CN110267527A - 可切割肽及包含可切割肽的杀昆虫和杀线虫蛋白 - Google Patents

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Abstract

一种由二元肽或三元肽组成的肽，所述肽包含至少4个氨基酸且最多16个氨基酸，由2或3个不同的区域组成，其中所述二元肽具有2个不同的区域而所述三元肽具有3个不同的区域；其中，所述肽能够被动物肠道蛋白酶和昆虫或线虫肠道蛋白酶二者切割。

Description

可切割肽及包含可切割肽的杀昆虫和杀线虫蛋白
相关申请的交叉引用
本申请是PCT申请，其要求2016年10月21日提交的美国临时申请序列号62/411,117的权益和优先权，该临时申请的公开内容通过引用整体并入本文。
序列表
本申请通过引用整体并入了名为“FAM_O_PCT_225312_417641_SEQ_LIST_2017_09_29_ST25.txt”(5.37MB)的序列表，该序列表创建于2017年9月29日，并以电子方式随此提交。
发明领域
描述并要求保护新的杀昆虫和杀线虫蛋白、可切割肽、编码它们的DNA构建体、转基因蛋白、它们在植物中的表达、产生转基因蛋白的方法、新方法、生产技术、新肽、新制剂，以及转基因蛋白内所含的产生比用于昆虫和线虫控制的相关杀昆虫和杀线虫蛋白预期更高的有害生物抗性的新的和已知的杀昆虫和杀线虫蛋白的组合。
背景技术
现代农业和园艺生产的食品的全球安全性受到昆虫有害生物的挑战。农民依靠杀昆虫剂来抑制昆虫损害，但因危险化学品退出市场以及对所有主要类别的化学和生物杀昆虫剂具有抗性的昆虫品系的进化，农民可获得的安全且具功能性的杀昆虫剂的商业选择正在减少。农民必须使用新的杀昆虫剂来维持作物保护。
杀昆虫和杀线虫肽、多肽和蛋白是对其靶标(通常是昆虫或线虫)有毒性的肽和蛋白聚合物。杀昆虫肽或毒素通常源自节肢动物来源，诸如源自蝎子或蜘蛛。可以通过注射或通过引诱昆虫从其食物中消耗该毒素(例如昆虫摄食转基因植物)而直接将毒素递送到昆虫的肠道或内脏器官。已知当通过将毒素散布在昆虫栖息的位置将毒素递送给昆虫，或通过喷洒或其他方法将毒素递送至昆虫的环境时，这些毒素具有抑制生长、损害运动或甚至杀灭昆虫的能力。通过直接暴露或摄取，昆虫与毒性肽、多肽或蛋白形成某种形式的接触。
然而，杀昆虫肽进入商业市场存在巨大的问题，迄今为止即使有也只有极少数杀昆虫肽经批准并投放商业市场，一个值得注意的例外是源自苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)或Bt的肽。目前，人们非常担心昆虫对Bt蛋白的抗性增强。
Bt蛋白或Bt肽是植物嵌入式保护剂和叶面喷雾剂形式的用于作物保护的有效杀昆虫剂。Bt蛋白的商业制剂广泛用于控制幼虫期的昆虫。抑制性半胱氨酸结基序(ICK)蛋白也是一类杀昆虫肽，它们源自节肢动物来源，诸如蝎子或蜘蛛的毒液。
已经鉴定了其他类别和类型的潜在肽，诸如胰蛋白酶调节抑制因子(TMOF)肽。TMOF肽必须被递送至其生理作用位点以发挥杀昆虫活性。已将TMOF肽鉴定为具有巨大潜力的潜在杀幼虫剂，参见D.Borovsky,Journal of Experimental Biology 206,3869-3875，但与几乎所有其他杀昆虫肽一样，TMOF尚未被商业化或尚未被农民广泛使用，并且这是有原因的。
能够以合理和经济的价格成功地以商业规模生产杀昆虫肽，并且肽的形成和折叠可重复，可能是商业化的重大障碍。杀昆虫肽的品种繁多、性能独特且性质特殊，并且可能的生产技术种类很多，可以提供大量肽应用和生产的方法，但很少(如果有的话)在商业上取得成功。
有几个原因可以解释为何已经鉴定出的众多杀昆虫肽中如此少被推向市场。第一，大多数杀昆虫肽要么太脆弱要么毒性不足而无法在商业上使用。第二，杀昆虫肽在商业上生产困难且成本高。第三，许多杀昆虫肽迅速降解并且半衰期短。第四，很少有杀昆虫肽在被植物表达时正确折叠，因此它们在经遗传修饰的生物(GMO)诸如经遗传修饰的植物中失去毒性。第五，大多数已鉴定的杀昆虫肽在被昆虫消耗时在昆虫中的系统性分布被阻断和/或丧失其毒性。Bt蛋白是最后这个问题的例外，因为它们扰乱昆虫摄食，因而得以广泛使用。
本发明为阻止了杀昆虫肽的商业化和广泛使用的这些主要问题提供了几种解决方案。本发明提供了转基因蛋白，所述转基因蛋白实现杀昆虫和杀线虫毒性肽的合成及其在活性部位(即昆虫或线虫的肠道或其他器官)处相对大量的释放。通过在宿主细胞区域中的定向表达促进在宿主中的合成，所述定向表达实现转基因蛋白的正确折叠并增强在宿主细胞中的合成。
发明内容
本发明提供了与毒性杀昆虫和/或杀线虫毒性肽和蛋白融合的可切割肽，所述毒性杀昆虫和/或杀线虫毒性肽和蛋白可在宿主细胞(例如将被昆虫或线虫有害生物消耗的植物细胞)中表达和合成。可切割肽可以在昆虫和/或线虫的肠道环境和/或血淋巴环境中以及在人的胃肠系统中被切割，从而释放其包含一种或多种杀昆虫和/或杀线虫毒性肽和蛋白的有效负载。
在第一方面，本发明提供了包含二元肽或三元肽的可切割肽，所述二元肽或三元肽包含至少4个氨基酸且最多16个氨基酸，由2或3个不同的区域组成。在一个实例中，二元肽具有两个不同的区域(昆虫或线虫可切割区域和动物(例如人)肠道可切割区域)，并且三元肽具有二元肽的两个相同区域，但还包括一个在二元肽中未发现的附加区域；并且其中所述二元肽和三元肽可被动物肠道蛋白酶和昆虫或线虫肠道蛋白酶二者切割。在一些实施方案中，本发明的可切割肽(二元和三元可切割肽(L))不能在植物细胞中被内源性植物蛋白酶切割，或不能被天然存在的植物蛋白酶切割。
在相关实施方案中，示例性二元肽包含以下氨基酸序列：X1-X2-Y1-Y2、X1-X2-X3-Y1-Y2、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2、X1-X2-Y1-Y2-Y3、X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3、X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4、X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4、Y1-Y2-X1-X2、Y1-Y2-X1-X2-X3、Y1-Y2-X1-X2-X3-X4、Y1-Y2-Y3-X1-X2、Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3、Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4，其中每个Xn和每个Yn均为氨基酸，并且其中X1选自：(全部为单字母氨基酸格式)A、D、E、G、I、K、L、N、P、Q、R和V；X2选自A、F、G、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V和Y；X3选自A、D、E、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V和Y；X4选自：R、H、K、D、E、S、T、N、Q、G、A、I、L、M、F、W、Y和V。在一些实施方案中，Y1选自：(全部为单字母氨基酸格式)A、D、E、F、G、I、L、N、Q、S、T、V和Y；Y2选自F、G、I、L和Y；以及Y3选自A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V和Y；并且Y4选自：R、H、K、D、E、S、T、N、Q、G、A、I、L、M、F、W、Y和V。
在另一个相关方面，本发明的三元肽包含至少5个氨基酸，最多16个氨基酸；其中所述三元肽包含二元肽和1至4个氨基酸的间隔区。在一些实施方案中，如本文所公开的那样，间隔区包含氨基酸序列GS并且框内融合至二元肽的N末端，或所述二元肽的C末端，或二元肽的N末端和C末端两者。
在第二方面，本发明提供了杀昆虫和/或杀线虫蛋白，其具有与杀昆虫或杀线虫毒性蛋白框内融合的可切割肽(二元肽或三元肽)。在另一个实施方案中，本发明提供了具有两种或更多种可切割肽的杀昆虫和/或杀线虫蛋白，其中所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含二元肽或三元肽，所述二元肽或三元肽与包含(TP-L)n的构建体框内融合，其中n是1至200、或1至100、或1至10范围内的整数。在另一个实施方案中，本文所述的杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含与二元肽或三元肽框内融合的内质网信号肽(ERSP)，所述二元肽或三元肽与杀昆虫或杀线虫毒性蛋白和/或重复构建体(L-TP)n或(TP-L)n框内融合，其中n是1至200、或1至100、或1至10范围内的整数。在各种实施方案中，示例性杀昆虫和/或杀线虫蛋白可包含蛋白构建体，所述构建体包含：(ERSP)-(TP-L)n或(ERSP)-(L)-(TP-L)n或(ERSP)-(L-TP)n或(ERSP)-(L-TP)n-(L)，其中n是1至200范围内的整数。在上述各种相关实施方案中，TP是毒性蛋白，L是二元肽或三元肽，并且n是1至200范围内的整数，优选1至100范围内的整数，且更优选1至10范围内的整数。在一些实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以包含相同或不同的TP，以及相同或不同的二元肽和/或三元肽。在一些实施方案中，C末端TP在其C末端与二元肽或三元肽融合或未融合。在一些实施方案中，N末端TP在其N末端与二元肽或三元肽融合或未融合。
在另一个实施方案中，本发明提供了具有两种或更多种可切割肽的杀昆虫和/或杀线虫蛋白，其中所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含与二元肽或三元肽的N末端、或构建体的N末端框内融合的稳定化结构域(STA)，所述构建体包含：(L-TP)n、(L-TP)n-L、(TP-L)n或L-(TP-L)n。在一些相关实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含与稳定化结构域(STA)的N末端框内融合的ERSP，所述稳定化结构域与二元肽或三元肽(其融合至毒性蛋白的N末端)的N末端或与构建体的N末端框内融合，所述构建体包含：(L-TP)n、(L-TP)n-L、(TP-L)n或L-(TP-L)n。在各种实施方案中，示例性杀昆虫和/或杀线虫蛋白可包括构建体，所述构建体包含：(ERSP)-(STA)-(L-TP)n或(ERSP)-(STA)-(L-TP)n-(L)或(ERSP)-(STA)-(TP-L)n或(ERSP)-(STA)-(L)-(TP-L)n或(STA)-(L-TP)n或(STA)-(L-TP)n-(L)或(STA)-(TP-L)n或(STA)-(L)-(TP-L)n。在一些相关实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含与二元肽或三元肽(其融合至毒性蛋白的N末端)的N末端或与构建体的N末端框内融合的ERSP，所述构建体包含：(L-TP)n、(L-TP)n-L、(TP-L)n或L-(TP-L)n。在各种实施方案中，示例性杀昆虫和/或杀线虫蛋白可包括如下构建体，所述构建体包含：(ERSP)-(L-TP)n或(ERSP)-(L-TP)n-(L)或(ERSP)-(TP-L)n或(ERSP)-(L)-(TP-L)n。在如本文和上文所述的各种实施方案中，TP定义为对昆虫和/或线虫有毒性的毒性蛋白，L是二元肽或三元肽，并且n是1至200范围内的整数，优选1至100范围内的整数，且更优选1至10范围内的整数。在一些实施方案中，本文和上文所述的构建体的C末端TP在其C末端与二元肽或三元肽融合或未融合。在一些实施方案中，N末端TP在其N末端与二元肽或三元肽融合或未融合。
在另一个相关方面，本发明提供了包含如本文举例说明的杀昆虫和/或杀线虫蛋白的植物或其部分。在相关实施方案中，本发明提供一种植物或其部分，其包含DNA构建体(例如表达载体)中的可操作地连接至可操作启动子(例如同源或异源启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码：包含如下肽的杀昆虫和/或杀线虫蛋白，所述肽包含二元肽或三元肽，所述二元肽和/或三元肽包含至少4个氨基酸且最多16个氨基酸并且由2或3个不同的区域组成，其中二元肽具有2个不同的区域而三元肽具有3个不同的区域；其中，二元肽和/或三元肽可被动物肠道蛋白酶(例如人肠道蛋白酶)和昆虫或线虫肠道蛋白酶二者切割，并且其中二元肽或三元肽(L)与毒性蛋白(TP)框内融合。在一些实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含重复构建体(L-TP)n或(TP-L)n，其中n是1至200、或1至100、或1至10范围内的整数。在相关实施方案中，二元肽和/或三元肽在其N末端可操作地融合至内质网信号肽(ERSP)的C末端，并且在其C末端可操作地融合至TP的N末端。参见图4、图5和图6C。在相关实施方案中，所述植物或其部分包含杀昆虫和/或杀线虫蛋白和/或编码如本文举例说明的杀昆虫和/或杀线虫蛋白的多核苷酸，其中杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含二元肽或三元肽，所述二元肽或三元肽与包含(TP-L)n的构建体框内融合，或者杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含重复构建体(L-TP)n或(TP-L)n，其中n是1至200、或1至100、或1至10范围内的整数。在相关实施方案中，所述植物或其部分包含杀昆虫和/或杀线虫蛋白和/或编码如本文举例说明的杀昆虫和/或杀线虫蛋白的多核苷酸，其中所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含与二元肽或三元肽的N末端框内融合的ERSP，所述二元肽或三元肽与包含(TP-L)n的构建体框内融合，或者所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含与二元肽和/或重复构建体(L-TP)n或(TP-L)n框内融合的ERSP。参见图4、图5和图6C。在各种实施方案中，示例性杀昆虫和/或杀线虫蛋白可包含以下构建体：(ERSP)-(TP-L)n或(ERSP)-(L)-(TP-L)n或(ERSP)-(L-TP)n或(ERSP)-(L-TP)n-(L)。在另一个实施方案中，植物或其部分包含与可操作启动子(例如同源或异源启动子)可操作地连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含与稳定化结构域(STA)的N末端框内融合的ERSP的杀昆虫和/或杀线虫蛋白。参见图3、图5和图6C。STA与二元肽或三元肽的N末端或与包含(L-TP)n、(L-TP)n-L、(TP-L)n或L-(TP-L)n的构建体的N末端框内融合。在各种实施方案中，示例性杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以包含：(ERSP)-(STA)-(L-TP)n或(ERSP)-(STA)-(L-TP)n-(L)或(ERSP)-(STA)-(TP-L)n或(ERSP)-(STA)-(L)-(TP-L)n或(STA)-(L-TP)n或(STA)-(L-TP)n-(L)或(STA)-(TP-L)n或(STA)-(L)-(TP-L)n。在各种实施方案中，TP是毒性蛋白，其可以是本公开中描述和举例说明的杀昆虫蛋白和/或杀线虫蛋白，L是二元肽或三元肽，并且n是1至200、或10至175、或20至150、或30至100、或40至100、或20至70、或20至60、或20至50、或20至40、或30至40范围内的整数。在一些实施方案中，n是1至20、或5至20、或10至20、或20至80、或30至60、或30至50范围内的整数且优选为大约或约或具体为20、25、30、35、40、45或50。在一些实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以包含相同或不同的TP，以及相同或不同的二元肽和/或三元肽。在一些实施方案中，C末端TP在其C末端与二元肽或三元肽融合或未融合。
在第三方面，本发明提供了控制植物的有害生物感染或侵染的方法。该方法包括在所述有害生物的食物中提供植物或其部分、或植物细胞，所述植物、其部分或植物细胞包含本文举例说明的杀昆虫和/或杀线虫蛋白、和/或DNA构建体，该DNA构建体包含至少一种可操作地连接至可操作启动子(例如同源或异源启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有一种或多种可切割二元肽和/或三元肽的杀昆虫和/或杀线虫蛋白。在一个相关实施方案中，所述植物或其部分包含编码杀昆虫和/或杀线虫蛋白的DNA构建体，其中所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含二元肽或三元肽，所述二元肽或三元肽与包含(TP-L)n的构建体或重复构建体(L-TP)n、(L-TP)n-L、(TP-L)n或L-(TP-L)n框内融合，其中n是1至200、或10至175、或20至150、或30至100、或40至100、或20至70、或20至60、或20至50、或20至40、或30至40范围内的整数。在一些实施方案中，n是1至20、或5至20、或10至20、或20至80、或30至60、或30至50范围内的整数且优选为大约或约或具体为20、25、30、35、40、45或50。在相关实施方案中，所述植物或其部分包含编码杀昆虫和/或杀线虫蛋白的DNA构建体，其中所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含与二元肽或三元肽的N末端框内融合的ERSP，所述二元肽或三元肽与包含(TP-L)n的构建体框内融合，或者所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含与二元肽和/或重复构建体(L-TP)n或(TP-L)n框内融合的ERSP。在各种实施方案中，示例性杀昆虫和/或杀线虫蛋白可包括：(ERSP)-(TP-L)n或(ERSP)-(L)-(TP-L)n或(ERSP)-(L-TP)n或(ERSP)-(L-TP)n-(L)，其中n是1至200、或10至175、或20至150、或30至100、或40至100、或20至70、或20至60、或20至50、或20至40、或30至40范围内的整数。在一些实施方案中，n是1至20、或5至20、或10至20、或20至80、或30至60、或30至50范围内的整数且优选为大约或约或具体为20、25、30、35、40、45或50。
在另一个实施方案中，所述植物或其部分包含编码杀昆虫和/或杀线虫蛋白的DNA构建体，其中所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含与稳定化结构域(STA)的N末端框内融合的ERSP。STA与二元肽或三元肽的N末端或与包含(L-TP)n、(L-TP)n-L、(TP-L)n或L-(TP-L)n的构建体的N末端框内融合。在各种实施方案中，示例性杀昆虫和/或杀线虫蛋白可包括如下构建体，从N末端到C末端为：(STA)-(TP-L)n或(STA)-(L)-(TP-L)n或(STA)-(L-TP)n或(STA)-(L-TP)n-(L)，其中n是1至200、或10至175、或20至150、或30至100、或40至100、或20至70、或20至60、或20至50、或20至40、或30至40范围内的整数。在一些实施方案中，n是1至20、或5至20、或10至20、或20至80、或30至60、或30至50范围内的整数且优选为大约或约或具体为20、25、30、35、40、45或50。在各种实施方案中，示例性杀昆虫和/或杀线虫蛋白可包括如下构建体就，从N末端到C末端为：(ERSP)-(STA)-(L-TP)n或(ERSP)-(STA)-(L-TP)n-(L)或(ERSP)-(STA)-(TP-L)n或(ERSP)-(STA)-(L)-(TP-L)n或(STA)-(L-TP)n或(STA)-(L-TP)n-(L)或(STA)-(TP-L)n或(STA)-(L)-(TP-L)n。在各种实施方案中，TP是毒性蛋白，L是二元肽或三元肽，并且n是1至200范围内的整数，优选1至100范围内的整数，更优选1至10范围内的整数。在一些实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以包含相同或不同的TP，以及相同或不同的二元肽和/或三元肽。在一些实施方案中，C末端TP在其C末端与二元肽或三元肽融合或未融合。在以上举例说明的每个示例性实施方案中，有害生物可以是如本公开中所描述的昆虫或线虫。在各种实施方案中，所述DNA构建体可以是载体，例如含有编码序列的克隆载体或表达载体，所述编码序列包含编码本发明的杀昆虫和/或杀线虫蛋白的多核苷酸和一种或多种允许编码序列在宿主细胞(例如细菌细胞、酵母细胞或植物细胞)中复制和/或表达的控制序列。在上述一些实施方案中，本发明的二元肽和/或三元肽不能在植物细胞中被内源植物蛋白酶切割，或不能被天然存在的植物蛋白酶切割。
在第四方面，本发明提供了经修饰的毒性肽或蛋白(TP)，其包含在毒性肽的活性部分和非活性部分之间插入(例如，框内融合)的二元肽或三元肽。在一个实例中，将二元肽或三元肽插入肽的可切割的前非活性(pro inactive)部分与肽的成熟活性部分之间。在另一个实例中，经修饰的毒性蛋白(TP)包括与本发明的二元肽或三元肽框内融合的稳定化结构域，所述二元肽或三元肽与毒性蛋白(TP)的活性部分框内融合。在另一个实例中，经修饰的毒性蛋白(TP)是苏云金芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌(“Bt”)来源的蛋白，在本文中称为“Bt蛋白”和“Bt肽”，它们可互换使用并且包括由Bt产生的肽，在本文中统称为Bt毒性蛋白或“Bt TP”。通常将此类肽和蛋白书写为“cry”、“cyt”和“VIP”蛋白，它们由由cry、cyt和vip基因编码。Bt TP更通常归属于由cry基因编码的杀昆虫晶体蛋白。Bt TP是PFIP(成孔杀昆虫蛋白)的实例。在各种实施方案中，经修饰的TP可包括如上文和本文所述的Bt蛋白，其中稳定化结构域(STA)与二元肽或三元肽或含有一种或两种或更多种本发明的二元肽或三元肽的构建体框内融合。所述二元肽或三元肽与Bt蛋白的活性片段框内融合，使得在暴露于昆虫和/或线虫的肠道环境和/或血淋巴环境以及在人的胃肠系统中时，所述二元肽或三元肽或者三元肽被切割，从而将TP的稳定化或非活性部分与TP的活性或成熟形式分离，使切割的活性或成熟部分具有杀昆虫和/或杀线虫性。在一些实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含Bt TP和/或经修饰的Bt蛋白、一种或多种二元肽和/或三元肽以及如上所述的ERSP和STA中的一种或多种。在如图3B所示的一些示例性实施方案中，经修饰的TP可包括BtTP，例如cry、cyt或VIP蛋白，其中TP非活性是Bt(非活性)(Bt TP的非活性部分)并且TP活性是Bt(活性)(Bt TP的活性部分)，它们被分离，并与一种或多种如图3B所示指定为L的二元肽和/或三元肽框内融合)。当暴露于昆虫和/或线虫的肠道环境和/或血淋巴环境以及在动物受试者(例如人受试者)的胃肠系统中时，二元肽或三元肽被切割，从而将TP的非活性部分与TP的活性或成熟部分分离，使切割的活性或成熟部分在昆虫和/或线虫中具有杀昆虫和/或杀线虫性。在一些相关实施方案中，如上所述的经修饰的TP，例如，示例性Bt TP，还可任选地包括框内融合至经修饰的TP的N末端部分的ERSP。
附图说明
图1.FRET试剂盒(目录号PSREPLI005，Mimotopes)中的FRET分子用于检测人模拟胃肠液(SGF)和昆虫肠道消化酶进行的基于氨基酸序列的切割的特异性的演示。该图来自Mimotopes FRET试剂盒，用于说明切割如何产生可检测的荧光。
图2.作为本发明的示例性实施方案的第一和第二方面的演示。第一方面是指定为(L)的二元和/或三元可切割接头肽的图示。第二方面说明了与毒性肽或蛋白(TP)融合的L的各种组合(1-200个重复)。
图3A.添加与融合至TP的L融合的任选稳定性结构域或稳定性蛋白(STA)的演示。该图演示了位于N末端位置并且框内融合至L和TP以形成说明性STA-L-TP构建体的STA的说明性用法。
图3B描绘了一个实施方案，其中包含TP的TP非活性部分的经修饰的TP与可切割的(L)肽框内融合，所述可切割的(L)肽框内融合至TP的TP活性部分。如图3B所示，当暴露于动物和昆虫和/或线虫肠道环境时，可切割的L肽被切割，从而将TP非活性部分和TP活性部分分离，从而在昆虫和/或线虫中释放TP的活性部分。在各种实施方案中，经修饰的TP是如本文所述的BtTP。
图4.演示在具有两种或更多种TP和ERSP的杀昆虫和/或杀线虫蛋白中的二元或三元可切割连接肽。该图说明了图2的各种实施方案，增加了ERSP的N末端融合。
图5.具演示有两种或更多种融合至STA的N末端的TP和ERSP的示例性杀昆虫和/或杀线虫蛋白的二元或三元可切割连接肽。该图说明了图2的各种实施方案，增加了STA及ERSP与该STA的N末端融合。
图6A描绘了示例性杀昆虫和/或杀线虫蛋白，其包含框内融合至泛素的BAASERSP，泛素融合至U+2-ACTX-Hv1a TP，后者继而融合至3个L-TP融合构建体(每个重复构建体包含连接可切割肽L，其中L是具有三个区域(XYZ)的三元可切割连接肽，并且其中Z区域是二肽甘氨酸-丝氨酸GS，并且TP是U-ACTX-Hv1a)并且其中最后一个TP U-ACTX-Hv1a具有融合的10个His的标签。
图6B描绘了包含BAAS ERSP的示例性说明性杀昆虫和/或杀线虫蛋白，BAAS ERSP框内融合至3重复构建体，该构建体包含融合至接头(L)的U-ACTX-Hv1a TP，接头(L)可以是二元或三元可切割连接肽。最后一个U-ACTX-Hv1a TP具有10个His的标签。
图6C描绘了以构建体形式显示的示例性杀昆虫和/或杀线虫蛋白的图示，其中ERSP、STA、(TP-L)N和TP的每种描绘都是框内融合的。在该构建体中，ERSP融合至STA结构域的N末端，STA结构域与重复构建体融合，该构建体包含融合至接头肽(L)的TP单元，其中重复构建体中的每个TP可以相同或不同并且重复构建体中的每个L可以相同或不同。最后，TP-L构建体的最后一个重复单元融合至TP的N末端。在该示例性实施方案中，N可以是1至10个重复单元，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9个或10个单元，使得在昆虫和/或线虫肠道环境中切割时，每个L均被切割，从而释放多个拷贝的TP，TP对摄取杀昆虫和/或杀线虫蛋白的昆虫或线虫具有杀昆虫和/或杀线虫性。
图7.演示与仅在CEW肠道提取物中切割的对照肽IGER相比，三元连接肽ALKLFVGS和IFVRLRGS在所有消化酶条件下的切割的检测。该图包含三种消化酶条件(行)和三种不同的蛋白(列)，每种蛋白含有四个TP单元(U-ACTX-Hv1a)与插入的三元连接肽或对照肽IGER。通过在每个凝胶图像下面所列的时间点添加变性条件(化学品和加热)来终止切割反应。带His标签的western印迹检测说明了三元肽ALKLFVGS和IFVRLRGS在所有消化条件下的消化和蛋白条带的消失，或者在SCR肠道提取物和SGF中对照肽IGER在所有时间点的完整蛋白条带的保留。
图8.稳定的玉米转化载体的实例。该图描绘了稳定的玉米转化载体的一个实例。白色箭头描绘载体的基本骨架组分。黑色箭头描绘载体的T-DNA部分，载体转化到玉米基因组中并导致表达含有可切割连接肽的杀昆虫蛋白的转基因玉米植株的选择和再生。
图9.在用图8中描述的载体转化之后表达包含如图6A中描述的示例性杀昆虫和/或杀线虫蛋白的开放阅读框(ORF)的玉米植株的田间试验的功效数据的实例。
具体实施方式
定义
“ACTX”或“ACTX肽”意指已经从属于阿特蛛亚科的澳大利亚漏斗网蜘蛛中分离的一系列杀昆虫ICK TP。一种这样的蜘蛛称为澳大利亚蓝山漏斗网蜘蛛，其学名为Hydronyche versuta。来自该物种的ACTX肽的三个实例是ω、κ和U肽。
“农杆菌感染”意指通过使用根癌农杆菌(A.tumefaciens)或发根农杆菌(A.rhizogenes)将DNA引入植物细胞内的植物转化方法。
“BAAS”表示大麦α-淀粉酶信号肽。它是ERSP的实例。
“二元载体”或“二元表达载体”意指本身可以在大肠杆菌菌株和农杆菌菌株中复制的表达载体。此外，载体含有由左边界和右边界序列界定的DNA区域(常常称为t-DNA)，该DNA区域被毒力基因识别以被农杆菌复制并递送到植物细胞中。
“Bt”，也称为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis或B.thuringiensis)，意指已在世界范围内使用60多年，用于控制农业、林业和公共卫生昆虫有害生物的革兰氏阳性土壤细菌。
“Bt蛋白”和“Bt肽”可互换使用并且包括由Bt产生的肽，在本文中统称为Bt毒性蛋白或“Bt TP”。通常将此类肽书写为“cry”、“cyt”和“VIP”蛋白，由cry、cyt和vip基因编码。Bt TP更通常归属于由cry基因编码的杀昆虫晶体蛋白。Bt TP是PFIP(成孔杀昆虫蛋白)的实例，参见下面的定义。序列表中提供了PFIP和其他Bt蛋白的实例。
“嵌合基因”意指编码源自一个或多个编码序列的部分的基因以产生新基因的DNA序列。
“可切割接头”，参见接头。
“条件培养基”意指已被细胞使用并富含细胞来源的材料但不含细胞的细胞培养基。
“转化”或“转化的”是指制备HP肽的过程。
“CRIP”和“CRIPS”分别是一种和多种富半胱氨酸杀昆虫蛋白的缩写。富半胱氨酸杀昆虫肽(CRIPS)是富含形成二硫键的半胱氨酸的肽。在具有至少10个氨基酸的蛋白或肽中CRIPS含有至少四(4)个，有时六(6)个，有时八(8)个半胱氨酸氨基酸，其中半胱氨酸形成两(2)个、三(3)个或四(4)个二硫键。二硫键有助于杀昆虫肽的折叠、三维结构和活性。半胱氨酸-半胱氨酸二硫键和它们形成的三维结构在这些杀昆虫肽的毒性中起重要作用。CRIP的实例是抑制性半胱氨酸结毒性蛋白或ICK TP(通常具有6-8个半胱氨酸)和具有二硫键但不被认为是ICK TP(非ICK CRIPS)的毒性肽的实例。ICK的实例是来自于蜘蛛并且如上所定义的ACTX肽。ICK蛋白的代表性实例包括U-ACTX杀昆虫肽、ω-ACTX杀昆虫肽和κ-ACTX杀昆虫肽。非ICK CRIP的实例是如同Av2和Av3的肽，它们是首先从海葵中鉴定的毒性肽。这些肽是调节昆虫外周神经系统(PNS)中的钠通道的一类化合物的实例。非ICK CRIPS可具有4-8个半胱氨酸，其形成2-4个二硫键。这些半胱氨酸-半胱氨酸二硫键稳定的毒性肽(CRIPS)在暴露于环境时可具有显著的稳定性。许多CRIPS分离自有毒动物，如蜘蛛、蝎子、蛇、海螺和海葵并且它们对昆虫有毒性。以下提供另外的描述。
“确定成分培养基”意指由已知化学组分组成但不含粗蛋白提取物或副产物如酵母提取物或蛋白胨的培养基。
“二硫键”意指在两个半胱氨酸之间通过其侧链上的两个硫醇基团偶联产生的共价键。
“双转基因肽表达载体”或“双转基因表达载体”意指含有两个拷贝的杀昆虫肽表达盒的酵母表达载体。
“ELISA”或“iELISA”意指分子生物学方案，其中将样品固定在板表面，然后如下进行检测：施用一抗，然后施用与酶缀合的二抗，所述酶将无色底物转化为可以在样品间检测和定量的有色底物。在该方案期间，洗去抗体，使得仅保留与其表位结合的抗体用于检测。我们手中的样品是从植物中分离的蛋白，并且ELISA允许对回收的表达的转基因蛋白的量进行定量。
“表达ORF”意指编码蛋白复合物的核苷酸，并且定义为ORF中的核苷酸。
“ER”或“内质网”是所有真核生物共有的亚细胞细胞器，在其中发生一些翻译后修饰过程。
“ERSP”或“内质网信号肽”是氨基酸的N末端序列，其在编码杀昆虫和/或杀线虫蛋白的mRNA分子的蛋白翻译期间被宿主细胞信号识别颗粒识别并结合，这样将蛋白翻译核糖体/mRNA复合物移动到细胞质中的ER。结果是蛋白翻译暂停，直到它与ER对接，在ER中它继续并且将所得蛋白注入到ER中。
“ersp”意指编码肽ERSP的核苷酸。
“ER运输”意指将细胞表达的蛋白转运到ER中进行翻译后修饰、分选和转运。
“FECT”意指使用狐尾草花叶病毒，消除包被蛋白基因和三基因段的瞬时植物表达系统。
“GFP”是指来自水母维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)的绿色荧光蛋白。它是翻译稳定化蛋白的实例。
“高产肽”或“HP肽”意指能够根据本文所述的程序制备或“转化”，并且一经转化，就可以以增加的产率或更高的生产率，或以高于正常的量在生物系统中产生的肽。更高的生产率可以是用转化前的肽，使用在转化前用于产生肽的相同或相似的生产方法可达到的生产率的20至400％或更高。
“同源性”当关于核酸使用时，是指互补性的程度。可能存在部分同源性或完全同源性(即，同一性)。“序列同一性”是指两种或更多种核酸或蛋白之间的相关性的量度，并且以关于总比较长度的百分比给出。同一性计算考虑了在它们各自较大序列中相同且位于相同相对位置的那些核苷酸或氨基酸残基。同一性的计算可以通过计算机程序中包含的算法来执行，例如“GAP”(Genetics Computer Group,Madison,Wis.)和“ALIGN”(DNAStar,Madison,Wis.)。部分互补序列是至少部分抑制完全互补序列(或与之竞争)与靶核酸杂交并且使用功能性术语“基本上同源”所指的序列。可以在低严格性条件下使用杂交测定(Southern或Northern印迹、溶液杂交等)检查完全互补序列与靶序列杂交的抑制。基本上同源的序列或探针将在低严格条件下竞争并抑制完全同源的序列与靶标的结合(即，杂交)。这并不是说低严格性条件是容许非特异性结合的；低严格性条件要求两个序列彼此的结合是特异性(即，选择性)相互作用。可以通过使用甚至缺乏部分互补性程度(例如，小于约30％同一性)的第二靶标来检验不存在非特异性结合；在不存在非特异性结合的情况下，探针不会与第二非互补性靶标杂交。
在优选的实施方案中，杂交条件基于核酸结合复合物的解链温度(Tm)并赋予限定的“严格性”。术语“杂交”是指互补核酸的配对。杂交和杂交强度(即，核酸之间的缔合强度)受到诸如核酸之间的互补程度、所涉及的条件的严格性、形成的杂交体的Tm及核酸内G:C比率等因素的影响。将在其结构内含有互补核酸配对的单个分子称为是“自我杂交的”。
术语“Tm”是指核酸的“解链温度”。解链温度是一群双链核酸分子一半解离成单链的温度。用于计算核酸Tm的等式在本领域中是公知的。如标准参考文献所示，当核酸在1MNaCl的水溶液中时，可以用以下等式计算Tm值的简单估计值：Tm＝81.5+0.41(％G+C)。术语“严格性”是指温度、离子强度和存在其他化合物如有机溶剂的条件，核酸杂交在该条件下进行。在“高严格性”条件下，核酸碱基配对仅在具有高频率的互补碱基序列的核酸片段之间发生。因此，对于源自遗传多样性的生物的核酸，常常需要“低”严格性条件，因为互补序列的频率通常较低。
当关于核酸杂交使用时，“低严格性条件”包括在采用长度为约500个核苷酸的探针时，相当于在42C°下在由5x SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4.H2O和1.85g/l EDTA，用NaOH将pH调至7.4)、0.1％SDS、5x Denhardt试剂[50x Denhardt每500ml含有：5g Ficoll(400型，Pharmacia)、5g BSA(级分V；Sigma)和100μg/mL变性鲑鱼精DNA组成的溶液中结合或杂交，然后在42C°下在包含5x SSPE、0.1％SDS的溶液中洗涤的条件。
当关于核酸杂交使用时，“中等严格性条件”包括在采用长度为约500个核苷酸的探针时，相当于在42C°下在由5x SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4.H2O和1.85g/lEDTA，用NaOH将pH调至7.4)、0.5％SDS、5x Denhardt试剂和100μg/mL变性鲑鱼精DNA组成的溶液中结合或杂交，然后在42C°下在包含10x SSPE、1.0％SDS的溶液中洗涤的条件。
当关于核酸杂交使用时，“高严格性条件”包括在采用长度为约500个核苷酸的探针时，相当于在42C°下在由5x SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4.H2O和1.85g/l EDTA，用NaOH将pH调至7.4)、0.5％SDS、5x Denhardt试剂和100μg/mL变性鲑鱼精DNA组成的溶液中结合或杂交，然后在42C°下在包含0.1x SSPE、1.0％SDS的溶液中洗涤的条件。
众所周知，可以采用许多等同条件来包括低严格性条件；考虑了诸如探针的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)和靶标的性质(存在于溶液中或固定的DNA、RNA、碱基组成等)以及盐和其他组分的浓度等因素(例如，甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在或不存在)，并且可以改变杂交溶液以产生与以上所列条件不同但等同的低严格性杂交条件。另外，本领域了解在高严格性条件下促进杂交的条件(例如，提高杂交和/或洗涤步骤的温度，在杂交溶液中使用甲酰胺等)。
“杂合肽”，又称为“杂合体”，又称为“杂合毒素”，又称为“杂合-ACTX-Hv1a”，又称为“天然杂合ACTX-Hv1a”，以及“U肽”，又称为“U毒素”，又称为“天然U”，又称为“U-ACTX-Hv1a”，又称为“天然U-ACTX-Hv1a”，全部是指ACTX肽，它是从一种称为澳大利亚蓝山漏斗网蜘蛛即Hydronyche versuta的蜘蛛中发现的，并且是昆虫电压门控Ca2+通道和电压门控K+通道的双重拮抗剂。
“IGER”意指短肽的基于其实际的单字母代码序列的名称。它是仅在昆虫中被切割的肽的实例。
“ICK基序”、“ICK基序蛋白”、“ICK多肽”、“ICK蛋白”、“抑制剂胱氨酸结基序”、“毒性昆虫ICK TP”、“ICK基序TP”、“CK肽”、“胱氨酸结基序”或“胱氨酸结肽”(全部在本文中可互换使用)，意指具有至少6个半段胱氨酸(half-cystine)核心氨基酸与三个二硫桥的16至60个氨基酸的肽，其中所述3个二硫桥是共价键，并且在六个半段胱氨酸残基中，共价二硫键位于从N末端氨基酸开始的六个核心半段胱氨酸氨基酸的第一个和第四个、第二个和第五个，以及第三个和第六个半段胱氨酸之间。一般而言，这种类型的肽包含β-发夹二级结构，其通常由位于基序的第四个和第六个核心半段胱氨酸之间的残基组成，发夹通过基序的三个二硫键提供的结构交联而稳定。注意，抑制剂胱氨酸结基序中可存在另外的半胱氨酸/胱氨酸或半段胱氨酸氨基酸。序列表中提供了实例。ICK蛋白的代表性实例包括U-ACTX杀昆虫肽、ω-ACTX杀昆虫肽和κ-ACTX杀昆虫肽。
“ick”意指编码ICK基序蛋白的核苷酸。
“ICK基序蛋白表达ORF”或“表达ORF”意指编码ICK基序蛋白复合物的核苷酸，并且定义为ORF中的核苷酸。
“ICK基序蛋白表达载体”或“ICK表达载体”或“ICK基序表达载体”意指含有表达ORF的二元载体。二元载体还含有围绕表达ORF的必需转录启动子和终止子序列，以促进ORF及其编码的蛋白的表达。
“昆虫”包括“昆虫纲”的所有生物。术语“成年前”昆虫是指在成年阶段之前的任何形式的生物，包括例如卵、幼虫和若虫。
“昆虫肠道环境”或“肠道环境”意指在昆虫或昆虫幼虫的前肠、中肠或后肠内存在的特定pH和蛋白酶条件。
“昆虫血淋巴环境”意指在昆虫或昆虫幼虫中存在的特定pH和蛋白酶条件。
如本文所用，术语“杀昆虫”通常用于指本文使用的多肽或蛋白增加昆虫死亡率或抑制昆虫生长速率的能力。如本文所用，术语“杀线虫”是指本文使用的多肽或蛋白增加线虫死亡率或抑制线虫生长速率的能力。一般而言，术语“线虫”包括所述生物的卵、幼虫、幼体和成熟形式。
“杀昆虫活性”意指在昆虫暴露于化合物或肽时或之后，昆虫死亡，停止或减缓其运动或其进食，停止或减缓其生长，不能化蛹，无法繁殖或无法产生可育后代。
“杀昆虫肽”或“杀昆虫蛋白”或“毒性多肽”或“毒性蛋白”(在本文中可互换使用)意指在被昆虫摄取，与昆虫接触或注入昆虫体内时具有杀昆虫活性的蛋白或多肽。
“杀昆虫肽生产菌株筛选”意指将高产率的杀昆虫肽生产酵母菌株与低产率菌株加以鉴别的筛选方法。在本文所述的方法中，它是指使用反相HPLC或家蝇注射生物测定的筛选。
“整合表达载体”或“整合载体”意指本身可以插入酵母细胞基因组的特定基因座中并稳定地成为酵母基因组的一部分的酵母表达载体。
“已知肽”意指已知具有生物活性的肽，并且可以是成熟肽或其任何形式或片段，包括前肽(pre peptide)和原肽(pro peptide)以及活性肽的缀合物。优选的已知肽是具有杀昆虫活性的肽。
在适当的上下文中，“L”意指可切割的插入二元肽或三元肽。当提及氨基酸时，“L”也可以指亮氨酸。
“接头、可切割接头或肽接头”意指短肽序列(二元肽或三元肽)，其是至少两种类型的蛋白酶的靶位点，其中一种类型的蛋白酶是昆虫和/或线虫蛋白酶，另一种类型的蛋白酶是人蛋白酶，使得接头可以被两种类型的可以切割蛋白并将其分成两个部分的蛋白酶分开，或意指短DNA序列，其位于ORF的阅读框中并且编码蛋白中是可以切割蛋白并将其分成两个部分的昆虫和/或线虫以及动物(例如人)蛋白酶的靶位点的短肽序列。
“鳞翅目(Lepidopteran)肠道环境”意指在鳞翅目昆虫或幼虫的前肠、中肠或后肠内存在的特定pH和蛋白酶条件。
“鳞翅目血淋巴环境”意指在鳞翅目昆虫或幼虫中存在的特定pH和蛋白酶条件。
“多ICK基序蛋白域”意指由通过多个插入接头肽连接的多个ICK基序TP组成的蛋白。多ICK基序TP结构域中的ICK基序TP可以相同或不同，并且该结构域中的插入接头肽也可以相同或不同。
“杀线虫肽”或“杀线虫蛋白”意指在被线虫摄取，与线虫接触或注入线虫体内时具有杀线虫活性的肽或蛋白，并且用作毒性肽和毒性蛋白的实例。
“杀线虫剂”和“杀线虫”是指杀线虫肽或杀线虫蛋白增加线虫死亡率或抑制线虫生长速率的能力。一般而言，术语“线虫”包括所述生物的卵、幼虫、幼体和成熟形式。
“非ICK CRIPS”可具有4-8个半胱氨酸，其形成2-4个二硫键。非ICK TP包括不是ICK TP的胱氨酸结肽。非ICK TP可具有与ICK不同的胱氨酸键连接顺序。非ICK CRIP的实例是如同Av2和Av3的肽，它们是首先从海葵中鉴定的肽。这些海葵肽是调节昆虫外周神经系统(PNS)中的钠通道的一类化合物的实例。
“非极性氨基酸”是弱疏水性的氨基酸，包括甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸。甘氨酸或gly是本发明二肽的最优选的非极性氨基酸。
“归一化肽产率”是指条件培养基中的肽产率除以测量肽产率时的相应细胞密度。肽产率可以用单位体积产生的肽的质量表示，例如，毫克每升或mg/L，或者用HPLC色谱仪中产生的肽的UV吸收峰面积表示，例如mAu.s。细胞密度可以用培养物在600nm波长下的可见光吸收(OD600)来表示。
“单字母代码”意指以其单字母代码列出，以区分蛋白一级结构中的各种氨基酸的肽序列。丙氨酸＝A，精氨酸＝R，天冬酰胺＝N，天冬氨酸＝D，天冬酰胺或天冬氨酸＝B，半胱氨酸＝C，谷氨酸＝E，谷氨酰胺＝Q，谷氨酰胺或谷氨酸＝Z，甘氨酸＝G，组氨酸＝H，异亮氨酸＝I，亮氨酸＝L，赖氨酸＝K，甲硫氨酸＝M，苯丙氨酸＝F，脯氨酸＝P，丝氨酸＝S，苏氨酸＝T，色氨酸＝W，酪氨酸＝Y，缬氨酸＝V。
“ω肽”，在本文中也称为“ω毒素”，其包括实例“ω-ACTX-Hv1a”，又称为“天然ωACTX-Hv1a”，全部是指一类ACTX肽，它是首先从一种称为澳大利亚蓝山漏斗网蜘蛛即Hydronyche versuta的蜘蛛中分离的，并且是昆虫电压门控Ca2+通道的拮抗剂。
“ORF”或“开放阅读框”或“肽表达ORF”意指编码以ATG起始密码子开始并以TGA、TAA或TAG终止密码子结束的蛋白的DNA序列。ORF也可以指DNA编码的已翻译的蛋白。
“可操作地连接”意指将两个相邻DNA序列放在一起，使得一个DNA序列的转录激活可以对另一个起作用。
“PEP”意指植物表达肽。
“肽表达盒”或“表达盒”意指由杀昆虫肽在生物表达系统中完全转录所必需的所有DNA元件组成的DNA序列。在本文所述的方法中，它包括转录启动子、编码α-交配因子信号序列和Kex 2切割位点的DNA序列，杀昆虫肽转基因、终止密码子和转录终止子。
“肽表达载体”意指含有异源杀昆虫肽转基因的宿主生物表达载体。
“肽表达酵母菌株”、“肽表达菌株”或“肽生产菌株”意指可以产生异源杀昆虫肽的酵母菌株。
“特制肽”意指先前具有来自生物表达系统的低肽产率，因为本文所述的用于增加其产率的方法而变成HP肽的肽。
“肽接头”，参见接头。
“肽转基因”或“杀昆虫肽转基因”意指编码杀昆虫肽并且可以在生物表达系统中翻译的DNA序列。
“肽产率”意指条件培养基中，由肽表达酵母菌株的细胞产生的杀昆虫肽浓度。它可以用单位体积产生的肽的质量表示，例如，毫克每升或mg/L，或者用HPLC色谱仪中产生的肽的UV吸收峰面积表示，例如mAu.s。
“围食膜”意指昆虫肠道内的一种衬里，其可以捕集大的食物颗粒，有助于它们移动通过肠道，同时允许消化，而且还保护肠壁。
“有害生物”包括但不限于：昆虫、真菌、细菌、线虫、螨虫、蜱等。
“PFIP”意指可以在昆虫肠道的内衬细胞(诸如肠上皮细胞)中形成孔或通道的蛋白。PFIP的实例是Bt毒性肽(Bt TP)，例如cry、crt和VIP，其他PFIP实例可以在序列表中找到。
“植物再生培养基”意指含有植物生长所必需的元素和维生素以及促进细胞再生成胚胎所必需的植物激素的任何培养基，所述胚胎可以发芽并产生源自组织培养物的小植株。常常培养基含有可选择的试剂，转基因细胞表达赋予对该试剂的抗性的选择基因。
“植物转基因蛋白”意指来自异源物种的蛋白，其在将编码它的DNA或RNA递送到一种或多种植物细胞内后在植物中表达。
“极性氨基酸”是极性的氨基酸，包括丝氨酸、苏氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、色氨酸和酪氨酸；优选的极性氨基酸是丝氨酸、苏氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸是最优选的。
“转录后基因沉默”或“PTGS”意指活细胞内阻遏基因表达的细胞过程。
在文件中“蛋白”与“肽”具有相同含义。
“重组载体”意指向其中插入了外源DNA的DNA质粒载体。
“选择基因”意指赋予经基因组修饰的生物在选择压力下生长的优势的基因。
“一个间隔区”或“多个间隔区”意指包含1至4个氨基酸的肽，如本文所公开的那样，其框内融合至二元肽的N末端，或二元肽的C末端，或二元肽的N末端和C末端两者，从而形成三元肽。三元肽与二元肽的不同之处在于三元肽与二元肽类似，只是有一个称为间隔区的附加区域，该附加区域包含任意1至4个氨基酸，更常包含2至4个氨基酸，有时包含1个、有时2个、有时3个、有时4个氨基酸并且有时也称为“Z”区。在一些具体实施方案中，间隔区可以称为“+2”或“加-2”，这是关于肽中包含如本文所述的任两个氨基酸肽例如“GS”的二肽的部分。在一些实施方案中，本发明所谓的三元肽具有三个区域，它们是：X区和Y区，第三区域称为“间隔区”或“Z”区。在一些实施方案中，X和Y中的每一个的长度均可为2-4个氨基酸，并且如果一个Z在二元肽之前且一个Z在二元肽之后，则可能有1或2个Z区，Z的长度可为每个Z有1-4个附加氨基酸，从而允许16个氨基酸的接头。
“STA”或“翻译稳定化蛋白”或“稳定化结构域”或“稳定化蛋白”，(在本文中可互换使用)意指具有足够的三级结构，使其可以在细胞中积聚而不被细胞的蛋白降解过程所靶向的蛋白。蛋白可以是5至50个氨基酸(aa)。在本文示例性实施方案中使用的一些实施方案中，STA可包括ICK-基序蛋白)，50至250个aa(GNA)、250至750个aa(例如，几丁质酶)和750至1500个aa(例如，增效蛋白(enhancin))。翻译稳定化蛋白由蛋白的DNA序列编码，该序列与ORF中编码杀昆虫蛋白的序列框内融合。融合蛋白可以是毒性蛋白的上游或下游，并且可以在两个序列之间具有任何插入序列，只要该插入序列不导致任一DNA序列的移码。翻译稳定化蛋白还可以具有增加ICK基序TP穿过肠壁递送到昆虫血淋巴中的活性。此类递送可以通过以下实现:通过跨肠壁主动运输整个ORF，或通过在肠道环境内的切割来分离ICK基序TP，同时翻译稳定化蛋白损坏围食膜和/或肠壁以增加ICK基序TP向血淋巴的扩散。
“sta”意指编码翻译稳定化蛋白的核苷酸。
“TMOF”、“TMOF基序”或“TMOF TP”意指“胰蛋白酶调节抑制因子”蛋白序列。序列表中提供了实例。本文提供了许多实例和变体。SEQ ID NO:708是野生型TMOF序列。在SEQ IDNO:709-721中提供了其他非限制性变体。其他实例将是已知的或者可以由本领域技术人员创造。
“毒性肽”或“毒性蛋白”或“TP”(全部可互换使用)意指分别被昆虫或线虫摄入，与昆虫或线虫接触或注入昆虫或线虫体内时具有杀昆虫和/或杀线虫活性的肽或蛋白。本发明的TP还包括经修饰的TP、突变TP或衍生TP。在一些实施方案中，突变或变体TP涵盖可具有一个或多个保守氨基酸取代的TP，当组合时，保守氨基酸取代基本上不会减弱突变TP相对于其非突变TP的杀昆虫和/或杀线虫活性，即保持的杀昆虫和/或杀线虫活性为非突变TP的杀昆虫和/或杀线虫活性的至少90％、或至少80％、或至少70％、或至少60％、或至少50％、或至少40％、或至少30％。TP还可以包括由具有一个或多个点突变，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个点突变或更多个点突变的多核苷酸编码的肽和蛋白，使得当编码突变TP的多核苷酸转录和/或翻译时，表达的突变TP肽或蛋白保持的杀昆虫和/或杀线虫活性是由相应的非突变TP多核苷酸编码的肽或蛋白的杀昆虫和/或杀线虫活性的至少90％、或至少80％、或至少70％、或至少60％、或至少50％、或至少40％、或至少30％。本发明的TP还可以包括与SEQID NO:5-1593和1761-1775及1761-1775中公开的任何TP具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少96％或至少97％或至少98％或至少99％的氨基酸序列同一性的TP肽和蛋白，并且仍然至少保持SEQ ID NO:5-1593和1761-1775所示的相应TP的至少90％、或至少80％、或至少70％、或至少60％、或至少50％、或至少40％、或至少30％的杀昆虫和/或杀线虫活性。本发明的TP还可以包括具有1-6个氨基酸延伸的TP肽和蛋白，所示氨基酸延伸框内融合至具有SEQ ID NO:5-1593和1761-1775所示的氨基酸序列的任何TP的N末端或C末端或两个末端。
“TSP”或“总可溶性蛋白”意指可从植物组织样品中提取并溶解到提取缓冲液中的蛋白的总量。
“转基因”意指编码转化到植物中的蛋白的异源DNA序列。
“转基因宿主细胞”意指用基因转化并已通过附加选择基因对其转基因状态进行选择的细胞。
“转基因植物”意指源自用外源DNA转化的单个细胞的植物，使得植物中的每个细胞都含有该转基因。
“瞬时表达系统”意指将编码可转化态植物病毒的DNA递送到表达它的植物细胞中的基于根癌农杆菌的系统。已经将植物病毒工程改造为以高浓度表达目标蛋白，例如高达TSP的40％。在技术论证中，使用了两种瞬时表达系统，TRBO和FECT系统，并且植物细胞是烟草植物“本氏烟(Nicotiana benthamiana)”的叶组织。
“TRBO”意指使用烟草花叶病毒，去除了病毒外壳蛋白基因的瞬时植物表达系统。
“胰蛋白酶切割”意指使用蛋白酶即胰蛋白酶(其识别暴露的赖氨酸和精氨酸氨基酸残基)以在该切割位点分离可切割接头的体外测定。它还意指胰蛋白酶切割该位点的作用。
“U-ACTX肽”或“U蛋白”或“U毒素”，其可包括“天然U”或“U-ACTX-Hv1a”或“天然U-ACTX-Hv1a”的实例(包括代表性实例，“杂合肽”，又称为“杂合毒素”，又称为“杂合-ACTX-Hv1a”，又称为“天然杂合ACTX-Hv1a”)，全部是指可在自然界中发现的或是另外被认为是U-ACTX肽的实例的天然蛋白或天然毒素，其在“U-ACTX-Hv1a”，又称为“天然U-ACTX-Hv1a”的情况下，是首先从起源于澳大利亚蓝山的蜘蛛中发现的并且是针对昆虫电压门控Ca2+通道和K+通道的双重拮抗剂的天然蜘蛛毒素。从中发现毒素的蜘蛛称为澳大利亚蓝山漏斗网蜘蛛，其学名为Hydronyche versuta。
“U+2肽”、“U+2蛋白”、“U+2毒素”或“U+2”或“U+2-ACTX-Hv1a”全部是指具有与天然肽可操作地连接的附加二肽的毒素，并且可以指蜘蛛毒素，有时称为U肽和上面提到的其他名称。与U肽可操作地连接并因此表示为“+2”或“加2”的附加二肽可以从几种肽中选择，其中任何一种都可以产生具有如本文所讨论的独特性质的“U+2肽”。这些有时也称为“高产量肽”。当使用术语“U+2-ACTX-Hv1a”时，它是指特定的高产量毒性肽，其包含来自学名为Hydronyche versuta的澳大利亚蓝山漏斗网蜘蛛的天然存在的肽。
通过筛选植物生长的Bt菌株的上清液以发现可能的杀昆虫活性，发现了“VIP”蛋白。它们与cry蛋白很少或没有相似之处，并且将它们命名为植物性杀昆虫蛋白或VIP。尤其可用于本文件和优选用于本文件的是具有鳞翅目活性的称为VIP3、Vip3蛋白或Vip毒素的那些。认为它们具有与Bt cry肽类似的作用模式。在本文件中，将VIP蛋白归类为PFIP类型的蛋白。
“酵母表达载体”或“表达载体”或“载体”意指可以将异源基因和/或表达盒引入酵母细胞中进行转录和翻译的质粒。
“产率”是指肽的产量，并且增加的产率可以意指增加的生产量，增加的生产速率，以及增加的平均或中值产率和增加的更高产率的频率。
(1).用于杀昆虫和/或杀线虫蛋白的可切割连接基团
