CN116478263A - 一种紫点海葵多肽毒素hc-g02及其合成方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种紫点海葵多肽毒素HC‑G02及其合成方法、应用，其氨基酸序列为APCSGCYYQVGNECVYDKLKC‑NH2。通过采用多肽固相合成法合成了线性肽HC‑G02，对线性肽进行纯化后纯度达到95％以上。通过定点氧化后获得紫点海葵氧化肽HC‑G02(二硫键的连接方式为C1‑C3，C2‑C4)。本发明通过热板实验测试发现紫点海葵氧化肽HC‑G02对小鼠物理性疼痛具有良好的镇痛作用，小鼠腹腔注射氧化肽HC‑G02后，在30min痛阈提高率逐渐升高，给药后120min痛阈提高率达到最高。氧化肽HC‑G02在50mg/kg下的镇痛效果与同等浓度的曲马多的镇痛效果相当，且镇痛时间延长。
Description
技术领域
本发明属于活性多肽技术领域，涉及一种紫点海葵多肽毒素HC-G02及其合成方法、应用。
背景技术
海葵为刺胞门、珊瑚虫纲、海葵目生物，是在世界范围内的深海和浅海水域都能够发现的一种海洋动物。海葵是现存最古老的有毒动物目之一，分子和化石数据表明它们的起源早于7.5亿年前的埃迪卡拉纪。海葵种类繁多，在全球已记录海葵目1100余种，分属于50科约400个属，而中国海葵物种约占世界的1/10。中国海葵物种多样性在南海分布最高。海葵触手上具有刺细胞，与其他刺胞动物一样，海葵将毒液集中在被称为刺丝囊的囊状细胞器中。与猎物接触时刺丝囊会穿透目标生物体，释放毒液麻痹或杀死对方以进行捕食、防御和威慑竞争对手。
《中华本草》和《中国药用动物志》记载海葵具有收敛固涩等功效，民间主要用来治疗痔疮、脱肛、绕虫病和体癣等。现代药理学研究表明海葵毒素具有镇痛等作用。
发明内容
本发明从紫点海葵中筛选出活性多肽序列，并通过氧化折叠合成紫点海葵功能多肽。通过镇痛实验阐明该海葵多肽具有一定镇痛活性。本发明为开发新型海洋药物奠定基础，为人类健康和海洋药物研究提供有力支撑。
本发明方案为：
一种紫点海葵多肽毒素HC-G02，其氨基酸序列为APCSGCYYQVGNECVYDKLKC-NH2，其具有四个半胱氨酸形成两个二硫键，二硫键的连接方式为C1-C3，C2-C4。
本发明还提供了所述紫点海葵多肽毒素HC-G02的合成方法，包括以下步骤：
(1)称取树脂，先用二氯甲烷浸泡，然后依次用二甲基甲酰胺和二氯甲烷洗涤，加入Fmoc-Ala-OH、二氯甲烷和N,N-二异丙基乙胺进行反应，再加入甲醇和二氯甲烷反应，用二甲基甲酰胺洗涤，再加入含吡啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤，得到第一个树脂；
(2)在第一个树脂中加入第二个氨基酸Fmoc-Pro-OH和缩合剂，再加入二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基碳二亚胺反应，再加入含哌啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤，得到第二个树脂；
(3)根据前述的HC-G02的氨基酸序列，重复步骤(2)直到肽链结束，得到线性肽树脂；
(4)向线性肽树脂中加入甲醇进行冲洗并抽干，加入切割液切割，过滤后，加入冰乙醚，离心去除上层液冰乙醚，得到沉淀多肽粗品；
(5)纯化多肽粗品，得纯品线性肽HC-G02；
(6)将步骤(5)的线性肽溶于甲醇水溶液中，再用乙酸稀释，滴加甲醇碘溶液，保持搅拌，形成第一个二硫键；
(7)再加入等体积盐酸-甲醇溶液，然后加入甲醇碘溶液，保持搅拌，形成第二个二硫键；
(8)纯化后得到多肽纯品。
进一步的，步骤(1)为：称取树脂，先用二氯甲烷浸泡，然后依次用二甲基甲酰胺和二氯甲烷洗涤，加入0.6～1.0mmol Fmoc-Ala-OH、10～15mL二氯甲烷和1～3mL N,N-二异丙基乙胺进行反应80～100min，后再加3～5mL甲醇和8～12mL二氯甲烷封闭反应25～35min，用二甲基甲酰胺洗涤，再加入含吡啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤15～25min，得到第一个树脂；其中，所述含哌啶的二甲基甲酰胺溶液为哌啶质量分数为20％的DMF溶液。
