CN114262370B

CN114262370B - 一种紫点海葵多肽毒素Hc-GQ及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN114262370B
Application number: CN202111540613.0A
Authority: CN
Inventors: 高炳淼; 廖燕玲; 符金星; 李明; 郭琦琦
Original assignee: Hainan Medical College
Current assignee: Hainan Medical College
Priority date: 2021-12-16
Filing date: 2021-12-16
Publication date: 2023-07-14
Anticipated expiration: 2041-12-16
Also published as: CN114262370A

Abstract

本发明公开了一种紫点海葵多肽毒素Hc‑GQ及其制备方法和应用，通过采用多肽固相合成法(SPPS)合成了线性肽Hc‑GQ，对线性肽进行HPLC纯化，然后利用空气氧化法对合成的线性肽进行一步法氧化折叠，经二硫键定向氧化后获得含3个二硫键的氧化肽Hc‑GQ(二硫键方式C1‑C6，C2‑C5，C3‑C4)，并对氧化折叠终产物进行HPLC纯化和质谱鉴定，得到紫点海葵多肽毒素Hc‑GQ，即氧化肽Hc‑GQ。本发明将合成的氧化肽Hc‑GQ以昆虫注射法测试对黄粉虫杀虫作用，可为研发新型、高效、安全生物杀虫剂奠定基础。

Description

一种紫点海葵多肽毒素Hc-GQ及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于多肽相关技术领域，涉及一种紫点海葵多肽毒素Hc-GQ及其制备方法和应用。

背景技术

节肢动物害虫分布于世界的各个角落，破坏了全球约20～30％的食物供应，而且它们也是许多人类疾病传播的罪魁祸首。近年来，随着化学农药的滥用，已导致许多昆虫物种产生抗药性和农产品农药残留超标等严重问题，农业污染日益严重。为解决农业环境危机和生态安全问题，研发新型、高效、安全生物杀虫剂迫在眉睫。如今世界许多国家从蛇毒、蝎毒、蜘蛛毒、海洋和植物等天然生物资源中筛分和鉴定各种有效生理活性成分，并利用这些天然神经生物毒素构建新型的生物杀虫剂和抗病虫害植物体系。

目前，捕食昆虫的动物例如海葵、芋螺、蝎子、蜘蛛和捕食性螨等分泌的多肽类毒素，其通过昆虫的特异性离子通道或受体而起到毒杀和捕获猎物，但其对哺乳动物的毒性很小或无毒副作用。其中，海葵毒素由于其主要作用对象为甲壳类动物,因而在生物毒素来源的杀虫剂开发中受到重视。因此，开展从海葵等海洋有毒生物资源中寻找杀虫活性多肽已成为高效安全杀虫剂研究的热点之一。

发明内容

本研究利用高通量转录组学从紫点海葵(Heteractis crispa)中发现紫点海葵多肽毒素Hc-GQ，其序列为KCQCSACGAETSLCNFTSGACLCK，具有6个半胱氨酸形成3个二硫键。鉴以此，本发明提出一种紫点海葵多肽毒素Hc-GQ的制备方法及其应用。

本发明的目的是提供一种紫点海葵多肽毒素Hc-GQ的制备方法及其应用，该方法制备的紫点海葵多肽毒素Hc-GQ具有高效杀虫效果，可为研发新型、高效、安全生物杀虫剂奠定基础。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种紫点海葵多肽毒素Hc-GQ，其序列为KCQCSACGAETSLCNFTSGACLCK，具有6个半胱氨酸形成3个二硫键，二硫键方式为C1-C6，C2-C5，C3-C4。

一种紫点海葵多肽毒素Hc-GQ的制备方法，包括如下步骤：

(1)称取2-cl树脂加入反应器中用二氯甲烷(DCM)浸泡，然后用二甲基甲酰胺(DMF)洗涤，再用DCM洗涤，加入Fmoc-Lys(tbu)-OH、DCM和N,N-二异丙基乙胺(DIEA)进行反应，后补加甲醇和DCM，封闭反应；