本发明提供了可操作以被在昆虫或线虫肠道或血淋巴环境中以及在动物胃肠系统(例如，人胃肠系统)中切割的二元肽和三元肽。因此，本发明提供了可切割二元肽和三元肽，当它们与较大的杀昆虫或杀线虫蛋白的其他组分连接时，可以被人、昆虫和线虫肠道环境中存在的某些蛋白酶和肽酶切割。有利地，杀昆虫和杀线虫肽的多个拷贝可以接合或连接(每个拷贝被一种或多种二元肽或三元肽分开)，以便在摄取或与肠道环境中的昆虫和/或线虫肽酶或蛋白酶接触时，二元肽或三元肽被切割以释放活性形式的已连接的杀昆虫和杀线虫肽(参见例如图2第二方面)。在这些说明性实施方案中，如图2第二方面所示的N可以为在1至200、或例如1至100、或优选地1至10范围内的任何整数，以及它们其间的任何整数。在本发明的各种实施方案中，二元肽和/或三元肽可以连接至1种或多达200种，以及它们其间的任何数字，例如1种至100种、或更优选地1种至10种毒性肽(即，杀昆虫和/或杀线虫肽)，从而形成杀昆虫和/或杀线虫转基因蛋白，以便在暴露于昆虫时，线虫或人胃肠环境将在二元肽和/或三元肽中的特异性底物序列处切割，从而从聚合物杀昆虫和/或杀线虫蛋白结构释放多种毒性肽。在各种实施方案中，编码杀昆虫和/或杀线虫转基因蛋白的多核苷酸可以用于转化植物细胞。在一些实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫转基因蛋白可以配制成可以以本领域技术人员已知的任何方式喷洒或以其他方式施用于植物或其部分的表面的组合物。因此，本文提供了可操作以在适当条件下在宿主细胞(例如，植物细胞)中编码一种或多种杀昆虫和/或杀线虫转基因蛋白的DNA构建体。用于控制植物细胞由寄生昆虫或寄生线虫引起的有害生物感染的方法包括通过重组技术向植物、植物组织或植物细胞施用或引入编码如本文所述的杀昆虫和/或杀线虫转基因蛋白的多核苷酸，以及在暴露于有害生物的田间使所述重组改变的植物、植物组织或植物细胞生长。替代性地，可以将杀昆虫和/或杀线虫转基因蛋白配制成可喷洒的组合物，并且通过直接施用来直接施用于易感的植物，以使得在杀昆虫和/或杀线虫转基因蛋白被感染性昆虫和/或线虫摄取时，杀昆虫和杀线虫肽的一个或多个拷贝或单体从感染性昆虫和/或线虫所摄取的杀昆虫和/或杀线虫蛋白切割下来，并且产生该肽的破坏昆虫和/或线虫的作用。
(1A).可切割二元和三元连接肽
在各种实施方案中，本发明提供了可切割二元和三元连接肽，该可切割二元和三元连接肽在存在动物(例如，人、昆虫和/或线虫)的胃肠系统中存在的动物、昆虫和线虫蛋白酶或肽酶的情况下被切割。如本文所用，术语胃肠环境和肠道环境可互换使用，并且旨在包括其通用含义，即其中所摄取的食物被蛋白水解酶降解的位置。在人模型中，能够分解肽和蛋白的胃肠环境可以包括口腔、胃和小肠。
昆虫和线虫肠道环境中存在的一些可用的蛋白酶和肽酶依赖于昆虫的生命阶段，因为这些酶通常在空间和时间上表达。昆虫的消化系统由消化道和相关的腺体组成。食物进入口腔并且与可以包含或可以不包含消化性蛋白酶和肽酶的分泌物混合。前肠和后肠是外胚层起源的。前肠通常作为原始食物的储存库。分离食物包从前肠进入中肠(肠系膜(mesenteron)或昆虫的胃(ventriculus))。中肠是食物营养物的消化和吸收部位。通常，某些蛋白酶和肽酶跟随肠道pH而存在于中肠中。人胃肠系统中的某些蛋白酶和肽酶可以包括：胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、羧肽酶、氨肽酶和二肽酶。昆虫和线虫的肠道环境包括食草动物物种中的消化系统的区域，其中肽和蛋白在消化期间被降解。昆虫和线虫肠道环境中存在的一些可用的蛋白酶和肽酶可以包括：(1)丝氨酸蛋白酶；(2)半胱氨酸蛋白酶；(3)天冬氨酸蛋白酶，和(4)金属蛋白酶。
植食性昆虫的消化系统中的两种主要蛋白酶类别是丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。Murdock等人(1987)对属于鞘翅目(Coleoptera)的各种有害生物的中肠酶进行了详细研究，而Srinivasan等人(2008)则报道了属于鳞翅目的各种有害生物的中肠酶。已知丝氨酸蛋白酶在幼虫肠道环境中占优势地位并且在鳞翅目中占总消化活性的约95％，而鞘翅目物种具有更广泛的优势肠道蛋白酶(包括半胱氨酸蛋白酶)。木瓜蛋白酶家族包括具有各种活性的肽酶，包括具有广泛特异性的内肽酶(诸如木瓜蛋白酶)、具有非常窄的特异性的内肽酶(诸如甘氨酰内肽酶)、氨肽酶、二肽基肽酶以及具有内肽酶活性和外肽酶活性二者的肽酶(诸如组织蛋白酶B和H)。各种昆虫的中肠中存在的其他示例性蛋白酶包括胰蛋白酶样酶，例如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、羧肽酶B和氨基三肽酶。
丝氨酸蛋白酶广泛分布于几乎所有动物和微生物中(Joanitti等人，2006)。在高等生物中，几乎2％的基因编码这些酶(Barrette-Ng等人，2003)。对于宿主生物的维持和存活基本上必不可少的丝氨酸蛋白酶在许多生物过程中发挥着关键作用。丝氨酸蛋白酶的经典分类通过它们的底物特异性进行，特别是P1处的残基：胰蛋白酶样(P1处优选的Lys/Arg)、胰凝乳蛋白酶样(P1处的大型疏水性残基，诸如Phe/Tyr/Leu)或弹性蛋白酶样(P1处的小型疏水性残基，诸如Ala/Val)(Tyndall等人修订，2005)。丝氨酸蛋白酶是一类蛋白水解酶，它们的中心催化机构由三个不变的残基：即天冬氨酸、组氨酸和独特反应性丝氨酸组成，它们的名称“催化三联体”来自后者。Asp-His-Ser三联体可以存在于至少四种不同的结构背景中(Hedtrom，2002)。这四类丝氨酸蛋白酶的代表是胰凝乳蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶Y和Clp蛋白酶。已经进行最详细研究的胰凝乳蛋白酶样家族的三种丝氨酸蛋白酶是胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶。最近，已经发现了具有新型催化三联体和二联体的丝氨酸蛋白酶(包括Ser-His-Glu、Ser-Lys/His、His-Ser-His和N末端Ser)在消化中的作用。
肽酶的所有主要类型已在线虫中有所描述。天冬氨酸肽酶主要描述于与营养物的消化相关的功能中。在无脊椎动物中，据认为这些肽酶与半胱氨酸肽酶一起具有与脊椎动物中的天冬氨酸肽酶和丝氨酸肽酶相同的作用。在寄生线虫中，半胱氨酸肽酶涵盖了寄生线虫中涉及肽酶的几乎所有功能。因此，组织蛋白酶B和组织蛋白酶L是属于木瓜蛋白酶家族的半胱氨酸肽酶的类型，并且已经在线虫中进行了全面研究。已经发现关于最佳温度和pH以及底物亲和力的高变性存在于来自线虫的不同种的组织蛋白酶B中。据认为，它们的主要作用是消化营养物，并且所观察到的高种间变异性是由于线虫适应它所占据的生态位。组织蛋白酶L似乎也参与营养物的消化。
昆虫和线虫的肠道环境中存在的一类已充分研究的消化酶是半胱氨酸蛋白酶的类别。术语“半胱氨酸蛋白酶”旨在描述在酶的催化位点具有半胱氨酸残基的高反应性硫醇基团的蛋白酶。有证据表明，许多植食性昆虫和植物寄生线虫至少部分依赖于中肠半胱氨酸蛋白酶来进行蛋白消化。这些植食性昆虫和植物寄生线虫包括但不限于半翅目(Hemiptera)，特别是南瓜缘蝽(Anasa tristis)；拟绿蝽(Acrosternum hilare)；点蜂缘椿象(Riptortus clavatus)；目前为止研究的几乎所有鞘翅目，特别是科罗拉多马铃薯甲虫(Leptinotarsa deaemlineata)；三线马铃薯甲虫(Lema trilineata)；芦笋甲虫(Crioceris asparagi)；墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis)；赤拟谷盗(Trioliumcastaneum)；扁拟谷盗(Tribolium confusum)；跳甲(凹胫跳甲属种(Chaetocnema spp.)、跳甲属种(Haltica spp.)和毛跳甲属种(Epitrix spp.))；玉米根虫(条叶甲属种(Diabrotica Spp.))；四纹豆象(Callosobruchus aculatue)；棉铃象(Antonomusgrandis)；米象(Sitophilus oryza)；玉米象(Sitophilus zeamais)；谷象(Sitophilusgranarius)；埃及苜蓿象甲(Hypera postica)；大豆象(Acanthoseelides obtectus)；谷蠹(Rhyzopertha dominica)；黄粉虫(Tenebrio molitor)；缨翅目(Thysanoptera)，特别是西花蓟马(Franklini ella occidentalis)；双翅目(Diptera)，特别是潜蝇属种(leafminerspp.)(非洲菊斑潜蝇(Liriomyza trifolii))；植物寄生线虫，特别是马铃薯胞囊线虫(线虫属种(Globodera spp.))、甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)和根瘤线虫(根瘤线虫属种(Meloidogyne spp.))。
另一类消化酶是天冬氨酸蛋白酶。术语“天冬氨酸蛋白酶”旨在描述在酶的催化位点具有两个高反应性天冬氨酸残基的蛋白酶，该蛋白酶的最常见特征是它被胃蛋白酶抑制剂(几乎全部已知的天冬氨酸蛋白酶的低分子量抑制剂)特异性抑制。有证据表明，许多植食性昆虫部分依赖于中肠天冬氨酸蛋白酶最常见地与半胱氨酸蛋白酶结合来进行蛋白消化。这些植食性昆虫包括但不限于半翅目，特别是长红猎蝽(Rhodnius prolixus)和臭虫(臭虫属种(Cimex spp.))以及瘤蝽科(Phymatidae)、蝽科(Pentatomidae)、长蝽科(Lygaeidae)和负蝽科(Belostomatidae)的成员；鞘翅目，在芫菁科(Meloidae)、金花虫科(Chrysomelidae)、瓢虫科(Coccinelidae)和豆象科(Bruchidae)(全部属于扁虫下目(Cucujiformia)系)中，特别是科罗拉多马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)、三线马铃薯甲虫(Lematri lineata)；南方玉米根虫(Diabrotica undecimpunctata)和西方玉米根虫(D.virgifera)、棉铃象(Anthonomus grandis)、南瓜缘蝽(Anasatristis)；跳蚤甲虫(萝卜菜跳甲(Phyllotreta crucifera))、四纹豆象(Callosobruchus maculatus)、墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis)、大豆潜叶细蛾(Odontota horni)、具缘芫菁(Epicautapestifera)和赤拟谷盗(Triolium castaneum)；双翅目，特别是家蝇(Musca domestica)(Terra和Ferreira(1994)Comn.Biochem.Physiol.109B:1-62；Wolfson和Murdock(1990)J.Chem.Ecol.16:1089-1102)。
在各种实施方案中，本发明提供了作为如上所述的人、昆虫和线虫蛋白水解酶、蛋白酶和肽酶(本文统称为“蛋白酶”)的底物的二元肽和三元肽。在各种实施方案中，二元肽和三元肽包含至少4个氨基酸且最多16个氨基酸，由2或3个不同的区域组成。因此，二元肽具有两个不同的区域，三元肽具有三个不同的区域。在各种实施方案中，本发明的二元肽和三元肽均可在一个区域内被人蛋白酶切割和在第二区域中被昆虫和/或线虫蛋白酶切割。三元肽与二元肽的不同之处在于它们具有称为间隔区(包含1至4个氨基酸)的另外区域。在一些实施方案中，间隔区可以是“+2”或“加2”二肽，该二肽包含如本文所述的任何两个氨基酸。
如本文所用，仅用于描述可以形成二元肽和三元肽的氨基酸的不同排列和组合，仅出于说明性目的，二元肽和三元肽的第一区域称为“X”，且“X”是昆虫和/或线虫蛋白酶的底物，二元肽和三元肽的第二区域称为“Y”，是动物(例如，人)蛋白酶(例如，人胃肠系统中存在的人蛋白酶)的底物。在一些实施方案中，本发明的三元肽具有X区和Y区，并且第三区域称为间隔区或“Z”区。在一些实施方案中，X和Y中的每个的长度可以是2至4个氨基酸，并且Z的长度可以是1至4个氨基酸。在一些实施方案中，二元可切割肽和/或三元可切割肽不能被植物蛋白酶切割，特别是当杀昆虫和/或杀线虫蛋白在植物或其部分中表达时。在这些实施方案中，植物表达的杀昆虫和/或杀线虫蛋白不能被植物蛋白酶原位切割，但是当表达杀昆虫和/或杀线虫蛋白的植物或其部分被人或昆虫或线虫摄取时，该杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以被人或昆虫或线虫肠道蛋白酶切割。
(1B).二元肽的描述和实例
因此，二元肽可以包含X(2-4)Y(2-4)、或Y(2-4)X(2-4)或由其组成，并且示例性三元肽可以包含X(2-4)Y(2-4)Z(1-4)、或Z(1-4)X(2-4)Y(2-4)、或Y(2-4)X(2-4)Z(1-4)、或Z(1-4)Y(2-4)X(2-4)、或Z(1-4)X(2-4)Y(2-4)Z(1-4)、或Z(1-4)Y(2-4)X(2-4)Z(1-4)，其中括号中的每个数字表示该区域的氨基酸的数量。例如，X(2-4)表示具有两至四个氨基酸的X区，例如X1X2(两个氨基酸)或X1X2X3(三个氨基酸)或X1X2X3X4(四个氨基酸)。例如，二元肽可以包含以下氨基酸序列：X1-X2-Y1-Y2、X1-X2-X3-Y1-Y2、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2、X1-X2-Y1-Y2-Y3、X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3、X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4、X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4、Y1-Y2-X1-X2、Y1-Y2-X1-X2-X3、Y1-Y2-X1-X2-X3-X4、Y1-Y2-Y3-X1-X2、Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3、Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4，其中每个Xn和每个Yn是氨基酸，并且其中X1选自：(全部为单字母氨基酸格式)A、D、E、G、I、K、L、N、P、Q、R和V；X2选自A、F、G、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V和Y；X3选自A、D、E、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V和Y；X4选自：R、H、K、D、E、S、T、N、Q、G、A、I、L、M、F、W、Y和V。在一些实施方案中，Y1选自：(全部为单字母氨基酸格式)A、D、E、F、G、I、L、N、Q、S、T、V和Y；Y2选自F、G、I、L和Y；以及Y3选自A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V和Y；并且Y4选自：R、H、K、D、E、S、T、N、Q、G、A、I、L、M、F、W、Y和V。
在各种实施方案中，示例性X区肽序列(即，可以被昆虫和/或线虫肠道/血淋巴环境中存在的一种或多种昆虫和/或线虫蛋白酶切割的肽序列)可以包括：AAG、AAK、AAR、AFG、AFK、AFR、AGF、AGI、AGK、AGL、AGN、AGQ、AGR、AGS、AGT、AGY、AIG、AIK、AIN、AIQ、AIR、AKF、AKG、AKI、AKK、AKL、AKN、AKQ、AKR、AKS、AKT、AKY、ALG、ALK、ALN、ALQ、ALR、APF、APG、APK、APR、ARF、ARG、ARI、ARK、ARL、ARN、ARQ、ARR、ARS、ART、ARY、ASG、ASK、ASR、ATG、ATK、ATR、AVG、AVK、AVR、AYG、AYK、AYR、DGK、DGR、DIG、DIK、DIR、DLG、DLK、DLR、EGK、EGR、EIG、EIK、EIR、ELG、ELK、ELR、ER、FVR、GAF、GAI、GAK、GAL、GAR、GAY、GFK、GFR、GIK、GIN、GIQ、GIR、GKA、GKD、GKE、GKF、GKI、GKK、GKL、GKN、GKQ、GKR、GKS、GKT、GKV、GKY、GLK、GLN、GLQ、GLR、GNA、GNK、GNR、GNV、GPK、GPR、GQA、GQK、GQR、GQV、GRA、GRD、GRE、GRF、GRI、GRK、GRL、GRN、GRQ、GRR、GRS、GRT、GRV、GRY、GSI、GSK、GSL、GSR、GTI、GTK、GTL、GTR、GVF、GVI、GVK、GVL、GVR、GVY、GYK、GYR、IGA、IGF、IGI、IGK、IGL、IGN、IGQ、IGR、IGS、IGT、IGV、IGY、IIG、IIK、IIR、IKA、IKF、IKG、IKI、IKK、IKL、IKN、IKQ、IKR、IKS、IKT、IKV、IKY、ILG、ILK、ILR、INA、ING、INK、INR、INV、IPG、IPK、IPR、IQA、IQG、IQK、IQR、IQV、IRA、IRF、IRG、IRI、IRK、IRL、IRN、IRQ、IRR、IRS、IRT、IRV、IRY、ISG、ISK、ISR、ITG、ITK、ITR、KAF、KAG、KAI、KAK、KAL、KAR、KAY、KFF、KFG、KFK、KFR、KGA、KGD、KGE、KGF、KGI、KGK、KGL、KGN、KGQ、KGR、KGS、KGT、KGV、KGY、KIG、KIK、KIN、KIQ、KIR、KKA、KKD、KKE、KKF、KKG、KKN、KKQ、KKS、KKT、KKV、KKY、KLG、KLK、KLN、KLQ、KLR、KNG、KNK、KNR、KPG、KPK、KPR、KQG、KQK、KQR、KRA、KRD、KRE、KRF、KRG、KRN、KRQ、KRS、KRT、KRV、KRY、KSG、KSI、KSK、KSL、KSR、KTG、KTI、KTK、KTL、KTR、KVF、KVG、KVI、KVK、KVL、KVR、KVY、KYG、KYK、KYR、LFR、LGA、LGF、LGI、LGK、LGL、LGN、LGQ、LGR、LGS、LGT、LGV、LGY、LIG、LIK、LIR、LK、LKA、LKF、LKG、LKI、LKK、LKL、LKN、LKQ、LKR、LKS、LKT、LKV、LKY、LLG、LLK、LLR、LNA、LNG、LNK、LNR、LNV、LPG、LPK、LPR、LQA、LQG、LQK、LQR、LQV、LRA、LRF、LRG、LRI、LRK、LRL、LRN、LRQ、LRR、LRS、LRT、LRV、LRY、LSG、LSK、LSR、LTG、LTK、LTR、NGK、NGR、NIG、NIK、NIR、NLG、NLK、NLR、PGK、PGR、PIG、PIK、PIR、PKG、PKK、PKR、PLG、PLK、PLR、PRG、PRK、PRR、QGK、QGR、QIG、QIK、QIR、QLG、QLK、QLR、RAF、RAG、RAI、RAK、RAL、RAR、RAY、RFF、RFG、RFK、RFR、RGA、RGD、RGE、RGF、RGI、RGK、RGL、RGN、RGQ、RGR、RGS、RGT、RGV、RGY、RIG、RIK、RIN、RIQ、RIR、RKA、RKD、RKE、RKF、RKG、RKK、RKN、RKQ、RKS、RKT、RKV、RKY、RLF、RLFL、RLG、RLK、RLN、RLQ、RLR、RNG、RNK、RNR、RPG、RPK、RPR、RQG、RQK、RQR、RRA、RRD、RRE、RRF、RRG、RRK、RRN、RRQ、RRR、RRS、RRT、RRV、RRY、RSG、RSI、RSK、RSL、RSR、RTG、RTI、RTK、RTL、RTR、RVF、RVG、RVI、RVK、RVL、RVR、RVY、RYG、RYK、RYR、VAG、VAK、VAR、VFG、VFK、VFR、VGF、VGI、VGK、VGL、VGN、VGQ、VGR、VGS、VGT、VGY、VIG、VIK、VIN、VIQ、VIR、VKF、VKG、VKI、VKK、VKL、VKN、VKQ、VKR、VKS、VKT、VKY、VLG、VLK、VLN、VLQ、VLR、VPG、VPK、VPR、VR、VRF、VRG、VRI、VRK、VRL、VRN、VRQ、VRR、VRS、VRT、VRY、VSG、VSK、VSR、VTG、VTK、VTR、VVG、VVK、VVR、VYG、VYK或VYR。
在各种实施方案中，示例性X区肽序列(即，可以被昆虫和/或线虫肠道/血淋巴环境中存在的一种或多种昆虫和/或线虫蛋白酶切割的肽序列)可以包括：AAK、AAR、AFK、AFR、AIK、AIN、AIQ、AIR、AKF、AKI、AKK、AKL、AKN、AKQ、AKR、AKS、AKT、AKY、ALK、ALN、ALQ、ALR、APK、APR、ARF、ARI、ARK、ARL、ARN、ARQ、ARR、ARS、ART、ARY、ASK、ASR、ATK、ATR、AVK、AVR、AYK、AYR、DIK、DIR、DLK、DLR、EIK、EIR、ELK、ELR、IIK、IIR、IKA、IKF、IKI、IKK、IKL、IKN、IKQ、IKR、IKS、IKT、IKV、IKY、ILK、ILR、INA、INK、INR、INV、IPK、IPR、IQA、IQK、IQR、IQV、IRA、IRF、IRI、IRK、IRL、IRN、IRQ、IRR、IRS、IRT、IRV、IRY、ISK、ISR、ITK、ITR、KAF、KAI、KAK、KAL、KAR、KAY、KFK、KFR、KIK、KIN、KIQ、KIR、KKA、KKD、KKE、KKF、KKN、KKQ、KKS、KKT、KKV、KKY、KLK、KLN、KLQ、KLR、KNK、KNR、KPK、KPR、KQK、KQR、KRA、KRD、KRE、KRF、KRN、KRQ、KRS、KRT、KRV、KRY、KSI、KSK、KSL、KSR、KTI、KTK、KTL、KTR、KVF、KVI、KVK、KVL、KVR、KVY、KYK、KYR、LIK、LIR、LKA、LKF、LKI、LKK、LKL、LKN、LKQ、LKR、LKS、LKT、LKV、LKY、LLK、LLR、LNA、LNK、LNR、LNV、LPK、LPR、LQA、LQK、LQR、LQV、LRA、LRF、LRI、LRK、LRL、LRN、LRQ、LRR、LRS、LRT、LRV、LRY、LSK、LSR、LTK、LTR、NIK、NIR、NLK、NLR、PIK、PIR、PKK、PKR、PLK、PLR、PRK、PRR、QIK、QIR、QLK、QLR、RAF、RAI、RAK、RAL、RAR、RAY、RFK、RFR、RIK、RIN、RIQ、RIR、RKA、RKD、RKE、RKF、RKN、RKQ、RKS、RKT、RKV、RKY、RLK、RLN、RLQ、RLR、RNK、RNR、RPK、RPR、RQK、RQR、RRA、RRD、RRE、RRF、RRN、RRQ、RRS、RRT、RRV、RRY、RSI、RSK、RSL、RSR、RTI、RTK、RTL、RTR、RVF、RVI、RVK、RVL、RVR、RVY、RYK、RYR、VAK、VAR、VFK、VFR、VIK、VIN、VIQ、VIR、VKF、VKI、VKK、VKL、VKN、VKQ、VKR、VKS、VKT、VKY、VLK、VLN、VLQ、VLR、VPK、VPR、VRF、VRI、VRK、VRL、VRN、VRQ、VRR、VRS、VRT、VRY、VSK、VSR、VTK、VTR、VVK、VVR、VYK或VYR。
在各种实施方案中，示例性Y区肽序列(即，可以被动物(例如，人)胃肠环境中存在的一种或多种动物(例如，人)蛋白酶切割的肽序列)可以包括：AFF、AFG、AFI、AFL、AFV、AFY、AGF、AGL、AIF、AIL、ALF、ALG、ALI、ALL、ALY、AYF、AYL、DFF、DFG、DFI、DFL、DFY、DGF、DGL、DIF、DLF、DLG、DLY、DYF、DYL、EFF、EFG、EFI、EFL、EFY、EGF、EGL、EIF、ELF、ELG、ELY、EYF、EYL、FF、FFA、FFD、FFE、FFF、FFG、FFI、FFK、FFL、FFR、FFS、FFT、FFV、FFY、FGA、FGD、FGE、FGF、FGI、FGK、FGL、FGR、FGS、FGT、FGV、FGY、FLV、FLR、FYA、FYD、FYE、FYF、FYG、FYI、FYK、FYL、FYR、FYS、FYT、FYV、FYY、GFA、GFD、GFE、GFF、GFI、GFK、GFL、GFR、GFS、GFT、GFV、GFY、GGL、GIF、GIL、GLF、GLI、GLL、GLY、GYF、GYL、IF、IFA、IFF、IFG、IFI、IFL、IFV、IFY、IGF、IGL、IIF、IIL、ILF、ILG、ILI、ILL、ILY、IYF、IYL、LFA、LFF、LFG、LFI、LFL、LFV、LFY、LG、LGA、LGE、LGF、LGI、LGL、LGV、LGY、LIF、LIG、LII、LIL、LIY、LLF、LLG、LLI、LLL、LLY、LYA、LYF、LYG、LYI、LYL、LYV、LYY、NFF、NFG、NFI、NFL、NFY、NGF、NGL、NIL、NLG、NLI、NLL、NYF、NYL、QFF、QFG、QFI、QFL、QFY、QGF、QGL、QIL、QLG、QLI、QLL、QYF、QYL、SFF、SFG、SFI、SFL、SFY、SGF、SGL、SIF、SIL、SLF、SLG、SLI、SLL、SLY、SYF、SYL、TFF、TFG、TFI、TFL、TFY、TGF、TGL、TIF、TIL、TLF、TLG、TLI、TLL、TLY、TYF、TYL、VFF、VFG、VFI、VFL、VFY、VGF、VGL、VIF、VIL、VLF、VLG、VLI、VLL、VLY、VYF、VYL、YFA、YFD、YFE、YFF、YFG、YFI、YFK、YFL、YFR、YFS、YFT、YFV、YFY、YGF、YGL、YYF或YYL。
在各种实施方案中，示例性Y区肽序列(即，可以被动物(例如，人)胃肠环境中存在的一种或多种动物(例如，人)蛋白酶切割的肽序列)可以包括：AFF、AFI、AFL、AFY、AIF、AIL、ALF、ALI、ALL、ALY、AYF、AYL、DFF、DFI、DFL、DFY、DIF、DLF、DLY、DYF、DYL、YFL、EFF、EFI、EFL、0、EFY、EIF、ELF、ELY、EYF、EYL、FFA、FFD、FFE、FFF、FFI、FFK、FFL、FFR、FFS、FFT、FFV、FFY、FYA、FYD、FYE、FYF、FYI、FYK、FYL、FYR、FYS、FYT、FYV、FYY、IFA、IFF、IFI、IFL、IFV、IFY、IIF、IIL、ILF、ILI、ILL、ILY、IYF、IYL、LFA、LFF、LFI、LFL、LFV、LFY、LIF、LII、LIL、LIY、LLF、LLI、LLL、LLY、LYA、LYF、LYI、LYL、LYV、LYY、NFF、NFI、NFL、NFY、NIL、NLI、NLL、NYF、NYL、QFF、QFI、QFL、QFY、QIL、QLI、QLL、QYF、QYL、SFF、SFI、SFL、SFY、SIF、SIL、SLF、SLI、SLL、SLY、SYF、SYL、TFF、TFI、TFL、TFY、TIF、TIL、TLF、TLI、TLL、TLY、TYF、TYL、VFF、VFI、VFL、VFY、VIF、VIL、VLF、VLI、VLL、VLY、VYF、VYL、YFA、YFD、YFE、YFF、YFI、YFK、YFL、YFR、YFS、YFT、YFV、YFY、YYF或YYL。
在各种实施方案中，示例性X或Y区肽序列(即，可以被动物(例如，人)胃肠环境中存在的一种或多种动物(例如，人)蛋白酶以及昆虫和/或线虫肠道/血淋巴环境中存在的一种或多种昆虫和/或线虫蛋白酶切割的肽序列)可以包括：AFG、AGF、AGL、ALG、DLG、ELG、GFK、GFR、IGF、IGL、ILG、LGA、LGF、LGI、LGL、LGV、LGY、LIG、LLG、NLG、QLG、VFG、VGF、VGL或VLG。
在一些说明性实例中，本发明的二元肽可以包含下式：X1-X2-Y1-Y2、X1-X2-X3-Y1-Y2、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2、X1-X2-Y1-Y2-Y3、X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3、X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4、X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4、Y1-Y2-X1-X2、Y1-Y2-X1-X2-X3、Y1-Y2-X1-X2-X3-X4、Y1-Y2-Y3-X1-X2、Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3、Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4，其中X1选自：(全部为单字母氨基酸格式)A、D、E、G、I、K、L、N、P、Q、R和V；X2选自A、F、G、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V和Y；X3选自A、D、E、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V和Y；X4选自：R、H、K、D、E、S、T、N、Q、G、A、I、L、M、F、W、Y和V。在一些实施方案中，Y1选自：(全部为单字母氨基酸格式)A、D、E、F、G、I、L、N、Q、S、T、V和Y；Y2选自F、G、I、L和Y；以及Y3选自A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V和Y；并且Y4选自：R、H、K、D、E、S、T、N、Q、G、A、I、L、M、F、W、Y和V。
在一些实施方案中，说明性二元肽(XY或YX)包含以下氨基酸序列：AFVRLF(SEQ IDNO:1594)、AKLFV(SEQ ID NO:1595)、ALFALK(SEQ ID NO:1596)、ALFLK(SEQ ID NO:1597)、ALFLR(SEQ ID NO:1598)、ALFR(SEQ ID NO:1599)、ALFRLR(SEQ ID NO:1600)、ALKALF(SEQID NO:1601)、ALKFF(SEQ ID NO:1602)、ALKFLV(SEQ ID NO:1603)、ALKIFV(SEQ ID NO:1604)、ALKLFV(SEQ ID NO:1605)、FFADIK(SEQ ID NO:1606)、FFALK(SEQ ID NO:1607)、FFLK(SEQ ID NO:1608)、FFLR(SEQ ID NO:1609)、FFRLR(SEQ ID NO:1610)、FGYRIK(SEQ IDNO:1611)、FLRLF(SEQ ID NO:1612)、FYARR(SEQ ID NO:1613)、GGLRKK(SEQ ID NO:1614)、IFVALK(SEQ ID NO:1615)、IFVLK(SEQ ID NO:1616)、IFVLR(SEQ ID NO:1617)、IFVR(SEQID NO:1618)、IFVRLR(SEQ ID NO:1619)、ILFNIK(SEQ ID NO:1620)、LFAAPF(SEQ ID NO:1621)、FVALK(SEQ ID NO:1622)、LFVLK(SEQ ID NO:1623)、LFVLR(SEQ ID NO:1624)、LFVR(SEQ ID NO:1625)、LFVRLR(SEQ ID NO:1626)、LFVRVFL(SEQ ID NO:1627)、LGER(SEQ IDNO:1628)、LKALF(SEQ ID NO:1629)、LKFF(SEQ ID NO:1630)、LKIFV(SEQ ID NO:1631)、LKLFV(SEQ ID NO:1632)、LRALF(SEQ ID NO:1633)、LRFF(SEQ ID NO:1634)、LRIFV(SEQ IDNO:1635)、LRLFV(SEQ ID NO:1636)、RALF(SEQ ID NO:1637)、RIFV(SEQ ID NO:1638)、RLFV(SEQ ID NO:1639)、RLRALF(SEQ ID NO:1640)、RLRFF(SEQ ID NO:1641)、RLRIFV(SEQ IDNO:1642)、RLRLFV(SEQ ID NO:1643)、RRKAFV(SEQ ID NO:1644)、RRKLIF(SEQ ID NO:1645)、RRRFFA(SEQ ID NO:1646)、VFGRKG(SEQ ID NO:1647)和YFVRK(SEQ ID NO:1648)。
在各种实施方案中，用于杀昆虫和/或杀线虫多肽和蛋白、DNA构建体并且并入转基因植物或其部分中的本发明的示例性二元肽可以包括一种或多种选自以下的可切割二元肽：IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF。
(1C).三元肽的描述和实例
在各种实施方案中，三元肽可以包括添加有1至4个氨基酸(与二元肽的N末端、C末端或两个末端框内融合)的上文所示的所有示例性二元肽。在一些实施方案中，本发明的三元肽可以包括具有一个、两个、三个或四个氨基酸(与示例性二元肽的N末端、C末端或两个末端框内融合)的上文公开的所有示例性二元肽。在另一个实例中，示例性三元肽可以包括添加有Z(1-4)(与上文定义的二元肽的N末端、C末端或两个末端框内定位)的X(2-4)Y(2-4)或Y(2-4)X(2-4)。在一些说明性实例中，各种三元肽实例可以包括氨基酸序列：Z1-X1-X2-Y1-Y2,Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2,Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2,Z1-X1-X2-Y1-Y2-Y3,Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3,Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3,Z1-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4,Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4,Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4,Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2,Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2,Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2,Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Y3,Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3,Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3,Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4,Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4,Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4,Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2,Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Y3,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3,Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2-Y3,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4,X1-X2-Y1-Y2-Z1,X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1,X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1,X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1,X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1,X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1,X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1,X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1,X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1,Z1-X1-X2-Y1-Y2-Z1,Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1,Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1,Z1-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1,Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1,Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1,Z1-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1,Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1,Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1,Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Z1,Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1,Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1,Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1,Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1,Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1,Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1,Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1,Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1,Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Z1,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1,Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1,Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1,X1-X2-Y1-Y2-Z1-Z2,X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1-Z2,X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1-Z2,X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2,X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2,X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2,X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2,X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2,X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2,Z1-X1-X2-Y1-Y2-Z1-Z2,Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1-Z2,Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1-Z2,Z1-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2,Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2,Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2,Z1-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2,Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2,Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2,Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Z1-Z2,Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1-Z2,Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1-Z2,Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2,Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2,Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2,Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2,Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2,Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2,X1-X2-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3,X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3,X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3,X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3,X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3,X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3,X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3,X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3,X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3,Z1-X1-X2-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3,Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3,Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3,Z1-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3,Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3,Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3,Z1-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3,Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3,Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2-Y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X3-X4-Z1,Z1-Z2-Y1-Y2-X1-X2-Z1,Z1-Z2-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1,Z1-Z2-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-Z1,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1,Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2,Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2,Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2,Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2,Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2,Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2,Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2,Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2,Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2,Z1-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2,Z1-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2,Z1-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2,Z1-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2,Z1-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2,Z1-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2,Z1-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2,Z1-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2,Z1-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2,Z1-Z2-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2,Z1-Z2-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2,Z1-Z2-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2,Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2-Z3,Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3,Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3,Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2-Z3,Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3,Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3,Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2-Z3,Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3,Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3,Z1-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2-Z3,Z1-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3,Z1-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3,Z1-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2-Z3,Z1-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3,Z1-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3,Z1-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2-Z3,Z1-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3,Z1-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3,Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4,Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4,Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4,Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4,Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4,Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4,Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4,Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4,Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4，其中X1选自：(均为单字母氨基酸形式)A、D、E、G、I、K、L、N、P、Q、R和V；X2选自A、F、G、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V和Y；X3选自A、D、E、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V和Y；X4选自：R、H、K、D、E、S、T、N、Q、G、A、I、L、M、F、W、Y和V。在一些实施方案中，Y1选自：(全部为单字母氨基酸格式)A、D、E、F、G、I、L、N、Q、S、T、V和Y；Y2选自F、G、I、L和Y；以及Y3选自A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V和Y；并且Y4选自：R、H、K、D、E、S、T、N、Q、G、A、I、L、M、F、W、Y和V。下文提供了选自上述三元肽的具体示例性三元肽。
在一些说明性实施方案中，二元肽可以包含至少4个氨基酸且最多8个氨基酸，而三元肽可以包含至少5个氨基酸最多16个氨基酸。