进一步的，步骤(2)为：在第一个树脂中加入1.5～2.0mmol第二个氨基酸Fmoc-Pro-OH和1.5～2.0mmol缩合剂，再加入5～15mL二甲基甲酰胺和1～3mL N,N-二异丙基碳二亚胺反应0.5～1.5h，再加入含哌啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤15～25min，得到第二个树脂；其中，所述含哌啶的二甲基甲酰胺溶液为哌啶质量分数为20％的DMF溶液。
进一步的，所述切割液含有：95wt％三氟乙酸、1wt％H2O、2wt％1,2-乙二硫醇和2wt％三异丙基硅烷。
进一步的，步骤(6)为：将步骤(5)的线性肽溶于50v/v％甲醇水溶液中，再用乙酸稀释使肽液最终浓度为每毫升含有肽1mg，滴加10mg/mL甲醇碘溶液，保持搅拌，形成第一个二硫键。
进一步的，步骤(7)为：再加入等体积盐酸-甲醇溶液，然后加入10mg/mL甲醇碘溶液，保持搅拌，形成第二个二硫键；
进一步的，步骤(8)中，利用高效液相色谱法进行纯化，纯化条件为：流动相A为H2O，流动相B为乙腈，流速5mL/min，45min线性梯度洗脱，流动相B体积占比由5％线性升至50％。
本发明还提出所述的紫点海葵多肽毒素HC-G02在制备镇痛剂方面的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明利用高通量转录组从紫点海葵(Heteractis crispa)中发现紫点海葵多肽毒素HC-G02，其氨基酸序列APCSGCYYQVGNECVYDKLKC-NH2，具有四个半胱氨酸可以形成两个二硫键。
2、本发明通过多肽固相合成法(SPPS)合成了线性肽HC-G02，对线性肽进行HPLC纯化，然后利用分步法对合成的线性肽进行氧化折叠，通过二硫键定点氧化后获得含有两个二硫键的氧化肽HC-G02，二硫键的连接方式为C1-C3，C2-C4。
3、本发明提供紫点海葵(Heteractis crispa)多肽毒素HC-G02的合成方法及其镇痛作用，该方法合成的紫点海葵多肽毒素HC-G02具有高效镇痛效果，可为研发新型、高效、安全生物镇痛剂奠定基础。
4、本发明通过热板实验发现紫点海葵氧化肽HC-G02对小鼠物理性疼痛具有良好的镇痛作用，小鼠腹腔注射氧化肽HC-G02后，在30min痛阈提高率逐渐升高，给药后120min痛阈提高率达到最高。氧化肽HC-G02在50mg/kg下的镇痛效果与同等浓度的曲马多的镇痛效果相当，且镇痛时间延长。
附图说明
图1为HPLC分析线性肽HC-G02示意图。
图2为线性肽HC-G02的质谱鉴定示意图。
图3为HPLC分析HC-G02第一步氧化后的氧化肽示意图。
图4为HC-G02第一步氧化后的氧化肽的质谱鉴定示意图。
图5为HPLC分析HC-G02第二步氧化后的氧化肽示意图。
图6为HC-G02第二步氧化后的氧化肽的质谱鉴定示意图。
图7为HC-G02氧化肽对小鼠的镇痛作用示意图，注：实验组对比于阴性对照组(PBS)，实验组对比于阳性对照组(曲马多)，*表示具有显著性差异(*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001)。
具体实施方式
为了使本领域的普通技术人员更好的理解本发明技术内容，下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步的描述。
本发明利用高通量转录组从紫点海葵(Heteractis crispa)中发现多肽毒素HC-G02，其氨基酸序列为APCSGCYYQVGNECVYDKLKC-NH2，二硫键的连接方式为C1-C3，C2-C4。
实验例：紫点海葵多肽毒素HC-G02的合成及其镇痛效果验证
1、材料与方法
1.1实验材料
色谱级三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA)和色谱级乙腈(Acetonitrile，ACN)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；water分析型C18柱(5μm，4.6mm×250mm)购自美国Waters公司；依利特制备型C18柱(10μm，10mm×250mm)购自大连依利特分析仪器有限公司。
