CN112458138B - 一种紫点海葵酶解多肽的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种紫点海葵酶解多肽的制备方法及其应用，其制备方法包括以下步骤：S1、预处理：收集紫点海葵，洗净后剪碎，超声破碎至溶液浑浊，置于有机溶剂浸泡去脂，冲洗、沥干，得到紫点海葵样品；S2、海葵总蛋白的提取：取步骤S1的紫点海葵样品，加入混合后的RIPA裂解液与PMSF蛋白酶抑制剂，静置20‑40min后超声破碎至溶液浑浊；低温离心，收集上清液得到粗品，真空冷冻干燥，制得海葵蛋白冻干粉；S3、酶解：取步骤S2的海葵蛋白冻干粉用纯水溶解，加入碱性蛋白酶，进行酶解酶解后煮沸灭活，得到酶解产物经超滤管离心，收集滤液，冷冻干燥，制得紫点海葵多肽。本发明制得紫点海葵多肽具有高效抗肿瘤活性。

Description

一种紫点海葵酶解多肽的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及多肽技术领域，特别涉及一种紫点海葵酶解多肽的制备方法及其应用。
背景技术
约100年的海葵毒液研究表明，海葵毒液是含有大量生物活性肽和蛋白质以及非蛋白质化合物的毒素混合物，分子量范围为3000至300000，主要分为海葵神经毒素和溶细胞素。目前已经鉴定出其中约250种化合物(肽，蛋白质，酶和蛋白酶抑制剂)和非蛋白质类物质(嘌呤，季铵化合物，生物胺和甜菜碱)。中国的海葵品种约为110种，于中国沿海广泛分布，其中南海最多，主要分布于潮间带、西沙群岛礁盘和底栖。
随着组学技术的发展，转录组学、蛋白质组学和肽组学研究发现，毒液中肽毒素的多样性似乎比预估的更为复杂。已经从海葵中分离并鉴定了100多种肽毒素，它们已经或将成为研究特定离子通道的结构和功能的重要工具。
迄今为止，海葵毒素中属于非蛋白类物质的沙海葵毒素(PTX)毒性最强，LD50为0.15μg/kg，毒性远超过河豚毒素(LD50为8μg/kg)和石房蛤毒素(LD50为10μg/kg)，可使血管强烈收缩和冠状动脉痉挛。此外大部分属蛋白类毒素，其中又以多肽为主。由于海葵神经毒素结构新颖、靶点专一、作用效率高，是目前研究最多、也最为深入的一大类海葵毒素，使这类多肽毒素成为神经生理学和药理学研究的重要工具而受到了更广泛的关注。
21世纪以来，在对海洋活性化合物的探索开发过程中，活性多肽是经过深入研究的代表之一。随着酶解法制备活性肽的研究增加，使得海洋生物资源得到了更好的发展。酶解法制备生物活性肽，提取得到的活性肽既能补充机体营养成分，又具有抗氧化、降血压、抗肿瘤、抗凝血等活性。因此，酶解法因生产条件温和，产品安全性高，成为制备外源肽(生物活性肽)的常见方法。
结肠癌是常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤，在我国以40～50岁年龄组发病率最高，男女之比为2～3：1，发病率占胃肠道肿瘤的第3位，而在美国，结肠癌和直肠癌的发病率似乎更高。结肠和直肠肿瘤最好的治疗方法是通过适当的淋巴结清扫术以及近端和远端的适当切缘进行手术治疗，以防止局部复发。而放射治疗似乎是术前或术后治疗直肠癌的合适辅助剂。化学药物治疗可提高治疗效果，以氟尿嘧啶为基础用药。
发明内容
鉴于此，本发明提出一种紫点海葵酶解多肽的制备方法及其应用，本发明制得紫点海葵多肽具有高效抗肿瘤活性。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种紫点海葵酶解多肽的制备方法，包括以下步骤：
S1、预处理：收集紫点海葵，洗净后剪碎，超声破碎至溶液浑浊，置于有机溶剂浸泡去脂，冲洗、沥干，得到紫点海葵样品；
S2、海葵总蛋白的提取：取步骤S1的紫点海葵样品，加入混合后的RIPA裂解液与PMSF蛋白酶抑制剂，静置20-40min后超声破碎至溶液浑浊；低温离心，收集上清液得到粗品，真空冷冻干燥，制得海葵蛋白冻干粉；
S3、酶解：取步骤S2的海葵蛋白冻干粉用纯水溶解，加入碱性蛋白酶，进行酶解，酶解后煮沸灭活，得到酶解产物经超滤管离心，收集滤液，冷冻干燥，制得紫点海葵多肽。
进一步的，步骤S3中，所述酶解条件为：加入酶量1000～4000U/g，酶解温度为50～60℃，pH为8～10、时间为2～6h。