(2)将步骤1得到的树脂产物抽干溶剂，用DMF洗涤，加入含哌啶的DMF溶液脱除Fmoc，抽干后用DMF洗涤，取树脂加入检测管中，采用茚三酮乙醇溶液和吡啶检测，显色即可；

(3)称取下一个氨基酸Fmoc-Cys-OH和1-羟基苯并三唑(HOBT)加入反应器中，倒入DMF，再加入N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)反应；

(4)将步骤3得到的树脂产物抽干溶剂，用DMF洗涤，加入含哌啶的DMF溶液脱除Fmoc，抽干后用DMF洗涤，取树脂加入检测管中，采用茚三酮乙醇溶液和吡啶检测，显色即可；

(5)按照紫点海葵多肽毒素Hc-GQ的序列称取不同氨基酸重复步骤(3)和(4)，直到肽链结束，检测无色即可，此时缩合已经完全，无游离氨基存在；

(6)用甲醇冲洗步骤5得到的树脂，抽干，倒入离心管中，加切割液切割，过滤掉树脂，滤液中加入冰乙醚析出产物，离心去掉上层乙醚，得到粗品多肽，即线性肽Hc-GQ；

(7)用HPLC分离纯化粗品多肽，得到纯品多肽，即纯品线性肽Hc-GQ；

(8)称取步骤(7)得到的纯品线性肽Hc-GQ制成水溶液，加入NH₄HCO₃搅拌，利用空气氧化法对合成的线性肽Hc-GQ进行法氧化折叠，取样用HPLC观察动态氧化折叠过程并对其纯化得到纯品，获得紫点海葵多肽毒素Hc-GQ。

进一步的，步骤(1)中，2-cl树脂取代度Sd可选为0.1～0.2mmol/g。

进一步的，步骤(1)中，加入0.6～1.0mmol Fmoc-Lys(tbu)-OH、10～15mL DCM和1～3mL DIEA进行反应80～100min，后再加3～5mL甲醇和8～12mL DCM，封闭反应25～35min。

进一步的，步骤(2)和步骤(4)中，采用含哌啶质量分数为20％的DMF溶液脱除Fmoc，15～25min。

进一步的，步骤(3)中，称取下一个氨基酸1.5～2.0mmol Fmoc-Cys-OH和1.5～2.0mmol HOBT加入反应器中，倒入5～15mL DMF，再加入1～3mL DIC反应0.5～1.5h。

进一步的，步骤(2)和步骤(4)中，采用茚三酮浓度为5g/100mL的乙醇溶液2滴、吡啶2滴，100℃加热2min检测树脂。

进一步的，步骤(6)中，切割液为95wt％三氟乙酸(TFA)、1wt％H₂0、2wt％乙二胺四乙酸(EDT)和2wt％三异丙基硅烷(TIS)。

进一步的，步骤(7)中，用HPLC分离纯化粗品多肽，线性肽Hc-GQ的洗脱时间为21.8min，得到纯品多肽，即纯品线性肽Hc-GQ。

进一步的，步骤(8)中，采用制备型HPLC对氧化72h后的Hc-GQ进行分离纯化，纯化后再利用分析型HPLC进行分析，氧化肽Hc-GQ的洗脱时间为19.4min，即获得紫点海葵多肽毒素Hc-GQ。

本发明还提出所述的紫点海葵多肽毒素Hc-GQ在杀虫剂中的应用。

相比于现有技术，本发明具有如下优点：

1、本研究利用高通量转录组学从紫点海葵中发现紫点海葵多肽毒素Hc-GQ，其序列为KCQCSACGAETSLCNFTSGACLCK，具有6个半胱氨酸形成3个二硫键。

2、本发明通过采用多肽固相合成法(SPPS)合成了线性肽Hc-GQ，对线性肽进行HPLC纯化，然后利用空气氧化法对合成的线性肽进行一步法氧化折叠，经二硫键定向氧化后获得含3个二硫键的氧化肽Hc-GQ(二硫键方式C1-C6，C2-C5，C3-C4)，并对氧化折叠终产物进行HPLC纯化和质谱鉴定，得到紫点海葵多肽毒素Hc-GQ，即氧化肽Hc-GQ。