1.2实验仪器
CEM全自动微波多肽合成仪(LibertyBlue，美国)；反相高效液相色谱(ThermoFisher，德国)；三重四极杆液相色谱质谱联用仪(岛津，日本)；台式冻干机(赛飞，中国)；智能热板仪(正华，中国)。
1.3实验方法
1.3.1紫点海葵多肽毒素HC-G02的合成方法，包括如下步骤：
(1)称取树脂(代度Sd＝0.8mmol/g的2-cl树脂)，先用DCM(二氯甲烷)浸泡，然后依次用DMF(二甲基甲酰胺)和DCM洗涤，加入0.8mmol氨基酸(Fmoc-Ala-OH)、12.5mL DCM和2mLDIEA(N,N-二异丙基乙胺)进行反应90min，后再加4mL甲醇和10mL DCM，封闭反应30min，用DMF洗涤，再加入哌啶质量分数为20％的DMF溶液洗涤20min，得到第一个树脂；
(2)在一个树脂中加入1.8mmol氨基酸(Fmoc-Pro-OH)和1.8mmol缩合剂(HOBT)，加入10mL DMF，再加入2mL DIC(N,N-二异丙基碳二亚胺)反应1h，再加入含哌啶质量分数为20％的DMF溶液洗涤10min，得到第二个树脂；
(3)根据HC-G02的氨基酸序列，重复步骤(2)直到肽链结束，得到线性肽树脂；
(4)向线性肽树脂中加入甲醇进行冲洗并抽干，加入切割液(95wt％TFA、1wt％H2O、2wt％EDT和2wt％TIS)切割，过滤后，加入冰乙醚，4℃、12000r/min、5min离心3次后去除上层液冰乙醚，得到沉淀多肽粗品；
(5)用HPLC分离纯化多肽粗品，得到多肽纯品，即纯品线性肽HC-G02(纯度达到95％以上)；HPLC条件与步骤(8)相同。
(6)将步骤(5)的线性肽溶于50v/v％甲醇水溶液中，再用乙酸稀释使肽液最终浓度为每毫升混合溶液(5v/v％甲醇+5v/v％水+90v/v％乙酸)中含有肽1mg，滴加10mg/mL甲醇碘溶液至溶液淡黄色，保持搅拌1min，形成第一个二硫键；
(7)再加入等体积(即与步骤6总体积相等)盐酸-甲醇溶液(即：含50mM HCl的甲醇)，然后加入浓度10mg/mL的甲醇碘溶液(加入量为步骤6加入的甲醇碘溶液的10倍量)，保持搅拌1h，形成第二个二硫键；
(8)用HPLC分离纯化，流动相A为H2O，流动相B为ACN(乙腈)，流速5mL/min，5％-50％(B相体积)45min线性梯度洗脱，检测波长220nm，然后MS鉴定，冷冻干燥后得到多肽纯品，即HC-G02；
进一步说明，在本发明的其他实施例中，紫点海葵多肽毒素HC-G02的合成方法可以在以下范围内实施，均能获得相似结果。所述合成方法包括如下步骤：
(1)称取树脂(代度Sd＝0.2～1.4mmol/g的2-cl树脂)，先用DCM(二氯甲烷)浸泡，然后依次用DMF(二甲基甲酰胺)和DCM洗涤，加入0.6～1.0mmol氨基酸(Fmoc-Ala-OH)、10～15mL DCM和1～3mL DIEA(N,N-二异丙基乙胺)进行反应80～100min，后再加3～5mL甲醇和8～12mL DCM，封闭反应25～35min，用DMF洗涤，再加入哌啶质量分数为20％的DMF溶液洗涤15～25min，得到第一个树脂；
(2)在第一个树脂中加入1.5～2.0mmol氨基酸(Fmoc-Pro-OH)和1.5～2.0mmol缩合剂(HOBT)，加入5～15mL DMF，再加入1～3mL DIC(N,N-二异丙基碳二亚胺)反应0.5～1.5h，再加入含哌啶质量分数为20％的DMF溶液洗涤15～25min，得到第二个树脂；
(3)根据HC-G02的氨基酸序列，重复步骤(2)直到肽链结束，得到线性肽树脂；
(4)向线性肽树脂中加入甲醇进行冲洗并抽干，加入切割液(95wt％TFA、1wt％H2O、2wt％EDT和2wt％TIS)切割，过滤后，加入冰乙醚，4℃、12000r/min、5min离心3次后去除上层液冰乙醚，得到沉淀多肽粗品；
(5)用HPLC分离纯化多肽粗品，得到多肽纯品，即纯品线性肽HC-G02(纯度达到95％以上)；HPLC条件与步骤(8)相同。
(6)将步骤(5)的线性肽溶于50v/v％甲醇水溶液中，再用乙酸稀释使肽液最终浓度为每毫升混合溶液(5v/v％甲醇+5v/v％水+90v/v％乙酸)中含有肽1mg，滴加10mg/mL甲醇碘溶液，保持搅拌1min，形成第一个二硫键；