进一步的，步骤S3中，所述碱性蛋白酶的酶解条件为：加酶量为4000U/g、pH＝8、温度为60℃、时间为6h。
进一步的，步骤S1中，所述有机溶剂为异丙醇，所述去脂的具体操作为浸泡于有机溶剂中去脂，每4h更换一次，连续换3次，再用纯水将有机溶剂冲洗干净。
进一步的，步骤S2中，所述RIPA裂解液与PMSF蛋白酶抑制剂的体积比为95～105：1。
进一步的，步骤S2中，所述低温离心为2-5℃、9000-11000r/min离心4-6min。
进一步的，步骤S3中，酶解后煮沸灭活10-20min。
进一步的，步骤S3中，所述超滤管的过滤的分子量为3kDa。
本发明紫点海葵酶解多肽应用于制备抗胃肠道肿瘤药物。
本发明紫点海葵酶解多肽应用于制备抗结肠癌药物。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的抗肿瘤多肽来源于海洋生物资源的蛋白酶解，属于海洋活性小分子肽，具有分子量小、结构新颖、较易合成、活性好等特点。易作用于离子通道或分子受体的亚型。该小分子多肽具有高效的抗肿瘤活性，特异性作用于结肠癌细胞HCT-116，在开发高效安全新颖的抗肿瘤化合物方面具有重要的应用价值。
附图说明
图1.海葵总蛋白电泳图，M：低分子量蛋白Marker；1-4依次为对比例1-3和实施例1的酶解前的海葵蛋白样品。
图2.不同蛋白酶酶解产物电泳图，M：低分子量蛋白Marker；0：海葵总蛋白样品；1：胃蛋白酶酶解样品(对比例1)；2：胰蛋白酶酶解样品(对比例2)；3：中性蛋白酶酶解样品(对比例3)；4：碱性蛋白酶酶解样品(实施例1)。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一种紫点海葵酶解多肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)海葵总蛋白的提取：收集海南紫点海葵(Heteractis crispa)，海葵以去离子水洗净后剪碎，超声破碎至溶液浑浊，浸泡于异丙醇中去脂，每4h更换一次，连续换3次，再用纯水将异丙醇冲洗干净。置于通风橱中沥干，分装标记，于-20℃保存备用，即得紫点海葵脱脂样品。取紫点海葵脱脂样品19g置于小烧杯中，加入混合后的RIPA裂解液(强)500μL与PMSF 5μL蛋白酶抑制剂共505μL(比例为100:1)，静置半小时后超声破碎至溶液浑浊。离心5min(4℃、10000r/min)，收集上清液得到粗品，保存至-80℃冰箱，进行真空冷冻干燥，冻成干粉，于-20℃保存备用，即得海葵蛋白冻干粉。
用超纯水将海葵蛋白冻干粉复溶，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒法及SDS-PAGE法检测蛋白含量、分子量分布。海葵总蛋白含量测定(BCA法)：以5mg/μl的牛血清蛋白(BSA)溶液为母液，配制一组梯度浓度的BSA溶液，在562nm处测定这组溶液的吸光度，得到蛋白质浓度对吸光度的一条标准曲线，测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线得到蛋白质的浓度。由标准曲线得总蛋白浓度为60.3mg/mL，蛋白总量为0.2g。
(2)酶解：取步骤S2的海葵蛋白冻干粉用纯水溶解，加入碱性蛋白酶，进行酶解，加入酶量为4000U/g，酶解条件为：pH为8、温度为60℃、时间为6h，酶解后煮沸灭活15min，得到酶解产物经3kDa超滤管离心，收集滤液(小于3kDa小分子多肽)，冷冻干燥保存至-20℃冰箱备用，即得紫点海葵多肽。
实施例2-本实施例与实施例1的区别在于，酶解条件为：加入酶量为2000U/g、pH为9、温度为50℃、时间为4h。
对比例1-本对比例与实施例2的区别在于，所述碱性蛋白酶替换为胃蛋白酶，酶解条件为：加入酶量为2000U/g、pH＝4、温度为37℃、时间为3h。
对比例2-本对比例与实施例2的区别在于，所述碱性蛋白酶替换为胰蛋白酶，酶解条件为：加入酶量为2000U/g、pH＝8、温度为37℃、时间为4h。