在相关实施方案中，上文描述了包含X区和Y区的可切割二元接头肽(L)，并且上文描述的可以与X区和/或Y区框内融合(融合到X区或Y区的N末端序列，或X区或Y区的C末端序列)的示例性Z区(1-4个氨基酸序列，例如，2个氨基酸序列)形成三元可切割连接肽。说明性Z或间隔区氨基酸序列可包括：AA、AF、AM、AN、AQ、AV、AW、AY、DA、DD、DE、DF、DG、DI、DL、DP、DS、DT、DV、DW、DY、EA、ED、EE、EF、EG、EI、EL、EP、ES、ET、EV、EW、EY、FA、FD、FE、FF、FI、FK、FL、FM、FN、FQ、FR、FS、FT、FV、FW、FY、GA、GD、GE、GF、GI、GL、GM、GN、GQ、GS、GV、GW、GY、HA、HD、HE、HF、HH、HI、HK、HL、HN、HP、HQ、HR、HS、HT、HV、HY、IA、ID、IE、IG、IH、II、IK、IL、IM、IN、IP、IQ、IR、IS、IT、IV、IW、KA、KD、KE、KF、KI、KL、KN、KQ、KV、KY、LA、LD、LE、LG、LH、LI、LK、LL、LM、LN、LP、LQ、LR、LS、LT、LV、LW、MA、MF、MG、MI、MK、ML、MM、MN、MQ、MR、MS、MT、MV、MY、NA、ND、NE、NF、NI、NL、NM、NN、NQ、NS、NT、NV、NY、QA、QD、QE、QF、QI、QL、QM、QN、QQ、QS、QT、QV、QY、RA、RD、RE、RF、RI、RL、RN、RQ、RV、RY、SA、SF、SG、SK、SN、SP、SQ、SR、SS、ST、SV、SW、SY、TA、TF、TG、TK、TN、TP、TQ、TR、TS、TT、TV、TW、TY、VA、VF、VM、VN、VQ、VV、VW、VY、WA、WF、WI、WK、WL、WN、WP、WQ、WR、WS、WT、WV、WW、WY、YA、YD、YE、YF、YI、YK、YL、YM、YN、YQ、YR、YS、YT、YV、YW或YY。在示例性实施方案中，本发明的单个三元肽可以包括与上文公开的说明性二元肽的N末端和/或C末端框内融合的两个氨基酸的序列，其中所述两个氨基酸的序列是AM、LH、MN、ES、WQ或DT。
在示例性实施方案中，本发明的单个三元肽可以包括与上文公开的说明性二元肽的N末端和/或C末端框内融合的两个氨基酸的序列，其中所述两个氨基酸的序列是GS、WN、WQ、MA或MV。
在一些实施方案中，三元肽的间隔区部分(Z区)包含可以与二元肽的N末端或C末端或它们两者框内融合的氨基酸序列GS。
在各种实施方案中，用于杀昆虫和/或杀线虫多肽和蛋白、DNA构建体并且并入转基因植物或其部分中的本发明的示例性二元肽可以包括一种或多种可切割三元肽，所述可切割三元肽包含或选自在N末端、C末端或两个末端上与Z区或间隔区序列(包含或选自GS、WN、WQ、MA、MV、AM、LH、MN、ES、WQ或DT，或由它们组成)框内融合的二元肽(选自IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF)，或由它们组成。
在一些实施方案中，用于杀昆虫和/或杀线虫多肽和蛋白、DNA构建体并且并入转基因植物或其部分中的本发明的示例性三元连接肽(L)可以包括含有以下氨基酸序列的(ZXY或XYZ)：AFVRLFGS(SEQ ID NO:1649)、AKLFVGS(SEQ ID NO:1650)、ALFALKGS(SEQ IDNO:1651)、ALFLKGS(SEQ ID NO:1652)、ALFLRGS(SEQ ID NO:1653)、ALFRGS(SEQ ID NO:1654)、ALFRLRGS(SEQ ID NO:1655)、ALKALFGS(SEQ ID NO:1656)、ALKFFGS(SEQ ID NO:1657)、ALKFLVGS(SEQ ID NO:1658)、ALKIFVGS(SEQ ID NO:1659)、ALKLFVGS(SEQ ID NO:1660)、FFADIKGS(SEQ ID NO:1661)、FFALKGS(SEQ ID NO:1662)、FFLKGS(SEQ ID NO:1663)、FFLRGS(SEQ ID NO:1664)、FFRLRGS(SEQ ID NO:1665)、FGYRIKGS(SEQ ID NO:1666)、FLRLFGS(SEQ ID NO:1667)、FYARRGS(SEQ ID NO:1668)、GGLRKKGS(SEQ ID NO:1669)、IFVALKGS(SEQ ID NO:1670)、IFVLKGS(SEQ ID NO:1671)、IFVLRGS(SEQ ID NO:1672)、IFVRGS(SEQ ID NO:1673)、IFVRLRGS(SEQ ID NO:1674)、ILFNIKGS(SEQ ID NO:1675)、LFAAPFGS(SEQ ID NO:1676)、LFVALKGS(SEQ ID NO:1677)、LFVLKGS(SEQ ID NO:1678)、LFVLRGS(SEQ ID NO:1679)、LFVRGS(SEQ ID NO:1680)、LFVRLRGS(SEQ ID NO:1681)、LFVRVFLGS(SEQ ID NO:1682)、LGERGS(SEQ ID NO:1683)、LKALFGS(SEQ ID NO:1684)、LKFFGS(SEQ ID NO:1685)、LKIFVGS(SEQ ID NO:1686)、LKLFVGS(SEQ ID NO:1687)、LRALFGS(SEQ ID NO:1688)、LRFFGS(SEQ ID NO:1689)、LRIFVGS(SEQ ID NO:1690)、LRLFVGS(SEQ ID NO:1691)、RALFGS(SEQ ID NO:1692)、RIFVGS(SEQ ID NO:1693)、RLFVGS(SEQ ID NO:1694)、RLRALFGS(SEQ ID NO:1695)、RLRFFGS(SEQ ID NO:1696)、RLRIFVGS(SEQ ID NO:1697)、RLRLFVGS(SEQ ID NO:1698)、RRKAFVGS(SEQ ID NO:1699)、RRKLIFGS(SEQ ID NO:1700)、RRRFFAGS(SEQ ID NO:1701)、VFGRKGGS(SEQ ID NO:1702)、YFVRKGS(SEQ ID NO:1703)、GSAFVRLF(SEQ ID NO:1704)、GSAKLFV(SEQ ID NO:1705)、GSALFALK(SEQ ID NO:1706)、GSALFLK(SEQ ID NO:1707)、GSALFLR(SEQ ID NO:1708)、GSALFR(SEQID NO:1709)、GSALFRLR(SEQ ID NO:1710)、GSALKALF(SEQ ID NO:1711)、GSALKFF(SEQ IDNO:1712)、GSALKFLV(SEQ ID NO:1713)、GSALKIFV(SEQ ID NO:1714)、GSALKLFV(SEQ IDNO:1715)、GSFFADIK(SEQ ID NO:1716)、GSFFALK(SEQ ID NO:1717)、GSFFLK(SEQ ID NO:1718)、GSFFLR(SEQ ID NO:1719)、GSFFRLR(SEQ ID NO:1720)、GSFGYRIK(SEQ ID NO:1721)、GSFLRLF(SEQ ID NO:1722)、GSFYARR(SEQ ID NO:1723)、GSGGLRKK(SEQ ID NO:1724)、GSIFVALK(SEQ ID NO:1725)、GSIFVLK(SEQ ID NO:1726)、GSIFVLR(SEQ ID NO:1727)、GSIFVR(SEQ ID NO:1728)、GSIFVRLR(SEQ ID NO:1729)、GSILFNIK(SEQ ID NO:1730)、GSLFAAPF(SEQ ID NO:1731)、GSLFVALK(SEQ ID NO:1732)、GSLFVLK(SEQ ID NO:1733)、GSLFVLR(SEQ ID NO:1734)、GSLFVR(SEQ ID NO:1735)、GSLFVRLR(SEQ ID NO:1736)、GSLFVRVFL(SEQ ID NO:1737)、GSLGER(SEQ ID NO:1738)、GSLKALF(SEQ ID NO:1739)、GSLKFF(SEQ ID NO:1740)、GSLKIFV(SEQ ID NO:1741)、GSLKLFV(SEQ ID NO:1742)、GSLRALF(SEQ ID NO:1743)、GSLRFF(SEQ ID NO:1744)、GSLRIFV(SEQ ID NO:1745)、GSLRLFV(SEQ ID NO:1746)、GSRALF(SEQ ID NO:1747)、GSRIFV(SEQ ID NO:1748)、GSRLFV(SEQ ID NO:1749)、GSRLRALF(SEQ ID NO:1750)、GSRLRFF(SEQ ID NO:1751)、GSRLRIFV(SEQ ID NO:1752)、GSRLRLFV(SEQ ID NO:1753)、GSRRKAFV(SEQ ID NO:1754)、GSRRKLIF(SEQ ID NO:1755)、GSRRRFFA(SEQ ID NO:1756)、GSVFGRKG(SEQ ID NO:1757)和GSYFVRK(SEQ ID NO:1758)。
在各种实施方案中，本发明的代表性二元肽可以包括：IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF。
(1D).杀昆虫和/或杀线虫蛋白
在本发明的各种实施方案中，本公开提供了具有如上所述的可切割肽(L)(二元肽或三元肽)的杀昆虫和/或杀线虫蛋白，该可切割肽与杀昆虫或杀线虫毒性蛋白(TP)框内融合。在另一个实施方案中，本发明提供了具有两种或更多种可切割肽的杀昆虫和/或杀线虫蛋白，其中杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含二元肽或三元肽，该二元肽或三元肽与包含：(L-TP)n、或(L-TP)n-L、或(TP-L)n、或L-(TP-L)n，基本上由它们组成或由它们组成的构建体框内融合，其中TP是毒性肽或毒性蛋白，L是二元可切割肽或三元可切割肽，并且n为1至200、或1至100、或1至10范围内的整数。在另一个实施方案中，本文所述的杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含与二元肽或三元肽框内融合的内质网信号肽(ERSP)，该二元肽或三元肽与杀昆虫和/或杀线虫毒性蛋白和/或重复构建体(L-TP)n或(TP-L)n框内融合，其中n为1至200、或1至100、或1至10范围内的整数。在各种实施方案中，示例性杀昆虫和/或杀线虫蛋白可包含蛋白构建体，所述构建体包含：(ERSP)-(TP-L)n或(ERSP)-(L)-(TP-L)n或(ERSP)-(L-TP)n或(ERSP)-(L-TP)n-(L)，其中n是1至200范围内的整数。在上述各种相关实施方案中，TP是毒性蛋白，L是二元肽或三元肽，并且n是1至200范围内的整数，优选1至100范围内的整数，且更优选1至10范围内的整数。在一些实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以包含相同或不同的TP，以及相同或不同的二元肽和/或三元肽。在一些实施方案中，C末端TP在其C末端与二元肽或三元肽融合或未融合。在一些实施方案中，N末端TP在其N末端与二元肽或三元肽融合或未融合。
在另一个实施方案中，本发明提供了具有两种或更多种可切割肽的杀昆虫和/或杀线虫蛋白，其中所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含与二元肽或三元肽的N末端、或构建体的N末端框内融合的稳定化结构域(STA)，所述构建体包含：(L-TP)n、(L-TP)n-L、(TP-L)n或L-(TP-L)n。在一些相关实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含与稳定化结构域(STA)的N末端框内融合的ERSP，所述稳定化结构域与二元肽或三元肽(其融合至毒性蛋白的N末端)的N末端或与构建体的N末端框内融合，所述构建体包含：(L-TP)n、(L-TP)n-L、(TP-L)n或L-(TP-L)n。在各种实施方案中，示例性杀昆虫和/或杀线虫蛋白可包括构建体，所述构建体包含：(ERSP)-(STA)-(L-TP)n或(ERSP)-(STA)-(L-TP)n-(L)或(ERSP)-(STA)-(TP-L)n或(ERSP)-(STA)-(L)-(TP-L)n或(STA)-(L-TP)n或(STA)-(L-TP)n-(L)或(STA)-(TP-L)n或(STA)-(L)-(TP-L)n。在一些相关实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含与二元肽或三元肽(其融合至毒性蛋白的N末端)的N末端或与构建体的N末端框内融合的ERSP，所述构建体包含：(L-TP)n、(L-TP)n-L、(TP-L)n或L-(TP-L)n。在各种实施方案中，示例性杀昆虫和/或杀线虫蛋白可包括如下构建体，所述构建体包含：(ERSP)-(L-TP)n或(ERSP)-(L-TP)n-(L)或(ERSP)-(TP-L)n或(ERSP)-(L)-(TP-L)n。在如本文和上文所述的各种实施方案中，TP定义为对昆虫和/或线虫有毒性的毒性蛋白，L是二元肽或三元肽，并且n是1至200范围内的整数，优选1至100范围内的整数，且更优选1至10范围内的整数。在一些实施方案中，本文和上文所述的构建体的C末端TP在其C末端与二元肽或三元肽融合或未融合。在一些实施方案中，N末端TP在其N末端与二元肽或三元肽融合或未融合。在一些上述实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白中使用的TP可以是具有SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:1593和SEQ ID NO:1761-SEQID NO:1775所示的氨基酸序列的肽或蛋白，或其变体。在各种实施方案中，TP可以是相同的或不同的，并且接头(L)可以是相同的或不同的。在一些相关实施方案中，可用于各种杀昆虫和/或杀线虫蛋白的TP、编码这些杀昆虫和/或杀线虫蛋白的多核苷酸和DNA构建体，以及含有这些杀昆虫和/或杀线虫蛋白的转基因植物或植物细胞包括与具有SEQ ID NO:5、SEQID NO:6和SEQ ID NO:1761、SEQ ID NO:1762、SEQ ID NO:1767、SEQ ID NO:1771-SEQ IDNO:1773所示的氨基酸序列的肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性或序列同源性的肽，及其变体。
(2).内质网络信号肽(ERSP)
在各种实施方案中，二元可切割连接肽和/或三元可切割连接肽可以与一种或多种另外的组分连接或融合或偶联(即，框内连接，并且在本文中可互换使用)。在一些实施方案中，二元可切割连接肽和/或三元可切割连接肽连接至本文进一步描述的内质网信号肽(ERSP)。在各种实施方案中，说明性二元可切割连接肽和/或三元可切割连接肽的N末端连接至ERSP的C末端。
如本文所用，ERSP是指在分泌的和膜结合的蛋白的氨基末端的氨基酸残基的短连续段。信号肽使蛋白靶向分泌途径，并且一旦在内质网膜中易位，就从新生链切下来。信号肽由三个区域组成：氨基末端极性区域(N区域)(其中经常观察到带正电的氨基酸残基)、7至8个氨基酸残基的中央疏水区域(H区域)和包括切割位点的羧基末端区域(C区域)。信号肽从成熟蛋白或多肽的切割发生在该切割位点。示例性ERSP的长度在3至100个氨基酸之间，或长度在5至50个氨基酸之间，或长度在20至30个氨基酸之间。ERSP是所谓的信号肽，因为它指导蛋白的运输。信号肽也可以称为靶向信号、信号序列、转运肽或定位信号。用于ER运输的信号肽的长度通常为15至30个氨基酸残基，并且具有由带正电的氨基末端区域和极性但不带电的羧基末端区域侧接的疏水残基的核心组成的三部分组织结构。(Zimmermann等人,“Protein translocation across the ER membrane”,Biochimica et BiohysicaActa,2011,1808:912-924)。
许多ERSP是已知的。许多植物ERSP是已知的。在各种实施方案中，说明性ERSP包括来源于植物ERSP的ERSP。在一些实施方案中，说明性ERSP还包括非植物ERSP，该非植物ERSP可以通过本文所述的程序操作。然而，许多植物ERSP是熟知的，并且某些示例性植物来源的ERSP可用于本发明。如本文所用，“植物ERSP”包括来自植物来源的天然存在的ERSP。它们不包括已经转染到植物或植物细胞中并且在植物中表达的非植物来源的ERSP。在一个示例性实施方案中，植物ERSP包括大麦α-淀粉酶信号肽(BAAS)，例如来源于植物大麦(Hordeumvulgare)，并且具有如下氨基酸序列：MANKHLSLSLFLVLLGLSASLASG(SEQ ID NO:4)。
在其他实施方案中，示例性ERSP可以包括酵母α-交配因子前原肽信号前导序列，该酵母α-交配因子前原肽信号前导序列由19个氨基酸的信号(前)序列，然后是67个残基的(原)序列(含有三个共有N-连接糖基化位点和二元Kex2内肽酶加工位点)组成。在一些实施方案中，说明性ERSP可以包括成熟酵母α-交配因子。在这些实施方案中，示例性酵母α-交配因子前原肽信号前导序列和成熟酵母α-交配因子可以存在于巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)酵母菌株中。
植物ERSP(它选自已知表达并且释放至植物的质外体空间中的蛋白的基因组序列)和几个实例包括：大麦α-淀粉酶信号肽、胡萝卜伸展蛋白、烟草PR1。以下参考文献提供了进一步描述，并且这些参考文献通过引用整体并入本文。De Loose,M.等人“Theextensin signal peptide allows secretion of a heterologous protein fromprotoplasts”Gene,99(1991)95-100。De Loose,M.等人描述了来自皱叶烟草(Nicotianaplumbaginifolia)的伸展蛋白编码基因的结构分析，该伸展蛋白编码基因的序列含有用于将蛋白易位至内质网的典型信号肽。Chen,M.H.等人“Signal peptide-dependenttargeting of a rice alpha-amylase and cargo proteins to plastids andextracellular compartments of plant cells”Plant Physiology,2004年7月；135(3):1367-77。2004年7月2日在线发表。Chen,M.H.等人通过分析转基因烟草中含有和不含信号肽的α-淀粉酶的表达来研究了α-淀粉酶在植物细胞中的亚细胞定位。这些参考文献和其他参考文献教导和公开了可用于本文所述的方法、程序和肽、蛋白和核苷酸复合物和构建体的信号肽。
在一些实施方案中，ERSP可以是大麦α-淀粉酶信号肽、或烟草伸展蛋白信号肽、或经修饰的烟草伸展蛋白信号肽、或Juniperus ashei或J.ashei的Jun a 3信号肽、或马铃薯蛋白酶抑制剂(II)(pinII)的信号肽。可操作以从植物和其他真核细胞分离ERSP序列的PCR引物是本领域已知的并且是可商购获得的。
在相关实施方案中，与ERSP偶联的二元可切割连接肽和/或三元可切割连接肽连接至毒性肽(TP)的N末端(ERSP-TP)。
(3).毒性肽(TP)
本发明的TP包括分别在被昆虫或线虫摄取、接触昆虫或线虫或注入昆虫或线虫中时具有杀昆虫和/或杀线虫活性的任何多肽或蛋白。在各种实施方案中，作为氨基酸的聚合物(即，蛋白物质)的若干类别的TP可以用作或合成为相同TP物类的单个单元或多聚体或者一种转基因表达的蛋白中包含的TP物类的混合物，其中多种TP中的每种侧接如上所述的一种或两种可切割二元肽或三元肽。在各种实施方案中，可用于本文所述的杀昆虫和/或杀线虫蛋白的示例性TP类别可以包括：CRIP TP、ICK TP、非-ICK TP、海葵肽、TMOF肽和Bt蛋白。在各种实施方案中，本公开的杀昆虫和/或杀线虫蛋白是非天然的人造构建体，该构建体包含至少一个二元可切割接头肽或三元可切割接头肽和至少一个TP。本公开的杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以化学合成、重组制备，并且在一些实施方案中，从多核苷酸合成为杀昆虫和/或杀线虫蛋白，该多核苷酸被插入酵母细胞、植物、植物组织中，或者在适当条件下在植物、植物组织或植物种子中表达。在一些实施方案中，本公开的杀昆虫和/或杀线虫蛋白包括ERSP。在相关实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白包括ERSP、两种或更多种二元可切割接头肽或三元可切割接头肽以及定位为与二元可切割接头肽或三元可切割接头肽相邻的一种或多种TP。可以合成包含二元可切割接头肽和/或三元可切割接头肽和TP亚基的其他多聚体和聚合物，并且在本文中对它们进一步描述。在相关实施方案中，包含二元可切割接头肽或三元可切割接头肽和TP亚基的多聚体和聚合物还可以包含位于杀昆虫和/或杀线虫蛋白的N末端的ERSP，并且还可以包含稳定化结构域(STA)。在一些实施方案中，STA还可以包括TP，例如ICK TP。(参见例如图3A和图5、图6A和图6C)。
如本文所用，“构建体”包括由各种多肽单元(例如，ERSP、二元可切割接头肽或三元可切割接头肽、TP和STA)组成的多肽或蛋白，这些亚基中的每个框内融合并且可操作以合成为单一蛋白。这些构建体可以以缩写形式书写，二元可切割接头肽或三元可切割接头肽或“接头”称为L，毒性蛋白称为TP，内质网信号肽称为ERSP，稳定化结构域称为STA。在各种实施方案中，本发明的杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以包含可以为相同的或可以为不同的TP。另外，在一些实施方案中，本发明的杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以包含可以为相同的或不同的二元可切割接头肽或三元可切割接头肽。在各种实施方案中，本发明的杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以具有与相同类型的接头融合的相同类型的TP，如本文公开和所示的杀昆虫和/或杀线虫蛋白的各种实例中所述，并且如各种构建体、杀昆虫和/或杀线虫蛋白和编码本发明的所有上述杀昆虫和/或杀线虫蛋白的多核苷酸所表示。在一些实施方案中，在其中DNA构建体或多核苷酸含有具有单个TP的开放阅读框的情况下，除了所有其他描述的TP之外，TP还可以包括Bt TP，限制条件是如果DNA构建体或多核苷酸含有包含两种或更多种TP的开放阅读框，所述两种或更多种TP不能是Bt TP。
示例性TP类别包括富含半胱氨酸的杀昆虫蛋白(CRIPS)。CRIPS具有4个、6个或8个半胱氨酸和2个、3个或4个二硫键。这类TP的一个实例称为抑制剂半胱氨酸结(ICK)基序蛋白。ICK基序TP是一类具有至少六个半胱氨酸残基的蛋白，这些半胱氨酸残基形成特定的ICK三级结构。ICK基序TP中的半胱氨酸残基的共价交联形成二硫桥，从而产生三级结构，三级结构使蛋白对蛋白酶，有时对极端物理条件(pH、温度、紫外线等)产生相对耐受性，并且赋予针对离子通道(可能是昆虫特有的)的活性。无脊椎动物和脊椎动物的毒液中的许多ICK基序TP已经进化，这些无脊椎动物和脊椎动物使用ICK基序TP作为毒素来固定化或杀死它们的捕食者或猎物。此类杀昆虫肽通常来源于蝎子、蜘蛛，有时还来源于蛇。在自然界中，毒性肽可以通过注射来被导向昆虫的肠道或内脏器官。就本发明的TP而言，TP的递送通常通过昆虫消耗植物组织中表达的杀昆虫和/或杀线虫蛋白来进行。在消耗来自食物的毒素时，例如以转基因植物为食的昆虫，ICK基序TP可以具有抑制生长、损害运动或甚至杀死昆虫的能力。
其他人已经展示ICK基序TP在植物中表达时会失去毒性。除非ICK基序TP表达为正确折叠的蛋白，否则它不能成功保护植物或作物免受昆虫损害。在一些情况下，植物表达的肽需要通过昆虫内的切割来活化或在植物中的表达过程中活化。植物表达的来自蜘蛛和蝎子的抑制性半胱氨酸结(ICK)基序蛋白已有描述(Khan等人,Transgenic Res.,2006,15:349-357；Hernández-Campuzano等人,Toxicon.2009年1月；53(1):122-8)。“ICK基序TP”或“抑制剂胱氨酸结基序蛋白”是具有16至60个氨基酸的肽，其中至少6个半段半胱氨酸核心氨基酸具有三个二硫桥，其中3个二硫桥是共价键，并且在六个半段胱氨酸残基中，共价二硫键在从N末端氨基酸开始的六个核心半段胱氨酸氨基酸的第一个和第四个、第二个和第五个、和第三个和第六个半段胱氨酸之间。ICK基序TP还包含β-发夹二级结构，该β-发夹二级结构通常由位于基序的第四个和第六个核心半段半胱氨酸之间的残基组成，发夹通过由基序的三个二硫键提供的结构交联来稳定。值得注意的是，另外的半胱氨酸/半胱氨酸或半段胱氨酸氨基酸可以存在于抑制剂半胱氨酸结基序中。
ICK基序在从许多物种的毒液中分离的肽中是常见的。无脊椎动物物种包括蜘蛛、蝎子、芋螺、海葵等，其他实例也很多，甚至已知蛇毒液也具有含有ICK基序的肽。ICK TP的实例包括来自澳大利亚蓝山漏斗网蜘蛛的ACTX肽(例如，U-ACTX肽、ω-ACTX肽κ-ACTX肽)。本文所述的其他ICK蛋白可用于合成本文所述的杀昆虫和/或杀线虫蛋白。
具有ICK基序的TP的实例可见于以下参考文献中。Lew,M.J.等人“Structure-Function Relationships ofω-Conotoxin GVIA”Journal of Biological Chemistry,第272卷,第18期,5月2日发行,第12014-12023页,1997年综述了N-型钙通道阻滞剂ω-芋螺毒素。Quintero-Hernandez,V.等人“Scorpion and Spider Venom Peptides:Gene Cloningand Peptide Expression”Toxicon,58,第644-663页,2011年综述了来自不同蜘蛛和蝎子物种的许多节肢动物毒性肽的概述。在Takahashi,H.等人“Solution structure ofhanatoxin1,a gating modifier of voltage-dependent K+channels:common surfacefeatures of gating modifier toxins”Journal of Molecular Biology,第297卷,第3期,2000年3月31日，第771-780页中使用NMR波谱法将哈那毒素1(Hanatoxin1)的三维结构鉴定为抑制剂半胱氨酸结基序。Zhu,S.等人“Evolutionary origin of inhibitorcystine knot peptides”FASEB J.,2003年9月17日,(12):1765-7,2003年7月3日在线发表公布了编码蝎子毒液ICK毒素肽奥皮考辛1(Opicalcine1)的cDNA的分离和鉴定。Dauplais,M.等人“On the convergent evolution of animal toxins”Journal of BiologicalChemistry.1997年2月14日；272(7):4302-9公开了BgK(来自海葵(疣状海葵(Bunodosomagranulifera))的K+通道阻断毒素)的序列特异性分配和二级结构鉴定。Escoubas,P.等人“Structure and pharmacology of spider venom neurotoxins”Biochimie,第82卷,第9–10期，2000年9月10日，第893-907页发布了蜘蛛毒液的组成和药理学的综述，该文献重点阐述了多肽毒素结构、作用方式和分子进化，示出了半胱氨酸桥、半胱氨酸结形成和“打结型”折叠。Galvez,A.等人“Purification and characterization of a unique,potent,peptidyl probe for the high conductance calcium-activated potassium channelfrom venom of the scorpion Buthus tamulus”Journal of Biological Chemistry,1990年7月5日；265(19):11083-90公开了纯化的肽，即伊比(利亚)蝎毒素(iberiotoxin)(来自蝎子(以印度红蝎(Buthus tamulus))毒液的Ca2+活化的K+通道的抑制剂)。Gimenez-Gallego,G.等人“Purification,sequence,and model structure of charybdotoxin,apotent selective inhibitor of calcium-activated potassium channels”Proc.Natl.Acad.Sci.,1988年5月；85(10):3329–3333公开了纯化的肽，即卡律布德蝎毒素(charybdotoxin)(来自蝎子(以色列金蝎(Leiurus quinquestriatus))毒液的Ca2+活化的K+通道的抑制剂)。根据这些和其他出版物，本领域技术人员应能够容易地鉴定具有我们所描述的ICK基序TP的蛋白和肽(ICK基序TP与“ICK基序”、“ICK基序蛋白”和“抑制剂胱氨酸结基序”可互换使用)。
在一些实例中，ICK基序TP的长度为26至60个氨基酸。一些ICK基序TP的长度在16至48个氨基酸之间。一些ICK基序TP的长度在26至48个氨基酸之间。一些ICK基序TP的长度在30至44个氨基酸之间。具有天然杀昆虫活性的ICK基序TP是优选的，但是具有其他类型活性(诸如耐盐性和抗冻性)的ICK基序TP是本领域技术人员已知的并且是本文要求保护的。ICK基序TP的实例包括ACTX肽和基因，并且包括称为Magi6的所有肽及其编码基因。
出于提供实例目的而非旨在以任何方式进行限制而公开的ICK基序TP和肽的具体实例是如上所述的TP及其同源物和肽变体。在一些实施方案中，一些优选的TP是来自澳大利亚漏斗网蜘蛛(Australian Funnel-web spider)毒液的那些特定的肽和核苷酸。在各种实施方案中，用于制备杀昆虫和/或杀线虫蛋白、组合物、杀昆虫和/或杀线虫蛋白或编码其的多核苷酸的示例性TP可以包括选自以下的一种或多种TP：U-ACTX TP、κ-ACTX TP和ω-ACTX TP和编码其的多核苷酸。以下文献在美国通过引用整体并入，是本领域技术人员已知的，并且已经全部公开。它们公开了许多ICK基序TP，这些ICK基序TP的全肽序列、ICK基序TP的全核苷酸序列被特别公开并且通过引用并入，此外全部公开内容(包括它们的所有序列表)通过引用并入。参见以下参考文献(全部通过引用整体并入本文)：2008年4月8日授权的US 7,354,993 B2，特别是来自7,354,993 B2的以SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:39列出的肽和核苷酸序列，和命名为U-ACTX多肽的那些肽和核苷酸序列，和可以形成2至4个链内二硫桥的这些和其他毒素及其变体，以及出现于7,354,993 B2的第4至9栏和图2中的肽。其他具体序列可见于2008年10月8日公布和授予EP专利1 812464 B1中，参见公报2008/41，特别是序列表中列出的肽和核苷酸序列，和可以形成2个至4个链内二硫桥的其他毒素的那些序列，和以1-39列出的那些序列，和名称为U-ACTX多肽的序列及其变体，以及出现于EP专利1 812464 B1的第0023段至第0055段，和出现于图1中的肽，所有具体列举的专利参考文献的公开内容通过引用整体并入本文。
本文描述和通过引用并入的杀昆虫和/或杀线虫蛋白和肽的实例是TP，这些TP包括：阿特蛛属(Atrax)或Hadronyche属(包括属种蓝山漏斗网蜘蛛(Hadronyche versuta))蜘蛛、或蓝山漏斗网蜘蛛、悉尼漏斗网蜘蛛、树状漏斗网蜘蛛、Atrax infensus中存在的、从它们分离的，或从它们衍生的肽及其变体，包括称为U-ACTX多肽的TP，U-ACTX多肽包括：U-ACTX-Hv1a、U+2-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1b、或突变体或变体，特别是任何这些类型的肽，特别是小于约200个氨基酸但大于约10个氨基酸的那些肽，以及特别是小于约150个氨基酸但大于约20个氨基酸的肽，特别是小于约100个氨基酸但大于约25个氨基酸的肽，特别是小于约65个氨基酸但大于约25个氨基酸的肽，特别是小于约55个氨基酸但大于约25个氨基酸的肽，特别是约37个或39个或约36个至42个氨基酸的肽，特别是小于约55个氨基酸但大于约25个氨基酸的肽，特别是小于约45个氨基酸但大于约35个氨基酸的肽，特别是小于约115个氨基酸但大于约75个氨基酸的肽，特别是小于约105个氨基酸但大于约85个氨基酸的肽，特别是小于约100个氨基酸但大于约90个氨基酸的肽，包括可以形成2个、3个和或4个或更多个链内二硫桥的此处提及的任何长度的肽毒素，包括破坏钙通道电流的毒素，包括破坏钾通道电流的毒素，特别是破坏昆虫钙通道或其U的毒素，特别是任何这些类型的毒素或其变体，以及具有口服或局部杀昆虫和/或杀线虫活性的本文所述的毒素中的任何类型的任何组合，这些TP可以通过本文所述的方法变得特殊。
当通过本发明描述的方法、程序或方法处理时，来自澳大利亚漏斗网蜘蛛阿特蛛属和Hadronyche属的U肽是特别合适的并且效果良好。本文提供了所测试的此类合适的肽的实例以及数据。另外特别地已知以下物种通过本发明公开的方法携带适合于植物以杀昆虫和/或杀线虫蛋白表达的毒性肽。以下物种具体名称为：树状漏斗网蜘蛛、Atraxinfensus、悉尼漏斗网蜘蛛、Hadronyche infensa、蓝山漏斗网蜘蛛。来源于上文列出的任何属和种和/或属种并且可以与U肽同源的任何TP均适合于植物以根据本发明的杀昆虫和杀线虫蛋白表达。适用于本文所述的各种杀昆虫和/或杀线虫多肽和蛋白的其他TP包括：κACTX TP、ω-ACTX TP和U-ACTX TP。
在一些实施方案中，可以将特定的TP克隆至合适的表达载体中，可以将这些表达载体与本文公开的ERSP和可切割连接基团一起制成适合于转化植物或其部分的杀昆虫和/或杀线虫蛋白，或者杀昆虫和/或杀昆虫蛋白可以与适当的赋形剂一起配制，以施用于植物或植物部分的表面。在一些实施方案中，合适的TP可以包括ICK基序TP：QYCVP VDQPC SLNTQPCCDD ATCTQ ERNEN GHTVYYCRA(SEQ ID NO:6)，该ICK基序TP的名称为“U-ACTX-Hv1a”，在位置3-18、10-23、17-37具有二硫桥。分子量为4426.84道尔顿。在另一个实施方案中，可以将特定的TP克隆至合适的表达载体中，可以将这些表达载体与本文公开的ERSP和可切割连接基团一起制成适合于转化植物或其部分的杀昆虫和/或杀线虫蛋白，或者杀昆虫和/或杀昆虫蛋白可以与适当的赋形剂一起配制，以施用于植物或植物部分的表面。在一些实施方案中，合适的TP可以包括ICK基序TP：GSQYC VPVDQ PCSLN TQPCC DDATC TQERN ENGHTVYYCR A(SEQ ID NO:5)，该ICK基序TP的名称为“U+2-ACTX-Hv1a”，在位置5-20、12-25、19-39具有二硫桥。分子量为4564.85道尔顿。可用于各种杀昆虫和/或杀线虫蛋白、编码这些杀昆虫和/或杀线虫蛋白的多核苷酸和DNA构建体、以及含有这些杀昆虫和/或杀线虫蛋白的转基因植物或植物细胞的其他ICK TP包括与具有SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:1593和SEQ IDNO:1761-SEQ ID NO:1775所示的氨基酸序列的肽或蛋白具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少100％序列同一性或序列同源性的肽或蛋白。在相关实施方案中，可用于各种杀昆虫和/或杀线虫蛋白、编码这些杀昆虫和/或杀线虫蛋白的多核苷酸和DNA构建体，以及含有这些杀昆虫和/或杀线虫蛋白的转基因植物或植物细胞的ICK TP包括与具有SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:1761、SEQ ID NO:1762、SEQ ID NO:1767、SEQ ID NO:1771-SEQ ID NO:1773所示的氨基酸序列的肽或蛋白具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性或序列同源性的肽或蛋白，及其变体。
(3A).Bt TP
在一些实施方案中，说明性TP还可以包括从苏云金芽孢杆菌(Bt)表达或分离的那些TP。这种普遍存在的革兰氏阳性产孢子细菌由于其能够在孢子形成期间合成伴孢晶体包含体而提供了有价值的资源。这些包括称为δ-内毒素的杀昆虫蛋白在内的晶体已经被广泛用作针对商业上感兴趣的昆虫有害生物的生物杀昆虫剂。Bt晶体毒素包括Cry蛋白(晶体毒素)和Cyt蛋白(溶细胞毒素)。Cry毒素是重要的毒力因子，允许细菌在死亡或弱化的昆虫幼虫中发育。最大的Cry毒素组有三个不同的结构域；所谓的三结构域(3D)Cry毒素提供了本综述的主要焦点。Cyt毒素除了对包括蚊子在内的各种昆虫具有体内活性之外，还具有体外溶细胞活性[5]。对某些双翅目有活性的Cyt毒素协同增强Cry蛋白对蚊子的毒性并延迟对后者的Bt蛋白或Bt肽(本文统称为Bt TP)的抗性的表达，这些Cyt毒素是以植物结合保护剂和叶面喷施剂这两种形式用于作物保护的有效杀昆虫剂。Bt蛋白的商业制剂广泛用于控制幼虫期的昆虫。Bt Cry蛋白和Cyt蛋白需要在昆虫中肠内溶解，以产生对于Cyt来说典型地为约130kDa、70kDa或27kDa的原毒素。这些原毒素进而在C末端和/或N末端处被中肠蛋白酶以蛋白水解方式切割，从而产生激活的核心毒素。Cry原毒素以蛋白水解方式激活，以产生成熟的活性毒素。将Cry原毒素加工成其活性形式对于获得毒素活性是必需的。加工由昆虫蛋白酶介导，这些昆虫蛋白酶在特定的序列处切割原毒素多肽。然后毒素穿过围食膜基质并与中肠细胞顶膜中的受体结合，其中受体结合是毒素特异性的重要决定因素。毒素插入上皮膜形成离子通道或离子孔，导致细胞裂解、中肠上皮组织损伤和幼虫死亡。在鳞翅目和双翅目中的易感染种之中，主要的肠道蛋白酶是丝氨酸类型，而在鞘翅目中，主要的蛋白酶是半胱氨酸和天冬氨酸蛋白酶，但其中一些使用组织蛋白酶G丝氨酸蛋白酶。由于激活是实现毒性的决定性步骤，所以已经提出，昆虫蛋白酶的类型和/或丰度对于促进毒素特异性很重要。在一些情况下，某些昆虫缺乏从Bt TP的激活或“活性”部分切割非活性部分的能力。本发明提供了具有定位在Bt TP的非活性部分与激活或“活性”部分之间的二元或三元可切割接头的某些杀昆虫蛋白和/或杀线虫蛋白(参见图3B)，以及包括杀昆虫蛋白和/或杀线虫蛋白和上文提到的编码Bt TP和杀昆虫蛋白和/或杀线虫蛋白的多核苷酸这些形式的多个拷贝(例如，Bt TP的2至10个拷贝，这些拷贝具有定位在Bt TP的非活性部分与活性部分之间的介入可切割接头)的杀昆虫蛋白和/或杀线虫蛋白。在一些实施方案中，在DNA构建体或多核苷酸包含具有单个TP的开放阅读框的情况下，除了所有其他描述的TP之外，该TP还可以包括Bt TP，限制条件是如果该DNA构建体或多核苷酸包含含有两种或更多种TP的开放阅读框，那么这两种或更多种TP不能是两种或更多种Bt TP。
Bt TP的具体实例可以包括以下的肽：其中Bt蛋白为Cry或Cyt蛋白，并且/或者Bt蛋白选自Cry1、Cry3、TIC851、CryET70、Cry22、TIC901、TIC201、TIC407、TIC417、二元杀昆虫蛋白CryET80和CryET76、二元杀昆虫蛋白TIC100和TIC101、杀昆虫蛋白ET29或ET37与杀昆虫蛋白TIC810或TIC812的组合，以及二元杀昆虫蛋白PS149B1。Bt TP可以选自Cry蛋白、Cry1A蛋白或Cry1F蛋白，或Cry1F-Cry1A组合蛋白，或者该Bt TP包含与美国专利号7,304,206的SEQ ID NO:10、12、14、26、28或34具有至少90％同一性的氨基酸序列。我们描述了其中Bt TP是Dipel的转基因植物，还描述了其中Bt TP是Thuricide的转基因植物。本文所述的杀昆虫和/或杀线虫多肽和蛋白的另一个实例是Cry Bt TP，称为Cry51。该Bt TP在美国专利号8,609,936 B2(2013年12月17日公布，其公开内容通过引用整体并入本文)中公开。该Cry Bt TP对草盲蝽属(lygus)的摄食植物的昆虫具有杀昆虫作用。例示的Cry Bt TP可以在本发明中用作例如杀昆虫蛋白和/或杀线虫蛋白中的TP，或者包含所述杀昆虫和/或杀线虫多肽和蛋白的植物或其植物部分(例如植物细胞、植物组织或植物种子)中的TP。
在各种实施方案中，提供了对应于编码Bt TP的核酸序列的分离的核酸分子。此外，涵盖了对应于这些多核苷酸的氨基酸序列。特别地，本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码2009年4月18日公布的US 2009/0099081中所示的氨基酸序列的核苷酸序列，该专利通过引用整体并入本文，并且所有序列由具体地通过引用并入的编号标识。如US 2009/0099081中所公开的各种杀昆虫多肽和编码这些杀昆虫多肽的多核苷酸(例如，SEQ ID NO:9、11、13、15或18，或以SEQ ID NO:1、2、4、6、7、8、10、12、14、16或17示出的核苷酸序列)，以及它们的变体和片段全部通过引用整体并入本文。还涵盖了与本发明的核苷酸序列互补或与本发明的序列杂交的核苷酸序列。
编码本发明的蛋白的核苷酸序列包括2009年4月18日公开的US 2009/0099081中示出的序列，包括US 2009/0099081中的SEQ ID NO:1、2、4、6、7、8、10、12、14、16或17，以及这些序列的变体、片段和互补核苷酸序列，这些核苷酸序列通过引用整体并入本文。术语“互补序列”是指与给定的核苷酸序列充分互补，使得它可以与给定的核苷酸序列杂交从而形成稳定双链体的核苷酸序列。可以用作组合物、转基因分子(多核苷酸和蛋白)的TP的说明性Bt蛋白氨基酸序列在本公开中如SEQ ID NO:33-533所示列出。
作为这些Bt蛋白编码核苷酸序列的片段的核酸分子也涵盖在本发明中(例如，2009年4月18日公布的US 2009/0099081，该专利通过引用整体并入本文，并且来自US2009/0099081的所有序列由具体地通过引用并入的编号标识。SEQ ID NO:8是SEQ ID NO:4和12的片段；SEQ ID NO:4是如US 2009/0099081中所公开的SEQ ID NO:2的片段)。所谓“片段”，是指编码Bt蛋白的核苷酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码Bt蛋白的生物活性部分，或者该片段可以是可以使用下文所公开的方法用作杂交探针或PCR引物的片段。作为Bt蛋白核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1860、1870、1880、1885个连续的核苷酸，或者最多达本文所公开的全长Bt蛋白编码核苷酸序列中存在的核苷酸数(例如，2009年4月18日公布的US 2009/0099081中的1890个核苷酸，这里作为US 2009/0099081的序列表中的以下序列提供：SEQID NO:1和2；SEQ ID NO:4的1806个核苷酸；SEQ ID NO:6、7、8和16的1743个核苷酸；SEQ IDNO:10的1809个核苷酸；以及SEQ ID NO:12和14的1752个核苷酸)。所谓“连续的”核苷酸，是指彼此紧邻的核苷酸残基。本发明的核苷酸序列的片段将编码保留Bt蛋白的生物活性并因此保留杀有害生物活性的蛋白片段。所谓“保留活性”，是指该片段将具有Bt蛋白的杀有害生物活性的至少约30％、至少约50％，至少约70％、80％、90％、95％或更高。用于测量杀有害生物活性的方法是本领域熟知的。参见例如Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83:2480-2485；Andrews等人，(1988)Biochem.J.252:199-206；Marrone等人，(1985)J.ofEconomic Entomology78:290-293；和美国专利号5,743,477，所有这些文献都通过引用整体并入本文，并且所有序列由具体地通过引用并入的编号标识。
编码本发明的蛋白的生物活性部分的Bt蛋白编码核苷酸序列的片段将编码至少约15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、560、570、575、580、585、590、595、600个连续的氨基酸，或者最多达本发明的全长Bt蛋白中存在的氨基酸总数(例如，SEQ ID NO:41的580个氨基酸、SEQ ID NO:43的602个氨基酸，以及SEQ ID NO:45和47的583个氨基酸)。
本发明的优选Bt蛋白由与2009年4月18日公布的US2009/0099081的核苷酸序列(序列1、2、4、6、7、8、10、12、14、16或17)充分相同的核苷酸序列编码，该专利通过引用整体并入本文，并且所有序列由具体地通过引用并入的编号标识。所谓“充分相同”，是指使用本文所述的比对程序之一，利用标准参数与参考序列相比，具有至少约60％或65％的序列同一性、约70％或75％的序列同一性、约80％或85％的序列同一性，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性的氨基酸或核苷酸序列。本领域的技术人员将认识到，通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等，可以适当调节这些值以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白的对应同一性。
本发明还涵盖变体核酸分子(例如，2009年4月18日公布的US2009/0099081，该专利通过引用整体并入本文，并且所有序列由具体地通过引用并入的编号标识，序列2是序列1的变体；序列7和8是序列6的变体；序列10是序列4和12的变体；并且序列14是序列12的变体)。编码Bt蛋白的核苷酸序列的“变体”包括编码本文所公开的Bt蛋白、但由于遗传密码的简并性而保守地不同的那些序列，以及如上文所讨论的充分相同的那些序列。
可以使用熟知的分子生物学技术(诸如聚合酶链反应(PCR)和如下文所概述的杂交技术)来鉴定天然存在的等位基因变体。变体核苷酸序列还包括以合成方式衍生的核苷酸序列，这些核苷酸序列已经例如通过使用定点诱变法产生，但如下文所讨论的那样仍编码本发明中所公开的Bt蛋白。本发明所涵盖的变体蛋白具有生物活性，也就是说它们继续拥有天然蛋白的所需生物活性，即保留杀昆虫和/或杀线虫活性(也称为杀有害生物活性)。所谓“保留活性”，是指该变体将具有天然蛋白的杀有害生物活性的至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％。用于测量杀有害生物活性的方法是本领域熟知的。参见例如Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83:2480-2485；Andrews等人，(1988)Biochem.J.252:199-206；Marrone等人，(1985)J.of Economic Entomology 78:290-293；和美国专利号5,743,477，所有这些文献都通过引用整体并入本文，并且所有序列由具体地通过引用并入的编号标识。
在本发明的一个方面，可以用于设计和合成含有可切割连接分子(即，二元肽和三元肽)的杀昆虫蛋白和/或杀线虫蛋白的一些TP可以包括一种或多种合成的axmi-004Bt蛋白序列(诸如2009年4月18日公布的US 2009/0099081中所公开的那些，该专利通过引用整体并入本文，并且所有序列由具体地通过引用并入的编号标识)(序列1)和synaxmi-004B(序列2)。这些合成序列相对于U.S.7,355,099中所列举的axmi-004序列(序列3)具有改变的DNA序列(该专利通过引用整体并入本文，并且所有序列由具体地通过引用并入的编号标识)，并且编码最初的AXMI-004蛋白。同样地，指定了synaxmi-004B-2M(序列4)，该序列编码最初在美国专利申请序列号10/782,020中鉴定的axmi-004交替起始位点(本文中称为axmi-004B-2M，并以序列5示出)。
另外的TP包括尽可能指定的axmi-004B-3M(2009年4月18日公布的US 2009/0099081，该专利通过引用整体并入本文，并且所有序列由具体地通过引用并入的编号标识，序列16)，并且编码以序列9示出的AXMI-004B-3M氨基酸序列。还指定了编码AXMI-004B-3M蛋白的合成序列。这些合成核苷酸序列被指定为synaxmi-004B-3M、synaxmi-004C-3M和synaxmi-004D-3M，并且分别以序列6、7和8示出。在本发明的另一个方面，设计编码AXMI-004B-3M蛋白的核苷酸序列的经修饰形式，使得向编码的蛋白中添加另外的N末端残基。这些序列被指定为synaxmi-004B-3M-alt1(2009年4月18日公布的US 2009/0099081，序列10)、synaxmi-004B-3M-alt2(序列12)、synaxmi-004B-3M-alt3(序列14)和synaxmi-004B-3M-alt4(序列17)。这些编码的蛋白被指定为AXMI-004B-3M-ALT1(序列11)、AXMI-004B-3M-ALT2(序列13)、AXMI-004B-3M-ALT3(序列15)和AXMI-004B-3M-ALT4(序列18)。
其他Bt蛋白和基因描述可以在下文中找到。下面提到的每一份专利公开都附有关于该公开所涉及的Bt毒素的注释，据此通过引用整体并入本文。这些文献也已经公布，它们及其序列都不受专利权限制。
Bt基因的另外的实例、适合用作编码本发明的TP和TP的多核苷酸的蛋白，以及描述它们的专利文献可以在下表1、2和3中找到。表1、表2、表3中的专利文献(特别是美国专利和美国申请)据此通过引用整体并入本文。
(e)表1.Bt毒素
(f)表2.杂交杀昆虫晶体蛋白和专利
(g)表3.与其他杂交杀昆虫晶体蛋白有关的专利
本公开的序列表包括示例性Bt TP氨基酸序列SEQ ID NO:33-533。这些氨基酸序列包括Bt蛋白Cry和Cyt蛋白序列的实例。实例有很多，并且本领域技术人员将知道各种Bt序列的适合取代本公开中的那些序列的许多其他实例。
(3B).TMOF TP
在一些实施方案中，TP的另一种来源可以包括：胰蛋白酶调节抑制因子(TMOF)肽。TMOF肽必须以各种方式递送至其生理作用位点，并且TMOF肽已经被鉴定为具有巨大潜力的潜在杀幼虫剂，参见D.Borovsky,Journal of Experimental Biology 206,3869-3875，该文献的公开内容通过引用整体并入本文。
在各种实施方案中，说明性TP包括ICK基序TP，其可以是ICK基序长度介于16个与60个氨基酸之间、且具有以适当的顺序产生共价交联二硫键的至少6个半胱氨酸残基的任何多肽或蛋白。
在各种实施方案中，说明性TP包括CRIP TP，例如ICK TP，例如衍生自或源自澳大利亚漏斗网蜘蛛或蓝山漏斗网蜘蛛、悉尼漏斗网蜘蛛、树状漏斗网蜘蛛、Atrax infensus的ICK TP，包括称为U-ACTX多肽、U-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1b或者突变体或变体，ω-ACTX多肽和变体以及κ-ACTX多肽和变体的TP。在一些实施方案中，说明性CRIP TP包括非ICK CRIP TP，例如，衍生自或源自具有非ICK CRIP的动物(诸如海葵、海胆和海蛞蝓)的非ICK CRIP TP，及其变体。在一个示例性实施方案中，非ICK CRIP TP可以是衍生自名为Anemonia viridi的海葵的TP，任选地包括名为Av2和Av3的TP，尤其是与包括在本申请的序列表中列出的这些肽的Av2和Av3类似的TP、或者其突变体或变体。
在其他实施方案中，可以在本文所述的重组构建体和杀昆虫和/或杀线虫蛋白和植物中使用的其他TP可以包括ACTX蛋白和/或TMOF蛋白中的一种或多种。TMOF基序”或“TMOF蛋白”包括胰蛋白酶调节抑制因子肽。提供了TMOF TP的许多实例和变体。本申请中的SEQ ID NO:708是示例性野生型TMOF序列。其他非限制性变体以SEQ ID NO:709-721提供。其他实例是已知的，或者可以由本领域技术人员在本领域已知的知识的指导下创建。
(3C).可切割的Bt TP
在一些实施方案中，代表性Bt毒性蛋白(TP)可以包括如本文所提供的可切割BtTP，其包含插入该Bt TP的活性部分与非活性部分之间的二元肽或三元肽。在一个实例中，将二元肽或三元肽插入肽的可切割的前非活性(pro inactive)部分与肽的成熟活性部分之间。在另一个实例中，Bt TP包括与本发明的二元肽或三元肽框内融合的稳定化结构域，该二元肽或三元肽与该Bt TP的活性部分框内融合。在另一个实例中，Bt TP经常被写为“cry”、“cyt”或“VIP”蛋白，由cry、cyt和vip基因编码。Bt TP更通常归属于由cry基因编码的杀昆虫晶体蛋白。Bt TP是PFIP(成孔杀昆虫蛋白)的实例。在各种实施方案中，杀昆虫蛋白和/或杀线虫蛋白可以包括含有两种或更多种二元肽或三元肽和至少一种与一种或多种二元肽和/或三元肽框内融合的Bt TP的蛋白，在一些实施方案中，在被摄取并暴露于肠道环境或血淋巴环境时可用于提供杀昆虫组合物和/或杀线虫组合物的杀昆虫蛋白和/或杀线虫蛋白可以含有如上所述的Bt TP和/或可切割的Bt TP，并且在本文中进一步例示，含有插入该TP的可切割的前体(非活性)部分与该TP的成熟(活性)部分之间的二元肽或三元肽。
例如，二元肽或三元肽在插入Bt TP的可切割的原非活性部分与该Bt TP的成熟活性部分之间时，提供了可切割的Bt TP，该可切割的Bt TP在被摄入并与昆虫或线虫的肠道蛋白酶接触时，导致可切割的Bt TP发生切割(参见图3B)。在一些实施方案中，含有可切割和/或不可切割的Bt TP的杀昆虫蛋白和/或杀线虫蛋白可以由DNA构建体编码，该DNA构建体在转化到植物或其部分中时，或者在直接施用于植物表面，当该杀昆虫蛋白和/或杀线虫蛋白被摄取并暴露于目标昆虫和/或线虫的肠道环境和/或血淋巴环境时，提供杀昆虫活性和/或杀线虫活性。