(7)再加入等体积(即与步骤6总体积相等)盐酸-甲醇溶液(即：含50mM HCl的甲醇)，然后加入浓度10mg/mL的甲醇碘溶液(加入量为步骤6加入的甲醇碘溶液的10-20倍量)，保持搅拌1h，形成第二个二硫键；
(8)用HPLC分离纯化，流动相A为H2O，流动相B为ACN(乙腈)，流速5mL/min，5％-50％(B相体积)45min线性梯度洗脱，检测波长220nm，然后MS鉴定，冷冻干燥后得到多肽纯品；
1.3.2热板实验
选实验用雌性小鼠体重约20±2g的小鼠进行热板实验。参照现有技术方法，简单描述如下：
小鼠被放置在智能热板仪(温度55±0.5℃上)进行基线测量。小鼠于热板仪上测定痛阈值，热板仪的温度设置在温度55±0.5℃，以小鼠舔后足为观察指标，重复测量2次，时间间隔大于五分钟，获得小鼠正常痛阈值。预选在30秒内有阳性反应的小鼠30只，随机分为五组，每组6只。
用磷酸缓冲盐溶液(PBS)将本发明获得的紫点海葵多肽毒素HC-G02，即氧化肽HC-G02，溶解至5mg/ml、2.5mg/ml和0.5mg/ml，按照小鼠体重以10μl/g注射相应剂量至小鼠腹部，使得最终给药剂量为50mg/kg、25mg/kg和5mg/kg。以10μl/g PBS溶液腹腔注射小鼠作为阴性对照组，以50mg/kg的曲马多为阳性对照组。每次实验的终点都发生在动物对有害的热刺激表现出特征性的物理反应时，如舔爪或跳跃。最大截止时间设置为60秒，以防止组织损伤。腹腔注射于给药后30min、60min、90min、120min、180min、240min、300min测定痛阈值(s)，然后计算出痛阈提高率(％)。
1.3.3数据处理
数据均采用软件GraphPad Prism8进行统计和处理，对照组和实验组间的数据采用t检验分析，*表示差异显著(p<0.05)，**表示差异极显著(p<0.01)，***表示差异极显著(p<0.001)，****表示差异极显著(p<0.0001)。
2结果
2.1多肽的合成和氧化折叠
采用多肽固相合成法(SPPS)合成了紫点海葵线性肽HC-G02，对线性肽进行HPLC纯化，质谱图见图2。利用定点氧化法对合成的线性肽进行一步法氧化折叠，并对氧化折叠终产物进行HPLC纯化和质谱鉴定。第一步氧化后的氧化肽HC-G02的分子量(见图4)与线性肽HC-G02相比，相差约2Da，证明正确形成第一个二硫键，第二步氧化后的氧化肽HC-G02的分子量(见图6)与第一步氧化后的氧化肽相差约144Da，证明正确形成第二个二硫键。
2.2氧化肽的分离纯化
采用分析型HPLC对线性肽HC-G02进行分析，结果如图1所示，线性肽HC-G02的洗脱时间为21.920min。采用制备型HPLC对三步氧化后的HC-G02进行分离纯化，纯化后再利用分析型HPLC进行分析，结果如图3和图5所示，第一步氧化后的氧化肽HC-G02和第二步氧化后的氧化肽HC-G02的洗脱时间分别为20.972min和19.863min。
本发明利用定点氧化法对合成的线性肽HC-G02样品进行两步法氧化折叠，并对氧化折叠终产物进行HPLC纯化和质谱鉴定，获得紫点海葵多肽毒素HC-G02，即氧化肽HC-G02，其序列为APCSGCYYQVGNECVYDKLKC-NH2，具有4个半胱氨酸形成2个二硫键，二硫键方式为C1-C3，C2-C4。
2.3热板实验
实验结果如图7所示，通过氧化肽HC-G02低中高剂量给药的痛阈提高率可以观察到腹腔注射给药后不同给药剂量的痛阈提高率都有上升趋势，高剂量(50mg/kg)给药对于痛阈值影响最大，痛阈提高率随着给药浓度的增加而增大，呈现高剂量组＞中剂量组＞低剂量组＞阴性对照组。通过热板实验，发现紫点海葵氧化肽HC-G02对小鼠物理性疼痛具有良好的镇痛作用，小鼠腹腔注射氧化肽HC-G02后，在30min痛阈提高率逐渐升高，给药后120min痛阈提高率达到最高。氧化肽HC-G02在50mg/kg下的镇痛效果与同等浓度的曲马多的镇痛效果相当，且镇痛时间延长。
以上所述仅为本发明的部分实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种紫点海葵多肽毒素HC-G02，其特征在于，其氨基酸序列为APCSGCYYQVGNECVYDKLKC-NH2。