对比例3-本对比例与实施例2的区别在于，所述碱性蛋白酶替换为中性蛋白酶，酶解条件为：加入酶量为2000U/g、pH＝7.5、温度为50℃、时间为3h。
试验例1电泳实验
将实施例1以及对比例1-3制得的紫点海葵多肽，经SDS-PAGE电泳。如图1-2所示，相比对比例1-3，实施例1(碱性蛋白酶)水解度最大，为最佳水解酶。
其中，图1.海葵总蛋白电泳图，M：低分子量蛋白Marker；
1-4依次为对比例1-3和实施例1的酶解前的海葵蛋白样品。
图2.不同蛋白酶酶解产物电泳图，M：低分子量蛋白Marker；
0：海葵总蛋白样品；1：胃蛋白酶酶解样品(对比例1)；
2：胰蛋白酶酶解样品(对比例2)；3：中性蛋白酶酶解样品(对比例3)；
4：碱性蛋白酶酶解样品(实施例1)。
试验例2CCK-8法检测海葵多肽对HCT-116细胞增殖抑制活性
结肠癌细胞系HCT-116用含10％胎牛血清的DMEM培养液于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，待细胞贴壁生长至70％-80％汇合度时进行传代或实验。将HCT-116细胞接种于96孔板中，设置对照组(纯化水)及药物组，药物组分别加入实施例1-2以及对比例1-3的紫点海葵多肽，每组设5个复孔，培养24h后加入10μL CCK-8溶液并孵育0.5h。酶标仪检测吸光度A值，抑制率(IR)＝(对照组A值-药物组A值)/对照组A值×100％。
Figure BDA0002807788270000061
结果显示，实施例1-2紫点海葵多肽对HCT-116细胞增殖抑制率明显高于对比例1-3，其中，实施例1的紫点海葵多肽对HCT-116细胞增殖抑制率较高。
试验例3
将实施例1-2紫点海葵多肽分别进小鼠安全试验，结果显示无毒性反应。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种紫点海葵酶解多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、预处理：收集紫点海葵，洗净后剪碎，超声破碎至溶液浑浊，置于有机溶剂浸泡去脂，冲洗、沥干，得到紫点海葵样品；
S2、海葵总蛋白的提取：取步骤S1的紫点海葵样品，加入混合后的 RIPA 裂解液与PMSF蛋白酶抑制剂，静置20-40min后超声破碎至溶液浑浊；低温离心，收集上清液得到粗品，真空冷冻干燥，制得海葵蛋白冻干粉；
S3、酶解：取步骤S2的海葵蛋白冻干粉用纯水溶解，加入碱性蛋白酶，进行酶解，酶解后煮沸灭活，得到酶解产物经超滤管离心，收集滤液，冷冻干燥，制得紫点海葵多肽；
步骤S3中，所述酶解条件为：加入酶量2000~4000U/g，酶解温度为50~60°C，pH为8~9、时间为4~6h；所述超滤管的过滤的分子量为3kDa。
2.根据权利要求1所述的紫点海葵酶解多肽的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述碱性蛋白酶的酶解条件为： 加酶量为4000 U/g 、pH=8 、温度为60℃、时间为6h。
3.根据权利要求1所述的一种紫点海葵酶解多肽的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述有机溶剂为异丙醇，所述去脂的具体操作为浸泡于有机溶剂中去脂，每4h更换一次，连续换3次，再用纯水将有机溶剂冲洗干净。
4.根据权利要求1所述的紫点海葵酶解多肽的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述RIPA 裂解液与PMSF蛋白酶抑制剂的体积比为95~105：1。
5.根据权利要求1所述的紫点海葵酶解多肽的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述低温离心为2-5°C、9000-11000r/min离心4-6min。
6.根据权利要求1所述的紫点海葵酶解多肽的制备方法，其特征在于，步骤S3中，酶解后煮沸灭活10-20min。
7.根据权利要求1中所述的紫点海葵多肽应用于制备抗结肠癌药物。
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