3、将合成的氧化肽Hc-GQ以昆虫注射法测试对黄粉虫杀虫作用，获得高效杀虫效果的海洋多肽，可为研发新型、高效、安全生物杀虫剂奠定基础。

附图说明

图1为线性肽Hc-GQ的质谱鉴定示意图。

图2为HPLC分析线性肽Hc-GQ示意图。

图3为HPLC分析氧化肽Hc-GQ示意图。

图4为氧化肽Hc-GQ对黄粉虫的杀虫作用示意图，注：实验组对比于阴性对照组(negative control)，*表示具有显著性差异(**p<0.01；***p<0.001)。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

本发明提出一种紫点海葵多肽毒素Hc-GQ，其序列为KCQCSACGAETSLCNFTSGACLCK，具有6个半胱氨酸形成3个二硫键，二硫键方式为C1-C6，C2-C5，C3-C4。

本发明还提供了一种紫点海葵多肽毒素Hc-GQ的制备方法，所述方法包括如下内容：

1、材料与方法

1.1实验材料

色谱级三氟乙酸(Trifluoroacetic acid，TFA)和色谱级乙腈(Acetonitrile，ACN)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；water分析型C18柱(5μm，4.6mm×250mm)购自美国Waters公司；依利特制备型C18柱(10μm，10mm×250mm)购自大连依利特分析仪器有限公司；质粒抽提试剂盒等常规分子生物学试剂购自天根生物工程有限公司。

1.2实验仪器

CEM全自动微波多肽合成仪(LibertyBlue，美国)；反相高效液相色谱(ThermoFisher，德国)；三重四极杆液相色谱质谱联用仪(岛津，日本)；台式冻干机(赛飞，中国)；酶标仪(MR-96A，深圳迈瑞)；膜片钳系统(Axon900A，美国)。

1.3实验方法

1.3.1一种紫点海葵多肽毒素Hc-GQ的制备方法，包括如下步骤：

(1)称取2-cl树脂3g，取代度Sd＝0.2mmol/g，加入反应器中用20mL DCM浸泡5min，再用20mL DMF洗涤两次，第3次用DCM洗涤一次，加入0.8mmol的Fmoc-Lys(tbu)-OH，加入12mLDCM、2mL DIEA，反应90min，90min后补加4mL分析甲醇、10mLDCM，封闭反应30min。

(2)将步骤1得到的树脂产物抽干溶剂，用DMF洗涤4次，加入哌啶质量分数为20％的DMF溶液脱除Fmoc，20min。抽干后，用DMF洗涤树脂5次，取少量树脂(10～20粒)加入检测管中，加入茚三酮浓度为5g/100mL的乙醇溶液2滴、吡啶2滴，100℃加热2min，采用的乙醇为分析乙醇，显色即可，此时缩合未完全，存在游离氨基。

(3)称取下一个氨基酸Fmoc-Cys-OH(1.8mmol)和HOBT(1.8mmol)，加入反应器中，倒入10mL DMF，再加入2mL DIC反应1h。

(4)将步骤3得到的树脂产物抽干溶剂，用DMF洗涤4次，加入哌啶质量分数为20％的DMF溶液脱除Fmoc，20min。抽干后，用DMF洗涤树脂5次，取少量树脂(10～20粒)加入检测管中，加入茚三酮浓度为5g/100mL的乙醇溶液2滴、吡啶2滴，100℃加热2min，显色即可，此时缩合未完全，存在游离氨基。

(5)按照紫点海葵多肽毒素Hc-GQ的序列称取不同氨基酸重复步骤(3)和(4)，直到肽链结束，检测无色即可，此时缩合已经完全，无游离氨基存在。

(6)用甲醇冲洗步骤5得到的树脂，抽干，倒入在50mL离心管中，加切割液(95wt％TFA+1wt％H₂0+2wt％EDT+2wt％TIS)40mL，摇晃切割2h，最后把切割液(过滤走树脂)平分在4个新的50mL离心管中，加入40mL冰乙醚，摇晃均匀，3000转/min离心2分钟，多肽留在底部，倒走上层的乙醚，得到粗品多肽，即线性肽Hc-GQ。