2.根据权利要求1所述的紫点海葵多肽毒素HC-G02，其特征在于，所述紫点海葵多肽毒素HC-G02具有四个半胱氨酸形成两个二硫键，二硫键的连接方式为C1-C3和C2-C4。
3.权利要求1所述紫点海葵多肽毒素HC-G02的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)称取树脂，先用二氯甲烷浸泡，然后依次用二甲基甲酰胺和二氯甲烷洗涤，加入Fmoc-Ala-OH、二氯甲烷和N,N-二异丙基乙胺进行反应，再加入甲醇和二氯甲烷反应，用二甲基甲酰胺洗涤，再加入含吡啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤，得到第一个树脂；
(2)在第一个树脂中加入第二个氨基酸Fmoc-Pro-OH和缩合剂，再加入二甲基甲酰胺和N,N-二异丙基碳二亚胺反应，再加入含哌啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤，得到第二个树脂；
(3)根据权利要求1所述的氨基酸序列，重复步骤(2)直到肽链结束，得到线性肽树脂；
(4)向线性肽树脂中加入甲醇进行冲洗并抽干，加入切割液切割，过滤后，加入冰乙醚，离心去除上层液冰乙醚，得到沉淀多肽粗品；
(5)纯化多肽粗品，得纯品线性肽HC-G02；
(6)将步骤(5)的线性肽溶于甲醇水溶液中，再用乙酸稀释，滴加甲醇碘溶液，保持搅拌，形成第一个二硫键；
(7)再加入等体积盐酸-甲醇溶液，然后加入甲醇碘溶液，保持搅拌，形成第二个二硫键；
(8)纯化后得到多肽纯品。
4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，步骤(1)为：称取树脂，先用二氯甲烷浸泡，然后依次用二甲基甲酰胺和二氯甲烷洗涤，加入0.6～1.0mmol Fmoc-Ala-OH、10～15mL二氯甲烷和1～3mL N,N-二异丙基乙胺进行反应80～100min，再加3～5mL甲醇和8～12mL二氯甲烷封闭反应25～35min，用二甲基甲酰胺洗涤，再加入含吡啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤15～25min，得到第一个树脂；其中，所述含哌啶的二甲基甲酰胺溶液是哌啶质量分数为20％的DMF溶液。
5.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，步骤(2)为：在第一个树脂中加入1.5～2.0mmol第二个氨基酸Fmoc-Pro-OH和1.5～2.0mmol缩合剂，再加入5～15mL二甲基甲酰胺和1～3mL N,N-二异丙基碳二亚胺反应0.5～1.5h，再加入含哌啶的二甲基甲酰胺溶液洗涤15～25min，得到第二个树脂；其中，所述含哌啶的二甲基甲酰胺溶液是哌啶质量分数为20％的DMF溶液。
6.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，所述切割液含有：95wt％三氟乙酸、1wt％H2O、2wt％1,2-乙二硫醇和2wt％三异丙基硅烷。
7.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，步骤(6)为：将步骤(5)的线性肽溶于50v/v％甲醇水溶液中，再用乙酸稀释使肽液最终浓度为每毫升混合溶液中含有肽1mg，滴加10mg/mL甲醇碘溶液，保持搅拌，形成第一个二硫键。
8.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，步骤(7)为：再加入与步骤6总体积相等的盐酸-甲醇溶液，然后加入10mg/mL甲醇碘溶液，保持搅拌，形成第二个二硫键。
9.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于，步骤(8)和步骤(5)中，利用高效液相色谱法进行纯化，纯化条件为：流动相A为H2O，流动相B为乙腈，流速5mL/min，45min线性梯度洗脱，流动相B体积占比由5％升至50％。
10.权利要求1所述的紫点海葵多肽毒素HC-G02在制备镇痛剂方面的应用。
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