本文描述过且通过引用并入的经鉴定TP是上文提到的TP氨基酸序列的变体或突变肽和蛋白，具体地讲，具有如以SEQ ID NO:5-1593和1761-1775示出的氨基酸序列的肽和蛋白、与这些序列或本文中提及的序列具有同源性或序列同一性的肽和蛋白，它们还被鉴定并声称适合于根据本文所述的方法变得特殊，包括与本文所公开的任何序列或通过引用并入本文的任何序列具有以下同一性百分比中的至少任一种的所有同源序列：与上文提到的专利中鉴定的任何和所有序列，以及本文鉴定的任何其他序列(包括本申请的序列表中的每一个序列)具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更大的氨基酸序列同一性或100％的氨基酸序列同一性。术语“同源”或“同源性”在本文中与数字(诸如50％或更大的数)一起使用时，是指两种肽之间的同一性百分比或相似性百分比。同源或同源性在没有与数字百分比一起使用时，是指在进化或发育方面密切相关的两个肽序列，因为它们有共同的物理和功能方面的性质，例如局部毒性和相似的大小(即，同源物在本文明确提及的或通过本文的上述参考文献鉴定的肽的长100％的长度或短50％的长度内)。本发明的TP还包括本文具体公开或描述的TP的变体，术语“变体”意味着具有杀昆虫活性和/或杀线虫活性，且在一个或多个(例如，几个)位置处包含改变(即，取代、插入和/或缺失)的多肽或蛋白。取代意味着用不同的氨基酸替换占据某个位置的氨基酸；缺失意味着除去占据某个位置的氨基酸；插入则意味着在占据某个位置的氨基酸附近和紧随其后添加氨基酸。本发明的TP变体具有SEQ ID NO:5-1593和1761-1775的多肽和蛋白以及本文所公开的其他特异性鉴定的TP的杀昆虫活性和/或杀线虫活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％。本发明的变体具有SEQ ID NO:5-1593和1761-1775的任一种多肽或蛋白的杀昆虫活性和/或杀线虫活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％。
TP还可以包括由具有一个或多个点突变(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个点突变或更多个点突变)的多核苷酸编码的变体TP肽和蛋白，使得当突变的TP编码多核苷酸被转录和/或翻译时，表达的突变TP肽或蛋白保留至少为由对应的非突变TP多核苷酸编码的肽或蛋白的杀昆虫活性和/或杀线虫活性的90％、或80％、或70％、或60％、或50％的杀昆虫活性和/或杀线虫活性。本发明的TP还可以包括以下TP肽和蛋白：它们与以SEQ ID NO:5-1593和1761-1775所公开的任何TP具有至少80％、或至少85％、或至少90％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％的氨基酸序列同一性，并且仍保留以SEQ IDNO:5-1593和1761-1775示出的对应TP的杀昆虫活性和/或杀线虫活性的至少95％、或90％、或80％、或70％、或60％或50％。
这些变体TP还可以在一个或多个(例如，几个)其他位置处包含一个或多个另外的取代。氨基酸改变可以具有次要的性质，即，不会显著影响肽或蛋白的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；通常为1至30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，诸如氨基末端甲硫氨酸残基；或通过改变净电荷或另一种功能而有利于纯化的小延伸，诸如多组氨酸序列、抗原表位或结合结构域。保守取代的实例在以下各组之内：碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且例如由H.Neurath和R.L.Hill在The Proteins,AcademicPress,New York(1979)中描述。常见的取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。替代性地，氨基酸改变具有改变多肽的物理化学特性的性质。例如，氨基酸改变可以改善多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。
可以根据本领域已知的程序，诸如定点诱变法或丙氨酸扫描诱变法(Cunningham和Wells，1989,Science 244:1081-1085)来鉴定肽或蛋白中的必需氨基酸。在后一技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，然后测试所得的突变分子的杀昆虫或杀线虫活性，以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。另见Hilton等人，1996,J.Biol.Chem.271:4699-4708。杀昆虫和/或杀线虫肽或蛋白的活性位点或其他生物相互作用也可以通过结构的物理分析来测定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见例如de Vos等人，1992,Science 255:306-312；Smith等人，1992,J.Mol.Biol.224:899-904；Wlodaver等人，1992,FEBS Lett.309:59-64。必需氨基酸的身份也可以根据与如本文所公开和/或如以SEQ IDNO:5-1593和1761-1775所示的相关TP肽或蛋白的比对来推断。
本发明的TP还可以包括具有与本文所述的任何TP的N末端或C末端或这两个末端框内融合的1至6个氨基酸延伸的TP肽和蛋白，例如具有如以SEQ ID NO:5-1593和1761-1775所示的氨基酸序列的TP。可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备变体，这些诱变程序诸如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。
定点诱变是其中在编码亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，几个)突变的技术。定点诱变可以通过PCR在体外完成，涉及使用含有所需突变的寡核苷酸引物。定点诱变也可以通过盒式诱变在体外进行，涉及在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的一个位点处通过限制酶切割，随后将含有突变的寡核苷酸连接在该多核苷酸中。通常，消化质粒和寡核苷酸的限制酶是相同的，从而允许质粒和插入物的粘性末端彼此连接。参见例如Scherer和Davis，1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA76:4949-4955；以及Barton等人，1990,Nucleic Acids Res.18:7349-4966。定点诱变也可以通过本领域已知的方法在体内完成。参见例如美国专利申请公布号2004/0171154；Storici等人，2001,NatureBiotechnol.19:773-776；Kren等人，1998,Nat.Med.4:285-290；以及Calissano和Macino，1996,Fungal Genet.Newslett.43:15-16。可以在本发明中使用任何定点诱变程序。存在许多可获得的可以用来制备本发明的变体TP的商业试剂盒。
合成基因构建使得有必要在体外合成设计的多核苷酸分子，以编码感兴趣的多肽。可以利用许多技术，诸如由Tian等人(2004,Nature432:1050-1054)描述的基于多重微芯片的技术和其中在光可编程的微流控芯片上合成和装配寡核苷酸的相似技术，来进行基因合成。
可以作出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用已知的诱变方法、重组方法和/或改组方法进行测试，随后进行有关筛选程序，诸如以下文献所公开的那些：Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science 241:53-57；Bowie和Sauer，1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等人，1991,Biochemistry30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire等人，1986,Gene 46:145；Ner等人，1988,DNA7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量自动化筛选方法组合，以检测由宿主细胞表达的克隆的诱变多肽的活性(Ness等人，1999,Nature Biotechnology 17:893-896)。使用本领域的标准方法可以从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子并且对其快速测序。这些方法允许快速确定肽或蛋白中的各个氨基酸残基的重要性。
通过将合成基因构建和/或定点诱变和/或随机诱变和/或改组的多个方面组合而完成半合成基因构建。半合成构建的代表是利用合成的多核苷酸片段的方法，结合PCR技术。基因的限定区域因此可以从头合成，而其他区域则可以使用位点特异性诱变引物来扩增，同时另外的其他区域可以接受易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
出于描述杀昆虫和/或杀线虫肽、蛋白，编码此类杀昆虫和/或杀线虫肽和蛋白的多核苷酸、编码此类杀昆虫和/或杀线虫肽和蛋白的DNA构建体、含有此类杀昆虫和/或杀线虫肽和蛋白的转基因植物或其部分、用于控制有害生物感染或侵染的方法，以及用于增加结合了此类杀昆虫和/或杀线虫肽和蛋白的作物的产量的方法的目的，本发明的TP还涵盖(包括在其定义之内)在TP或毒性肽的定义之内的如上所述的变体和突变体和突变的TP。在各种实施方案中，本文具体描述的TP包括具有如以SEQ ID NO:5-1593和1761-1775所示的氨基酸序列的任何TP、本文所述的任何专利或非专利参考文献中列举的任何TP，以及它们的任何变体或突变体或突变的肽或蛋白。在各种实施方案中，本文所述的杀昆虫蛋白和/或杀线虫蛋白包括与具有如以SEQ ID NO:5、6和1761、1762、1767、1771-1773所示的氨基酸序列的肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％的序列同一性或序列同源性的TP，及其变体。
(4).重组杀昆虫和杀线虫肽DNA组合物
在各种实施方案中，本发明提供杀昆虫和杀线虫多肽、蛋白和DNA构建体，以及编码此类多肽和蛋白的多核苷酸。编码此类杀昆虫和杀线虫多肽和蛋白的DNA构建体可以包含含有编码一个长融合蛋白的开放阅读框(ORF)的单个多核苷酸，或者可以包含当在载体中提供时，使编码如本文所述的此类杀昆虫多肽和杀线虫多肽的mRNA能够转录的多个多核苷酸。该DNA构建体还可以含有必需的调控元件，诸如启动子、终止序列、增强子和抗生素抗性基因，这些调控元件允许该DNA构建体或其部分在宿主细胞中有效地转录和翻译。在一些实施方案中，本发明的DNA构建体可以包括与可操作启动子(例如，同源或异源启动子)可操作地连接的多核苷酸，其中该多核苷酸编码：包含二元肽或三元肽的杀昆虫肽和/或杀线虫肽，该二元肽或三元肽包含至少4个氨基酸且最多16个氨基酸并且由2或3个不同的区域组成，其中该二元肽具有2个不同的区域而该三元肽具有3个不同的区域。该二元肽或三元肽可被动物肠道蛋白酶和昆虫和/或线虫肠道蛋白酶二者切割。在各种实施方案中，该二元肽或三元肽可操作地融合(即，框内融合)至如本文所述的内质网信号肽(ERSP)的C末端，并且可操作地融合至TP(例如CRIP TP)的N末端。(参见例如图4至图6C)。在上述内容的相关实施方案中，可用于制备重组杀昆虫和/或杀线虫蛋白的TP可以包括一种或多种ICK TP，例如选自从属于阿特蛛亚科的澳大利亚漏斗网蜘蛛中分离的杀昆虫ICK肽的“ACTX”或“ACTX肽”家族的TP，例如一种或多种选自ω-ACTX TP、κ-ACTX TP和U-ACTX TP的TP，例如U+2-ACTX-Hv1a、U-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1b，或与具有如SEQ ID NO:5、6和1761、1762、1767、1771-1773所示的氨基酸序列的肽或蛋白具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性或序列同源性的TP，及其变体(其中TP如果多于一个则可以是相同或不同的)，并且每种杀昆虫和/或杀线虫蛋白还包含一种或多种三元肽(上文称为L)，所述三元肽可包含选自IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF的二元肽的氨基酸序列，该氨基酸序列在二元肽的N末端、C末端或两个末端与选自GS、WN、WQ、MA、MV、AM、LH、MN、ES、WQ或DT或由其组成的Z区或间隔区序列框内融合。
(4A).编码杀昆虫和杀线虫转基因蛋白的DNA构建体
在各种实施方案中，编码杀昆虫和/或杀线虫蛋白的说明性DNA构建体可以针对将向其中引入该DNA构建体的物种进行密码子优化。例如，在该DNA构建体将被转化到植物中的情况下，可以对该DNA构建体进行密码子优化以在植物细胞中表达和复制。
在一些实施方案中，该DNA构建体包含编码含有以下氨基酸序列的二元肽的多核苷酸：X1-X2-Y1-Y2、X1-X2-X3-Y1-Y2、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2、X1-X2-Y1-Y2-Y3、X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3、X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4、X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4、Y1-Y2-X1-X2、Y1-Y2-X1-X2-X3、Y1-Y2-X1-X2-X3-X4、Y1-Y2-Y3-X1-X2、Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3、Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4，其中每个Xn和每个Yn均为氨基酸，并且其中每个Xn和每个Yn均为氨基酸，并且其中X1选自：(全部为单字母氨基酸格式)A、D、E、G、I、K、L、N、P、Q、R和V；X2选自A、F、G、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V和Y；X3选自A、D、E、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V和Y；X4选自：R、H、K、D、E、S、T、N、Q、G、A、I、L、M、F、W、Y和V。在一些实施方案中，Y1选自：(全部为单字母氨基酸格式)A、D、E、F、G、I、L、N、Q、S、T、V和Y；Y2选自F、G、I、L和Y；以及Y3选自A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V和Y；并且Y4选自：R、H、K、D、E、S、T、N、Q、G、A、I、L、M、F、W、Y和V。
在一些实施方案中，说明性DNA构建体可编码包含一种或多种说明性二元肽(XY或YX)的杀昆虫和/或杀线虫蛋白。在一些实施方案中，示例性DNA构建体可编码包含具有以下氨基酸序列的可切割二元肽的杀昆虫和/或杀线虫蛋白：AFVRLF(SEQ ID NO:1594)、AKLFV(SEQ ID NO:1595)、ALFALK(SEQ ID NO:1596)、ALFLK(SEQ ID NO:1597)、ALFLR(SEQ IDNO:1598)、ALFR(SEQ ID NO:1599)、ALFRLR(SEQ ID NO:1600)、ALKALF(SEQ ID NO:1601)、ALKFF(SEQ ID NO:1602)、ALKFLV(SEQ ID NO:1603)、ALKIFV(SEQ ID NO:1604)、ALKLFV(SEQ ID NO:1605)、FFADIK(SEQ ID NO:1606)、FFALK(SEQ ID NO:1607)、FFLK(SEQ ID NO:1608)、FFLR(SEQ ID NO:1609)、FFRLR(SEQ ID NO:1610)、FGYRIK(SEQ ID NO:1611)、FLRLF(SEQ ID NO:1612)、FYARR(SEQ ID NO:1613)、GGLRKK(SEQ ID NO:1614)、IFVALK(SEQ IDNO:1615)、IFVLK(SEQ ID NO:1616)、IFVLR(SEQ ID NO:1617)、IFVR(SEQ ID NO:1618)、IFVRLR(SEQ ID NO:1619)、ILFNIK(SEQ ID NO:1620)、LFAAPF(SEQ ID NO:1621)、FVALK(SEQ ID NO:1622)、LFVLK(SEQ ID NO:1623)、LFVLR(SEQ ID NO:1624)、LFVR(SEQ ID NO:1625)、LFVRLR(SEQ ID NO:1626)、LFVRVFL(SEQ ID NO:1627)、LGER(SEQ ID NO:1628)、LKALF(SEQ ID NO:1629)、LKFF(SEQ ID NO:1630)、LKIFV(SEQ ID NO:1631)、LKLFV(SEQ IDNO:1632)、LRALF(SEQ ID NO:1633)、LRFF(SEQ ID NO:1634)、LRIFV(SEQ ID NO:1635)、LRLFV(SEQ ID NO:1636)、RALF(SEQ ID NO:1637)、RIFV(SEQ ID NO:1638)、RLFV(SEQ IDNO:1639)、RLRALF(SEQ ID NO:1640)、RLRFF(SEQ ID NO:1641)、RLRIFV(SEQ ID NO:1642)、RLRLFV(SEQ ID NO:1643)、RRKAFV(SEQ ID NO:1644)、RRKLIF(SEQ ID NO:1645)、RRRFFA(SEQ ID NO:1646)、VFGRKG(SEQ ID NO:1647)和YFVRK(SEQ ID NO:1648)。
在各种实施方案中，示例性DNA构建体可编码包含具有以下氨基酸序列构建体的可切割三元肽的杀昆虫和/或杀线虫蛋白：Z1-X1-X2-Y1-Y2,Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2,Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2,Z1-X1-X2-Y1-Y2-Y3,Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3,Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3,Z1-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4,Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4,Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4,Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2,Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2,Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2,Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Y3,Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3,Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3,Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4,Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4,Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4,Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2,Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Y3,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3,Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2-Y3,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4,X1-X2-Y1-Y2-Z1,X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1,X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1,X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1,X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1,X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1,X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1,X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1,X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1,Z1-X1-X2-Y1-Y2-Z1,Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1,Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1,Z1-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1,Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1,Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1,Z1-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1,Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1,Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1,Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Z1,Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1,Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1,Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1,Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1,Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1,Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1,Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1,Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1,Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Z1,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1,Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1,Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1,X1-X2-Y1-Y2-Z1-Z2,X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1-Z2,X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1-Z2,X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2,X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2,X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2,X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2,X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2,X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2,Z1-X1-X2-Y1-Y2-Z1-Z2,Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1-Z2,Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1-Z2,Z1-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2,Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2,Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2,Z1-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2,Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2,Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2,Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Z1-Z2,Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1-Z2,Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1-Z2,Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2,Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2,Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2,Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2,Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2,Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2,X1-X2-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3,X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3,X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3,X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3,X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3,X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3,X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3,X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3,X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3,Z1-X1-X2-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3,Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3,Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3,Z1-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3,Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3,Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3,Z1-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3,Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3,Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X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Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-Z1,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1,Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2,Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2,Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2,Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2,Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2,Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2,Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2,Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2,Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2,Z1-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2,Z1-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2,Z1-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2,Z1-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2,Z1-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2,Z1-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2,Z1-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2,Z1-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2,Z1-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2,Z1-Z2-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2,Z1-Z2-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2,Z1-Z2-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2,Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2-Z3,Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3,Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3,Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2-Z3,Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3,Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3,Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2-Z3,Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3,Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3,Z1-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2-Z3,Z1-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3,Z1-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3,Z1-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2-Z3,Z1-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3,Z1-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3,Z1-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2-Z3,Z1-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3,Z1-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3,Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4,Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4,Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4,Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4,Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4,Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4,Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4,Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4,Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4,Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4，其中X1选自：(全部为单字母氨基酸格式)A、D、E、G、I、K、L、N、P、Q、R和V；X2选自A、F、G、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V和Y；X3选自A、D、E、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V和Y；X4选自：R、H、K、D、E、S、T、N、Q、G、A、I、L、M、F、W、Y和V。在一些实施方案中，Y1选自：(全部为单字母氨基酸格式)A、D、E、F、G、I、L、N、Q、S、T、V和Y；Y2选自F、G、I、L和Y；以及Y3选自A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V和Y；并且Y4选自：R、H、K、D、E、S、T、N、Q、G、A、I、L、M、F、W、Y和V。
在相关实施方案中，上文描述了包含X区和Y区的可切割二元接头肽(L)，并且上文描述的可以与X区和/或Y区框内融合(融合到X区或Y区的N末端序列，或X区或Y区的C末端序列)的示例性Z区(1-4个氨基酸序列，例如，2个氨基酸序列)形成三元可切割连接肽。说明性Z或间隔区氨基酸序列可包括：AA、AF、AM、AN、AQ、AV、AW、AY、DA、DD、DE、DF、DG、DI、DL、DP、DS、DT、DV、DW、DY、EA、ED、EE、EF、EG、EI、EL、EP、ES、ET、EV、EW、EY、FA、FD、FE、FF、FI、FK、FL、FM、FN、FQ、FR、FS、FT、FV、FW、FY、GA、GD、GE、GF、GI、GL、GM、GN、GQ、GS、GV、GW、GY、HA、HD、HE、HF、HH、HI、HK、HL、HN、HP、HQ、HR、HS、HT、HV、HY、IA、ID、IE、IG、IH、II、IK、IL、IM、IN、IP、IQ、IR、IS、IT、IV、IW、KA、KD、KE、KF、KI、KL、KN、KQ、KV、KY、LA、LD、LE、LG、LH、LI、LK、LL、LM、LN、LP、LQ、LR、LS、LT、LV、LW、MA、MF、MG、MI、MK、ML、MM、MN、MQ、MR、MS、MT、MV、MY、NA、ND、NE、NF、NI、NL、NM、NN、NQ、NS、NT、NV、NY、QA、QD、QE、QF、QI、QL、QM、QN、QQ、QS、QT、QV、QY、RA、RD、RE、RF、RI、RL、RN、RQ、RV、RY、SA、SF、SG、SK、SN、SP、SQ、SR、SS、ST、SV、SW、SY、TA、TF、TG、TK、TN、TP、TQ、TR、TS、TT、TV、TW、TY、VA、VF、VM、VN、VQ、VV、VW、VY、WA、WF、WI、WK、WL、WN、WP、WQ、WR、WS、WT、WV、WW、WY、YA、YD、YE、YF、YI、YK、YL、YM、YN、YQ、YR、YS、YT、YV、YW或YY。在示例性实施方案中，本发明的单个三元肽可以包括与上文公开的说明性二元肽的N末端和/或C末端框内融合的两个氨基酸的序列，其中所述两个氨基酸的序列是AM、LH、MN、ES、WQ或DT。
在示例性实施方案中，本发明的单个三元肽可以包括与上文公开的说明性二元肽的N末端和/或C末端框内融合的两个氨基酸的序列，其中所述两个氨基酸的序列是GS、WN、WQ、MA或MV。
在一些实施方案中，三元肽的间隔区部分(Z区)包含可以与二元肽的N末端或C末端或它们两者框内融合的氨基酸序列GS。
在各种实施方案中，本发明的用于杀昆虫和/或杀线虫多肽和蛋白、编码杀昆虫和/或杀线虫多肽和蛋白且并入转基因植物或其部分中的DNA构建体和多核苷酸的示例性二元肽可包括选自以下或由其组成的一种或多种可切割三元肽：选自IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF的在N末端、C末端或两个末端与选自GS、WN、WQ、MA、MV、AM、LH、MN、ES、WQ或DT或由其组成的Z区或间隔区序列框内融合的二元肽。
在一些实施方案中，示例性DNA构建体可编码包含具有一种或多种以下说明性氨基酸序列的可切割三元肽(ZXY或XYZ)的杀昆虫和/或杀线虫蛋白：AFVRLFGS(SEQ ID NO:1649)、AKLFVGS(SEQ ID NO:1650)、ALFALKGS(SEQ ID NO:1651)、ALFLKGS(SEQ ID NO:1652)、ALFLRGS(SEQ ID NO:1653)、ALFRGS(SEQ ID NO:1654)、ALFRLRGS(SEQ ID NO:1655)、ALKALFGS(SEQ ID NO:1656)、ALKFFGS(SEQ ID NO:1657)、ALKFLVGS(SEQ ID NO:1658)、ALKIFVGS(SEQ ID NO:1659)、ALKLFVGS(SEQ ID NO:1660)、FFADIKGS(SEQ ID NO:1661)、FFALKGS(SEQ ID NO:1662)、FFLKGS(SEQ ID NO:1663)、FFLRGS(SEQ ID NO:1664)、FFRLRGS(SEQ ID NO:1665)、FGYRIKGS(SEQ ID NO:1666)、FLRLFGS(SEQ ID NO:1667)、FYARRGS(SEQ ID NO:1668)、GGLRKKGS(SEQ ID NO:1669)、IFVALKGS(SEQ ID NO:1670)、IFVLKGS(SEQ ID NO:1671)、IFVLRGS(SEQ ID NO:1672)、IFVRGS(SEQ ID NO:1673)、IFVRLRGS(SEQ ID NO:1674)、ILFNIKGS(SEQ ID NO:1675)、LFAAPFGS(SEQ ID NO:1676)、LFVALKGS(SEQ ID NO:1677)、LFVLKGS(SEQ ID NO:1678)、LFVLRGS(SEQ ID NO:1679)、LFVRGS(SEQ ID NO:1680)、LFVRLRGS(SEQ ID NO:1681)、LFVRVFLGS(SEQ ID NO:1682)、LGERGS(SEQ ID NO:1683)、LKALFGS(SEQ ID NO:1684)、LKFFGS(SEQ ID NO:1685)、LKIFVGS(SEQ ID NO:1686)、LKLFVGS(SEQ ID NO:1687)、LRALFGS(SEQ ID NO:1688)、LRFFGS(SEQID NO:1689)、LRIFVGS(SEQ ID NO:1690)、LRLFVGS(SEQ ID NO:1691)、RALFGS(SEQ ID NO:1692)、RIFVGS(SEQ ID NO:1693)、RLFVGS(SEQ ID NO:1694)、RLRALFGS(SEQ ID NO:1695)、RLRFFGS(SEQ ID NO:1696)、RLRIFVGS(SEQ ID NO:1697)、RLRLFVGS(SEQ ID NO:1698)、RRKAFVGS(SEQ ID NO:1699)、RRKLIFGS(SEQ ID NO:1700)、RRRFFAGS(SEQ ID NO:1701)、VFGRKGGS(SEQ ID NO:1702)、YFVRKGS(SEQ ID NO:1703)、GSAFVRLF(SEQ ID NO:1704)、GSAKLFV(SEQ ID NO:1705)、GSALFALK(SEQ ID NO:1706)、GSALFLK(SEQ ID NO:1707)、GSALFLR(SEQ ID NO:1708)、GSALFR(SEQ ID NO:1709)、GSALFRLR(SEQ ID NO:1710)、GSALKALF(SEQ ID NO:1711)、GSALKFF(SEQ ID NO:1712)、GSALKFLV(SEQ ID NO:1713)、GSALKIFV(SEQ ID NO:1714)、GSALKLFV(SEQ ID NO:1715)、GSFFADIK(SEQ ID NO:1716)、GSFFALK(SEQ ID NO:1717)、GSFFLK(SEQ ID NO:1718)、GSFFLR(SEQ ID NO:1719)、GSFFRLR(SEQ ID NO:1720)、GSFGYRIK(SEQ ID NO:1721)、GSFLRLF(SEQ ID NO:1722)、GSFYARR(SEQID NO:1723)、GSGGLRKK(SEQ ID NO:1724)、GSIFVALK(SEQ ID NO:1725)、GSIFVLK(SEQ IDNO:1726)、GSIFVLR(SEQ ID NO:1727)、GSIFVR(SEQ ID NO:1728)、GSIFVRLR(SEQ ID NO:1729)、GSILFNIK(SEQ ID NO:1730)、GSLFAAPF(SEQ ID NO:1731)、GSLFVALK(SEQ ID NO:1732)、GSLFVLK(SEQ ID NO:1733)、GSLFVLR(SEQ ID NO:1734)、GSLFVR(SEQ ID NO:1735)、GSLFVRLR(SEQ ID NO:1736)、GSLFVRVFL(SEQ ID NO:1737)、GSLGER(SEQ ID NO:1738)、GSLKALF(SEQ ID NO:1739)、GSLKFF(SEQ ID NO:1740)、GSLKIFV(SEQ ID NO:1741)、GSLKLFV(SEQ ID NO:1742)、GSLRALF(SEQ ID NO:1743)、GSLRFF(SEQ ID NO:1744)、GSLRIFV(SEQ ID NO:1745)、GSLRLFV(SEQ ID NO:1746)、GSRALF(SEQ ID NO:1747)、GSRIFV(SEQ ID NO:1748)、GSRLFV(SEQ ID NO:1749)、GSRLRALF(SEQ ID NO:1750)、GSRLRFF(SEQID NO:1751)、GSRLRIFV(SEQ ID NO:1752)、GSRLRLFV(SEQ ID NO:1753)、GSRRKAFV(SEQ IDNO:1754)、GSRRKLIF(SEQ ID NO:1755)、GSRRRFFA(SEQ ID NO:1756)、GSVFGRKG(SEQ IDNO:1757)和GSYFVRK(SEQ ID NO:1758)。
在各种实施方案中，DNA构建体包含编码三元肽的多核苷酸，该三元肽具有二元肽的氨基酸序列，且在二元肽的N末端添加间隔区，和/或在二元肽的C末端添加间隔区，其中间隔区是一个氨基酸或包含1-4个氨基酸，优选两个氨基酸的肽，例如GS、WN、WQ、MA或MV。下面提供了用作间隔区的其他特定间隔区实例和最佳氨基酸。
在一些实施方案中，编码杀昆虫和/或杀线虫蛋白的示例性DNA构建体包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸相组合或单独地编码包含以下氨基酸序列的一种或多种二元肽：在N末端和/或C末端与选自以下氨基酸序列的一个或多个间隔区序列框内融合的IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF：GS、WN、WQ、MA、MV、AM、LH、MN、ES、WQ和DT。在各种实施方案中，用于转化或转染真核细胞(例如，酵母细胞或植物细胞)的示例性DNA构建体包含编码杀昆虫和/或杀线虫蛋白的多核苷酸，所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含选自以下或由其组成的一种或多种可切割三元肽：选自IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF的二元肽，其在N末端、C末端或两个末端与选自GS、WN、WQ、MA、MV、AM、LH、MN、ES、WQ或DT或由其组成的Z区或间隔区序列以及如本文所述的一种或多种TP(例如，如本公开全文中举例说明的CRIP TP，例如ICK TP或非ICK CRIP TP、TMOF TP、或Bt TP)框内融合。在相关实施方案中，上述一种或多种二元肽或三元肽(称为接头L)与TP，以及任选地与ERSP和/或任选地STA框内融合，例如(从N末端至C末端)：(L-TP)n-L、或(L-TP-L)n、(ERSP)-(STA)-(L-TP)n、或(ERSP)-(STA)-(L-TP)n-(L)、或(ERSP)-(STA)-(TP-L)n、或(ERSP)-(STA)-(L)-(TP-L)n、或(STA)-(L-TP)n、或(STA)-(L-TP)n-(L)、或(STA)-(TP-L)n、或(STA)-(L)-(TP-L)n，其中n为1至200，例如，1-100、或1-20、或1-10。在与上述内容相关的实施方案中，由一种或多种多核苷酸编码的杀昆虫和/或杀线虫蛋白可含有相同或不同的TP，和相同或不同的二元肽和/或三元肽。在上述内容的相关实施方案中，三元肽(上文称为L)可包含选自IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF的二元肽的氨基酸序列，该氨基酸序列在二元肽的N末端、C末端或两个末端与选自GS、WN、WQ、MA、MV、AM、LH、MN、ES、WQ或DT或由其组成的Z区或间隔区序列框内融合。
在上述内容的相关实施方案中，可用于制备编码(1)杀昆虫和/或杀线虫蛋白的DNA构建体或多核苷酸的TP可以包括一种或多种ICK TP，例如选自从属于阿特蛛亚科的澳大利亚漏斗网蜘蛛中分离的杀昆虫ICK肽的“ACTX”或“ACTX肽”家族的TP，例如一种或多种选自ω-ACTX TP、κ-ACTX TP和U-ACTX TP的TP，例如U+2-ACTX-Hv1a、U-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1b，或与具有如SEQ ID NO:5、6和1761、1762、1767、1771-1773所示的氨基酸序列的肽或蛋白具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性或序列同源性的TP，及其变体(其中TP如果多于一个则可以是相同或不同的)，并且每种杀昆虫和/或杀线虫蛋白还包含一种或多种三元肽(上文称为L)，所述三元肽可包含选自IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF的二元肽的氨基酸序列，该氨基酸序列在二元肽的N末端、C末端或两个末端与选自GS、WN、WQ、MA、MV、AM、LH、MN、ES、WQ或DT或由其组成的Z区或间隔区序列框内融合，其中TP如果多于一个则可以是相同或不同的，并且每种杀昆虫和/或杀线虫蛋白还包含一种或多种三元肽(上文称为L)，所述三元肽可包含选自IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF的二元肽的氨基酸序列，该氨基酸序列在二元肽的N末端、C末端或两个末端与选自GS、WN、WQ、MA、MV、AM、LH、MN、ES、WQ或DT或由其组成的Z区或间隔区序列框内融合。
在各种实施方案中，本发明的DNA构建体编码杀昆虫和/或杀线虫TP，其含有一种或多种如本文所述的二元肽和/或三元肽。所述一种或多种二元肽和/或三元肽是可切割连接单元，它们既可以在动物肠道环境中被切割(例如在人肠道中通过人消化蛋白酶的作用而切割)，也可以在昆虫或线虫的肠道环境中被切割。本文提供了可在动物肠道(例如人肠道、昆虫肠道或线虫肠道)中获得的各种蛋白酶。在一些实施方案中，本发明的DNA构建体编码杀昆虫和/或杀线虫TP，其含有一种或多种可在鳞翅目或鞘翅目昆虫的种的肠道中可切割的二元肽和/或三元肽。编码可在鳞翅目或鞘翅目昆虫的种的肠道中被切割的二元肽和/或三元肽的相同DNA构建体也可以在人肠道中通过人消化蛋白酶的作用而被切割。
如本文所公开，还提供了包含多核苷酸的DNA构建体，所述多核苷酸编码与TP框内融合的可切割二元肽和/或三元肽，当存在合适的肠道蛋白酶时，所述TP从编码的二元肽和/或三元肽中释放，并在预期的目标昆虫或线虫中提供杀昆虫和/或杀线虫活性。在各种实施方案中，TP可以是一类通常称为CRIP肽、ICK TP、非ICK TP(例如海葵肽)、TMOF肽和Bt蛋白的TP。在一些实施方案中，TP是选自成孔杀昆虫蛋白(PFIP)和富半胱氨酸杀昆虫蛋白(CRIP)的蛋白。本发明的组合物和方法可以使用任何基于氨基酸聚合物的TP，包括在2013年3月8日提交的国际PCT申请序列号PCT/US2013/030042中描述的那些，该公开的内容通过引用整体并入本文。
