50%，表明该多肽在低浓度就可表现出良好的清除自由基能力，抗衰老、抗氧化的功能突出。

综合以上内容，在本申请中：

通过同源比对法在已建立的海葵毒素多肽库中对大量海葵毒素进行初步筛选找到拟具有活性的多肽毒素后，用Fmoc固相合成法合成毒素HC-G01的线性肽，经碘氧化法氧化折叠成具有活性的多肽毒素，将两个二硫键连接成功的氧化肽经高效液相色谱仪（HPLC）制备纯化且质谱鉴定正确后采用注射法、热板法和DPPH清除自由基的方法依次验证其对斑马鱼的致死性、镇痛和抗氧化活性，成功合成了含有两个二硫键且具有天然构型的氧化肽HC-G01。

此多肽毒素的多活性筛选实验表明，HC-G01对斑马鱼有一定的毒性，其半数致死量LD50为21.06 mg/kg；对小鼠有一定的镇痛作用，其半数有效量ED50为23.79 mg/kg；在DPPH清除自由基活性实验中表现良好，其肽液浓度为5 mg/mL的清除率即可达到90%以上，从海葵多肽库中筛选并合成的HC-G01表现出的有价值的活性是对斑马鱼致死性、镇痛和抗氧化，为新药研发和探索海葵毒素作用靶点提供更多数据。

在本发明的实施例的描述中，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (2)

1.一种紫点海葵多肽毒素HC-G01，其特征在于，其序列为QSCPRCHRRDHFGKCRKLDPCPD，二硫键的连接方式C1-C3和C2-C4。

2.根据权利要求1所述的紫点海葵多肽毒素HC-G01的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、将取代率为0.337 mmol/g的Amide-AM树脂2754.19mg，用二氯甲烷浸泡10 min后，再依次用DMF和DCM洗涤，以二甲基甲酰胺作为助溶剂；

步骤2、加入用30ml助溶剂溶解的Oxyma 4.26g、量取3ml活化剂DIC和20ml哌啶分别用助溶剂稀释到40ml和100ml，按照序列分别称取精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸带Acm、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、半胱氨酸2.73g、0.66g、0.71g、0.37g、0.18g、0.75g、0.22g、0.57g、0.24g、0.54g、0.24g、0.50g，用助溶剂溶解，以Acm作为半胱氨酸的保护基，通过CEM全自动微波多肽自动合成仪将氨基酸从羧基端到氨基端合成树脂肽：QSC(Acm) PRCHRRDHFGKC(Acm)RKLDPCPD；

步骤3、以三氟乙酸﹕乙二胺四乙酸﹕三异丙基硅烷﹕水= 95.0%﹕2.0%﹕2.0%﹕1.0%的比例配制切割液；

步骤4、将上述得到的树脂肽去掉废液，用二氯甲烷洗涤3次，倒入离心管中，按照每20mg树脂肽加入1 mL切割液的配比于40℃下切割40 min，过滤掉树脂；

步骤5、滤液逐滴加入20倍体积的-20℃冰乙醚中形成沉淀，以12000 rpm、0℃离心5min弃上层乙醚清液，重复此操作洗涤3次，即得到粗品多肽；

步骤6、将粗品多肽进行柱色谱分离纯化，流动性A为乙腈、B为纯水，以5 mL/min的流速，5%-50%乙腈梯度洗脱45 min，检测波长为220 nm，经反复纯化后-80℃冷冻干燥，得到纯线性肽；

步骤7、在通风橱内，用分析天平称取10 mg线性肽溶解于1 mL 50%的甲醇-水，完全溶解后加9 mL的乙酸，混合均匀且呈透明澄清，然后边搅拌边滴加以纯甲醇为溶媒的10 mg/mL的碘液，至出现淡黄色且不褪色时立即停止滴加，再继续搅拌一分钟后，第一对二硫键形成，整个过程均在避光条件下进行；

步骤8、将氧化折叠完成形成一对二硫键的肽液加等体积的50 mmol/L的盐酸溶液，再加入余下的以纯甲醇为溶媒的10 mg/mL的碘液，搅拌90 min，即形成第二个二硫键，反应完成后，边搅拌边向溶液中加入适量L(+)-抗坏血酸来中和过量碘，褐色溶液随即逐渐褪至无色，猝灭反应；

步骤9、将上述的线性肽、氧化折叠好的氧化肽都进行质谱鉴定。