(7)用HPLC分离纯化粗品多肽，得到纯品多肽，即纯品线性肽Hc-GQ，然后由真空冷冻干燥机冻干成粉末状。

(8)称取步骤(7)得到的纯品线性肽Hc-GQ样品，用少量水助溶后获得线性肽Hc-GQ溶液，加入0.1M NH₄HCO₃搅拌，线性肽Hc-GQ浓度达到0.5mg/mL，利用空气氧化法对合成的线性肽Hc-GQ样品进行一步法氧化折叠，于24、48、72h取样用HPLC观察动态氧化折叠过程并对其纯化得到纯品，随后用质谱进行鉴定确认。

1.3.2昆虫注射法

选用体重约180mg的黄粉虫进行昆虫注射法，参照现有技术方法，简单描述如下：用0.7％NaCl将本发明获得的紫点海葵多肽毒素Hc-GQ，即氧化肽Hc-GQ，溶解至2.5nM、5nM、10nM、15nM和20nM，各注射5μL至黄粉虫腹部。以无液体注射黄粉虫作为空白对照，5μL0.7％NaCl溶液注射黄粉虫作为阴性对照组。

1.3.3数据处理

数据均采用软件GraphPad Prism6进行统计和处理，对照组和实验组间的数据采用t检验分析，*表示差异显著(p<0.05)，**表示差异极显著(p<0.01)。

2结果

2.1多肽的合成和氧化折叠

采用多肽固相合成法(SPPS)合成了线性肽Hc-GQ，对线性肽进行HPLC纯化，经质谱鉴定分子量为2427.90Da(见图1)。利用空气氧化法对合成的线性肽进行一步法氧化折叠，并对氧化折叠终产物进行HPLC纯化和质谱鉴定。线性肽Hc-GQ理论分子量为2427.90Da，氧化肽Hc-GQ的分子量为2421.17，两者相差约为6Da，证明其正确形成3个二硫键。

2.2氧化肽的分离纯化

采用分析型HPLC对线性肽Hc-GQ进行分析，结果如图2所示，线性肽Hc-GQ的洗脱时间为21.8min，根据峰面积计算其纯度为99.98％。采用制备型HPLC对氧化72h后的Hc-GQ进行分离纯化，纯化后再利用分析型HPLC进行分析，结果如图3所示，氧化肽Hc-GQ的洗脱时间为19.4min，根据峰面积计算其纯度为98.95％。

本发明利用空气氧化法对合成的线性肽Hc-GQ样品进行一步法氧化折叠，并对氧化折叠终产物进行HPLC纯化和质谱鉴定，获得紫点海葵多肽毒素Hc-GQ，即氧化肽Hc-GQ，其序列为KCQCSACGAETSLCNFTSGACLCK，具有6个半胱氨酸形成3个二硫键，二硫键方式为C1-C6，C2-C5，C3-C4。

2.3昆虫注射法

实验结果如图4所示，空白对照和阴性对照组的黄粉虫死亡率均为0，表明采用注射法来评价氧化肽Hc-GQ的杀虫效果是可行的。黄粉虫的死亡率均随着氧化肽Hc-GQ的剂量增加而增加，与对照组相比均具有显著性差异。高剂量20nM氧化肽Hc-GQ对昆虫的死亡率达到74.7％，经软件计算半数致死剂量为10.7nM。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 海南医学院

<120> 一种紫点海葵多肽毒素Hc-GQ及其制备方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> PRT

<213> 紫点海葵（Heteractis crispa）

<400> 1

Lys Cys Gln Cys Ser Ala Cys Gly Ala Glu Thr Ser Leu Cys Asn Phe

1 5 10 15

Thr Ser Gly Ala Cys Leu Cys Lys

20

Claims

1.一种紫点海葵多肽毒素Hc-GQ，其特征在于，其序列为KCQCSACGAETSLCNFTSGACLCK，具有6个半胱氨酸形成3个二硫键，二硫键方式为C1-C6，C2-C5，C3-C4。