本发明还涉及包含编码杀昆虫和/或杀线虫蛋白的多核苷酸的核酸构建体，所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含至少一个可切割接头和一个TP。在一些实施方案中，核酸构建体可以是DNA核酸构建体或RNA核酸构建体。在本发明的一些实施方案中，核酸构建体可包含可操作地连接到一个或多个控制序列的至少一个编码序列，所述至少一个编码序列可操作以编码至少一种杀昆虫和/或杀线虫蛋白，所述一个或多个控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中在与控制序列相容的条件下表达。术语“可操作地连接”是指这样的构型，其中将控制序列置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置，使得控制序列指导编码序列的表达。
可以按多种方式操纵多核苷酸以提供杀昆虫和/或杀线虫蛋白的表达。在将多核苷酸插入载体之前对多核苷酸进行操纵可能是理想的或必需的，这取决于表达载体。利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
控制序列可以是或包括启动子，启动子是被宿主细胞识别以表达多核苷酸的多核苷酸。启动子含有介导杀昆虫和/或杀线虫蛋白表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变、截短和杂合启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
在酵母宿主中，有用的启动子从酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因获得。Romanos等人,1992,Yeast 8:423-488描述了酵母宿主细胞的其他有用启动子。
控制序列也可以是转录终止子，其被宿主细胞识别以终止转录。终止子序列与编码杀昆虫和/或杀线虫蛋白的多核苷酸的3'末端可操作地连接。可以使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。用于细菌宿主细胞的优选终止子得自克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶(amyL)和大肠埃希菌核糖体RNA(rrnB)的基因。酵母宿主细胞的优选终止子得自酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因。Romanos等人(1992，同上)描述了酵母宿主细胞的其他有用终止子。控制序列还可以是增加基因表达的位于启动子下游和基因编码序列上游的mRNA稳定子区域。
控制序列还可以包括前导序列，前导序列是mRNA的对宿主细胞的翻译非常重要的非翻译区。前导序列与编码杀昆虫和/或杀线虫蛋白的多核苷酸的5'末端可操作地连接。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。酵母宿主细胞的合适前导序列得自酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因。
控制序列还可以包括多聚腺苷酸化序列，多聚腺苷酸化序列是这样一种序列，它可操作地连接到杀昆虫和/或杀线虫蛋白编码序列的3'末端，并且当转录时，被宿主细胞识别为将聚腺苷残基添加到所转录的mRNA的信号。可以使用在宿主细胞中有功能的任何多聚腺苷酸化序列。酵母宿主细胞的有用多聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.Cellular Biol.15:5983-5990进行了描述。
还可能需要添加相对于宿主细胞的生长而调控杀昆虫和/或杀线虫蛋白表达的调控序列。调控系统的实例是那些导致基因表达响应于化学或物理刺激(包括存在调控化合物)而开启或关闭的系统。原核系统中的调控系统包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。调控序列的其他实例是允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码杀昆虫和/或杀线虫蛋白的多核苷酸将与调控序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及重组表达载体，其包含编码本发明的杀昆虫和/或杀线虫蛋白的多核苷酸、启动子以及转录和翻译终止信号。各种核苷酸和控制序列可以接合在一起以产生重组表达载体，所述重组表达载体可以包含一个或多个方便的限制性位点，以允许在此类位点处插入或取代编码杀昆虫和/或杀线虫蛋白的多核苷酸。可选地，可以通过将多核苷酸或包含多核苷酸的核酸构建体插入合适的表达载体中来表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列位于载体中，使得编码序列与适当的控制序列可操作地连接以进行表达。
重组表达载体可以是以下任何载体(例如，质粒或病毒)：其可以方便地进行重组DNA程序并且可以引起多核苷酸的表达。载体的选择将通常取决于载体与要引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性质粒或闭合的环状质粒。载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以包含任何确保自我复制的构件。可选地，载体可以是当被引入宿主细胞中时整合到基因组(例如植物基因组)中并与其整合到的染色体一起复制的载体。此外，可使用单个载体或质粒，或两个或更多个合起来含有要被引入宿主细胞基因组的总DNA的载体或质粒，或转座子。
载体优选地含有一个或多个选择性标记，所述一个或多个选择性标记允许容易地选择转化的、转染的、转导的或类似的细胞。选择性标记是这样一种基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养型等。细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)dal基因，或赋予抗生素抗性诸如氨苄西林、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性的标记。用于酵母宿主细胞的合适标记包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)以及它们的等价物。
载体优选地含有允许载体整合到宿主细胞基因组中或允许载体在细胞中独立于基因组而自主复制的元件。为了整合到宿主细胞基因组中，载体可以依赖编码杀昆虫和/或杀线虫蛋白的多核苷酸序列或载体的任何其他元件以通过同源或非同源重组整合到基因组中。可选地，载体可以含有另外的多核苷酸，用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组的染色体中的精确位置。为了提高在精确位置整合的可能性，整合元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对以及800至10,000个碱基对，这些核酸具有与相应的靶序列高度的序列同一性，以增强同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体还可以包含复制起点，从而使得载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制。复制起点可以是介导在细胞中起作用的自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”是指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。细菌复制起点的实例是允许在大肠埃希菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060和pAM.β.1的复制起点。用于酵母宿主细胞的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合以及ARS4和CEN6的组合。可以将多于一个本发明的多核苷酸的拷贝插入宿主细胞中以增加杀昆虫和/或杀线虫蛋白的产生。多核苷酸拷贝数的增加可以通过以下方式获得：将至少一个另外的序列拷贝整合到宿主细胞基因组中，或将可扩增的选择性标记基因与多核苷酸包含在一起，其中通过在适当的选择剂存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的扩增拷贝并因而包含多核苷酸的另外拷贝的细胞。用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域技术人员熟知的(参见例如Sambrook等人，1989，同上)。
(4B).融合到与构建体(TP-L)n框内融合的二元肽或三元肽的ERSP
在一些实施方案中，每种杀昆虫和/或杀线虫蛋白可包含融合到二元肽或三元肽的ERSP，所述二元肽或三元肽与包含(TP-L)n的构建体框内融合，其中TP是毒性蛋白，L是二元肽或三元肽，并且n是1至200范围内的整数。参见图4。在这些实施方案的一些中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白中的TP可以是相同或不同的。
本文描述了所有这些类别的TP，并且所有这些类别均可以并入本文所述的DNA构建体中，其中至少一种TP与至少一种二元肽或三元肽框内编码，优选地两种或更多种TP在框内侧接至少一种或至少两种可切割二元肽或三元肽，例如：(ERSP)-(L)-TP-(L)-TP、(ERSP)-(L)-TP-(L)-TP-(L)、(L-TP)n-L、(L-TP-L)n、(ERSP)-(TP-L)n、(ERSP)-(L)-(TP-L)n、(ERSP)-(L-TP)n、(ERSP)-(L-TP)n-(L)、(ERSP)-(STA)-(L-TP)n、(ERSP)-(STA)-(L-TP)n-(L)、(ERSP)-(STA)-(TP-L)n、或(ERSP)-(STA)-(L)-(TP-L)n、或(STA)-(L-TP)n、或(STA)-(L-TP)n-(L)、或(STA)-(TP-L)n、或(STA)-(L)-(TP-L)n，其中(L)是二元肽或三元肽，并且每个L可以是相同或不同的，TP是可以相同或不同的毒性肽，并且n是1至200，优选1至100，并且最优选1至10范围内的整数。参见图4和图5。
在一些实施方案中，本发明提供杀昆虫和/或杀线虫蛋白和DNA构建体，所述DNA构建体包含编码杀昆虫和/或杀线虫蛋白的多核苷酸，所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白可包含一种或多种二元肽和/或三元肽和一种或多种TP。二元肽和/或三元肽中的每一者可以是相同或不同的，并且每个TP可以是相同或不同的。在一些实施方案中，本发明提供杀昆虫和/或杀线虫蛋白和DNA构建体，所述DNA构建体包含编码杀昆虫和/或杀线虫蛋白的多核苷酸，所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白可包含两种或更多种二元肽和/或三元肽和两种或更多种TP。二元肽和/或三元肽中的每一者可以是相同或不同的，并且每个TP可以是相同或不同的。在一个说明性实施方案中，本发明提供了DNA构建体，其包含至少一个可操作地连接到可操作启动子(例如同源或异源启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有一种或多种TP和两种或更多种可切割二元肽或三元肽的杀昆虫和/或杀线虫蛋白。参见图2。
在另一个相关方面，本发明提供杀昆虫和/或杀线虫蛋白，其中所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含与二元肽或三元肽的N末端框内融合的ERSP，所述二元肽或三元肽与包含(TP-L)n的构建体框内融合，或者所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含与二元肽或三元肽的N末端融合的ERSP，所述二元肽或三元肽与包含(L-TP)n的构建体框内融合。
在本文所述的DNA构建体的相关实施方案中，至少一个TP与至少一个二元肽或三元肽框内编码，优选地两种或更多种TP在框内侧接至少一种或至少两种可切割二元肽或三元肽，上文描述了包含X区和Y区的可切割二元接头肽(L)，并且上文描述的可以与X区和/或Y区框内融合(融合到X区或Y区的N末端序列，或X区或Y区的C末端序列)的示例性Z区(1-4个氨基酸序列，例如，2个氨基酸序列)形成三元可切割连接肽。说明性Z或间隔区氨基酸序列可包括：AA、AF、AM、AN、AQ、AV、AW、AY、DA、DD、DE、DF、DG、DI、DL、DP、DS、DT、DV、DW、DY、EA、ED、EE、EF、EG、EI、EL、EP、ES、ET、EV、EW、EY、FA、FD、FE、FF、FI、FK、FL、FM、FN、FQ、FR、FS、FT、FV、FW、FY、GA、GD、GE、GF、GI、GL、GM、GN、GQ、GS、GV、GW、GY、HA、HD、HE、HF、HH、HI、HK、HL、HN、HP、HQ、HR、HS、HT、HV、HY、IA、ID、IE、IG、IH、II、IK、IL、IM、IN、IP、IQ、IR、IS、IT、IV、IW、KA、KD、KE、KF、KI、KL、KN、KQ、KV、KY、LA、LD、LE、LG、LH、LI、LK、LL、LM、LN、LP、LQ、LR、LS、LT、LV、LW、MA、MF、MG、MI、MK、ML、MM、MN、MQ、MR、MS、MT、MV、MY、NA、ND、NE、NF、NI、NL、NM、NN、NQ、NS、NT、NV、NY、QA、QD、QE、QF、QI、QL、QM、QN、QQ、QS、QT、QV、QY、RA、RD、RE、RF、RI、RL、RN、RQ、RV、RY、SA、SF、SG、SK、SN、SP、SQ、SR、SS、ST、SV、SW、SY、TA、TF、TG、TK、TN、TP、TQ、TR、TS、TT、TV、TW、TY、VA、VF、VM、VN、VQ、VV、VW、VY、WA、WF、WI、WK、WL、WN、WP、WQ、WR、WS、WT、WV、WW、WY、YA、YD、YE、YF、YI、YK、YL、YM、YN、YQ、YR、YS、YT、YV、YW或YY。在示例性实施方案中，本发明的单个三元肽可以包括与上文公开的说明性二元肽的N末端和/或C末端框内融合的两个氨基酸序列，其中所述两个氨基酸序列是AM、LH、MN、ES、WQ或DT。
在示例性实施方案中，本发明的单个三元肽可以包括与上文公开的说明性二元肽的N末端和/或C末端框内融合的两个氨基酸序列，其中所述两个氨基酸序列是GS、WN、WQ、MA或MV。
在一些实施方案中，三元肽的间隔区部分(Z区)包含可以与二元肽的N末端或C末端或它们两者框内融合的氨基酸序列GS。
在各种实施方案中，本发明的用于杀昆虫和/或杀线虫多肽和蛋白、编码杀昆虫和/或杀线虫多肽和蛋白且并入转基因植物或其部分中的DNA构建体和多核苷酸的示例性二元肽可包括选自以下或由其组成的一种或多种可切割三元肽：选自IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF的在N末端、C末端或两个末端与选自GS、WN、WQ、MA、MV、AM、LH、MN、ES、WQ或DT或由其组成的Z区或间隔区序列框内融合的二元肽。在与上述内容相关的实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白可含有相同或不同的TP，并且二元肽和/或三元肽可以是相同的或不同的。在上述内容的相关实施方案中，三元肽(上文称为L)可包含选自IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF的二元肽的氨基酸序列，该氨基酸序列在二元肽的N末端、C末端或两个末端与选自GS、WN、WQ、MA、MV、AM、LH、MN、ES、WQ或DT或由其组成的Z区或间隔区序列框内融合。参见图4。在上述内容的相关实施方案中，可用于制备杀昆虫和/或杀线虫蛋白的TP可以包括一种或多种ICK TP，例如选自从属于阿特蛛亚科的澳大利亚漏斗网蜘蛛中分离的杀昆虫ICK肽的“ACTX”或“ACTX肽”家族的TP，例如一种或多种选自ω-ACTX TP、κ-ACTX TP和U-ACTX TP的TP，例如U+2-ACTX-Hv1a、U-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1b(其中TP如果多于一个则可以是相同或不同的)，并且每种杀昆虫和/或杀线虫蛋白还包含一种或多种三元肽(上文称为L)，所述三元肽可包含选自IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF的二元肽的氨基酸序列，该氨基酸序列在二元肽的N末端、C末端或两个末端与选自GS、WN、WQ、MA、MV、AM、LH、MN、ES、WQ或DT或由其组成的Z区或间隔区序列框内融合。
在各种实施方案中，示例性杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以包括(ERSP)-(L)-TP-(L)-TP、(ERSP)-(L)-TP-(L)-TP-(L)、(L-TP)n-L、(L-TP-L)n、(ERSP)-(TP-L)n、(ERSP)-(L)-(TP-L)n、(ERSP)-(L-TP)n、(ERSP)-(L-TP)n-(L)、(ERSP)-(STA)-(L-TP)n、(ERSP)-(STA)-(L-TP)n-(L)、(ERSP)-(STA)-(TP-L)n、或(ERSP)-(STA)-(L)-(TP-L)n、或(STA)-(L-TP)n、或(STA)-(L-TP)n-(L)、或(STA)-(TP-L)n、或(STA)-(L)-(TP-L)n，其中(L)是二元肽或三元肽，并且每个L可以相同或不同，TP是可以相同或不同的毒性肽，并且n是1至200，优选1至100，最优选1至10范围内的整数(参见例如图4所示的示例性杀昆虫和/或杀线虫蛋白，其中n是1至200，优选1至100，最优选1至10范围内的整数)。在相关实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以包含相同或不同的TP，以及相同或不同的二元肽和/或三元肽。在上述内容的相关实施方案中，三元肽(上文称为L)可包含选自IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF的二元肽的氨基酸序列，该氨基酸序列在二元肽的N末端、C末端或两个末端与选自GS、WN、WQ、MA、MV、AM、LH、MN、ES、WQ或DT或由其组成的Z区或间隔区序列框内融合。在另一个实施方案中，植物或其部分包含与可操作启动子(例如同源或异源启动子)可操作地连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含与稳定化结构域(STA)的N末端框内融合的ERSP的杀昆虫和/或杀线虫蛋白。参见图5和图6C。
STA可以与二元肽或三元肽的N末端或包含(L-TP)n、(L-TP)n-L、(TP-L)n或L-(TP-L)n的构建体的N末端框内融合。
在各种实施方案中，示例性杀昆虫和/或杀线虫蛋白和/或包含一种或多种各自或组合编码此类杀昆虫和/或杀线虫蛋白的多核苷酸的DNA构建体可包括以下构建体：(ERSP)-(STA)-(L-TP)n、或(ERSP)-(STA)-(L-TP)n-(L)、或(ERSP)-(STA)-(TP-L)n、或(ERSP)-(STA)-(L)-(TP-L)n、或(STA)-(L-TP)n、或(STA)-(L-TP)n-(L)、或(STA)-(TP-L)n、或(STA)-(L)-(TP-L)n，其中TP是毒性蛋白，L是二元肽或三元肽，并且n是1至200范围内的整数，优选1至100范围内的整数，更优选1至10范围内的整数。在一些实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以包含相同或不同的TP，并且二元肽和/或三元肽可以是相同或不同的。在一些实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白具有在其C末端与二元肽或三元肽融合或未融合的C末端TP。在上述内容的相关实施方案中，可用于制备编码(1)杀昆虫和/或杀线虫蛋白的DNA构建体或多核苷酸的TP可以包括一种或多种ICK TP，例如选自从属于阿特蛛亚科的澳大利亚漏斗网蜘蛛中分离的杀昆虫ICK肽的“ACTX”或“ACTX肽”家族的TP，例如一种或多种选自ω-ACTX TP、κ-ACTX TP和U-ACTX TP的TP，例如U+2-ACTX-Hv1a、U-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1b，或与具有如SEQ ID NO:5、6和1761、1762、1767、1771-1773所示的氨基酸序列的肽或蛋白具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性或序列同源性的TP，及其变体(其中TP如果多于一个则可以是相同或不同的)，并且每种杀昆虫和/或杀线虫蛋白还包含一种或多种三元肽(上文称为L)，所述三元肽可包含选自IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF的二元肽的氨基酸序列，该氨基酸序列在二元肽的N末端、C末端或两个末端与选自GS、WN、WQ、MA、MV、AM、LH、MN、ES、WQ或DT或由其组成的Z区或间隔区序列框内融合。
编码可操作地与TP融合的可切割连接肽的DNA构建体可以用多种宿主细胞特异性调控组分构建。在一些实施方案中，可以将DNA构建体转化到多种宿主细胞中，以用于表达、合成编码蛋白或用于遗传操纵。在一些实施方案中，宿主细胞可以是细菌细胞、酵母细胞、植物细胞或动物细胞，例如农杆菌属细胞、芽孢杆菌属细胞、埃希氏菌属细胞、沙门氏菌属细胞、假单胞菌属细胞和根瘤菌属细胞。在各种实施方案中，宿主细胞是植物细胞。
在一些实施方案中，包含本文所述的可切割连接肽的杀昆虫和/或杀线虫组合物旨在将TP散布到摄取杀昆虫和/或杀线虫组合物或以其他方式与杀昆虫和/或杀线虫组合物接触的昆虫和/或线虫有害生物中。本发明提供植物或其部分(“植物或其部分”在本文中定义为包括但不限于植物和植物组织(例如，植物的根、茎、叶片、花或其部分)、植物细胞、或所述植物的植物种子)，其包含：包含二元肽或三元肽的杀昆虫和/或杀线虫蛋白或多肽，所述二元肽和/或三元肽包含至少4个氨基酸且最多16个氨基酸并且由2或3个不同的区域组成，其中二元肽具有2个不同的区域而三元肽具有3个不同的区域；其中，二元肽和/或三元肽能够被动物肠道蛋白酶和昆虫或线虫肠道蛋白酶二者切割，并且在一些实施方案中，二元肽和/或三元肽与内质网信号肽(ERSP)的C末端可操作地融合且与TP的N末端可操作地融合。
在一些实施方案中，包含本文所述的可切割连接肽的杀昆虫和/或杀线虫组合物旨在将TP散布到摄取杀昆虫和/或杀线虫组合物或以其他方式与杀昆虫和/或杀线虫组合物接触的昆虫和/或线虫有害生物中或使TP被这些昆虫和/或线虫有害生物消耗。本发明提供植物或其部分(“植物或其部分”在本文中定义为包括但不限于植物和植物组织、植物细胞、或所述植物的植物种子)，其包含：包含一种或多种二元肽和/或三元肽的杀昆虫和/或杀线虫蛋白或多肽，所述二元肽和/或三元肽包含至少4个氨基酸且最多16个氨基酸并且由2或3个不同的区域组成，其中二元肽具有2个不同的区域而三元肽具有3个不同的区域；其中，二元肽和/或三元肽能够被动物肠道蛋白酶(例如人肠道蛋白酶)和昆虫或线虫肠道蛋白酶二者切割，并且在一些实施方案中，二元肽和/或三元肽与内质网信号肽(ERSP)的C末端可操作地融合且与TP的N末端可操作地融合。在这些实施方案的一些中，示例性三元肽(称为L)可以包括选自IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF的二元肽的氨基酸序列，该氨基酸序列在二元肽的N末端、C末端或两个末端与选自GS、WN、WQ、MA、MV、AM、LH、MN、ES、WQ或DT或由其组成的Z区或间隔区序列框内融合。
在一些实施方案中，包含本文所述的可切割连接肽的杀昆虫和/或杀线虫组合物旨在将TP散布到摄取杀昆虫和/或杀线虫组合物或以其他方式与杀昆虫和/或杀线虫组合物接触的昆虫和/或线虫有害生物中或使TP被这些昆虫和/或线虫有害生物消耗。本发明提供植物或其部分(“植物或其部分”在本文中定义为包括但不限于植物和植物组织、植物细胞、或所述植物的植物种子)，其包含：包含二元肽或三元肽的杀昆虫和/或杀线虫蛋白或多肽，所述二元肽和/或三元肽包含至少4个氨基酸且最多16个氨基酸并且由2或3个不同的区域组成，其中二元肽具有2个不同的区域而三元肽具有3个不同的区域；其中，二元肽和/或三元肽能够被动物肠道蛋白酶和昆虫或线虫肠道蛋白酶二者切割，并且在一些实施方案中，二元肽和/或三元肽与内质网信号肽(ERSP)的C末端可操作地融合且与TP的N末端可操作地融合。
在相关实施方案中，所述植物或其部分包含编码杀昆虫和/或杀线虫蛋白的多核苷酸，其中所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含与二元肽或三元肽的N末端框内融合的ERSP，所述二元肽或三元肽与包含(TP-L)n的构建体框内融合，或者所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含与二元肽和/或重复构建体(L-TP)n或(TP-L)n框内融合的ERSP。参见图4。在各种实施方案中，示例性杀昆虫和/或杀线虫蛋白可包括从N末端至C末端的以下构建体：(ERSP)-(L)-TP-(L)-TP、(ERSP)-(L)-TP-(L)-TP-(L)、(L-TP)n-L、(L-TP-L)n、(ERSP)-(TP-L)n、(ERSP)-(L)-(TP-L)n、(ERSP)-(L-TP)n、(ERSP)-(L-TP)n-(L)、(ERSP)-(STA)-(L-TP)n、(ERSP)-(STA)-(L-TP)n-(L)、(ERSP)-(STA)-(TP-L)n、或(ERSP)-(STA)-(L)-(TP-L)n、或(STA)-(L-TP)n、或(STA)-(L-TP)n-(L)、或(STA)-(TP-L)n、或(STA)-(L)-(TP-L)n，其中(L)是二元肽或三元肽，并且每个L可以是相同或不同的，TP是可以相同或不同的毒性肽，并且n是1至200，优选1至100，并且最优选1至10范围内的整数。在这些实施方案的一些中，示例性三元肽(称为L)可以包括选自IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF的二元肽的氨基酸序列，该氨基酸序列在二元肽的N末端、C末端或两个末端与选自GS、WN、WQ、MA、MV、AM、LH、MN、ES、WQ或DT或由其组成的Z区或间隔区序列框内融合。在上述内容的相关实施方案中，可用于制备编码(1)杀昆虫和/或杀线虫蛋白的DNA构建体或多核苷酸的TP可以包括一种或多种ICK TP，例如选自从属于阿特蛛亚科的澳大利亚漏斗网蜘蛛中分离的杀昆虫ICK肽的“ACTX”或“ACTX肽”家族的TP，例如一种或多种选自ω-ACTX TP、κ-ACTX TP和U-ACTX TP的TP，例如U+2-ACTX-Hv1a、U-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1b，或与具有如SEQ IDNO:5、6和1761、1762、1767、1771-1773所示的氨基酸序列的肽或蛋白具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性或序列同源性的TP，及其变体(其中TP如果多于一个则可以是相同或不同的)，并且每种杀昆虫和/或杀线虫蛋白还包含一种或多种三元肽(上文称为L)，所述三元肽可包含选自IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF的二元肽的氨基酸序列，该氨基酸序列在二元肽的N末端、C末端或两个末端与选自GS、WN、WQ、MA、MV、AM、LH、MN、ES、WQ或DT或由其组成的Z区或间隔区序列框内融合。
在另一个实施方案中，植物或其部分包含与可操作启动子(例如同源或异源启动子)可操作地连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含与稳定化结构域(STA)的N末端框内融合的ERSP的杀昆虫和/或杀线虫蛋白。参见图5。STA与二元肽或三元肽的N末端或包含(L-TP)n、(L-TP)n-L、(TP-L)n或L-(TP-L)n的构建体的N末端框内融合。在各种实施方案中，示例性杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以包含：(ERSP)-(STA)-(L-TP)n、或(ERSP)-(STA)-(L-TP)n-(L)、或(ERSP)-(STA)-(TP-L)n、或(ERSP)-(STA)-(L)-(TP-L)n、或(STA)-(L-TP)n、或(STA)-(L-TP)n-(L)、或(STA)-(TP-L)n、或(STA)-(L)-(TP-L)n，其中TP是如本文所述的毒性蛋白，L是二元肽或三元肽，并且n是1至200范围内的整数，优选1至100范围内的整数，更优选1至10范围内的整数。在一些实施方案中，具有如上所示的构建体的杀昆虫和/或杀线虫蛋白可含有相同或不同的TP，以及相同或不同的二元肽和/或三元肽。在这些实施方案的一些中，具有如上所示的构建体的杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以含有与具有如SEQ ID NO:5、6和1761、1762、1767、1771-1773所示的氨基酸序列的肽或蛋白具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性或序列同源性的TP，及其变体(其中TP如果多于一个则可以是相同或不同的)，并且每种杀昆虫和/或杀线虫蛋白还包含一种或多种三元肽(上文称为L)，其可以包含选自IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF的二元肽的氨基酸序列，该氨基酸序列在二元肽的N末端、C末端或两个末端上与选自GS、WN、WQ、MA、MV、AM、LH、MN、ES、WQ或DT或由其组成的Z区或间隔区序列框内融合。
在一些实施方案中，C末端TP在其C末端与二元肽或三元肽融合或未融合。参见图2、图4和图5。在这些实施方案的一些中，示例性三元肽(称为L)可以包括选自IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF的二元肽的氨基酸序列，该氨基酸序列在二元肽的N末端、C末端或两个末端与选自GS、WN、WQ、MA、MV、AM、LH、MN、ES、WQ或DT或由其组成的Z区或间隔区序列框内融合。
读者应理解，在实践中，TP-接头构建体(接头被定义为包括可切割二元肽或三元肽)可以写为(TP-L)n，或者图2中所示的变型也可以以长形式写出。例如，当n为5时，那么以长形式写出的(TP-L)n将表现为：TP-L-TP-L-TP-L-TP-L-TP-L。在这样的构建体在诸如植物或其部分的系统中制备和产生之后，L或接头将被昆虫和/或线虫的肠道或血淋巴环境中的昆虫和/或线虫蛋白酶分开，以允许释放大量单一毒性肽并发挥其毒性作用，从而杀死或固定昆虫和/或线虫或减缓其摄食。当发生这种情况时，根据各种情形，L或接头可以在接头中的不同氨基酸之间或在毒性肽与接头之间被切割，使得在TP或毒性肽的任一侧上，可以存在0至16个仍然附连在毒性肽上的氨基酸，所述氨基酸是从开始时初始长度为1至16个氨基酸的L或接头上剩下的。换句话说，在蛋白酶切割后，TP可能没有来自附连到其上的接头的氨基酸，或者它可能具有一个或两个由接头的残存物构成的“残留物”(stub)又名“残余物”(nubbin)(融合到N末端和/或C末端的一个或两个残留物)，其大小从1到16个氨基酸不等，但更常见的是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸。残留物可以在N末端、C末端上或N末端和C末端两者上。这些残留物的大小并不总是相同，该大小取决于这些残留物被昆虫和/或人肠道环境中的蛋白酶切割的方式，而这根据蛋白酶和所用的接头而变化。通常，将存在附连到毒性肽的两“侧”的残留物，两个残留物源于连接肽的不同部分。有时，在切割后没有残留物或只有1个残留物附连到TP。
根据起始接头的长度，残留物的大小范围可以为1-16个氨基酸(并且可能没有残留物)，更常见的是，残留物将为2-14个氨基酸、3-12个氨基酸、4-8个氨基酸或5-7个氨基酸，或者它们可以是以下任何长度的氨基酸：1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、10、1-11；2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10和2-11；或3-4、3-5、3-6、3-7、3-8、3-9、3-10和3-11；或4-5、4-6、4-7、4-8、4-9、4-10和4-11；或5-6、5-7、5-8、5-9、5-10和5-11；或6-7、6-8、6-9、6-10和6-11；或7-8、7-9、7-10和7-11；和8-9、8-10或8-11；和9-10或9-11；或10或11个氨基酸。
因此，在切割之前，构建体可能表现为TP-L-TP-L-TP-L-TP-L-TP-L(我们的上述实例，并在图2中以等同形式示出)，其中例如，如果接头具有6个aa(或氨基酸)，则在蛋白酶切割后，TP-L-TP-L-TP-L-TP-L-TP-L构建体被分解成具有残留物的单个毒性肽(TP)，这些毒性肽可能表现如下：第一个肽可以是TP-2aa(2aa来自6aa接头的一侧)，然后是来自接头的附连到毒性肽另一端的最后部分的4aa，如：4aa-TP-2aa，第三个肽是4aa-TP-2aa，第四个肽是4aa-TP-2aa，然后第五个和最后一个切割的TP将表现为4aa-TP-6aa，因为最后的接头可能未被切割。有时，切割并不总是发生，因为构建体的最后一个TP没有附连到另一个TP上。或者它可能被切割而留下4aa-TP-2aa。在肽酶切割后附连于毒性肽的这些少许aa片段被我们称为“残留物”，它们通常不影响或抑制因昆虫肠道中的切割而产生的切割毒性肽的活性。
当ERSP与(TP-L)n或(L-TP)n融合时，也可能出现残留物，如图4中所示，并且在这样的构建体中，残留物可以包括ERSP的片段，和或如图5中所示，其中L-TP进一步与STA或BAAS或泛素融合，无论构建体中使用了什么。残留物可以是长度为1个氨基酸或更长直至16个氨基酸的任何长度的肽的任何组合。它们可能不规则地附连到TP上。在毒性肽之前和之后，残留物可能不具有相同的氨基酸长度或数量。
在各种实施方案中，提供了已用本文所述的DNA构建体转化的宿主细胞，该DNA构建体可操作以表达本发明的杀昆虫和/或杀线虫蛋白。在各种实施方案中，宿主细胞可以是真核细胞，例如酵母细胞，例如来自酵母属(Sacchromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、许旺酵母属(Schwanniomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)、曲霉属(Aspergillus)的酵母细胞；植物细胞；以及哺乳动物细胞。
在各种实施方案中，用编码杀昆虫和/或杀线虫蛋白的DNA构建体(瞬时地或稳定地)转化的预期宿主细胞是植物细胞，所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含可操作地与TP融合的可切割连接肽。在一些实施方案中，可用本文所述的DNA构建体转化的植物细胞可包括但不限于：苜蓿、香蕉、大麦、豆、西兰花、卷心菜、油菜、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭菜、莴苣、火炬松、粟、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、杨树、南瓜(pumpkin)、辐射松、萝卜、油菜籽、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜属蔬菜(squash)、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、西瓜和小麦植物细胞。
本发明提供了杀昆虫和/或杀线虫蛋白，使得当昆虫和/或线虫摄入该杀昆虫和/或杀线虫蛋白时，昆虫和/或线虫的肠道环境蛋白酶切割二元肽和/或三元肽，从而释放融合的TP，并将与杀昆虫和/或杀线虫蛋白接触的昆虫和/或线虫杀死、固定、使其不能正常发挥作用或者减缓其摄食或生长。在某些实施方案中，可以选择将并入杀昆虫和/或杀线虫蛋白中的TP以靶向特定的昆虫或线虫有害生物，或用于在特定植物中表达或针对植物经历的特定条件。在一些实施方案中，被配制用于直接施用给植物的由转基因植物、植物组织或植物种子产生的杀昆虫和/或杀线虫蛋白，或包含一种或多种具有相同或不同TP的杀昆虫和/或杀线虫蛋白的组合物具有由ICK TP和Bt TP的组合构成的TP。转基因植物、植物组织或植物种子可以表达杀昆虫蛋白，或一种或多种编码杀昆虫蛋白的多核苷酸，所述杀昆虫蛋白包含一种或多种ICK TP，所述ICK TP衍生自澳大利亚漏斗网蜘蛛的任何种、或者阿特蛛属或Hadronyche属的澳大利亚漏斗网蜘蛛、以及澳大利亚蓝山漏斗网蜘蛛(Hadronycheversuta)。在一些实施方案中，本发明提供转基因植物或其部分(例如，植物组织、植物细胞或植物种子)，其中所述转基因植物或其部分包含含有以下构建体(从N末端到C末端)的杀昆虫蛋白：(ERSP)-(L)-TP-(L)-TP、(ERSP)-(L)-TP-(L)-TP-(L)、(L-TP)n-L、(L-TP-L)n、(ERSP)-(TP-L)n、(ERSP)-(L)-(TP-L)n、(ERSP)-(L-TP)n、(ERSP)-(L-TP)n-(L)、(ERSP)-(STA)-(L-TP)n、(ERSP)-(STA)-(L-TP)n-(L)、(ERSP)-(STA)-(TP-L)n、或(ERSP)-(STA)-(L)-(TP-L)n、或(STA)-(L-TP)n、或(STA)-(L-TP)n-(L)、或(STA)-(TP-L)n、或(STA)-(L)-(TP-L)n，其中(L)是二元肽或三元肽，并且每个L可以相同或不同，TP是可以相同或不同的毒性肽，并且n是1至200，优选1至100，最优选1至10范围内的整数。
在相关实施方案中，转基因植物或其部分可以表达杀昆虫和/或杀线虫蛋白，所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以包含相同或不同的TP，以及相同或不同的二元肽和/或三元肽。在相关实施方案中，所述转基因植物或其部分(例如，植物组织、植物细胞或植物种子)包含一种或多种多核苷酸，所述多核苷酸各自或组合地可操作以表达包含构建体的杀昆虫蛋白，所述构建体包括以下构建体、选自以下构建体或由以下构建体组成：(从N末端至C末端)(ERSP)-(L)-TP-(L)-TP、(ERSP)-(L)-TP-(L)-TP-(L)、(L-TP)n-L、(L-TP-L)n、(ERSP)-(TP-L)n、(ERSP)-(L)-(TP-L)n、(ERSP)-(L-TP)n、(ERSP)-(L-TP)n-(L)、(ERSP)-(STA)-(L-TP)n、(ERSP)-(STA)-(L-TP)n-(L)、(ERSP)-(STA)-(TP-L)n、(ERSP)-(STA)-(L)-(TP-L)n、(STA)-(L-TP)n、(STA)-(L-TP)n-(L)、(STA)-(TP-L)n、(STA)-(L)-(TP-L)n，其中(L)是二元肽或三元肽，并且每个L可以相同或不同，TP是可以相同或不同的毒性肽，并且n是1至200，优选1至100，最优选1至10范围内的整数。在上述内容的相关实施方案中，可用于制备包含编码(1)杀昆虫和/或杀线虫蛋白的DNA构建体或多核苷酸的转基因植物或其部分的TP可以包括一种或多种ICK TP，例如选自从属于阿特蛛亚科的澳大利亚漏斗网蜘蛛中分离的杀昆虫ICK肽的“ACTX”或“ACTX肽”家族的TP，例如一种或多种选自ω-ACTX TP、κ-ACTX TP和U-ACTX TP的TP，例如U+2-ACTX-Hv1a、U-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1b，或与具有如SEQ ID NO:5、6和1761、1762、1767、1771-1773所示的氨基酸序列的肽或蛋白具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性或序列同源性的一种或多种TP，及其变体(其中TP如果多于一个则可以是相同或不同的)，并且每种杀昆虫和/或杀线虫蛋白还包含一种或多种三元肽(上文称为L)，所述三元肽可包含选自IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF的二元肽的氨基酸序列，该氨基酸序列在二元肽的N末端、C末端或两个末端与选自GS、WN、WQ、MA、MV、AM、LH、MN、ES、WQ或DT或由其组成的Z区或间隔区序列框内融合。
在相关实施方案中，所述一种或多种多核苷酸在可操作以表达如上文和本文所述的杀昆虫和/或杀线虫蛋白的表达载体中提供，并且处于组成型或诱导型启动子的控制下，其中该表达载体在宿主细胞例如植物细胞中瞬时表达，或者其中可操作以编码杀昆虫蛋白的多核苷酸稳定整合到植物或其部分的核DNA中。在上述内容的相关实施方案中，可用于制备编码(1)杀昆虫和/或杀线虫蛋白的DNA构建体或多核苷酸的TP可以包括一种或多种ICKTP，例如选自从属于阿特蛛亚科的澳大利亚漏斗网蜘蛛中分离的杀昆虫ICK肽的“ACTX”或“ACTX肽”家族的TP，例如一种或多种选自ω-ACTX TP、κ-ACTX TP和U-ACTX TP的TP，例如U+2-ACTX-Hv1a、U-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1b(其中TP如果多于一个则可以是相同或不同的)，并且每种杀昆虫和/或杀线虫蛋白还包含一种或多种三元肽(上文称为L)，所述三元肽可包含选自IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF的二元肽的氨基酸序列，该氨基酸序列在二元肽的N末端、C末端或两个末端与选自GS、WN、WQ、MA、MV、AM、LH、MN、ES、WQ或DT或由其组成的Z区或间隔区序列框内融合。
在一些实施方案中，用于控制昆虫和/或线虫有害生物的方法可包括向所述昆虫和/或线虫施用包含杀昆虫和/或杀线虫蛋白的制剂，所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含Bt(苏云金芽孢杆菌)TP和ICK(抑制剂胱氨酸结)TP的组合。在从杀昆虫和/或杀线虫蛋白释放至少50％的TP时，Bt TP与ICK TP的比率(基于由此释放的干重)可以选自至少约以下比率：99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95和1:99，或这些值中的任何两个值的任意组合。Bt TP与ICK TP的比率(基于由此释放的干重)可以选自约以下比率：50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、1:99、0.5:99.5、0.1:99.9和0.01:99.99，或这些值中的任何两个值的任意组合。制剂可以包含杀昆虫和/或杀线虫蛋白和适当的赋形剂，或者杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以通过一种或多种细菌菌株的培养物表达，当配制并施用于植物时，这些细菌菌株产生杀昆虫和/或杀线虫蛋白，其随后被昆虫和/或线虫有害生物摄取。在各种实施方案中，组合物中Bt TP和ICK TP的总浓度选自以下百分比浓度：1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％，或这些值中的任何两个值之间的任意范围，而组合物的剩余百分比由赋形剂构成。本文所述的任何杀昆虫和/或杀线虫蛋白和植物均可用于控制昆虫和/或线虫、它们的生长和损害，尤其是它们对植物的损害。在一些实施方案中，包含Bt TP和ICK TP的组合的杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以通过喷洒在植物上、或昆虫的位置、或需要保护的植物的位置而施用。
在一些实施方案中，用于控制有害生物感染的说明性方法包括制备包含含有BtTP和ICK TP的组合的杀昆虫和/或杀线虫蛋白的制剂，其可以包括本文所述的或能够由本领域技术人员鉴于本公开而制备的任何组合物。所述制剂中的一些包括使用极性非质子溶剂和或水，和或当极性非质子溶剂的存在量为1-99重量％时，极性质子溶剂的存在量为1-99重量％，水的存在量为0-98重量％。制剂包括其中Bt TP是Dipel并且ICK TP是杂合-ACTX-Hv1a肽，或与具有如SEQ ID NO:5、6和1761、1762、1767、1771-1773所示的氨基酸序列的肽或蛋白具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性或序列同源性的TP，及其变体(其中TP如果多于一个则可以是相同或不同的)的制剂。
极性非质子溶剂制剂在含有MSO时特别有效。以下实例旨在说明本发明，而不是以任何方式限制本发明。
在一些实施方案中，由转基因植物或其部分产生或被配制用于直接施用给植物的杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含Bt TP和TMOF TP的组合，当它们组合在单一杀昆虫和/或杀线虫蛋白中时可以在TP的组合被适当地递送到昆虫栖息的位置时抑制生长、损害运动或甚至杀死昆虫。喷雾干燥的粉末可以使用作为主要活性剂的如本文所述的包含如上所述的TP组合的杀昆虫和/或杀线虫蛋白，以及一种或多种各种赋形剂和发酵副产物而制备。
我们描述了包含Bt(苏云金芽孢杆菌)蛋白和TMOF TP的杀昆虫和/或杀线虫蛋白组合物。在一些实施方案中，用于控制昆虫和/或线虫有害生物的方法可包括将包含含有Bt(苏云金芽孢杆菌)TP和TMOF TP的组合的杀昆虫和/或杀线虫蛋白的制剂施用于所述昆虫和/或线虫。在从杀昆虫和/或杀线虫蛋白释放至少50％的TP时，Bt TP与TMOF TP的比率(基于由此释放的干重)可以选自约任何或所有以下比率：99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95和1:99，或这些值中的任何两个值的任意组合。制剂可以包含杀昆虫和/或杀线虫蛋白和适当的赋形剂，或者杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以通过一种或多种细菌菌株的培养物表达，当配制并施用于植物时，这些细菌菌株产生杀昆虫和/或杀线虫蛋白，其随后被昆虫和/或线虫有害生物摄取。在各种实施方案中，组合物中Bt TP和TMOF TP的总浓度选自以下百分比浓度：1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％，或这些值中的任何两个值之间的任意范围，而组合物的剩余百分比由赋形剂构成。本文所述的任何杀昆虫和/或杀线虫蛋白和植物均可用于控制昆虫和/或线虫、它们的生长和损害，尤其是它们对植物的损害。在一些实施方案中，包含Bt TP和TMOF TP的组合的杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以通过喷洒在植物上、或昆虫的位置、或需要保护的植物的位置而施用。
在一些实施方案中，用于控制有害生物感染的说明性方法包括制备包含含有BtTP和TMOF TP的组合的杀昆虫和/或杀线虫蛋白的制剂，其可以包括本文所述的或能够由本领域技术人员鉴于本公开而制备的任何组合物。所述制剂中的一些包括使用极性非质子溶剂和或水，和或当极性非质子溶剂的存在量为1-99重量％时，极性质子溶剂的存在量为1-99重量％，水的存在量为0-98重量％。在某些实施方案中，如本文所提供，用于TP的任何组合的杀昆虫和/或杀线虫蛋白可包含一种或多种二元肽和/或三元肽。杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以包含来自说明性组合的与三元肽连接的一种或多种TP，其中间隔区位于三元肽的二元肽部分的N末端侧或三元肽的二元肽部分的C末端侧。在一些实施方案中，间隔区是二肽(例如GS)，其可以与杀昆虫和/或杀线虫蛋白内的TMOF TP单元可操作地连接。在一些实施方案中，间隔区二肽连接在TMOF TP的N末端；并且其中间隔区由二肽的N末端上的一个非极性氨基酸和二肽的C末端上的一个极性氨基酸构成，包括其中二肽是甘氨酸-丝氨酸的实施方案；包括其中TMOF TP包括以下这样的实施方案的实施方案：其中TMOF TP与本文公开的任何TMOF序列具有至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更大的序列同一性；包括其中Bt蛋白是任何Bt TP的实施方案；包括其中Bt TP是Cry或Cyt蛋白的实施方案；包括其中Bt TP选自Cry1、Cry3、TIC851、CryET70、Cry22、TIC901、TIC201、TIC407、TIC417、二元杀昆虫蛋白CryET80和CryET76、二元杀昆虫蛋白TIC100和TIC101、杀昆虫蛋白ET29或ET37与杀昆虫蛋白TIC810或TIC812的组合以及二元杀昆虫蛋白PS149B1的实施方案；包括其中Bt TP选自Cry蛋白、Cry1A蛋白或Cry1F蛋白的实施方案；包括其中Bt TP是组合Cry1F-Cry1A蛋白的实施方案；包括其中Bt TP包含与美国专利号7,304,206的SEQ ID NO:10、12、14、26、28或34至少90％相同的氨基酸序列的实施方案；包括其中Bt内毒素是Dipel的实施方案；包括其中Bt蛋白是Thuricide的实施方案。
在一些实施方案中，用于控制昆虫和/或线虫有害生物的方法可包括将包含含有Bt(苏云金芽孢杆菌)TP和TMOF TP的组合的杀昆虫和/或杀线虫蛋白的制剂施用于所述昆虫和/或线虫。在从杀昆虫和/或杀线虫蛋白释放至少50％的TP时，Bt TP与TMOF TP的比率(基于由此释放的干重)可以选自至少约以下比率：99:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95和1:99，或这些值中的任何两个值的任意组合。Bt TP与TMOF TP的比率(基于由此释放的干重)可以选自约以下比率：50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、1:99、0.5:99.5、0.1:99.9和0.01:99.99，或这些值中的任何两个值的任意组合。制剂可以包含杀昆虫和/或杀线虫蛋白和适当的赋形剂，或者杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以通过一种或多种细菌菌株的培养物表达，当配制并施用于植物时，这些细菌菌株产生杀昆虫和/或杀线虫蛋白，其随后被昆虫和/或线虫有害生物摄取。在各种实施方案中，组合物中Bt TP和TMOF TP的总浓度选自以下百分比浓度：1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％，或这些值中的任何两个值之间的任意范围，而组合物的剩余百分比由赋形剂构成。本文所述的任何杀昆虫和/或杀线虫蛋白和植物均可用于控制昆虫和/或线虫、它们的生长和损害，尤其是它们对植物的损害。在一些实施方案中，包含Bt TP和TMOF TP的组合的杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以通过喷洒在植物上、或昆虫的位置、或需要保护的植物的位置而施用。
在一些实施方案中，用于控制有害生物感染的方法包括提供表达杀昆虫和/或杀线虫蛋白的转化植物，所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白表达本文所述的Bt TP和TMOF TP的组合，其中在转化植物的平均叶片中，作为所表达的TP的总量的重量百分比，Bt和TMOF TP各自的平均浓度为约：1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％，或这些值中的任何两个值之间的任意范围。
在一些实施方案中，表达本文所述的Bt TP和TMOF TP的组合的杀昆虫和/或杀线虫蛋白在玉米、大豆、棉花、水稻、高粱、柳枝稷、甘蔗、苜蓿、马铃薯或番茄中表达。在一些实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白在具有如上所述的杀昆虫和/或杀线虫蛋白的转基因种子中表达。
在一些实施方案中，转化的植物在转化的植物中表达本文所述的Bt TP和TMOF TP的适当折叠的组合，并导致在所述植物中蓄积所表达和适当折叠的本文所述的Bt TP和TMOF TP的组合，以及导致植物产量的提高或对昆虫和/或线虫损害的抗性，并且它们控制作物和天然林或人造林中的昆虫和/或线虫有害生物。我们描述了由本文所述的任何产物和方法制备的转基因植物。
(5).转基因植物
本发明的方法涉及将核苷酸或DNA构建体引入宿主细胞例如植物中。“引入”旨在向植物提供DNA构建体，提供的方式使得构建体进入植物细胞的内部。本发明的方法不要求使用用于将DNA构建体引入植物的特定方法，只要DNA构建体可以进入植物的至少一个细胞的内部。用于将DNA构建体引入植物的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。用于转化多核苷酸(包括含有杀昆虫蛋白的克隆和表达载体)的方法是本领域已知的。例如，通过引入与信号肽和分子标记融合的重组杀昆虫蛋白来克隆和转化植物的方法可以在2013年3月8日提交的国际PCT申请序列号PCT/US2013/030042中找到，该公开的内容通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，
“植物”是指整株植物、植物器官(例如叶片、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚和它们的后代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮细胞、花粉)。
“转基因植物”或“转化植物”或“稳定转化的”植物或细胞或组织是指已将外源核酸序列或DNA片段并入或整合到植物细胞中的植物。这些核酸序列包括是外源的或不存在于未转化的植物细胞中的核酸序列，以及可以是内源的或存在于未转化的植物细胞中的核酸序列。“异源”通常是指这样的核酸序列，它们不是细胞内源性的也不是它们所存在的天然基因组的一部分内源性的，并且已通过感染、转染、显微注射、电穿孔、显微投影等添加到细胞中。
植物细胞的转化可以通过本领域已知的几种技术之一完成。可以修饰本发明的DNA构建体以获得或增强在植物细胞中的表达。通常，表达这种蛋白的构建体将含有促进基因转录的启动子，以及允许转录终止和多聚腺苷酸化的3'非翻译区。此类构建体的组织在本领域中是熟知的。在一些情况下，对基因进行工程改造以使得所得的肽在植物细胞内被分泌或以其他方式被靶向可能是有用的。例如，可以将基因工程改造为含有信号肽以促进肽向内质网的转移。也可以优选地将植物表达盒工程改造成含有内含子，使得内含子的mRNA加工是表达所必需的。
在各种实施方案中，包含编码本发明的杀昆虫和/或杀线虫蛋白的多核苷酸的DNA构建体可以瞬时或稳定地转化到未修饰的植物细胞中，或者可以转化到先前发生了遗传改变的植物细胞中。在一个实施方案中，包含编码本发明的杀昆虫和/或杀线虫蛋白的多核苷酸的DNA构建体可以稳定地转化到未修饰的植物细胞中，即先前未用任何异源DNA或RNA材料转化或转染的植物细胞。用于稳定整合外来或异源表达载体的方法如下描述。在其他实施方案中，可以用一种DNA构建体转化遗传上未改变的植物细胞，所述DNA构建体包含可操作以编码本发明的一种杀昆虫和/或杀线虫蛋白的多核苷酸。在该实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白仅含有一种类型的TP，例如ICK基序TP。在其他实施方案中，可以用两种不同的DNA构建体转化遗传上未改变的植物细胞，每种构建体包含可操作以编码本发明的一种杀昆虫和/或杀线虫蛋白的多核苷酸，其中每种构建体的杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含不同的TP，例如，在一种DNA构建体中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含ICK基序的一个或多个TP拷贝，而另一种DNA构建体包含编码不同TP(例如Bt TP)的多核苷酸。可以通过使用相同的启动子或不同的启动子和其他控制序列来操纵两种类型的杀昆虫和/或杀线虫蛋白的表达，以引起杀昆虫和/或杀线虫蛋白、或杀昆虫和/或杀线虫蛋白两者的差异表达。
在一些实施方案中，转基因植物或其部分可以产生或表达一种或多种含有一种或多种TP的杀昆虫和/或杀线虫蛋白。在一个实施方案中，TP是ICK TP，例如杂合-ACTX-Hv1a，例如具有SEQ ID NO:5或6的氨基酸序列的TP(或其变体)，和/或所表达的ICK TP可包含20-100个氨基酸和2-4个二硫键，和或ICK TP是与本文所述的ICK TP和/或Bt TP中的任一者具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性的任何杀昆虫肽，并且具体地在具有如SEQ ID NO:5-1593和1761-1775所示的氨基酸序列的任何TP或其变体中举例说明。
在各种实施方案中，转基因植物可以表达并产生一种或多种可以相同或可以不同的ICK TP(例如，ω-ACTX TP、κ-ACTX TP或U-ACTX TP，例如杂合-ACTX-Hv1a TP)，或与具有如SEQ ID NO:5、6和1761、1762、1767、1771-1773所示的氨基酸序列的肽或蛋白具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性或序列同源性的TP，及其变体(其中TP如果多于一个则可以是相同或不同的)。
在另一个实施方案中，转基因植物或其部分可以表达和产生一种或多种可以相同或不同的Bt TP。应当理解，尽管转基因植物或其部分可表达并产生相同类型的TP或不同的TP，但转基因植物将不具有可操作以从同一DNA构建体编码和表达ICK TP和Bt TP的单一DNA构建体。这两种类型的TP可以在植物或其部分中表达和产生，但是这两种类型的TP源自如本文所述的单独的DNA构建体。本文公开的转基因植物可包含、表达和产生含有已知BtTP的杀昆虫和/或杀线虫蛋白，包括Cry或Cyt蛋白TP，和/或选自Cry1、Cry3、TIC851、CryET70、Cry22、TIC901、TIC201、TIC407、TIC417、CryET80、和CryET76、TIC100TIC101、ET29、ET37、TIC810、TIC812、PS149B1及其组合的Bt TP。Bt TP可选自Cry蛋白、Cry1A蛋白或Cry1F蛋白、或Cry1F-Cry1A蛋白的组合，或者它包含与美国专利号7,304,206的SEQ ID NO:10、12、14、26、28或34具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，转基因植物可以产生包含Bt TP(例如Dipel和/或Thuricide)的杀昆虫和/或杀线虫蛋白。
在一些实施方案中，转基因植物表达本文所述的TP，其中在转化植物的平均叶片中，作为所表达的TP的总量的重量百分比，Bt和ICK TP各自的平均浓度为约：1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％，或这些值中的任何两个值之间的任意范围。
在一些实施方案中，本文所述的杀昆虫和/或杀线虫蛋白在玉米、大豆、棉花、水稻、高粱、柳枝稷、甘蔗、苜蓿、马铃薯或番茄中表达。在一些实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白在具有如上所述的杀昆虫和/或杀线虫蛋白的转基因种子中表达。
在其他实施方案中，包含可操作以编码本发明的杀昆虫和/或杀线虫蛋白的多核苷酸的DNA构建体可以在先前已经过遗传修饰的植物细胞中瞬时或稳定表达，例如，先前已用另一TP(例如，如本文所述的ICK基序TP或Bt TP)转化的植物细胞。在该实施方案中，可以转化本发明的DNA构建体，使得杀昆虫和/或杀线虫蛋白或先前引入的TP的表达可以由相同的启动子控制，或者杀昆虫和/或杀线虫蛋白和先前引入的TP中的每一者可以使用不同的启动子或表达条件来控制，以促进两者的差异表达。应当理解的是，两种不同的Bt TP的转化无法发生，不管DNA构建体是包含可操作以编码具有多种TP的杀昆虫和/或杀线虫蛋白的多核苷酸还是转化含有单一TP的多个DNA构建体。在任一种情况下，只有单一种类的Bt TP才能转化到植物中，无论是作为单一TP表达还是在含有相同种类的Bt TP的多个拷贝的杀昆虫和/或杀线虫蛋白中表达。
在一些实施方案中，本发明提供了转基因植物，其包含Bt(苏云金芽孢杆菌)TP和ICK(抑制剂胱氨酸结)TP的组合。该转基因植物可以由如本文所提供的DNA构建体的独立且分开的稳定遗传插入而制备，其产生表达Bt TP的第一开花植物和表达ICK TP的第二开花植物。这些植物之一的花粉将被杂交到另一植物的雌花器官上以形成包含以下两者的基因杂交：含有Bt TP的杀昆虫和/或杀线虫蛋白和含有ICK TP遗传性状的杀昆虫和/或杀线虫蛋白。该有性杂交和导致这两种性状得以遗传的进一步杂交所产生的后代将产生包含Bt(苏云金芽孢杆菌)TP和ICK(抑制剂胱氨酸结)TP的组合的转基因植物。
在一些实施方案中，转基因植物或其部分可操作以表达由编码杀昆虫和/或杀线虫蛋白的DNA构建体编码的杀昆虫和/或杀线虫蛋白，其中所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含与二元肽或三元肽的N末端框内融合的ERSP，所述二元肽或三元肽与包含(TP-L)n的构建体框内融合，或者所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含与二元肽和/或重复构建体(L-TP)n或(TP-L)n框内融合的ERSP。在各种实施方案中，示例性杀昆虫和/或杀线虫蛋白可包含以下构建体：(ERSP)-(TP-L)n、或(ERSP)-(L)-(TP-L)n、或(ERSP)-(L-TP)n、或(ERSP)-(L-TP)n-(L)。在另一个实施方案中，转基因植物或其部分包含与可操作启动子可操作地连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含与稳定化结构域(STA)的N末端框内融合的ERSP的杀昆虫和/或杀线虫蛋白。STA与二元肽或三元肽的N末端或包含(L-TP)n、(L-TP)n-L、(TP-L)n或L-(TP-L)n的构建体的N末端框内融合。在各种实施方案中，示例性杀昆虫和/或杀线虫蛋白可包含以下从N末端至C末端的构建体：(ERSP)-(L)-TP-(L)-TP、(ERSP)-(L)-TP-(L)-TP-(L)、(L-TP)n-L、(L-TP-L)n、(ERSP)-(TP-L)n、(ERSP)-(L)-(TP-L)n、(ERSP)-(L-TP)n、(ERSP)-(L-TP)n-(L)、(ERSP)-(STA)-(L-TP)n、(ERSP)-(STA)-(L-TP)n-(L)、(ERSP)-(STA)-(TP-L)n、或(ERSP)-(STA)-(L)-(TP-L)n、或(STA)-(L-TP)n、或(STA)-(L-TP)n-(L)、或(STA)-(TP-L)n、或(STA)-(L)-(TP-L)n，其中(L)是二元肽或三元肽，并且每个L可以相同或不同，TP是可以相同或不同的毒性肽，并且n是1至200，优选1至100，最优选1至10范围内的整数。在一些实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以包含相同或不同的TP，以及相同或不同的二元肽和/或三元肽。在一些实施方案中，C末端TP在其C末端与二元肽或三元肽融合或未融合。在上述内容的相关实施方案中，转基因植物或其部分可包含一种或多种可用于制备杀昆虫和/或杀线虫蛋白的TP。转基因植物或其部分可以包含杀昆虫和/或杀线虫蛋白，所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以包含一种或多种ICK TP，例如选自从属于阿特蛛亚科的澳大利亚漏斗网蜘蛛中分离的杀昆虫ICK肽的“ACTX”或“ACTX肽”家族的TP，例如一种或多种选自ω-ACTX TP、κ-ACTX TP和U-ACTX TP的TP，例如U+2-ACTX-Hv1a、U-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1b或杂合ACTX-Hv1a肽，或与具有如SEQ ID NO:5、6和1761、1762、1767、1771-1773所示的氨基酸序列的肽或蛋白具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性或序列同源性的TP，及其变体(其中TP如果多于一个则可以是相同或不同的)，并且每种杀昆虫和/或杀线虫蛋白还包含一种或多种三元肽(上文称为L)，所述三元肽可包含选自IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF的二元肽的氨基酸序列，该氨基酸序列在二元肽的N末端、C末端或两个末端与选自GS、WN、WQ、MA、MV、AM、LH、MN、ES、WQ或DT或由其组成的Z区或间隔区序列框内融合。
在各种实施方案中，植物或其部分(例如植物细胞)先前已经用Bt TP转化，随后将含有Bt TP的植物或其部分(例如植物细胞)用可操作以编码杀昆虫和/或杀线虫蛋白的DNA构建体转化，该构建体可以包括一种或多种ICK TP，例如选自从属于阿特蛛亚科的澳大利亚漏斗网蜘蛛中分离的杀昆虫ICK肽的“ACTX”或“ACTX肽”家族的TP，例如一种或多种选自ω-ACTX TP、κ-ACTX TP和U-ACTX TP的TP，例如U+2-ACTX-Hv1a、U-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1b或杂合-ACTX-Hv1a肽，或与具有如SEQ ID NO:5、6和1761、1762、1767、1771-1773所示的氨基酸序列的肽或蛋白具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性或序列同源性的一种或多种TP，及其变体(其中TP如果多于一个则可以是相同或不同的)，并且每种杀昆虫和/或杀线虫蛋白还包含一种或多种三元肽(上文称为L)，所述三元肽可包含选自IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF的二元肽的氨基酸序列，该氨基酸序列在二元肽的N末端、C末端或两个末端与选自GS、WN、WQ、MA、MV、AM、LH、MN、ES、WQ或DT或由其组成的Z区或间隔区序列框内融合。所得植物或其部分(例如植物细胞)具有Bt TP和含有一种或多种ICK基序TP的杀昆虫和/或杀线虫蛋白的稳定表达。
在各种实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白也可以使用稳定的植物转化技术整合到植物基因组中，因此杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以在植物中稳定表达并保护转化的植物一代又一代。对于植物的稳定转化，包含DNA构建体的表达载体可以是环状的或线性的。载体DNA中必须包含一些关键组分。基于如上所述的在瞬时植物表达中开展的研究，对于在植物中的最佳表达，应仔细设计用于稳定植物转化的杀昆虫和/或杀线虫杀昆虫和/或杀线虫蛋白ORF。杀昆虫和/或杀线虫杀昆虫和/或杀线虫蛋白的表达通常由在转基因植物的所有细胞中的一些中驱动转录的启动子控制。启动子可以是强植物病毒启动子，例如来自花椰菜花叶病毒(CaMV)的组成型35S启动子；它也可以是强植物启动子，例如来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的氢过氧化物裂解酶启动子(pHPL)；来自大豆的多聚泛素(Gmubi)启动子；来自不同植物物种(水稻、玉米、马铃薯等)的泛素启动子等。植物转录终止子通常出现在ORF的终止密码子之后，以停止RNA聚合酶和mRNA的转录。为了评估杀昆虫和/或杀线虫杀昆虫和/或杀线虫蛋白的表达，报告基因能够被包含在表达载体中，例如，用于GUS染色测定的β-葡糖醛酸酶基因(GUS)、用于在紫外光下的绿色荧光检测的绿色荧光蛋白(GFP)基因等。为了选择转化的植物，通常将选择性标记基因包含在表达载体中。标记基因表达产物可以为转化的植物提供对特定抗生素(例如卡那霉素、潮霉素等)或特定除草剂(例如草甘膦等)的抗性。如果采用农杆菌感染技术进行植物转化，则T-DNA左边界和右边界序列也被包含在表达载体中以将T-DNA部分转运到植物中。可以使用任何已建立和熟知的转化技术将构建的表达载体转化到植物细胞或组织中。农杆菌感染是使用根癌农杆菌菌株或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)菌株转化植物的非常流行的方式。粒子轰击(也称为基因枪或生物射弹)技术也非常普遍用于植物转化。其他不太常用的转化方法包括组织电穿孔、碳化硅晶须、DNA直接注射等。转化后，将转化的植物细胞或组织置于植物再生培养基上，以成功地将转化的植物细胞或组织再生成转基因植物。可以进行杀昆虫和/或杀线虫杀昆虫和/或杀线虫蛋白ORF在转化植物中的整合和表达的评估。
在一些实施方案中，“植物表达盒”可以插入“植物转化载体”中。说明性植物转化载体可以由实现植物转化所需的一种或多种DNA载体构成。例如，本领域的常见做法是利用由一个以上连续DNA区段构成的植物转化载体。这些载体在本领域中通常称为“二元载体”。二元载体以及具有辅助质粒的载体最常用于农杆菌属介导的转化，其中实现有效转化所需的DNA区段的大小和复杂性非常大，并且将功能分离到单独的DNA分子上是有利的。二元载体通常包含质粒载体，该质粒载体包含T-DNA转移所需的顺式作用序列(例如左边界和右边界)、经工程改造为能够在植物细胞中表达的选择性标记以及“目的基因”(产生转基因植物所需的经工程改造为能够在植物细胞中表达的基因)。该质粒载体上还存在细菌复制所需的序列。顺式作用序列的排列方式允许有效转移到植物细胞中并在其中表达。例如，本文所述的选择性标记基因和杀昆虫和/或杀线虫蛋白位于左边界与右边界之间。第二质粒载体通常含有介导T-DNA从农杆菌属转移到植物细胞的反式作用因子。该质粒通常含有毒力功能(Vir基因)，其使得农杆菌属能感染植物细胞，并通过边界序列处的切割和vir介导的DNA转移而转移DNA，如本领域所理解的那样(Hellens和Mullineaux(2000)Trends in PlantScience 5:446-451)。几种类型的农杆菌属菌株(例如，LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等)可用于植物转化。第二质粒载体不是通过其他方法例如显微投影、显微注射、电穿孔、聚乙二醇等转化植物所必需的。
一般而言，植物转化方法涉及将异源DNA转移到靶植物细胞(例如，未成熟或成熟的胚、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等)中，然后应用最大阈值水平的适当选择(取决于选择性标记基因)以从一组未转化的细胞团中回收转化的植物细胞。通常将外植体转移到新供应的相同培养基中并按常规方式培养。随后，在置于补充有最大阈值水平的选择剂的再生培养基上后，将转化的细胞分化成芽。然后将芽转移到选择性生根培养基中以回收生根的芽或小植株。然后，转基因小植物生长成成熟植物并产生可育种子(例如Hiei等人(1994)The Plant Journal 6:271-282；Ishida等人(1996)Nature Biotechnology14:745-750)。通常将外植体转移到新供应的相同培养基中并按常规方式培养。用于产生转基因植物的技术和方法的一般描述见于Ayres和Park(1994)Critical Reviews in PlantScience 13:219-239以及Bommineni和Jauhar(1997)Maydica 42:107-120。由于转化后的材料含有许多细胞；因此转化的和未转化的细胞都存在于任何一块受试目标愈伤组织或组织或细胞群中。杀死未转化细胞并允许转化细胞增殖的能力产生转化的植物培养物。通常，除去未转化细胞的能力限制了转化植物细胞的快速回收和转基因植物的成功产生。
转化方案以及将核苷酸序列引入植物的方案可以根据目标在于进行转化的植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)而变化。转基因植物的产生可以通过几种方法之一进行，包括但不限于显微注射、电穿孔、直接基因转移、通过农杆菌将异源DNA引入植物细胞(农杆菌属介导的转化)、用粘附于粒子的异源外来DNA轰击植物细胞、弹道粒子加速、气溶胶束转化(美国已公开的申请号20010026941、美国专利号4,945,050、国际公开号WO 91/00915、美国已公开的申请号2002015066)、Lec1转化和各种其他非粒子直接介导的转移DNA的方法。
转化叶绿体的方法是本领域已知的。参见例如Svab等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:8526-8530；Svab和Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:913-917；Svab和Maliga(1993)EMBO J.12:601-606。该方法依赖于粒子枪递送含有选择性标记的DNA并通过同源重组将DNA靶向质体基因组。另外，质体转化可以通过核编码的且质体定向的RNA聚合酶的组织优先表达来反式激活沉默的质体携带的转基因而完成。这样的系统在McBride等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:7301-7305中进行了报道。
在将异源外来DNA整合到植物细胞中之后，然后在培养基中应用最大阈值水平的适当选择以杀死未转化的细胞，并通过定期转移到新鲜培养基中分离和增殖从该选择处理中存活的推定转化的细胞。通过连续传代并经过合适的筛选而挑战，鉴定并增殖用质粒载体转化了的细胞。然后可以使用分子和生物化学方法来确认整合的异源目的基因存在于转基因植物的基因组中。
已经转化的细胞可以按照常规方式生长成植物。参见例如McCormick等人(1986)Plant Cell Reports 5:81-84。然后可以使这些植物生长，并用相同的转化品系或不同的品系授粉，并鉴定具有所需表型特征的组成型表达的所得杂交体。可以生长两代或更多代以确保稳定维持和遗传所需表型特征的表达，然后收获种子以确保实现所需表型特征的表达。以这种方式，本发明提供了转化的种子(也称为“转基因种子”)，本发明的核苷酸构建体(例如，本发明的表达盒)稳定地并入其基因组中。
(5A).植物转化评估
在将异源外来DNA引入植物细胞后，对异源基因在植物基因组中的转化或整合通过各种方法进行证实，例如分析与整合基因相关联的核酸、蛋白和代谢物。
PCR分析是一种快速的方法，用于在移植到土壤中之前的早期阶段筛选转化的细胞、组织或芽中是否存在所并入的基因(Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning:ALaboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)。使用对目的基因或农杆菌属载体背景等具有特异性的寡核苷酸引物进行PCR。
植物转化可以通过基因组DNA的Southern印迹分析来确认(Sambrook和Russell，2001，同上)。一般而言，从转化体中提取总DNA，用合适的限制酶消化，在琼脂糖凝胶中分级分离并转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。然后根据标准技术(Sambrook和Russell，2001，同上)，用例如放射性标记的32P靶DNA片段探测膜或“印迹”，以证实将引入的基因整合到植物基因组中。
在Northern印迹分析中，根据本领域常规使用的标准程序(Sambrook和Russell，2001，同上)，从转化体的特定组织中分离RNA，在甲醛琼脂糖凝胶中分级分离，并印迹到尼龙滤膜上。然后通过本领域已知的方法(Sambrook和Russell，2001，同上)，通过使滤膜与衍生自Bt蛋白的放射性探针杂交来测试由Bt蛋白编码的RNA的表达。
可以对转基因植物进行蛋白质印迹、生物化学测定等，以通过标准程序(Sambrook和Russell，2001，同上)使用与TP上存在的一个或多个表位结合的抗体来证实转化的TP的存在。
因此，本发明提供转基因植物或其部分，其包含与可操作启动子(例如同源或异源启动子)可操作地连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码：包含如本文所述的二元肽或三元肽的肽。在一些实施方案中，二元肽或三元肽可包含至少4个氨基酸且最多16个氨基酸的氨基酸序列。二元肽具有两个区域，三元肽具有相同的两个区域和另一个称为间隔区的区域。二元肽和/或三元肽中的每一者能够被动物肠道蛋白酶(例如人胃肠蛋白酶)和昆虫或线虫肠道蛋白酶二者切割。在各种实施方案中，多核苷酸还编码内质网信号肽(ERSP)，该内质网信号肽在其C末端与二元肽和/或三元肽的N末端融合。在这些实施方案中，二元肽和/或三元肽也可操作地与TP的N末端融合。在另外其他实施方案中，转基因植物可包含用DNA构建体转化的一个细胞或多个细胞，所述DNA构建体包含至少一个与可操作启动子(例如同源或异源启动子)可操作地连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有两种或更多种可切割二元肽或三元肽的杀昆虫和/或杀线虫蛋白。杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含在其C末端与二元肽或三元肽的N末端框内融合的ERSP，并且二元肽或三元肽在其C末端与包含(TP-L)n的构建体融合，其中TP是毒性肽或蛋白，L是二元肽或三元肽，并且n是1至200、或1至100、或1至10范围内的整数。在这些杀昆虫和/或杀线虫蛋白中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白的最后一个TP(即在其C末端)可以在其C末端与二元肽或三元肽融合或未融合。在各种实施方案中，示例性杀昆虫和/或杀线虫蛋白可包括以下结构：(ERSP)-(TP-L)n、或(ERSP)-(L)-(TP-L)n、或(ERSP)-(L-TP)n、或(ERSP)-(L-TP)n-(L)。在另一个实施方案中，植物或其部分包含与可操作启动子(例如同源或异源启动子)可操作地连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含与稳定化结构域(STA)的N末端框内融合的ERSP的杀昆虫和/或杀线虫蛋白。STA与二元肽或三元肽的N末端或包含(L-TP)n、(L-TP)n-L、(TP-L)n或L-(TP-L)n的构建体的N末端框内融合。在各种实施方案中，示例性杀昆虫和/或杀线虫蛋白可包含或选自以下从N末端至C末端的构建体或由所述构建体组成：(ERSP)-(L)-TP-(L)-TP、(ERSP)-(L)-TP-(L)-TP-(L)、(L-TP)n-L、(L-TP-L)n、(ERSP)-(TP-L)n、(ERSP)-(L)-(TP-L)n、(ERSP)-(L-TP)n、(ERSP)-(L-TP)n-(L)、(ERSP)-(STA)-(L-TP)n、(ERSP)-(STA)-(L-TP)n-(L)、(ERSP)-(STA)-(TP-L)n、或(ERSP)-(STA)-(L)-(TP-L)n、或(STA)-(L-TP)n、或(STA)-(L-TP)n-(L)、或(STA)-(TP-L)n、或(STA)-(L)-(TP-L)n，其中(L)是二元肽或三元肽，并且每个L可以相同或不同，TP是可以相同或不同的毒性肽，并且n是1至200，优选1至100，最优选1至10范围内的整数。在一些实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以包含相同或不同的TP，以及相同或不同的二元肽和/或三元肽。在一些实施方案中，C末端TP在其C末端与二元肽或三元肽融合或未融合。
在一些实施方案中，可接受包含本文所述的可切割连接肽的杀昆虫和/或杀线虫肽组合物的表达的转基因植物或其部分可包括：苜蓿、香蕉、大麦、豆、西兰花、卷心菜、油菜、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭菜、莴苣、火炬松、粟、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、杨树、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜属蔬菜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、西瓜和小麦植物细胞。在一些实施方案中，转基因植物可以从最初用本文所述的DNA构建体转化的细胞生长。在其他实施方案中，转基因植物可以在特定组织或植物部分(例如叶片、茎、花、萼片、果实、根或种子或其组合)中表达所编码的杀昆虫和/或杀线虫肽组合物。
在本发明的另一个方面，可以产生表达杀昆虫和/或杀线虫杀昆虫和/或杀线虫蛋白的转基因植物，所述蛋白当在合适的蛋白酶存在下切割时具有杀有害生物活性。上文通过实例描述的方法可用于产生转基因植物，但产生转基因植物细胞的方式对本发明并不重要。可以使用本领域已知或描述的方法，例如农杆菌属介导的转化、生物射弹转化(参见例如Kikkert JR1,Vidal JR,Reisch BI.,“Stable transformation of plant cells byparticle bombardment/biolistics.”,Methods Mol Biol.2005；286:61-78，其公开内容通过引用整体并入本文)以及非粒子介导的方法。表达杀昆虫和/或杀线虫杀昆虫和/或杀线虫蛋白的植物可以通过本领域描述的常规方法分离，例如通过转化愈伤组织、选择经转化的愈伤组织以及从这种转基因愈伤组织再生可育植物。在这样的过程中，可以使用任何基因作为选择性标记，只要其在植物细胞中的表达赋予鉴定或选择转化细胞的能力即可。
已经开发了许多与植物细胞一起使用的标记，例如对氯霉素、氨基糖苷G418、潮霉素等的抗性。编码叶绿体代谢中涉及到的产物的其他基因也可用作选择性标记。例如，尤其可以使用对植物除草剂如草甘膦、溴苯腈或咪唑啉酮提供抗性的基因。已经报道了此类基因(Stalker等人(1985)J.Biol.Chem.263:6310-6314(溴苯腈抗性腈水解酶基因)和Sathasivan等人(1990)Nucl.Acids Res.18:2188(AHAS咪唑啉酮抗性基因)。另外，本文公开的基因可用作评估细菌或植物细胞转化的标记。用于检测植物、植物器官(例如，叶片、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚或其后代中转基因的存在的方法是本领域熟知的。在一个实施方案中，通过测试杀有害生物活性来检测转基因的存在。
可以测试表达杀昆虫和/或杀线虫蛋白的可育植物的杀有害生物活性，并选择显示出最佳活性的植物以用于进一步育种。本领域存在用于测定有害生物活性的方法。通常，将切割的TP混合并用于进食测定。参见例如Marrone等人(1985)J.of EconomicEntomology78:290-293。
因此，本发明提供了转基因植物，其意指已经用DNA构建体转化的植物或其部分，所述DNA构建体包含与可操作启动子(例如，可在由此转化的植物细胞中操作的同源或异源启动子)可操作地连接的多核苷酸。在一些实施方案中，转化的多核苷酸编码：包含二元肽或三元肽的肽，其中所述肽包含至少4个氨基酸且最多16个氨基酸并且由2或3个不同的区域组成。二元肽具有2个不同的区域而三元肽具有3个不同的区域。二元肽和三元肽能够被动物(例如人)肠道蛋白酶和昆虫或线虫肠道蛋白酶二者切割。二元肽或三元肽与内质网信号肽(ERSP)的C末端可操作地融合，并且与TP的N末端可操作地融合。在各种实施方案中，用DNA构建体转化植物细胞，所述DNA构建体包含至少一个可操作地连接到可操作启动子(例如同源或异源启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码具有一种或多种可切割二元肽或三元肽的杀昆虫和/或杀线虫蛋白。杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含与二元肽或三元肽的N末端框内融合的ERSP，并且二元肽或三元肽与包含(TP-L)n的构建体框内融合，其中TP是毒性蛋白，L是二元肽或三元肽，并且n是1至200范围内的整数，并且其中C末端TP在其C末端与二元肽或三元肽融合或未融合。在一些实施方案中，本发明提供了转基因植物，其中在转基因植物或其部分中表达的杀昆虫和/或杀线虫蛋白衍生自DNA构建体，所述DNA构建体编码与二元肽或三元肽的N末端框内融合的ERSP，并且二元肽或三元肽与包含(TP-L)n的构建体框内融合，其中TP是毒性蛋白，L是二元肽或三元肽，并且n是1至200范围内的整数，并且其中C末端TP在其C末端与二元肽或三元肽融合或未融合。在各种实施方案中，示例性杀昆虫和/或杀线虫蛋白可包括以下结构：(ERSP)-(TP-L)n、或(ERSP)-(L)-(TP-L)n、或(ERSP)-(L-TP)n、或(ERSP)-(L-TP)n-(L)。在另一个实施方案中，植物或其部分包含与可操作启动子(例如同源或异源启动子)可操作地连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含与稳定化结构域(STA)的N末端框内融合的ERSP的杀昆虫和/或杀线虫蛋白。STA与二元肽或三元肽的N末端或包含(L-TP)n、(L-TP)n-L、(TP-L)n或L-(TP-L)n的构建体的N末端框内融合。在各种实施方案中，示例性杀昆虫和/或杀线虫蛋白可包含从N末端至C末端包含以下部分的构建体：(ERSP)-(L)-TP-(L)-TP、(ERSP)-(L)-TP-(L)-TP-(L)、(L-TP)n-L、(L-TP-L)n、(ERSP)-(TP-L)n、(ERSP)-(L)-(TP-L)n、(ERSP)-(L-TP)n、(ERSP)-(L-TP)n-(L)、(ERSP)-(STA)-(L-TP)n、(ERSP)-(STA)-(L-TP)n-(L)、(ERSP)-(STA)-(TP-L)n、或(ERSP)-(STA)-(L)-(TP-L)n、或(STA)-(L-TP)n、或(STA)-(L-TP)n-(L)、或(STA)-(TP-L)n、或(STA)-(L)-(TP-L)n，其中(L)是二元肽或三元肽，并且每个L可以相同或不同，TP是可以相同或不同的毒性肽，并且n是1至200，优选1至100，最优选1至10范围内的整数。在一些实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以包含相同或不同的TP，以及相同或不同的二元肽和/或三元肽。在一些实施方案中，C末端TP在其C末端与二元肽或三元肽融合或未融合。在上述内容的相关实施方案中，可用于制备编码(1)杀昆虫和/或杀线虫蛋白的DNA构建体或多核苷酸的TP可以包括一种或多种ICK TP，例如选自从属于阿特蛛亚科的澳大利亚漏斗网蜘蛛中分离的杀昆虫ICK肽的“ACTX”或“ACTX肽”家族的TP，例如一种或多种例如选自ω-ACTX TP、κ-ACTX TP和U-ACTXTP的TP，例如U+2-ACTX-Hv1a、U-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1b或杂合-ACTX-Hv1a肽，或与具有如SEQ ID NO:5、6和1761、1762、1767、1771-1773所示的氨基酸序列的肽或蛋白具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性或序列同源性的TP，及其变体(其中TP如果多于一个则可以是相同或不同的)，并且每种杀昆虫和/或杀线虫蛋白还包含一种或多种三元肽(上文称为L)，所述三元肽可包含选自IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF的二元肽的氨基酸序列，该氨基酸序列在二元肽的N末端、C末端或两个末端与选自GS、WN、WQ、MA、MV、AM、LH、MN、ES、WQ或DT或由其组成的Z区或间隔区序列框内融合。
在相关实施方案中，转基因植物表达和产生杀昆虫和/或杀线虫蛋白，所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白含有一个或多个可衍生自澳大利亚漏斗网蜘蛛或海葵的CRIP TP的拷贝。在一些实施方案中，用来自选自阿特蛛属或Hadronyche属的澳大利亚漏斗网蜘蛛的蜘蛛或选自沟迎风海葵(Anemonia viridis)的海葵的CRIP TP转化本文描述和举例说明的转化植物的真实或想象实例。转基因植物可以产生包含一种或多种ICK TP(例如杂合-ACTX-Hv1a)的杀昆虫和/或杀线虫蛋白。CRIP TP可以是表达时含有20-100个氨基酸和2-4个二硫键的ICK TP或非ICK TP。可用于本文公开的转基因肽的TP可具有与SEQ ID NO:5或6、SEQ IDNO:33-1032和SEQ ID NO:1761-1775及其变体至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更大的序列同一性。在各种实施方案中，当杀昆虫和/或杀线虫蛋白的二元肽和/或三元肽被昆虫和/或线虫肠道环境中存在的适当蛋白酶切割，从而从杀昆虫和/或杀线虫蛋白释放一种或多种TP时，所述CRIP TP中的一种或多种变得有活性，或在昆虫或线虫中发挥其杀昆虫和/或杀线虫活性。
(6).控制有害生物感染的方法
在本发明的各种实施方案中，提供了用于控制有害生物感染或侵染(可互换使用)的方法，其中有害生物可以是昆虫、线虫或两者。在一些实施方案中，用于控制这样的有害生物感染的方法包括在有害生物的食物中提供植物或其部分，其中该植物或其部分包含并表达编码如本文所述的杀昆虫和/或杀线虫TP的多核苷酸。在其他实施方案中，杀有害生物有效量的包含杀昆虫和/或杀线虫蛋白的组合物在植物暴露于有害生物之前或在有害生物感染或侵染期间施用于植物，使得含有杀昆虫和/或杀线虫蛋白的组合物的施用减少影响植物的有害生物的数量，或者降低因而与组合物接触的植物上的有害生物感染的严重性，并且任选地使得植物与不存在该组合物时暴露于相同有害生物的类似植物相比能够存活和/或生长。
在一些实施方案中，植物表达可操作以组成型或诱导型表达杀昆虫和/或杀线虫蛋白的多核苷酸。多核苷酸可以与可操作启动子(例如同源或异源启动子)可操作地连接，其中多核苷酸编码具有一种或多种可切割二元肽或三元肽的杀昆虫和/或杀线虫蛋白。杀昆虫和/或杀线虫蛋白可包括以下结构：(ERSP)-(TP-L)n、或(ERSP)-(L)-(TP-L)n、或(ERSP)-(L-TP)n、或(ERSP)-(L-TP)n-(L)。在另一个实施方案中，植物或其部分包含与可操作启动子(例如同源或异源启动子)可操作地连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码本文所述的杀昆虫和/或杀线虫蛋白，所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含与稳定化结构域(STA)的N末端框内融合的ERSP。STA与二元肽或三元肽的N末端或包含(L-TP)n、(L-TP)n-L、(TP-L)n或L-(TP-L)n的构建体的N末端框内融合。在各种实施方案中，示例性杀昆虫和/或杀线虫蛋白可包含或选自以下从N末端至C末端的构建体或由所述构建体组成：(ERSP)-(L)-TP-(L)-TP、(ERSP)-(L)-TP-(L)-TP-(L)、(L-TP)n-L、(L-TP-L)n、(ERSP)-(TP-L)n、(ERSP)-(L)-(TP-L)n、(ERSP)-(L-TP)n、(ERSP)-(L-TP)n-(L)、(ERSP)-(STA)-(L-TP)n、(ERSP)-(STA)-(L-TP)n-(L)、(ERSP)-(STA)-(TP-L)n、或(ERSP)-(STA)-(L)-(TP-L)n、或(STA)-(L-TP)n、或(STA)-(L-TP)n-(L)、或(STA)-(TP-L)n、或(STA)-(L)-(TP-L)n，其中(L)是二元肽或三元肽，并且每个L可以相同或不同，TP是可以相同或不同的毒性肽，并且n是1至200，优选1至100，最优选1至10范围内的整数。在一些实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以包含相同或不同的TP，以及相同或不同的二元肽和/或三元肽。在一些实施方案中，C末端TP在其C末端与二元肽或三元肽融合或未融合。在上文和本文公开的以上构建体中有用的TP可与SEQ IDNO:5或6、SEQ ID NO:33和/或选自SEQ ID NO:33-1032的TP及其变体具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更大的序列同一性。在上述内容的相关实施方案中，可用于制备编码(1)杀昆虫和/或杀线虫蛋白的DNA构建体或多核苷酸的TP可以包括一种或多种ICK TP，例如选自从属于阿特蛛亚科的澳大利亚漏斗网蜘蛛中分离的杀昆虫ICK肽的“ACTX”或“ACTX肽”家族的TP，例如一种或多种选自ω-ACTX TP、κ-ACTX TP和U-ACTX TP的TP，例如U+2-ACTX-Hv1a、U-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1b(其中TP如果多于一个则可以是相同的或不同的)，或与具有如SEQ ID NO:5、6和1761、1762、1767、1771-1773所示的氨基酸序列的肽或蛋白具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性或序列同源性的TP，及其变体(其中TP如果多于一个则可以是相同或不同的)，并且每种杀昆虫和/或杀线虫蛋白还包含一种或多种三元肽(上文称为L)，所述三元肽可包含选自IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF的二元肽的氨基酸序列，该氨基酸序列在二元肽的N末端、C末端或两个末端与选自GS、WN、WQ、MA、MV、AM、LH、MN、ES、WQ或DT或由其组成的Z区或间隔区序列框内融合。在相关实施方案中，用于控制有害生物感染的方法在植物或其部分(例如植物组织、植物细胞和/或植物种子)中提供杀昆虫和/或杀线虫蛋白的表达和合成。所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含一种或多种可切割接头肽，所述接头肽与一种或多种TP框内融合。在一些实施方案中，可切割接头肽是包含以下氨基酸序列的二元肽：X1-X2-Y1-Y2、X1-X2-X3-Y1-Y2、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2、X1-X2-Y1-Y2-Y3、X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3、X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4、X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4、Y1-Y2-X1-X2、Y1-Y2-X1-X2-X3、Y1-Y2-X1-X2-X3-X4、Y1-Y2-Y3-X1-X2、Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3、Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4，其中每个Xn和每个Yn均为氨基酸，并且其中每个Xn和每个Yn均为氨基酸，并且其中X1选自：(全部为单字母氨基酸格式)A、D、E、G、I、K、L、N、P、Q、R和V；X2选自A、F、G、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V和Y；X3选自A、D、E、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V和Y；X4选自：R、H、K、D、E、S、T、N、Q、G、A、I、L、M、F、W、Y和V。在一些实施方案中，Y1选自：(全部为单字母氨基酸格式)A、D、E、F、G、I、L、N、Q、S、T、V和Y；Y2选自F、G、I、L和Y；以及Y3选自A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V和Y；并且Y4选自：R、H、K、D、E、S、T、N、Q、G、A、I、L、M、F、W、Y和V。
在一些实施方案中，用于控制有害生物的方法中的说明性杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含一种或多种说明性二元肽(XY或YX)。在一些实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含具有以下氨基酸序列的可切割二元肽：AFVRLF(SEQ ID NO:1594)、AKLFV(SEQ ID NO:1595)、ALFALK(SEQ ID NO:1596)、ALFLK(SEQ ID NO:1597)、ALFLR(SEQ ID NO:1598)、ALFR(SEQ ID NO:1599)、ALFRLR(SEQ ID NO:1600)、ALKALF(SEQ ID NO:1601)、ALKFF(SEQ IDNO:1602)、ALKFLV(SEQ ID NO:1603)、ALKIFV(SEQ ID NO:1604)、ALKLFV(SEQ ID NO:1605)、FFADIK(SEQ ID NO:1606)、FFALK(SEQ ID NO:1607)、FFLK(SEQ ID NO:1608)、FFLR(SEQ ID NO:1609)、FFRLR(SEQ ID NO:1610)、FGYRIK(SEQ ID NO:1611)、FLRLF(SEQ IDNO:1612)、FYARR(SEQ ID NO:1613)、GGLRKK(SEQ ID NO:1614)、IFVALK(SEQ ID NO:1615)、IFVLK(SEQ ID NO:1616)、IFVLR(SEQ ID NO:1617)、IFVR(SEQ ID NO:1618)、IFVRLR(SEQID NO:1619)、ILFNIK(SEQ ID NO:1620)、LFAAPF(SEQ ID NO:1621)、FVALK(SEQ ID NO:1622)、LFVLK(SEQ ID NO:1623)、LFVLR(SEQ ID NO:1624)、LFVR(SEQ ID NO:1625)、LFVRLR(SEQ ID NO:1626)、LFVRVFL(SEQ ID NO:1627)、LGER(SEQ ID NO:1628)、LKALF(SEQ IDNO:1629)、LKFF(SEQ ID NO:1630)、LKIFV(SEQ ID NO:1631)、LKLFV(SEQ ID NO:1632)、LRALF(SEQ ID NO:1633)、LRFF(SEQ ID NO:1634)、LRIFV(SEQ ID NO:1635)、LRLFV(SEQ IDNO:1636)、RALF(SEQ ID NO:1637)、RIFV(SEQ ID NO:1638)、RLFV(SEQ ID NO:1639)、RLRALF(SEQ ID NO:1640)、RLRFF(SEQ ID NO:1641)、RLRIFV(SEQ ID NO:1642)、RLRLFV(SEQ ID NO:1643)、RRKAFV(SEQ ID NO:1644)、RRKLIF(SEQ ID NO:1645)、RRRFFA(SEQ IDNO:1646)、VFGRKG(SEQ ID NO:1647)和YFVRK(SEQ ID NO:1648)。