2.根据权利要求1所述的紫点海葵多肽毒素Hc-GQ的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）称取2-cl树脂加入反应器中用DCM浸泡，然后用DMF洗涤，再用DCM洗涤，加入Fmoc-Lys（tbu）-OH、DCM和DIEA进行反应，后补加甲醇和DCM，封闭反应；

（2）将步骤1得到的树脂产物抽干溶剂，用DMF洗涤，加入含哌啶的DMF溶液脱除Fmoc，抽干后用DMF洗涤，取树脂加入检测管中，采用茚三酮乙醇溶液和吡啶检测，显色即可；

（3）称取下一个氨基酸Fmoc-Cys-OH和HOBT加入反应器中，倒入DMF，再加入DIC反应；

（4）将步骤3得到的树脂产物抽干溶剂，用DMF洗涤，加入含哌啶的DMF溶液脱除Fmoc，抽干后用DMF洗涤，取树脂加入检测管中，采用茚三酮乙醇溶液和吡啶检测，显色即可；

（5）按照紫点海葵多肽毒素Hc-GQ的序列称取不同氨基酸重复步骤（3）和（4），直到肽链结束；

（6）用甲醇冲洗步骤5得到的树脂，抽干，倒入离心管中，加切割液切割，过滤掉树脂，滤液中加入冰乙醚析出产物，离心去掉上层乙醚，得到粗品多肽，即线性肽Hc-GQ；

（7）用HPLC分离纯化粗品多肽，得到纯品多肽，即纯品线性肽Hc-GQ；

（8）称取步骤（7）得到的纯品线性肽Hc-GQ制成水溶液，加入NH₄HCO₃搅拌，利用空气氧化法对合成的线性肽Hc-GQ进行法氧化折叠，取样用HPLC观察动态氧化折叠过程并对其纯化得到纯品，获得紫点海葵多肽毒素Hc-GQ。

3.根据权利要求2所述的紫点海葵多肽毒素Hc-GQ的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，加入0.6~1.0mmol Fmoc-Lys（tbu）-OH、10~15mL DCM和1~3mL DIEA进行反应80~100min，后再加3~5mL甲醇和8~12mL DCM，封闭反应25~35min。

4.根据权利要求2所述的紫点海葵多肽毒素Hc-GQ的制备方法，其特征在于，步骤（2）和步骤（4）中，采用含哌啶质量分数为20%的DMF溶液脱除Fmoc，15~25min。

5.根据权利要求2所述的紫点海葵多肽毒素Hc-GQ的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，称取1.5~2.0mmol氨基酸和1.5~2.0mmol HOBT加入反应器中，倒入5~15mL DMF，再加入1~3mL DIC反应0.5~1.5h。

6.根据权利要求2所述的紫点海葵多肽毒素Hc-GQ的制备方法，其特征在于，步骤（2）和步骤（4）中，采用茚三酮浓度为5g/100mL的乙醇溶液2滴、吡啶2滴，100℃加热2min检测树脂。

7.根据权利要求2所述的紫点海葵多肽毒素Hc-GQ的制备方法，其特征在于，步骤（6）中，切割液为95wt%TFA、1wt%H₂0、2wt%EDT和2wt% TIS。

8.根据权利要求2所述的紫点海葵多肽毒素Hc-GQ的制备方法，其特征在于，步骤（7）中，用HPLC分离纯化粗品多肽，线性肽Hc-GQ的洗脱时间为21.8min，得到纯品多肽，即纯品线性肽Hc-GQ。

9.根据权利要求2所述的紫点海葵多肽毒素Hc-GQ的制备方法，其特征在于，步骤（8）中，采用制备型HPLC对氧化72h后的Hc-GQ进行分离纯化，纯化后再利用分析型HPLC进行分析，氧化肽Hc-GQ的洗脱时间为19.4min，即获得紫点海葵多肽毒素Hc-GQ。

10.权利要求1所述的紫点海葵多肽毒素Hc-GQ在制备杀虫剂中的应用，所述虫为黄粉虫。