在各种实施方案中，说明性杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含具有以下氨基酸序列构建体的可切割三元肽：Z1-X1-X2-Y1-Y2、Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2、Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2、Z1-X1-X2-Y1-Y2-Y3、Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3、Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3、Z1-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4、Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4、Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4、Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2、Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2、Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2、Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Y3、Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3、Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3、Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4、Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4、Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4、Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2、Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2、Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2、Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Y3、Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3、Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3、Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4、Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4、Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2-Y3、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4、X1-X2-Y1-Y2-Z1、X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1、X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1、X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1、X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1、X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1、Z1-X1-X2-Y1-Y2-Z1、Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1、Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1、Z1-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1、Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1、Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1、Z1-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1、Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1、Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1、Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Z1、Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1、Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1、Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1、Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1、Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1、Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1、Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1、Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1、Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Z1、Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1、Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1、Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1、Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1、Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1、Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1、Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1、Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2-Z1、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1、X1-X2-Y1-Y2-Z1-Z2、X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1-Z2、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1-Z2、X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2、X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2、X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2、X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2、Z1-X1-X2-Y1-Y2-Z1-Z2、Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1-Z2、Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1-Z2、Z1-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2、Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2、Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2、Z1-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2、Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2、Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2、Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Z1-Z2、Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1-Z2、Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1-Z2、Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2、Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2、Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2、Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2、Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2、Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2、X1-X2-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3、X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3、X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3、X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3、X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3、X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3、Z1-X1-X2-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3、Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3、Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3、Z1-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3、Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3、Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3、Z1-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3、Z1-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3、Z1-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-Z4-X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3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4-X1-X2-X3-Z1、Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-Z1、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-Z1、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1、Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2、Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2、Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2、Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2、Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2、Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2、Z1-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2、Z1-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2、Z1-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2、Z1-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2、Z1-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2、Z1-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2、Z1-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2、Z1-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2、Z1-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2、Z1-Z2-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2、Z1-Z2-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2、Z1-Z2-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2、Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2、Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2、Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2、Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2、Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2、Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2、Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2-Z3、Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3、Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3、Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2-Z3、Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3、Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2-Z3、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3、Z1-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2-Z3、Z1-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3、Z1-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3、Z1-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2-Z3、Z1-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3、Z1-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3、Z1-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2-Z3、Z1-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3、Z1-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3、Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4、Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4、Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4、Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4、Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4、Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Z2-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Z2-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Z2-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Z2-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Z2-Z3-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-Z1-Z2-Z3-Z4、Z1-Z2-Z3-Z4-Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4-Z1-Z2-Z3-Z4，其中X1选自：(全部为单字母氨基酸格式)A、D、E、G、I、K、L、N、P、Q、R和V；X2选自A、F、G、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V和Y；X3选自A、D、E、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V和Y；X4选自：R、H、K、D、E、S、T、N、Q、G、A、I、L、M、F、W、Y和V。在一些实施方案中，Y1选自：(全部为单字母氨基酸格式)A、D、E、F、G、I、L、N、Q、S、T、V和Y；Y2选自F、G、I、L和Y；以及Y3选自A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V和Y；并且Y4选自：R、H、K、D、E、S、T、N、Q、G、A、I、L、M、F、W、Y和V。
在相关实施方案中，用于控制有害生物感染的方法在植物或其部分(例如植物组织、植物细胞和/或植物种子)中提供杀昆虫和/或杀线虫蛋白的表达和合成。所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含如上所述的二元肽，并且可包含与上文公开的说明性二元肽的N末端和/或C末端框内融合的两个氨基酸间隔区序列(Z区)，其中所述两个氨基酸间隔区序列Z1Z2序列可以是GS、WN、WQ、MA和MV中的一种或多种。
在一些实施方案中，用于上述方法的杀昆虫和/或杀线虫蛋白可包含具有一种或多种以下说明性氨基酸序列的可切割三元肽(ZXY或XYZ)：AFVRLFGS(SEQ ID NO:1649)、AKLFVGS(SEQ ID NO:1650)、ALFALKGS(SEQ ID NO:1651)、ALFLKGS(SEQ ID NO:1652)、ALFLRGS(SEQ ID NO:1653)、ALFRGS(SEQ ID NO:1654)、ALFRLRGS(SEQ ID NO:1655)、ALKALFGS(SEQ ID NO:1656)、ALKFFGS(SEQ ID NO:1657)、ALKFLVGS(SEQ ID NO:1658)、ALKIFVGS(SEQ ID NO:1659)、ALKLFVGS(SEQ ID NO:1660)、FFADIKGS(SEQ ID NO:1661)、FFALKGS(SEQ ID NO:1662)、FFLKGS(SEQ ID NO:1663)、FFLRGS(SEQ ID NO:1664)、FFRLRGS(SEQ ID NO:1665)、FGYRIKGS(SEQ ID NO:1666)、FLRLFGS(SEQ ID NO:1667)、FYARRGS(SEQID NO:1668)、GGLRKKGS(SEQ ID NO:1669)、IFVALKGS(SEQ ID NO:1670)、IFVLKGS(SEQ IDNO:1671)、IFVLRGS(SEQ ID NO:1672)、IFVRGS(SEQ ID NO:1673)、IFVRLRGS(SEQ ID NO:1674)、ILFNIKGS(SEQ ID NO:1675)、LFAAPFGS(SEQ ID NO:1676)、LFVALKGS(SEQ ID NO:1677)、LFVLKGS(SEQ ID NO:1678)、LFVLRGS(SEQ ID NO:1679)、LFVRGS(SEQ ID NO:1680)、LFVRLRGS(SEQ ID NO:1681)、LFVRVFLGS(SEQ ID NO:1682)、LGERGS(SEQ ID NO:1683)、LKALFGS(SEQ ID NO:1684)、LKFFGS(SEQ ID NO:1685)、LKIFVGS(SEQ ID NO:1686)、LKLFVGS(SEQ ID NO:1687)、LRALFGS(SEQ ID NO:1688)、LRFFGS(SEQ ID NO:1689)、LRIFVGS(SEQ ID NO:1690)、LRLFVGS(SEQ ID NO:1691)、RALFGS(SEQ ID NO:1692)、RIFVGS(SEQ ID NO:1693)、RLFVGS(SEQ ID NO:1694)、RLRALFGS(SEQ ID NO:1695)、RLRFFGS(SEQID NO:1696)、RLRIFVGS(SEQ ID NO:1697)、RLRLFVGS(SEQ ID NO:1698)、RRKAFVGS(SEQ IDNO:1699)、RRKLIFGS(SEQ ID NO:1700)、RRRFFAGS(SEQ ID NO:1701)、VFGRKGGS(SEQ IDNO:1702)、YFVRKGS(SEQ ID NO:1703)、GSAFVRLF(SEQ ID NO:1704)、GSAKLFV(SEQ ID NO:1705)、GSALFALK(SEQ ID NO:1706)、GSALFLK(SEQ ID NO:1707)、GSALFLR(SEQ ID NO:1708)、GSALFR(SEQ ID NO:1709)、GSALFRLR(SEQ ID NO:1710)、GSALKALF(SEQ ID NO:1711)、GSALKFF(SEQ ID NO:1712)、GSALKFLV(SEQ ID NO:1713)、GSALKIFV(SEQ ID NO:1714)、GSALKLFV(SEQ ID NO:1715)、GSFFADIK(SEQ ID NO:1716)、GSFFALK(SEQ ID NO:1717)、GSFFLK(SEQ ID NO:1718)、GSFFLR(SEQ ID NO:1719)、GSFFRLR(SEQ ID NO:1720)、GSFGYRIK(SEQ ID NO:1721)、GSFLRLF(SEQ ID NO:1722)、GSFYARR(SEQ ID NO:1723)、GSGGLRKK(SEQ ID NO:1724)、GSIFVALK(SEQ ID NO:1725)、GSIFVLK(SEQ ID NO:1726)、GSIFVLR(SEQ ID NO:1727)、GSIFVR(SEQ ID NO:1728)、GSIFVRLR(SEQ ID NO:1729)、GSILFNIK(SEQ ID NO:1730)、GSLFAAPF(SEQ ID NO:1731)、GSLFVALK(SEQ ID NO:1732)、GSLFVLK(SEQ ID NO:1733)、GSLFVLR(SEQ ID NO:1734)、GSLFVR(SEQ ID NO:1735)、GSLFVRLR(SEQ ID NO:1736)、GSLFVRVFL(SEQ ID NO:1737)、GSLGER(SEQ ID NO:1738)、GSLKALF(SEQ ID NO:1739)、GSLKFF(SEQ ID NO:1740)、GSLKIFV(SEQ ID NO:1741)、GSLKLFV(SEQ ID NO:1742)、GSLRALF(SEQ ID NO:1743)、GSLRFF(SEQ ID NO:1744)、GSLRIFV(SEQ ID NO:1745)、GSLRLFV(SEQ ID NO:1746)、GSRALF(SEQ ID NO:1747)、GSRIFV(SEQ ID NO:1748)、GSRLFV(SEQ ID NO:1749)、GSRLRALF(SEQ ID NO:1750)、GSRLRFF(SEQID NO:1751)、GSRLRIFV(SEQ ID NO:1752)、GSRLRLFV(SEQ ID NO:1753)、GSRRKAFV(SEQ IDNO:1754)、GSRRKLIF(SEQ ID NO:1755)、GSRRRFFA(SEQ ID NO:1756)、GSVFGRKG(SEQ IDNO:1757)和GSYFVRK(SEQ ID NO:1758)。
在各种实施方案中，用于上述方法的杀昆虫和/或杀线虫蛋白可由多核苷酸编码，该多核苷酸编码可切割三元肽，该三元肽具有如上文和本文所述的二元肽的氨基酸序列，且在二元肽的N末端添加间隔区，和/或在二元肽的C末端添加间隔区，其中间隔区是一个氨基酸或包含1-4个氨基酸，优选两个氨基酸的肽，例如GS、WN、WQ、MA或MV。下面提供了用作间隔区的其他特定间隔区实例和最佳氨基酸。在上述内容的相关实施方案中，可用于制备编码(1)杀昆虫和/或杀线虫蛋白的DNA构建体或多核苷酸的TP可以包括一种或多种ICK TP，例如选自从属于阿特蛛亚科的澳大利亚漏斗网蜘蛛中分离的杀昆虫ICK肽的“ACTX”或“ACTX肽”家族的TP，例如一种或多种选自ω-ACTX TP、κ-ACTX TP和U-ACTX TP的TP，例如U+2-ACTX-Hv1a、U-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1b(其中TP如果多于一个则可以是相同的或不同的)，或与具有如SEQ ID NO:5、6和1761、1762、1767、1771-1773所示的氨基酸序列的肽或蛋白具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性或序列同源性的TP，及其变体(其中TP如果多于一个则可以是相同或不同的)，并且每种杀昆虫和/或杀线虫蛋白还包含一种或多种三元肽(上文称为L)，所述三元肽可包含选自IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF的二元肽的氨基酸序列，该氨基酸序列在二元肽的N末端、C末端或两个末端与选自GS、WN、WQ、MA、MV、AM、LH、MN、ES、WQ或DT或由其组成的Z区或间隔区序列框内融合。
与如本文所述的一种或多种TP融合的示例性二元肽和三元肽(例如ALKLFV、ALKFLV或IFVRLR)可用于产生杀昆虫和/或杀线虫蛋白，所述蛋白在由转基因植物表达和合成时可对抗有害生物感染。在各种实施方案中，用于控制植物的有害生物感染的方法包括在田间种植种子或植物，其中所述植物或种子可操作以在植物中表达杀昆虫和/或杀线虫蛋白或组合物，或者施用包含含有一种或多种TP蛋白的杀昆虫和/或杀线虫蛋白的组合物，所述TP蛋白选自成孔杀昆虫蛋白(PFIP)和富半胱氨酸杀昆虫蛋白(CRIP)，例如，所述TP可以是抑制剂半胱氨酸结(ICK)基序蛋白、非ICK蛋白、Bt蛋白或这些蛋白的任意组合，以及使植物或种子在田间生长，所述植物或种子在有害生物存在下能够继续存活和/或在有害生物存在下能够在田间生长。在此类实施方案中，在消耗表达杀昆虫和/或杀线虫蛋白的植物或至少部分地涂有杀昆虫和/或杀线虫蛋白的植物后，有害生物感染得以减少，有害生物的至少一部分死亡。在一个实施方案中，可用在控制有害生物感染的方法中的TP可包括衍生自或源自澳大利亚蓝山漏斗网蜘蛛、悉尼漏斗网蜘蛛(Atrax robustus)、树状漏斗网蜘蛛(Atrax formidabilis)、Atrax infensus的抑制剂半胱氨酸结(ICK)基序蛋白，包括称为U-ACTX多肽的TP：U-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1b，选自ω-ACTX TP、κ-ACTX TP和U-ACTX TP，例如U+2-ACTX-Hv1a、U-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1b或杂合-ACTX-Hv1a肽，或与具有如SEQ ID NO:5、6和1761、1762、1767、1771-1773所示的氨基酸序列的肽或蛋白具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性或序列同源性的TP，及其突变体或变体。
在一些实施方案中，控制植物的有害生物感染的方法提供杀有害生物有效量的由植物或其部分以杀昆虫和/或杀线虫蛋白形式合成的一种或多种TP。在一些实施方案中，包含一种或多种在暴露于昆虫和/或线虫肠道环境时可切割的TP的杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以从转化到植物或其部分中的DNA构建体产生。在一些实施方案中，示例性DNA构建体编码一种或多种杀昆虫和/或杀线虫蛋白，每种杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含与二元肽或三元肽的N末端框内融合的ERSP，并且二元肽或三元肽与包含(TP-L)n或(L-TP)n的构建体框内融合，其中每个TP是毒性蛋白，L是二元肽或三元肽，并且n是1至200范围内的整数，并且其中C末端TP在其C末端与二元肽或三元肽融合或未融合。当n大于1时，每个TP和每个L可以是相同或不同的。
在其他实施方案中，用于控制这种有害生物感染的示例性方法包括在有害生物的食物中提供植物或其部分，其中所述植物或其部分包含并表达编码含有一种或多种如本文所述的TP的杀昆虫和/或杀线虫杀昆虫和/或杀线虫蛋白的多核苷酸。在一些实施方案中，植物组成型或诱导型表达多核苷酸。多核苷酸可以与可操作启动子(例如同源或异源启动子)可操作地连接，其中多核苷酸编码具有一种或多种可切割二元肽或三元肽的杀昆虫和/或杀线虫蛋白。杀昆虫和/或杀线虫蛋白可包括以下结构：(ERSP)-(TP-L)n、或(ERSP)-(L)-(TP-L)n、或(ERSP)-(L-TP)n、或(ERSP)-(L-TP)n-(L)。在另一个实施方案中，植物或其部分包含与可操作启动子(例如同源或异源启动子)可操作地连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含与稳定化结构域(STA)的N末端框内融合的ERSP的杀昆虫和/或杀线虫蛋白。STA与二元肽或三元肽的N末端或包含(L-TP)n、(L-TP)n-L、(TP-L)n或L-(TP-L)n的构建体的N末端框内融合。在各种实施方案中，示例性杀昆虫和/或杀线虫蛋白可包含以下从N末端至C末端的构建体：(ERSP)-(L)-TP-(L)-TP、(ERSP)-(L)-TP-(L)-TP-(L)、(L-TP)n-L、(L-TP-L)n、(ERSP)-(TP-L)n、(ERSP)-(L)-(TP-L)n、(ERSP)-(L-TP)n、(ERSP)-(L-TP)n-(L)、(ERSP)-(STA)-(L-TP)n、(ERSP)-(STA)-(L-TP)n-(L)、(ERSP)-(STA)-(TP-L)n、或(ERSP)-(STA)-(L)-(TP-L)n、或(STA)-(L-TP)n、或(STA)-(L-TP)n-(L)、或(STA)-(TP-L)n、或(STA)-(L)-(TP-L)n，其中(L)是二元肽或三元肽，并且每个L可以相同或不同，TP是可以相同或不同的毒性肽，并且n是1至200，优选1至100，最优选1至10范围内的整数。在一些实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以包含相同或不同的TP，以及相同或不同的二元肽和/或三元肽。在本文公开的转基因植物或其部分中有用的TP可与SEQ ID NO:5或6、SEQ ID NO:33和/或选自SEQ ID NO:33-1032的肽及其变体具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更大的序列同一性。在一些实施方案中，C末端TP在其C末端与二元肽或三元肽融合或未融合。在上述内容的相关实施方案中，可用于制备编码(1)杀昆虫和/或杀线虫蛋白的DNA构建体或多核苷酸的TP可以包括一种或多种ICKTP，例如选自从属于阿特蛛亚科的澳大利亚漏斗网蜘蛛中分离的杀昆虫ICK肽的“ACTX”或“ACTX肽”家族的TP，例如一种或多种选自ω-ACTX TP、κ-ACTX TP和U-ACTX TP的TP，例如U+2-ACTX-Hv1a、U-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1a、rU-ACTX-Hv1b，或与具有如SEQ ID NO:5、6和1761、1762、1767、1771-1773所示的氨基酸序列的肽或蛋白具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性或序列同源性的TP，及其变体(其中TP如果多于一个则可以是相同或不同的)，并且其中DNA构建体或多核苷酸还编码(2)与至少一种二元肽或三元肽框内融合的一种或多种三元肽(上文称为L)，所述三元肽可包含选自IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF的二元肽的氨基酸序列，该氨基酸序列在二元肽的N末端、C末端或两个末端与选自GS、WN、WQ、MA、MV、AM、LH、MN、ES、WQ或DT或由其组成的Z区或间隔区序列框内融合。
在一些实施方案中，用于控制昆虫和/或线虫有害生物感染或侵染的方法可包括产生包含杀昆虫和/或杀线虫蛋白的组合的转基因植物，每种杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含Bt(苏云金芽孢杆菌)TP或ICK(抑制剂胱氨酸结)TP，所述TP在被所述昆虫和/或线虫摄取时，将发挥杀昆虫和/或杀线虫活性并控制或减少或消除有害生物感染和/或侵染。该植物可以由DNA的独立稳定的遗传插入而制备，所述插入产生表达Bt TP的开花植物和表达ICKTP的第二开花植物。这些植物之一的花粉将被杂交到另一植物的雌花器官上以形成包含BtTP和ICK TP两种遗传性状的基因杂交。该有性杂交和导致这两种性状得以遗传的进一步杂交所产生的后代将产生针对所述昆虫和/或线虫的包含Bt(苏云金芽孢杆菌)TP和ICK(抑制剂胱氨酸结)TP的组合的转基因植物。
在一些实施方案中，本文所述的DNA构建体可编码杀昆虫和/或杀线虫蛋白，所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白含有适于治疗特定植物或植物群(例如特定类型的作物)中的特定有害生物侵染的特定TP。在一个实施方案中，本发明的杀昆虫和/或杀线虫蛋白可包含选自以下一者或多者的TP：Cry 1A.l05、Cry2Ab2、Cry1F、Cry3Bbl、Cry34Ab1和Cry35Ab1。这些TP可以单独表达或组合表达以处理特定作物，例如玉米。在一些实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白具有从N末端到C末端的以下结构：(ERSP)-(L)-TP-(L)-TP、(ERSP)-(L)-TP-(L)-TP-(L)、(L-TP)n-L、(L-TP-L)n、(ERSP)-(TP-L)n、(ERSP)-(L)-(TP-L)n、(ERSP)-(L-TP)n、(ERSP)-(L-TP)n-(L)、(ERSP)-(STA)-(L-TP)n、(ERSP)-(STA)-(L-TP)n-(L)、(ERSP)-(STA)-(TP-L)n、或(ERSP)-(STA)-(L)-(TP-L)n、或(STA)-(L-TP)n、或(STA)-(L-TP)n-(L)、或(STA)-(TP-L)n、或(STA)-(L)-(TP-L)n，其中(L)是二元肽或三元肽，并且每个L可以相同或不同，TP是可以相同或不同的毒性肽，并且n是1至200，优选1至100，最优选1至10范围内的整数。在一些实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白可包含相同或不同的TP，以及相同或不同的二元肽和/或三元肽，其中TP是选自Cry 1A.l05、Cry2Ab2、Cry1F、Cry3Bbl、Cry34Ab1和Cry35Ab1或其组合的毒性蛋白，L是二元肽或三元肽，并且n是1至200范围内的整数，优选地1至100范围内的整数，更优选地1至10范围内的整数，所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白可用于处理以下玉米有害生物：欧洲玉米螟(European corn borer，ECB)、西南玉米螟(Southwestern corn borer，SWCB)、南方玉米秆螟(Southern cornstalk borer，SCSB)、玉米穗虫(Corn earworm，CEW)、秋粘虫(Fall armyworm，FAW)、秆螟(Stalk borer)、小玉米秆螟(Lesser corn stalk borer)、甘蔗螟(Sugarcane borer，SCB)、西方豆类夜盗虫(Western bean cutworm，WBC)、小地老虎(Black cutworm)、西方玉米根虫(Western cornrootworm，WCRW)、北方玉米根虫(Northern corn rootworm，NCRW)或墨西哥玉米根虫(Mexican corn rootworm，MCRW)。
在其他实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白具有从N末端到C末端的以下结构：(ERSP)-(L)-TP-(L)-TP、(ERSP)-(L)-TP-(L)-TP-(L)、(L-TP)n-L、(L-TP-L)n、(ERSP)-(TP-L)n、(ERSP)-(L)-(TP-L)n、(ERSP)-(L-TP)n、(ERSP)-(L-TP)n-(L)、(ERSP)-(STA)-(L-TP)n、(ERSP)-(STA)-(L-TP)n-(L)、(ERSP)-(STA)-(TP-L)n、或(ERSP)-(STA)-(L)-(TP-L)n、或(STA)-(L-TP)n、或(STA)-(L-TP)n-(L)、或(STA)-(TP-L)n、或(STA)-(L)-(TP-L)n，其中(L)是二元肽或三元肽，并且每个L可以相同或不同，TP是可以相同或不同的毒性肽，并且n是1至200，优选1至100，最优选1至10范围内的整数。在一些实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以包含相同或不同的TP，以及相同或不同的二元肽和/或三元肽，其中TP是棉Cry 1AC，可用于处理以下棉花PIP(Bollgard I和II-第一个基因，然后是两个基因)有害生物：棉铃虫(CBW)Helicoverpa zea(Boddie)、烟芽夜蛾(TBW)Heliothis virescens和棉红铃虫(PBW)Pectinophora gossypiella(Sanders)。在相关实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白具有从N末端到C末端的以下结构：(ERSP)-(L)-TP-(L)-TP、(ERSP)-(L)-TP-(L)-TP-(L)、(L-TP)n-L、(L-TP-L)n、(ERSP)-(TP-L)n、(ERSP)-(L)-(TP-L)n、(ERSP)-(L-TP)n、(ERSP)-(L-TP)n-(L)、(ERSP)-(STA)-(L-TP)n、(ERSP)-(STA)-(L-TP)n-(L)、(ERSP)-(STA)-(TP-L)n、或(ERSP)-(STA)-(L)-(TP-L)n、或(STA)-(L-TP)n、或(STA)-(L-TP)n-(L)、或(STA)-(TP-L)n、或(STA)-(L)-(TP-L)n，其中(L)是二元肽或三元肽，并且每个L可以相同或不同，TP是可以相同或不同的毒性肽，并且n是1至200，优选1至100，最优选1至10范围内的整数。在一些实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以包含相同或不同的TP，以及相同或不同的二元肽和/或三元肽，其中TP是棉Cry1Ac和/或Cry2Ab，可用于处理以下棉花有害生物：棉铃虫(CBW)Helicoverpa zea(Boddie)、烟芽夜蛾(TBW)Heliothis virescens、棉红铃虫(PBW)Pectinophora gossypiella(Sanders)、秋粘虫(FAW)、甜菜夜蛾(Beet armyworm，BAW)和大豆夜蛾(Soybean looper，SBL)。
在其他实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白具有从N末端到C末端的以下结构：(ERSP)-(L)-TP-(L)-TP、(ERSP)-(L)-TP-(L)-TP-(L)、(L-TP)n-L、(L-TP-L)n、(ERSP)-(TP-L)n、(ERSP)-(L)-(TP-L)n、(ERSP)-(L-TP)n、(ERSP)-(L-TP)n-(L)、(ERSP)-(STA)-(L-TP)n、(ERSP)-(STA)-(L-TP)n-(L)、(ERSP)-(STA)-(TP-L)n、或(ERSP)-(STA)-(L)-(TP-L)n、或(STA)-(L-TP)n、或(STA)-(L-TP)n-(L)、或(STA)-(TP-L)n、或(STA)-(L)-(TP-L)n，其中(L)是二元肽或三元肽，并且每个L可以相同或不同，TP是可以相同或不同的毒性肽，并且n是1至200，优选1至100，最优选1至10范围内的整数。在一些实施方案中，杀昆虫和/或杀线虫蛋白可以包含相同或不同的TP，以及相同或不同的二元肽和/或三元肽，其中TP是大豆Cry1Ac，可以用于处理以下大豆PIP有害生物：藜豆毛虫(velvetbean caterpillar)(Anticarcia gemmatalis)、大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)、大豆卷叶蛾(soybeananxil borer)(Epinotia aporema)和向日葵尺蠖(sunflower looper)(Rachiplusia nu)。
在一些实施方案中，该方法规定用DNA构建体转化一个植物细胞或多个植物细胞，所述DNA构建体编码包含杀昆虫和/或杀线虫杀昆虫和/或杀线虫蛋白的组合物。转化的植物可以是重组植物、植物的一部分、或者植物或植物部分的产物。虽然可以实现植物或植物部分的转化，但杀昆虫和/或杀线虫组合物可以在宿主细胞中以重组方式产生，包括细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、植物宿主细胞或动物宿主细胞。在一些实施方案中，可以在酵母生产菌株或细菌生产菌株中合成包含ERSP、一种或多种可切割连接肽和一种或多种TP的杀昆虫和/或杀线虫蛋白，以产生毫克、克或千克量的杀昆虫和/或杀线虫蛋白，以施用于多棵植物或植物田间，即施用于作物以控制或预防有害生物感染。在一些实施方案中，可以在一种或多种局部施用于植物或植物的一部分上的制剂中提供杀有害生物有效量的杀昆虫和/或杀线虫蛋白，其中杀昆虫和/或杀线虫蛋白在包含杀昆虫和/或杀线虫蛋白的细菌细胞、细菌孢子、真菌细胞、真菌孢子或伴孢晶体中配制。可选地，含有杀昆虫和/或杀线虫蛋白的杀昆虫和/或杀线虫组合物可以直接施用于植物表面。
如本文所用，本文所述的杀有害生物有效量的杀昆虫和/或杀线虫蛋白包括当将从杀昆虫和/或杀线虫蛋白中切割的TP时适当地递送到昆虫和/或线虫栖息的位置时可抑制生长、损害运动或甚至杀死昆虫和/或线虫的任何量。在各种实施方案中，含有杀昆虫和/或杀线虫蛋白的组合物可以配制成粉末、乳液、溶液、颗粒、微粉化粒子等，以及本领域中用于施用杀昆虫蛋白如Bt蛋白的、可以施用于需要控制有害生物的植物表面的其他制剂和组合物形式。如此分布的TP的量(假定至少50％的TP从杀昆虫和/或杀线虫蛋白中切割和释放)可以使用本领域技术人员已知的C18rpHPLC方法定量。
在本文所述的实施方案中，包含一种或多种TP和一种或多种可切割接头的本发明的杀昆虫和/或杀线虫蛋白对多种昆虫和线虫有效。本文提供的方法可用于控制、预防或降低有害生物感染的严重性，杀死在其食物中消耗植物或其部分的昆虫和/或线虫，优化植物的生长潜力，提高易受有害生物感染的作物的产量，以及用于需要控制和/或消除以植物组织为食的昆虫和/或线虫的各种其他方法。对本文所述的方法、组合物和方法敏感的各种类型的昆虫和线虫如下。
昆虫和线虫：昆虫可以选自鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthroptera)、缨翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、虱目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等等。更具体地，昆虫有害生物包括鞘翅目、鳞翅目和双翅目。
对于用杀昆虫多肽处理而言，具有合适的农业、家庭和/或医学/兽医学重要性的昆虫包括但不限于下列纲和目的成员。
鞘翅目包括肉食亚目(suborder Adephaga)和多食亚目(suborder Polyphaga)。肉食亚目包括步甲总科(superfamily Caraboidea)和豉甲总科(superfamilyGyrinoidea)。多食亚目包括牙甲总科(superfamily Hydrophiloidea)、隐翅甲总科(superfamily Staphylinoidea)、花萤总科(superfamily Cantharoidea)、郭公虫总科(superfamily Cleroidea)、叩头虫总科(superfamily Elateroidea)、花甲总科(superfamily Dascilloidea)、泥甲总科(superfamily Dryopoidea)、丸甲总科(superfamily Byrrhoidea)、扁甲总科(superfamily Cucujoidea)、芜菁总科(superfamily Meloidea)、花蚤总科(superfamily Mordelloidea)、拟步甲总科(superfamily Tenebrionoidea)、长蠹总科(superfamily Bostrichoidea)、金龟总科(superfamily Scarabaeoidea)、天牛总科(superfamily Cerambycoidea)、叶甲总科(superfamily Chrysomeloidea)以及象甲总科(superfamily Curculionoidea)。步甲总科包括虎甲科(family Cicindelidae)、步甲科(family Carabidae)以及龙虱科(familyDytiscidae)。豉甲总科包括豉甲科(family Gyrinidae)。牙甲总科包括牙甲科(familyHydrophilidae)。隐翅甲总科包括葬甲科(family Silphidae)和隐翅甲科(familyStaphylinidae)。花萤总科包括花萤科(family Cantharidae)和萤科(familyLampyridae)。郭公虫总科包括郭公虫科(family Cleridae)和皮蠹科(familyDermestidae)。叩头虫总科包括叩头虫科(family Elateridae)和吉丁虫科(familyBuprestidae)。扁甲总科包括瓢虫科(family Coccinellidae)。芫菁总科包括芜菁科(family Meloidae)。拟步甲总科包括拟步甲科(family Tenebrionidae)。金龟总科包括黑蜕科(family Passalidae)和金龟科(family Scarabaeidae)。天牛总科包括天牛科(family Cerambycidae)。叶甲总科包括叶甲科(family Chrysomelidae)。象甲总科包括象甲科(family Curculionidae)和小蠹科(family Scolytidae)。
鞘翅目的实例包括但不限于：美国豆象(菜豆象(Acanthoscelides obtectus))、叶甲(杨毛臀萤叶甲(Agelastica alni))、叩甲(直条叩甲(Agriotes lineatus)、暗色叩甲(Agriotes obscurus)、二色叩甲(Agriotes bicolor))、谷盗(米扁虫(Ahasverusadvena))、马铃薯鳃金龟(summer schafer Amphimallon solstitialis)、家具窃蠹(furniture beetle,Anobium punctatum)、花象属种(Anthonomus spp.)(象鼻虫)、甜菜隐食甲(Pygmy mangold beetle,Atomaria linearis)、地毯甲虫类(圆皮蠹属种(Anthrenusspp.)、毛皮蠹属种(Attagenus spp.))、豇豆象(四纹豆象(Callosobruchus maculates))、干果甲虫(黄斑露尾甲(Carpophilus hemipterus))、卷心菜荚象甲(白菜房原象甲(Ceutorhynchus assimilis))、冬油菜茎象甲(Ceutorhynchus picitarsis)、线虫(烟草金针虫(Conoderus vespertinus)和南方马铃薯金针虫(Conoderus falli))、香蕉象甲(香蕉根颈象(Cosmopolites sordidus))、新西兰草地蛴螬(新西兰草金龟Costelytrazealandica))、六月金龟(绿六月花金龟(Cotinis nitida))、向日葵茎象(密点细枝象(Cylindrocopturus adspersus))、火腿皮蠹(Dermestes lardarius)、玉米根虫(玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera))、西方玉米根虫(Diabrotica virgifera virgifera)和巴氏根萤叶甲(Diabrotica barberi)、墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis)、北美家天牛(Hylotropes bajulus)、紫苜蓿叶象(Hypera postica)、裸蛛甲(Gibbium psylloides)、烟草甲(Lasioderma serricorne)、科罗拉多马铃薯甲虫(马铃薯叶甲(Leptinotarsadecemlineata))、粉蠹属(Lyctus)甲虫(粉蠹属种)、露尾甲(油菜花露尾甲(Meligethesaeneus))、五月鳃金龟(Melolontha melolontha)、美洲蜘蛛甲(Mezium americanum)、黄蛛甲(Niptus hololeucus)、谷盗类(锯谷盗(Oryzaephilus surinamensis)和大眼锯谷盗(Oryzaephilus mercator))、葡萄黑耳喙象(Otiorhynchus sulcatus)、芥甲虫(辣根猿叶甲(Phaedon cochleariae))、十字花科植物跳甲(蔬菜黄条跳甲(Phyllotretacruciferae))、黄曲条跳甲(Phyllotreta striolata)、卷心菜茎跳甲(油菜蚤跳甲(Psylliodes chrysocephala))、蛛甲属(Ptinus)种(蜘甲)；谷蠹(Rhizoperthadominica)、豌豆象(条纹根瘤象甲(Sitona lineatus))、米象和谷象(米象(Sitophilusoryzae)和谷象(Sitophilus granaries))、红色瓜子象(黄褐小爪象(Smicronyxfulvus))、窃蠹(药材甲(Stegobium paniceum))、大黄粉虫(黄粉虫(Tenebrio molitor))、粉甲(赤拟谷盗(Tribolium castaneum)和杂拟谷盗(Tribolium confusum))、仓库和橱柜甲虫(斑皮蠹属种(Trogoderma spp.))和向日葵叶甲(Zygogramma exclamation's)。
革翅目(蠼螋类)的实例包括但不限于：欧洲球螋普通蠼螋(Forficulaauricularia)和河岸蠼螋(Labidura riparia)。
网翅目(Dictvonptera)的实例包括但不限于：东方蜚蠊(Blatta orientalis)、德国小蠊(Blatella germanica)、马德拉蜚蠊(Leucophaea maderae)、美洲大蠊(Periplaneta americana)和烟色大蠊(Periplaneta fuliginosa)。
倍足亚纲(Diplonoda)的实例包括但不限于：带斑蛇千足虫(Blaniulusguttulatus)、平脊千足虫(Brachydesmus superus)和温室千足虫(Oxidus gracilis)。
双翅目包括长角亚目(Nematocera)、短角亚目(Brachycera)以及环裂亚目(Cyclorrhapha)。长角亚目包括大蚊科(Tipulidae)、毛蠓科(Psychodidae)、蚊科(Culicidae)、蠓科(Ceratopogonidae)、摇蚊科(Chironomidae)、蚋科(Simuliidae)、毛蚊科(Bibionidae)以及瘿蚊科(Cecidomyiidae)。短角亚目包括水虻科(Stratiomyidae)、虻科(Tabanidae)、剑虻科(Therevidae)、食虫虻科(Asilidae)、拟食虫虻科(Mydidae)、蜂虻科(Bombyliidae)以及长足虻科(Dolichopodidae)。环裂亚目包括无缝组(DivisionAschiza)和无缝组(Aschiza)。无缝组包括蚤蝇科(Phoridae)、蚜蝇科(Syrphidae)和眼蝇科(Conopidae)。有缝组包括无瓣类(Acalyptratae)和有瓣类(Calyptratae)。无瓣类包括斑蝇科(Otitidae)、实蝇科(Tephritidae)、潜蝇科(Agromyzidae)以及果蝇科(Drosophilidae)。有瓣类包括虱蝇科(Hippoboscidae)、狂蝇科(Oestridae)、寄蝇科(Tachinidae)、花蝇科(Anthomyiidae)、蝇科(Muscidae)、丽蝇科(Calliphoridae)以及麻蝇科(Sarcophagidae)。
双翅目的实例包括但不限于：家蝇(Musca domestica)、非洲盾波蝇(Cordylobiaanthropophaga)、拟蚊蠓(库蠓属种(Culicoides spp.))、蜂虱(蜂虱蝇属种(Braulaspp.))、甜菜浅叶花蝇(Pegomyia betae)、黑蝇(斯蚋属种(Cnephia spp.)、真蚋属种(Eusimulium spp.)、蚋属种(Simulium spp.))、胃蝇(黄蝇属种(Cuterebra spp.)、胃蝇属种(Gastrophilus spp.)、狂蝇属种(Oestrus spp.))、大蚊(大蚊属种(Tipula spp.))、眼潜蝇(潜蝇属种(Hippelates spp.))、污物繁殖蝇(丽蝇属种(Calliphora spp.)、厕蝇属种(Fannia spp.)、水虻属种(Hermetia spp.)、绿蝇属种(Lucilia spp.)、家蝇属种(Muscaspp.)、腐蝇属种(Muscina spp.)、金属色绿蝇属种(Phaenicia spp.)、伏蝇属种(Phormiaspp.))、麻蝇(食肉麻蝇种(Sarcophaga spp.)、污蝇属种(Wohlfahrtia spp.))；欧小蝇(黑麦秆蝇(Oscinella frit))、果蝇(寡鬃实蝇属种(Dacus spp.))、果蝇属种(Drosophilaspp.))、齿股蝇属(齿股蝇属种(Hydrotea spp.))、小麦瘿蝇(Mayetiola destructor)、黑角蝇(黑角蝇属种(Haematobia spp.))、马蝇和斑虻(斑虻属种(Chrysops spp.))、麻虻属种(Haematopota spp.)、虻属种(Tabanus spp.))、虱蝇(羊虱蝇属种(Lipoptena spp.))、拟虱蝇属种(Lynchia spp.)和鸽虱蝇属种(Pseudolynchia spp.))、地中海果蝇(Ceratitus spp.)、蚊(伊蚊属种(Aedes spp.)、按蚊属种(Anopheles spp.)、库蚊属种(Culex spp.)、鳞蚊属种(Psorophora spp.))、白蛉(白蛉属种(Phlebotomus spp.)、罗蛉属种(Lutzomyia.spp.))、旋丽蝇(蛆症金蝇(Chtysomya bezziana)和螺旋蛆蝇(Cochliomyia hominivorax))、绵羊蜱(蜱蝇属种(Melophagus spp.))；厩螫蝇(螫蝇属种(Stomoxys spp.))、采采蝇(舌蝇属种(Glossina spp.))和皮蝇(皮蝇属种(Hypodermaspp.))。
等翅目(白蚁类)的实例包括但不限于：来自草白蚁科(Hodotermitidae)、木白蚁科(Kalotermitidae)、澳白蚁科(Mastotermitidae)、鼻白蚁科(Rhinotennitidae)、齿白蚁科(Serritermitidae)、白蚁科(Termitidae)、原白蚁科(Termopsidae)的种
异翅亚目(Heteroptera)的实例包括但不限于：臭虫(温带臭虫(Cimexlectularius))、污棉虫(中棉红蝽(Dysdercus intermedius))、阳光虫(麦扁盾蝽(Eurygaster integriceps))、牧草盲蝽(Lygus lineolaris)、喜绿蝽(青臭龟虫(Nezaraantennata))、稻绿蝽(Nezara viridula))和锥猎蝽(大锥蝽(Panstrogylus megistus)、红猎蝽(Rhodnius ecuadoriensis)、浅红色猎蝽(Rhodnius pallescans)、长红猎蝽(Rhodnius prolixus)、Rhodnius robustus、二分锥蝽(Triatoma dimidiata)、骚扰锥蝽(Triatoma infestans)和泥色锥蝽(Triatoma sordida))。
同翅目的实例包括但不限于：加利福尼亚红圆蚧(Aonidiella aurantii)、蚕豆蚜(Aphis fabae)、棉蚜(Aphis gossypii)、苹果蚜(Aphis pomi)、黑刺粉虱(Aleurocanthusspiniferus)、夹竹桃圆蚧(Aspidiotus hederae)、棉粉虱(Bemesia tabaci)、甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae)、梨黄木虱(Cacopsylla pyricola)、醋栗蚜(Cryptomyzusribis)、葡萄根瘤蚜(Daktulosphaira vitifoliae)、桔木虱Diaphorina citri)、马铃薯微叶蝉(Empoasca fabae)、蚕豆微叶蝉(Empoasca solana)、葡萄微叶蝉(Empoasca vitis)、绵蚜(Eriosoma lanigerum)、欧洲果圆蚧(Eulecanium corni)、桃大尾蚜(Hyalopterusarundinis)、稻灰飞虱(Laodelphax striatellus)、马铃薯长管蚜(Macrosiphumeuphorbiae)、桃蚜(Myzus persicae)、稻叶蝉(Nephotettix cinticeps)、稻褐飞虱(Nilaparvata lugens)、成瘿瘤蚜(瘿绵蚜属种(Pemphigus spp.))、忽布疣额蚜(Phorodonhumuli)、粟缢蚜(Rhopalosiphum padi)、乌盔蚧(Saissetia oleae)、麦二岔蚜(Schizaphis graminum)、燕麦长管蚜(Sitobion avenae)和温室白粉虱(Trialeurodesvaporariorum)。
等足目(Isopoda)的实例包括但不限于：鼠妇(common pillbug,Armadillidiumvulgare)和鼠妇(common woodlouse,Oniscus asellus)。
鳞翅目包括凤蝶科(Papilionidae)、粉蝶科(Pieridae)、灰蝶科(Lycaenidae)、蛱蝶科(Nymphalidae)、斑蝶科(Danaidae)、眼蝶科(Satyridae)、弄蝶科(Hesperiidae)、天蛾科(Sphingidae)、天蚕蛾科(Saturniidae)、尺娥科(Geometridae)、灯娥科(Arctiidae)、夜蛾科(Noctuidae)、毒蛾科(Lymantriidae)、透翅蛾科(Sesiidae)以及谷蛾科(Tineidae)。
鳞翅目的实例包括但不限于：Adoxophyes orana(茶小卷叶蛾)、Agrotis ipsolon(小地老虎)、Archips podana(苹褐长翅卷蛾)、Bucculatrix pyrivorella(梨潜蛾)、Bucculatrix thurberiella(棉叶穿孔潜蛾)、Bupalus piniarius(松尺蠖)、Carpocapsapomonella(苹果蠹蛾)、Chilo suppressalis(二化螟)、Choristoneura fumiferana(东部云杉色卷蛾)、Cochylis hospes(向日葵细圈叶蛾)、Diatraea grandiosella(西南玉米秆草螟)、Earls insulana(埃及金刚钻)、Euphestia kuehniella(地中海粉螟)、Eupoeciliaambiguella(欧洲葡萄卷叶蛾)、Euproctis chrysorrhoea(黄毒蛾)、Euproctis subflava(东方毒蛾)、Galleria mellonella(大蜡螟)、Helicoverpa armigera(棉铃虫)、Helicoverpa zea(棉铃虫)、Heliothis virescens(烟夜蛾)、Hofmannophilapseudopretella(褐织叶蛾)、Homeosoma electellum(向日葵斑螟)、Homona magnanima(东方茶树卷蛾)、Lithocolletis blancardella(斑幕潜叶蛾)、Lymantria dispar(舞毒蛾)、Malacosoma neustria(黄褐天幕毛虫)、Mamestra brassicae(甘蓝夜蛾)、Mamestraconfigurata(披肩粘虫)、天蛾幼虫Manduca sexta和Manuduca quinquemaculata、Operophtera brumata(冬尺蠖)、Ostrinia nubilalis(欧洲玉米螟)、Panolis flammea(小眼夜蛾)、Pectinophora gossypiella(棉红铃虫)、Phyllocnistis citrella(桔细潜蛾)、Pieris brassicae(大菜粉蝶)、Plutella xylostella(小菜蛾)、Rachiplusia ni(大豆尺夜蛾)、Spilosoma virginica(黄色熊蛾)、Spodoptera exigua(甜菜夜蛾)、Spodopterafrugiperda(秋夜蛾)、Spodoptera littoralis(海灰翅夜蛾)、Spodoptera litura(斜纹夜蛾)、Spodoptera praefica(黄纹夜蛾)、Sylepta derogata(棉卷叶螟)、Tineolabisselliella(负袋夜蛾)、Tineola pellionella(网衣蛾)、Tortrix viridana(欧洲橡树卷叶蛾)、Trichoplusia ni(甘蓝银纹夜蛾)和Yponomeuta padella(巢蛾)。
直翅目的实例包括但不限于：家蟋(Acheta domesticus)、树蝗(Anacridiumspp.)、飞蝗(Locusta migratoria)、双带蚱蜢(Melanoplus bivittatus)、长额负蝗(Melanoplus dfferentialis)、赤腿蚱蜢(Melanoplus femurrubrum)、迁徙蚱蜢(Melanoplus sanguinipes)、北美蝼蛄(Neocurtilla hexadectyla)、松红翅蝗(Nomadacris septemfasciata)、短翅蝼蛄(Scapteriscus abbreviatus)、南美蝼蛄(Scapteriscus borellii)、蝼蛄(Scapteriscus vicinus)和沙漠蝗(Schistocercagregaria)。
虱目的实例包括但不限于：牛羽虱(Bovicola bovis)、咬虱(Damalinia spp.)、猫羽虱(Felicola subrostrata)、短鼻牛虱(Haematopinus eloysternus)、尾车专换虱(Haematopinus quadriperiussus)、猪虱(Haematopinus suis)、面虱(Linognathusovillus)、足虱(Linognathus pedalis)、狗长颚虱(Linognathus setosus)、长鼻牛虱(Linognathus vituli)、鸡体虱(Menacanthus stramineus)、家禽箭轴虱(Menopongallinae)、人体虱(Pediculus humanus)、阴虱(Phthirus pubis)、牛管虱(Solenopotescapillatus)和狗羽虱(Trichodectes canis)。
啮虫目(Psocoptera)的实例包括但不限于：书虱(嗜卷书虱(Liposcelisbostrychophila)、无色书虱(Liposcelis decolor)、嗜虫书虱(Liposcelis entomophila)和尘虱(Trogium pulsatorium))。
蚤目的实例包括但不限于：禽蚤(Ceratophyllus gallinae)、狗蚤(Ctenocephalides canis)、猫蚤(Ctenocephalides fells)、人蚤(Pulex irritans)和东方鼠蚤(Xenopsylla cheopis)。
综合纲的实例包括但不限于：庭院么蚰(Scutigerella immaculate)。
缨尾目的实例包括但不限于：灰衣鱼(Ctenolepisma longicaudata)、四线衣鱼(Ctenolepisma quadriseriata)、普通衣鱼(Lepisma saccharina)和家衣鱼(Thennobiadomestica)。
缨翅目的实例包括但不限于：烟草蓟马(Frankliniella fusca)、花蓟马(Frankliniella intonsa)、苜蓿蓟马(Frankliniella occidentalis)、棉芽蓟马(Frankliniella schultzei)、温室条蓟马(Hercinothrips femoralis)、大豆蓟马(Neohydatothrips variabilis)、Kelly柑桔蓟马(Pezothrips kellyanus)、鳄梨蓟马(Scirtothrips perseae)、南黄蓟马(Thrips palmi)和棉蓟马(Thrips tabaci)。
线虫的实例包括但不限于：寄生线虫例如根结线虫、孢囊线虫和根斑线虫，包括异皮线虫(Heterodera spp.)、根结线虫(Meloidogyne spp.)和球异皮线虫(Globoderaspp.)；特别是孢囊线虫的成员，包括但不限于：Heterodera glycines(大豆孢囊线虫)；Heterodera schachtii(甜菜孢囊线虫)；Heterodera avenae(禾谷孢囊线虫)；以及Globodera rostochiensis和Globodera pailida(马铃薯孢囊线虫)。根斑线虫包括但不限于：短体线虫(短体线虫属种(Pratylenchus spp.))。
在一个实施方案中，包含本文所述的多肽、多核苷酸、细胞、载体等的杀昆虫和杀线虫组合物可用于处理外寄生物。外寄生物包括但不限于：蚤、蜱、疥癣、螨、蚊、令人讨厌和叮咬人的蝇、虱和包含前述外寄生物的一种或多种的组合。术语“蚤”包括蚤目(Siphonaptera)寄生蚤的普通种或偶然种，特别是栉头蚤种(Ctenocephalides)，特别是猫栉头蚤(C.fells)和犬栉头蚤(C.cams)、鼠蚤(印鼠客蚤(Xenopsylla cheopis))和人蚤(Pulex irritans)。
针对主要作物的本发明的昆虫有害生物包括但不限于：玉米：Ostrinianubilalis(欧洲玉米螟)；Agrotis ipsilon(小地老虎)；Helicoverpa zea(棉铃虫)；Spodoptera frugiperda(秋夜蛾)；Diatraea grandiosella(西南玉米秆草螟)；Elasmopalpus lignosellus(小玉米茎蛀虫)；Diatraea saccharalis(蔗螟)；Diabroticavirgifera(玉米根叶甲)；Diabrotica longicornis barberi(长角叶甲)；Diabroticaundecimpunctata howardi(南方玉米根叶甲)；Melanotus spp.(捻转血矛线虫)；Cyclocephala borealis(圆头犀金龟(蛴螬))；Cyclocephala immaculata(南方圆头犀金龟(蛴螬))；Popillia japonica(日本丽金龟)；Chaetocnema pulicaria(玉米跳甲)；Sphenophorus maidis(玉米谷象)；Rhopalosiphum maidis(玉米缢管蚜)；Anuraphismaidiradicis(玉米根蚜)；Blissus leucopterus leucopterus(白翅长蝽)；Melanoplusfemurrubrum(赤腿蚱蜢)；Melanoplus sanguinipes(迁徙蚱蜢)；Hylemya platura(玉米种蝇)；Agromyza parvicornis(玉米斑潜蝇)；Anaphothrips obscrurus(草蓟马)；Solenopsis milesta(窃蚁)；Tetranychus urticae(荨麻叶螨)；高梁：Chilo partellus(高粱螟)；Spodoptera frugiperda(秋夜蛾)；Helicoverpa zea(棉铃虫)；Elasmopalpuslignosellus(小玉米茎蛀虫)；Feltia subterranea(粒肤地老虎)；Phyllophaga crinita(蛴螬)；Eleodes、Conoderus和Aeolus spp.(捻转血矛线虫)；Oulema melanopus(橙足负尼虫)；Chaetocnema pulicaria(玉米跳甲)；Sphenophorus maidis(玉米谷象)；Rhopalosiphum maidis(玉米缢管蚜)；Sipha flava(蔗黄伪毛蚜)；Blissus leucopterusleucopterus(白翅长蝽)；Contarinia sorghicola(高粱瘿蚊)；Tetranychuscinnabarinus(朱砂叶螨)；Tetranychus urticae(荨麻叶螨)；小麦：Pseudaletiaunipunctata(粘虫)；Spodoptera frugiperda(秋夜蛾)；Elasmopalpus lignosellus(小玉米茎蛀虫)；Agrotis orthogonia(西方地老虎)；Elasmopalpus lignosellus(小玉米茎蛀虫)；Oulema melanopus(橙足负尼虫)；Hypera punctata(车轴草叶象甲)；Diabroticaundecimpunctata howardi(南方玉米根叶甲)；俄罗斯小麦蚜虫；Schizaphis graminum(麦二岔蚜)；Macrosiphum avenae(麦长管蚜)；Melanoplus femurrubrum(赤腿蚱蜢)；Melanoplus differentialis(长额负蝗)；Melanoplus sanguinipes(迁徙蚱蜢)；Mayetiola destructor(小麦瘿蚊)；Sitodiplosis mosellana(麦红吸浆虫)；Meromyzaamericana(美洲麦秆蝇)；Hylemya coarctata(冬作种蝇)；Frankliniella fusca(烟草蓟马)；Cephus cinctus(麦茎蜂)；Aceria tulipae(郁金香瘤瘿螨)；向日葵：Suleimahelianthana(向日葵芽蛾)；Homoeosoma electellum(向日葵斑螟)；Zygogrammaexclamationis(向日葵叶甲)；Bothyrus gibbosus(胡萝卜金龟)；Neolasiopteramurtfeldtiana(向日葵籽瘿蚊)；棉：Heliothis virescens(棉芽虫)；Helicoverpa zea(棉铃虫)；Spodoptera exigua(甜菜夜蛾)；Pectinophora gossypiella(棉红铃虫)；Anthonomus grandis(棉铃象甲)；Aphis gossypii(棉蚜)；Pseudatomoscelis seriatus(棉跳盲蝽)；Trialeurodes abutilonea(结翅粉虱)；Lygus lineolaris(牧草盲蝽)；Melanoplus femurrubrum(赤腿蚱蜢)；Melanoplus differentialis(长额负蝗)；Thripstabaci(棉蓟马)；Franklinkiella fusca(烟草蓟马)；Tetranychus cinnabarinus(朱砂叶螨)；Tetranychus urticae(荨麻叶螨)；稻：Diatraea saccharalis(蔗螟)；Spodopterafrugiperda(秋夜蛾)；Helicoverpa zea(棉铃虫)；Colaspis brunnea(葡萄肖叶甲)；Lissorhoptrus oryzophilus(稻象甲)；Sitophilus oryzae(米象)；Nephotettixnigropictus(黑尾叶蝉)；Blissus leucopterus leucopterus(白翅长蝽)；Acrosternumhilare(喜绿蝽)；大豆：Pseudoplusia includens(大豆尺夜蛾)；Anticarsia gemmatalis(黎豆夜蛾)；Plathypena scabra(苜蓿绿夜蛾)；Ostrinia nubilalis(欧洲玉米螟)；Agrotis ipsilon(小地老虎)；Spodoptera exigua(甜菜夜蛾)；Heliothis virescens(棉蚜虫)；Helicoverpa zea(棉铃虫)；Epilachna varivestis(墨西哥豆瓢虫)；Myzuspersicae(桃蚜)；Empoasca fabae(马铃薯微叶蝉)；Acrosternum hilare(喜绿蝽)；Melanoplus femurrubrum(赤腿蚱蜢)；Melanoplus differentialis(长额负蝗)；Hylemyaplatura(玉米种蝇)；Sericothrips variabilis(大豆蓟马)；Thrips tabaci(棉蓟马)；Tetranychus turkestani(土耳其斯坦叶螨)；Tetranychus urticae(荨麻叶螨)；大麦：Ostrinia nubilalis(欧洲玉米螟)；Agrotis ipsilon(小地老虎)；Schizaphis graminum(麦二岔蚜)；Blissus leucopterus leucopterus(白翅长蝽)；Acrosternum hilare(喜绿蝽)；Euschistus servus(褐臭蝽)；Delia platura(玉米种蝇)；Mayetiola destructor(小麦瘿蚊)；Petrobia latens(麦岩螨)；含油种子油菜：Brevicoryne brassicae(甘蓝蚜)；Phyllotreta cruciferae(蔬菜黄条跳甲(Flea beetle))；Mamestra configurata(披肩粘虫)；Plutella xylostella(小菜蛾)；Delia ssp.(根蛆)。
在一些实施方案中，杀昆虫组合物可用于处理包含一种或多种前述昆虫的组合。
易受本发明的肽影响的昆虫包括但不限于：蜚蠊目(Blattaria)、鞘翅目、弹尾目(Collembola)、双翅目、棘口目(Echinostomida)、半翅目、膜翅目、等翅目、鳞翅目、脉翅目(Neuroptera)、直翅目、小杆目(Rhabditida)、蚤目、缨翅目。属-种如下示出：Actebia属-黑行军虫(Actebia fennica)、地老虎属(Agrotis)-小地老虎(Agrotis ipsilon)、地老虎属(Agrotis)-黄地老虎(A.segetum)、干煞夜蛾属(Anticarsia)-黎豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis)、带卷蛾属(Argyrotaenia)-桔带卷蛾(Argyrotaenia citrana)、粉蝶属(Artogeia)-白粉蝶(Artogeia rapae)、蚕属(Bombyx)-家蚕(Bombyx-mori)、蛀褐夜蛾属(Busseola)-玉米茎蛀褐夜蛾(Busseola fusca)、丁字灰蝶属(Cacyreus)-马丁字灰蝶(Cacyreus marshall)、禾草螟属(Chilo)-二化螟(Chilo suppressalis)、色卷蛾属(Christoneura)-云杉色卷蛾(Christoneura fumiferana)、色卷蛾属(C.)-西方云杉色卷蛾(C.occidentalis)、色卷蛾属(C.)-短叶松芽色卷蛾(C.pinus pinus)、色卷蛾属(C.)-玫瑰色卷蛾(C.rosacena)、纵卷叶野螟属(Cnaphalocrocis)-稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocismedinalis)、细蛾属(Conopomorpha)-蒸枝可可细蛾(Conopomorpha cramerella)、斜栉柄卷蛾属(Ctenopsuestis)-斜纹卷蛾(Ctenopsuestis obliquana)、蠹蛾属(Cydia)-苹果蠹蛾(Cydia pomonella)、斑蝶属(Danaus)-君主斑蝶(Danaus plexippus)、根叶甲属(Diabrotica)-十一星瓜叶甲(Diabrotica undecimpunctata howardi)、蔗螟属(Diatraea)-小蔗螟(Diatraea saccharallis)、蔗螟属(D.)-西南玉米螟(D.grandiosella)、钻夜蛾属(Earias)-翠纹钻夜蛾(Earias vittella)、斑螟属(Elasmolpalpus)-南美玉米苗斑螟(Elasmolpalpus lignoselius)、杆螟属(Eldana)-薯杆螟(Eldana saccharina)、粉斑螟属(Ephestia)-地中海粉斑螟(Ephestia kuehniella)、叶小卷蛾属(Epinotia)-阿泊玛叶小卷蛾(Epinotia aporema)、褐卷蛾属(Epiphyas)-苹淡褐卷蛾(Epiphyas postvittana)、蜡螟属(Galleria)-大蜡螟(Galleria mellonella)、铃夜蛾属(Helicoverpa)-谷实夜蛾(Helicoverpa zea)、铃夜蛾属(H.)-澳洲棉铃虫(H.punctigera)、铃夜蛾属(H.)-棉铃虫(H.armigera)、实夜蛾属(Heliothis)-烟芽夜蛾(Heliothis virescens)、白蛾属(Hyphantria)-美国白蛾(Hyphantria cunea)、尺蠖属(Lambdina)-铁杉尺蠖(Lambdina fiscellaria)、豆食心虫属(Leguminivora)-大豆食心虫(Leguminivora glycinivorella)、花翅小蛾属(Lobesia)-葡萄花翅小蛾(Lobesiabotrana)、毒蛾属(Lymantria)-舞毒蛾(Lymantria dispar)、天慕毛虫属(Malacosoma)-森林天幕毛虫(Malacosoma disstria)、甘蓝夜蛾属(Mamestra)-甘蓝夜蛾(Mamestrabrassicae)、甘蓝夜蛾属(M.)-蓓带夜蛾(M.configurata)、烟草天蛾属(Manduca)-烟草天蛾(Manduca sexta)、刷须野螟属(Marasmia)-角目刷须野螟(Marasmia patnalis)、(Maruca vitrata)、古毒蛾属(Orgyia)-灰斑古毒蛾(Orgyia leucostigma)、秆野螟属(Ostrinia)-欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、秆野螟属(O.)-亚洲玉米螟(O.furnacalis)、褐卷蛾属(Pandemis)-苹果褐卷蛾(Pandemis pyrusana)、红铃虫属(Pectinophora)-棉红铃虫(Pectinophora gossypiella)、潜叶蛾属(Perileucoptera)-咖啡潜叶蛾(Perileucoptera coffeella)、茄麦蛾属(Phthorimaea)-马铃薯麦蛾(Phthorimaea opercullela)、Pianotortrix属Pianotortrix octo种、石竹小卷蛾属(Piatynota)-荷兰石竹小卷蛾(Piatynota stultana)、粉蝶属(Pieris)-大菜粉蝶(Pierisbrassicae)、谷斑螟属(Plodia)-印度谷斑螟(Plodia interpunctala)、菜蛾属(Plutella)-小菜蛾(Plutella xylostella)、尺夜蛾属(Pseudoplusia)-大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includens)、Rachiplusia属-向日葵尺蠖(Rachiplusia nu)、白禾螟属(Sciropophaga)-三化螟(Sciropophaga incertulas)、蛀茎夜蛾属(Sesamia)-蛀茎夜蛾(Sesamia calamistis)、雪灯蛾属(Spilosoma)-黄色熊蛾(Spilosoma virginica)、夜蛾属(Spodoptera)-甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、夜蛾属(S.)-草地夜蛾(S.frugiperda)、夜蛾属(S.)-棉贪夜蛾(S.littoralis)、夜蛾属(S.)-莎草黏虫(S.exempta)、夜蛾属(S.)-斜纹贪夜蛾(S.litura)、Tecia属-安第斯马铃薯块茎蛾(Tecia solanivora)、异舟蛾属(Thaumetopoea)-松异舟蛾(Thaumetopoea pityocampa)、粉夜蛾属(Trichoplusia)-粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、Wiseana属-蝙蝠蛾(Wiseana cervinata)、Wiseana属-copularis种(Wiseana copularis)、Wiseana属-jocosa种(Wiseana jocosa)、蜚蠊目(Blattaria)-小蜚蠊(Blattaria Blattella)、弹尾目(Collembola)-弹尾目奇跳属(CollembolaXenylla)、弹尾目(C.)-C.Folsomia、Echinostomida属-Fasciola种(EchinostomidaFasciola)、半翅目(Hemiptera)-突角长蝽属(Hemiptera Oncopeltrus)、半翅目(He.)-小粉虱属(He.Bemisia)、半翅目(He.)-长管蚜属(He.Macrosiphum)、半翅目(He.)-缢管蚜属(He.Rhopalosiphum)、半翅目(He.)-苑瘤属(He.Myzus)、膜翅目(Hymenoptera)-松叶蜂属(Hymenoptera Diprion)、膜翅目(Hy.)-蜜蜂属(Hy.Apis)、膜翅目(Hy.)-长距茧蜂属(Hy.Macrocentrus)、膜翅目(Hy.)-方室茧蜂属(Hy.Meteorus)、膜翅目(Hy.)-横索肿腿小蜂属(Hy.Nasonia)、膜翅目(Hy.)-火蚁属(Hy.Solenopsis)、等足目(Isopoda)-鼠妇属(Isopoda Porcellio)、等翅目(Isoptera)-散白蚁属(Isoptera Reticulitermes)、直翅目(Orthoptera)-Achta属(Orthoptera Achta)、前气门亚目(Prostigmata)-叶螨属(Prostigmata Tetranychus)、小杆目(Rhabitida)-拟丽突属(Rhabitida Acrobeloides)、小杆目(R.)-隐杆线虫属(R.Caenorhabditis)、小杆目(R.)-Distolabrellus属(R.Distolabrellus)、小杆目(R.)-Panagrellus属(R.Panagrellus)、小杆目(R.)-Pristionchus属(R.Pristionchus)、小杆目(R.)-草地垫刃线虫属(R.Pratylenchus)、小杆目(R.)-钩口线虫属(R.Ancylostoma)、小杆目(R.)-日圆线虫属(R.Nippostrongylus)、小杆目(R.)-Panagrellus属(R.Panagrellus)、小杆目(R.)-血矛线虫属(R.Haemonchus)、小杆目(R.)-根结线虫属(R.Meloidogyne)以及蚤目(Siphonaptera)-栉首蚤属(Siphonaptera Ctenocephalides)。如本文所用，昆虫有害生物和线虫有害生物是易受杀昆虫和/或杀线虫转基因蛋白组合物和编码其的多肽影响的昆虫和线虫物种。
选择极易受影响的昆虫和线虫的列表。下面的列表包含昆虫和线虫两者。线虫也易受本申请和权利要求中所确定的组合物和处理的影响。下面的昆虫和线虫被认为是特别合适的并且易受说明书和权利要求中所确定的组合物和处理的影响。
茎蛀虫-玉米茎蛀褐夜蛾-Busseola fusca、南方玉米螟-Diatraeacrambidoides、真行军虫-Pseudaletia unipuncta、西方豆类切根虫-Striacostaalbicosta、小地老虎-Agrotis ipsilon、棉铃虫-Helicoverpa zea、欧洲玉米螟-Ostrinianubilalis、秋夜蛾-Spodoptera frugiperda、西方玉米根虫-Diabrotica virgiferavirgifera、南方玉米根虫-Diabrotica undecimpunctata howardi、北方玉米根虫-Diabrotica barberi、西方牧草盲蝽-Lygus Hesperus、牧草盲蝽-Lygus lineolaris、大豆孢囊线虫-Heterodera glycines、根结线虫-Meloidogyne hapla、根斑线虫-Pratylenchuspenetrans、棉红铃虫-Pectinophora gossypiella、棉铃虫-Helicoverpa armigera、棉铃虫-Helicoverpa zea、甘蔗茎螟-Diatraea saccharalis、亚洲玉米螟-Ostriniafurnacalis、本土夜蛾幼虫-Helicoverpa punctigera、烟草夜蛾幼虫-Heliothisvirescens、甜菜夜蛾-Spodoptera exigua、大豆尺夜蛾-Chrysodeixis includens、黎豆夜蛾-Anticarcia gemmatalis、大豆尺夜蛾-Pseudoplusia includes、大豆夜小卷蛾-Epinotia aporema和向日葵尺蠖-Rachiplusia nu。
实施例
实施例1.二元和三元可切割连接肽的鉴定和分离
1.)可切割连接肽的FRET研究和发现
为了找到具有昆虫和/或线虫蛋白酶和人胃肠可切割特性的接头，本发明人使用了与FRET分子(染料和淬灭剂)偶联的肽文库来鉴定在昆虫肠道环境或模拟人胃肠环境中切割的肽作为报告基因测定。如图1所示，FRET试剂盒包含FRET分子池，这些分子具有一段3个可变氨基酸序列(网格图案圆圈)，该可变氨基酸序列由一系列甘氨酸氨基酸(水平线图案)围起来，这些甘氨酸氨基酸附连到染料(带有突出正方形的实心黑色圆圈)上或淬灭剂(具有方形凹痕的实心黑色圆圈)上。图1说明如果可变区不被切割则每个FRET分子都不产生信号，但是如果它被切割则能够被激发。切割发生的速度(即蛋白酶对序列的特异性)可以按荧光信号随时间发生的速率，即其斜率来排序。
所用的FRET试剂盒(目录号PSREPLI005,Mimotopes,Victoria,Australia)包含512个池，每个池最多8个不同的FRET分子。FRET反应具有非常高的通量，使用多通道装载移液器将酶添加到汇合材料的板中，然后每分钟读取一次板以获得可检测的荧光。记录每个反应的荧光检测输出。
如制造商所推荐的那样，在测定之前立即制备FRET样品(向每个孔中添加5μL50％的乙腈水溶液并在振荡器上搅拌板5分钟。然后添加45μL测定缓冲液并再次搅拌5分钟)。此时，FRET池准备好添加50μL工作酶储备液以开始反应。使用多通道重复移液器，向每个孔中添加50μL工作酶原储备液(对于每种测试的酶类型)，然后将板立即置于酶标仪(SpectraMax酶标仪，具有SoftMax Pro 6.0软件，Molecular Devices，Sunnyvale CA)中并使用激发320nm、发射420nm与截止值420nm的设置读取发射。每1分钟读取一次，持续15分钟。完成读板后，将它们用铝密封机密封并储存在-80℃。
为了测试胃蛋白酶或模拟人胃液(SGF)对FRET池的切割，测定缓冲液为35mM NaCl(pH 1.2)。通过将1mg/ml胃蛋白酶溶解在测定缓冲液中来制备商业来源的酶(SigmaP6887)酶。然后通过将250μL储备酶添加到50mL测定缓冲液中以1:200稀释胃蛋白酶储备液。然后将该工作溶液用于所有板筛选。
为了测试鞘翅目有害生物的肠或肠道酶对FRET池的切割，从南方玉米根虫(Diabrotica undecimpunctata)分离肠酶(CELOP)。南方玉米根虫是从CropCharacteristics(Farmington,MN)商购获得的3龄幼虫。在解剖开始之前，将昆虫置于冷包上几分钟，将昆虫麻醉。为了分离肠道，将后端用针固定到解剖板上，并使用另一根针划开头部后面的软组织。将针插入头壳后面，然后将其从固定的昆虫上拉开，从而将消化道随头部一起拉出体外。然后可以收集肠道。将约20根肠道添加到预先称重的具有100μL 100mMPBS pH 5.7溶液的管中，然后称重，以确定所加入的肠道的质量。通过将溶液涡旋1-2分钟来提取肠道内容物。然后将管以15,000rpm旋转1分钟。再将液体层转移至0.2μm微量离心过滤器并以15,000rcf旋转1分钟。用400μL 100mM PBS缓冲液(pH 5.7)洗涤过滤器，合并两次旋转的渗透物。然后将无菌过滤的肠道内容物在缓冲液中稀释至10mg/mL并储存在-20℃下。为了制备工作储备液，然后对于每个板，通过将700μL储备液用测定缓冲液稀释到7mL，而将肠道内容物稀释10倍。使用多通道重复移液器，向每个孔中添加50μL 1X肠道提取物并如上所述立即读取。
为了测试鳞翅目有害生物(LEP)的肠道酶对FRET池的切割，从玉米穗虫(Helicoverpa zea)中分离肠道酶。玉米穗虫昆虫是Benzon Research(Carlisle,PA)商购获得的卵。孵化的幼虫在人工饲料上饲养直至第4/5龄(20mm长)，然后分离出肠道。在肠道提取之前，使用CO2麻醉幼虫。然后将幼虫在头部和尾部用针固定在解剖板上。使用解剖剪刀，切开角质层。然后将解剖剪刀插入切口中，角质层沿昆虫呈纵向。接着小心地将角质层往后拉，用针划开以暴露消化道。使用去离子水，彻底冲洗昆虫以除去血淋巴。然后用镊子切离肠道，并置于500μL 200mM Tris-HCl pH 8.1 150mM NaCl溶液(测定缓冲液)中。将管预先称重，然后在添加后称重，以计算添加的肠道的总量。将CEW肠道在200mM Tris-HCl pH8.1 150mM NaCl中稀释至7mg/ml(10x)的储备浓度。对于每个板，用测定缓冲液将此溶液新鲜稀释20倍。使用多通道重复移液器，向每个孔中添加50μL 1X肠道提取物并如上所述立即读取。
1.1)FRET肽池的蛋白酶切割分析
用FRET试剂盒(目录号PSREPLI005,Mimotopes,Victoria,Australia)针对LEP、COLEOP和SGF肠道模拟蛋白酶环境进行了测试，并记录数据。生成了两种类型的数据(随时间的切割斜率(表示为原始斜率，或表示为指数值，其中最陡斜率为100％，每个斜率表示为最高斜率的百分比)和切割分量)。第一种类型的数据是10分钟内荧光检测的斜率。反应的斜率允许将两个或三个氨基酸序列按照它们在各种蛋白酶环境中切割的速度而排序。表4显示了每种消化条件所切割的前50个序列(SGF表示人胃肠环境；COLEOP是鞘翅目昆虫的肠道环境；以及LEP是鳞翅目昆虫的肠道环境)。表5中显示的是未在消化条件下切割的样品序列，并且表示不能在X和Y条件中切割的在马库什之外的序列的实例。
表4.来自以下每种消化条件的汇合FRET筛选的代表性可切割序列：SGF、COLEOP和LEP
表5.来自以下每种消化条件的汇合FRET筛选的5个失败可切割序列的实例：SGF、COLEOP和LEP
来自每种消化条件的前5％孔中代表的氨基酸用于产生构成二元肽的马库什组，所述二元肽包含选自以下项的氨基酸序列：X1-X2-Y1-Y2、X1-X2-X3-Y1-Y2、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2、X1-X2-Y1-Y2-Y3、X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3、X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4、X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4、Y1-Y2-X1-X2、Y1-Y2-X1-X2-X3、Y1-Y2-X1-X2-X3-X4、Y1-Y2-Y3-X1-X2、Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3、Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3和Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4，其中每个Xn和每个Yn均为氨基酸，并且其中X1选自：(全部为单字母氨基酸格式)A、D、E、G、I、K、L、N、P、Q、R和V；X2选自A、F、G、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V和Y；X3选自A、D、E、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V和Y；X4选自：R、H、K、D、E、S、T、N、Q、G、A、I、L、M、F、W、Y和V。在一些实施方案中，Y1选自：(全部为单字母氨基酸格式)A、D、E、F、G、I、L、N、Q、S、T、V和Y；Y2选自F、G、I、L和Y；以及Y3选自A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V和Y；并且Y4选自：R、H、K、D、E、S、T、N、Q、G、A、I、L、M、F、W、Y和V。
在从SGF(模拟人肠道环境)筛选中发现的序列的一个实施方案中，以XY或YX格式，人肠道蛋白酶可切割底物可包含一种或多种下列肽：AFF、AFG、AFI、AFL、AFV、AFY、AGF、AGL、AIF、AIL、ALF、ALG、ALI、ALL、ALY、AYF、AYL、DFF、DFG、DFI、DFL、DFY、DGF、DGL、DIF、DLF、DLG、DLY、DYF、DYL、EFF、EFG、EFI、EFL、EFY、EGF、EGL、EIF、ELF、ELG、ELY、EYF、EYL、FF、FFA、FFD、FFE、FFF、FFG、FFI、FFK、FFL、FFR、FFS、FFT、FFV、FFY、FGA、FGD、FGE、FGF、FGI、FGK、FGL、FGR、FGS、FGT、FGV、FGY、FLV、FLR、FYA、FYD、FYE、FYF、FYG、FYI、FYK、FYL、FYR、FYS、FYT、FYV、FYY、GFA、GFD、GFE、GFF、GFI、GFK、GFL、GFR、GFS、GFT、GFV、GFY、GGL、GIF、GIL、GLF、GLI、GLL、GLY、GYF、GYL、IF、IFA、IFF、IFG、IFI、IFL、IFV、IFY、IGF、IGL、IIF、IIL、ILF、ILG、ILI、ILL、ILY、IYF、IYL、LFA、LFF、LFG、LFI、LFL、LFV、LFY、LG、LGA、LGE、LGF、LGI、LGL、LGV、LGY、LIF、LIG、LII、LIL、LIY、LLF、LLG、LLI、LLL、LLY、LYA、LYF、LYG、LYI、LYL、LYV、LYY、NFF、NFG、NFI、NFL、NFY、NGF、NGL、NIL、NLG、NLI、NLL、NYF、NYL、QFF、QFG、QFI、QFL、QFY、QGF、QGL、QIL、QLG、QLI、QLL、QYF、QYL、SFF、SFG、SFI、SFL、SFY、SGF、SGL、SIF、SIL、SLF、SLG、SLI、SLL、SLY、SYF、SYL、TFF、TFG、TFI、TFL、TFY、TGF、TGL、TIF、TIL、TLF、TLG、TLI、TLL、TLY、TYF、TYL、VFF、VFG、VFI、VFL、VFY、VGF、VGL、VIF、VIL、VLF、VLG、VLI、VLL、VLY、VYF、VYL、YFA、YFD、YFE、YFF、YFG、YFI、YFK、YFL、YFR、YFS、YFT、YFV、YFY、YGF、YGL、YYF、YYL。
在从SGF筛选中发现的序列的另一个实施方案中，Y SGF可切割肽可包含以下一者或多者：AFF、AFI、AFL、AFY、AIF、AIL、ALF、ALI、ALL、ALY、AYF、AYL、DFF、DFI、DFL、DFY、DIF、DLF、DLY、DYF、DYL、YFL、EFF、EFI、EFL、0、EFY、EIF、ELF、ELY、EYF、EYL、FFA、FFD、FFE、FFF、FFI、FFK、FFL、FFR、FFS、FFT、FFV、FFY、FYA、FYD、FYE、FYF、FYI、FYK、FYL、FYR、FYS、FYT、FYV、FYY、IFA、IFF、IFI、IFL、IFV、IFY、IIF、IIL、ILF、ILI、ILL、ILY、IYF、IYL、LFA、LFF、LFI、LFL、LFV、LFY、LIF、LII、LIL、LIY、LLF、LLI、LLL、LLY、LYA、LYF、LYI、LYL、LYV、LYY、NFF、NFI、NFL、NFY、NIL、NLI、NLL、NYF、NYL、QFF、QFI、QFL、QFY、QIL、QLI、QLL、QYF、QYL、SFF、SFI、SFL、SFY、SIF、SIL、SLF、SLI、SLL、SLY、SYF、SYL、TFF、TFI、TFL、TFY、TIF、TIL、TLF、TLI、TLL、TLY、TYF、TYL、VFF、VFI、VFL、VFY、VIF、VIL、VLF、VLI、VLL、VLY、VYF、VYL、YFA、YFD、YFE、YFF、YFI、YFK、YFL、YFR、YFS、YFT、YFV、YFY、YYF、YYL。
在从昆虫可切割性中发现的示例性序列的一些实施方案中，X区可包含以下一种或多种昆虫和/或线虫肠道蛋白酶可切割肽序列：AAG、AAK、AAR、AFG、AFK、AFR、AGF、AGI、AGK、AGL、AGN、AGQ、AGR、AGS、AGT、AGY、AIG、AIK、AIN、AIQ、AIR、AKF、AKG、AKI、AKK、AKL、AKN、AKQ、AKR、AKS、AKT、AKY、ALG、ALK、ALN、ALQ、ALR、APF、APG、APK、APR、ARF、ARG、ARI、ARK、ARL、ARN、ARQ、ARR、ARS、ART、ARY、ASG、ASK、ASR、ATG、ATK、ATR、AVG、AVK、AVR、AYG、AYK、AYR、DGK、DGR、DIG、DIK、DIR、DLG、DLK、DLR、EGK、EGR、EIG、EIK、EIR、ELG、ELK、ELR、ER、FVR、GAF、GAI、GAK、GAL、GAR、GAY、GFK、GFR、GIK、GIN、GIQ、GIR、GKA、GKD、GKE、GKF、GKI、GKK、GKL、GKN、GKQ、GKR、GKS、GKT、GKV、GKY、GLK、GLN、GLQ、GLR、GNA、GNK、GNR、GNV、GPK、GPR、GQA、GQK、GQR、GQV、GRA、GRD、GRE、GRF、GRI、GRK、GRL、GRN、GRQ、GRR、GRS、GRT、GRV、GRY、GSI、GSK、GSL、GSR、GTI、GTK、GTL、GTR、GVF、GVI、GVK、GVL、GVR、GVY、GYK、GYR、IGA、IGF、IGI、IGK、IGL、IGN、IGQ、IGR、IGS、IGT、IGV、IGY、IIG、IIK、IIR、IKA、IKF、IKG、IKI、IKK、IKL、IKN、IKQ、IKR、IKS、IKT、IKV、IKY、ILG、ILK、ILR、INA、ING、INK、INR、INV、IPG、IPK、IPR、IQA、IQG、IQK、IQR、IQV、IRA、IRF、IRG、IRI、IRK、IRL、IRN、IRQ、IRR、IRS、IRT、IRV、IRY、ISG、ISK、ISR、ITG、ITK、ITR、KAF、KAG、KAI、KAK、KAL、KAR、KAY、KFF、KFG、KFK、KFR、KGA、KGD、KGE、KGF、KGI、KGK、KGL、KGN、KGQ、KGR、KGS、KGT、KGV、KGY、KIG、KIK、KIN、KIQ、KIR、KKA、KKD、KKE、KKF、KKG、KKN、KKQ、KKS、KKT、KKV、KKY、KLG、KLK、KLN、KLQ、KLR、KNG、KNK、KNR、KPG、KPK、KPR、KQG、KQK、KQR、KRA、KRD、KRE、KRF、KRG、KRN、KRQ、KRS、KRT、KRV、KRY、KSG、KSI、KSK、KSL、KSR、KTG、KTI、KTK、KTL、KTR、KVF、KVG、KVI、KVK、KVL、KVR、KVY、KYG、KYK、KYR、LFR、LGA、LGF、LGI、LGK、LGL、LGN、LGQ、LGR、LGS、LGT、LGV、LGY、LIG、LIK、LIR、LK、LKA、LKF、LKG、LKI、LKK、LKL、LKN、LKQ、LKR、LKS、LKT、LKV、LKY、LLG、LLK、LLR、LNA、LNG、LNK、LNR、LNV、LPG、LPK、LPR、LQA、LQG、LQK、LQR、LQV、LRA、LRF、LRG、LRI、LRK、LRL、LRN、LRQ、LRR、LRS、LRT、LRV、LRY、LSG、LSK、LSR、LTG、LTK、LTR、NGK、NGR、NIG、NIK、NIR、NLG、NLK、NLR、PGK、PGR、PIG、PIK、PIR、PKG、PKK、PKR、PLG、PLK、PLR、PRG、PRK、PRR、QGK、QGR、QIG、QIK、QIR、QLG、QLK、QLR、RAF、RAG、RAI、RAK、RAL、RAR、RAY、RFF、RFG、RFK、RFR、RGA、RGD、RGE、RGF、RGI、RGK、RGL、RGN、RGQ、RGR、RGS、RGT、RGV、RGY、RIG、RIK、RIN、RIQ、RIR、RKA、RKD、RKE、RKF、RKG、RKK、RKN、RKQ、RKS、RKT、RKV、RKY、RLF、RLFL、RLG、RLK、RLN、RLQ、RLR、RNG、RNK、RNR、RPG、RPK、RPR、RQG、RQK、RQR、RRA、RRD、RRE、RRF、RRG、RRK、RRN、RRQ、RRR、RRS、RRT、RRV、RRY、RSG、RSI、RSK、RSL、RSR、RTG、RTI、RTK、RTL、RTR、RVF、RVG、RVI、RVK、RVL、RVR、RVY、RYG、RYK、RYR、VAG、VAK、VAR、VFG、VFK、VFR、VGF、VGI、VGK、VGL、VGN、VGQ、VGR、VGS、VGT、VGY、VIG、VIK、VIN、VIQ、VIR、VKF、VKG、VKI、VKK、VKL、VKN、VKQ、VKR、VKS、VKT、VKY、VLG、VLK、VLN、VLQ、VLR、VPG、VPK、VPR、VR、VRF、VRG、VRI、VRK、VRL、VRN、VRQ、VRR、VRS、VRT、VRY、VSG、VSK、VSR、VTG、VTK、VTR、VVG、VVK、VVR、VYG、VYK、VYR。
在从昆虫可切割性中发现的序列的另一个实施方案中，X区可包含以下一种或多种昆虫和/或线虫肠道蛋白酶可切割肽序列：AAK、AAR、AFK、AFR、AIK、AIN、AIQ、AIR、AKF、AKI、AKK、AKL、AKN、AKQ、AKR、AKS、AKT、AKY、ALK、ALN、ALQ、ALR、APK、APR、ARF、ARI、ARK、ARL、ARN、ARQ、ARR、ARS、ART、ARY、ASK、ASR、ATK、ATR、AVK、AVR、AYK、AYR、DIK、DIR、DLK、DLR、EIK、EIR、ELK、ELR、IIK、IIR、IKA、IKF、IKI、IKK、IKL、IKN、IKQ、IKR、IKS、IKT、IKV、IKY、ILK、ILR、INA、INK、INR、INV、IPK、IPR、IQA、IQK、IQR、IQV、IRA、IRF、IRI、IRK、IRL、IRN、IRQ、IRR、IRS、IRT、IRV、IRY、ISK、ISR、ITK、ITR、KAF、KAI、KAK、KAL、KAR、KAY、KFK、KFR、KIK、KIN、KIQ、KIR、KKA、KKD、KKE、KKF、KKN、KKQ、KKS、KKT、KKV、KKY、KLK、KLN、KLQ、KLR、KNK、KNR、KPK、KPR、KQK、KQR、KRA、KRD、KRE、KRF、KRN、KRQ、KRS、KRT、KRV、KRY、KSI、KSK、KSL、KSR、KTI、KTK、KTL、KTR、KVF、KVI、KVK、KVL、KVR、KVY、KYK、KYR、LIK、LIR、LKA、LKF、LKI、LKK、LKL、LKN、LKQ、LKR、LKS、LKT、LKV、LKY、LLK、LLR、LNA、LNK、LNR、LNV、LPK、LPR、LQA、LQK、LQR、LQV、LRA、LRF、LRI、LRK、LRL、LRN、LRQ、LRR、LRS、LRT、LRV、LRY、LSK、LSR、LTK、LTR、NIK、NIR、NLK、NLR、PIK、PIR、PKK、PKR、PLK、PLR、PRK、PRR、QIK、QIR、QLK、QLR、RAF、RAI、RAK、RAL、RAR、RAY、RFK、RFR、RIK、RIN、RIQ、RIR、RKA、RKD、RKE、RKF、RKN、RKQ、RKS、RKT、RKV、RKY、RLK、RLN、RLQ、RLR、RNK、RNR、RPK、RPR、RQK、RQR、RRA、RRD、RRE、RRF、RRN、RRQ、RRS、RRT、RRV、RRY、RSI、RSK、RSL、RSR、RTI、RTK、RTL、RTR、RVF、RVI、RVK、RVL、RVR、RVY、RYK、RYR、VAK、VAR、VFK、VFR、VIK、VIN、VIQ、VIR、VKF、VKI、VKK、VKL、VKN、VKQ、VKR、VKS、VKT、VKY、VLK、VLN、VLQ、VLR、VPK、VPR、VRF、VRI、VRK、VRL、VRN、VRQ、VRR、VRS、VRT、VRY、VSK、VSR、VTK、VTR、VVK、VVR、VYK、VYR。
既满足高排序X可切割性条件也满足高排序Y可切割条件的共同序列的数量不足导致将X和Y类别中所发现的序列合并以构建二元肽和三元肽。该研究被称为第2轮，并且涉及上述第1轮数据的组合。对此进行测试的一种方式涉及昆虫可切割和SGF可切割序列的几种组合(分别设计并排序X和Y区域，以合成为FRET分子)。对此进行测试的另一种方式涉及昆虫可切割和SGF可切割序列的组合，这些组合被设计和排序以合成为编码ERSP-STA-(TP-L)n蛋白的DNA以用于瞬时植物表达。FRET和瞬时表达的蛋白均用于举例说明二元肽和三元肽的昆虫可切割和SGF可切割性质。
来自表示基于第1轮中所观察到的前几个命中的二元组合的子集的FRET分子的第2轮数据提供了各种二元组合的分层排序。如上文第1轮中所述，合成第2轮FRET分子，重悬浮并在切割酶测定中进行测试。针对LEP、COLEOP和SGF条件测试了二元可切割连接肽的许多组合。
来自编码这些ERSP-STA-(TP-L)n蛋白的变异(其中L是基于第2轮数据的二元肽和三元肽)的DNA的瞬时表达蛋白也用相同的切割酶(LEP、COLEOP和SGF)处理。
体现第2轮FRET实验的数据在章节1.1中列出。体现第2轮植物表达系统的数据在章节1.2中列出。将SEQ ID NO:1594-1758中列出的氨基酸序列作为FRET或瞬时植物表达而合成。
AFVRLFGS(SEQ ID NO:1649)、AKLFVGS(SEQ ID NO:1650)、ALFALKGS(SEQ ID NO:1651)、ALFLKGS(SEQ ID NO:1652)、ALFLRGS(SEQ ID NO:1653)、ALFRGS(SEQ ID NO:1654)、ALFRLRGS(SEQ ID NO:1655)、ALKALFGS(SEQ ID NO:1656)、ALKFFGS(SEQ ID NO:1657)、ALKFLVGS(SEQ ID NO:1658)、ALKIFVGS(SEQ ID NO:1659)、ALKLFVGS(SEQ ID NO:1660)、FFADIKGS(SEQ ID NO:1661)、FFALKGS(SEQ ID NO:1662)、FFLKGS(SEQ ID NO:1663)、FFLRGS(SEQ ID NO:1664)、FFRLRGS(SEQ ID NO:1665)、FGYRIKGS(SEQ ID NO:1666)、FLRLFGS(SEQ ID NO:1667)、FYARRGS(SEQ ID NO:1668)、GGLRKKGS(SEQ ID NO:1669)、IFVALKGS(SEQ ID NO:1670)、IFVLKGS(SEQ ID NO:1671)、IFVLRGS(SEQ ID NO:1672)、IFVRGS(SEQ ID NO:1673)、IFVRLRGS(SEQ ID NO:1674)、ILFNIKGS(SEQ ID NO:1675)、LFAAPFGS(SEQ ID NO:1676)、LFVALKGS(SEQ ID NO:1677)、LFVLKGS(SEQ ID NO:1678)、LFVLRGS(SEQ ID NO:1679)、LFVRGS(SEQ ID NO:1680)、LFVRLRGS(SEQ ID NO:1681)、LFVRVFLGS(SEQ ID NO:1682)、LGERGS(SEQ ID NO:1683)、LKALFGS(SEQ ID NO:1684)、LKFFGS(SEQ ID NO:1685)、LKIFVGS(SEQ ID NO:1686)、LKLFVGS(SEQ ID NO:1687)、LRALFGS(SEQ ID NO:1688)、LRFFGS(SEQ ID NO:1689)、LRIFVGS(SEQ ID NO:1690)、LRLFVGS(SEQ ID NO:1691)、RALFGS(SEQ ID NO:1692)、RIFVGS(SEQ ID NO:1693)、RLFVGS(SEQ ID NO:1694)、RLRALFGS(SEQ ID NO:1695)、RLRFFGS(SEQ ID NO:1696)、RLRIFVGS(SEQ ID NO:1697)、RLRLFVGS(SEQ ID NO:1698)、RRKAFVGS(SEQ ID NO:1699)、RRKLIFGS(SEQ ID NO:1700)、RRRFFAGS(SEQ ID NO:1701)、VFGRKGGS(SEQ ID NO:1702)、YFVRKGS(SEQ ID NO:1703)。
来自举例说明二元肽或三元肽中X和Y可切割性的组合的第2轮FRET的数据如表6所示。
表6.显示出在X和Y切割条件下的可切割性的X-Y组合的代表性序列
实施例3.候选二元/三元可切割连接肽的植物蛋白表达测试
使用称为FECT的烟草瞬时表达系统技术(FECT(Liu Z&Kearney CM,BMCBiotechnology,2010,10:88，其公开内容通过引用整体并入本文)进行了包含被二元或三元可切割连接肽插入的TP的多个拷贝的蛋白的克隆和表达。FECT载体含有用于农杆菌感染的T-DNA区，该区包含驱动狗尾草花叶病毒RNA的表达的CaMV 35S启动子，而没有编码病毒包被蛋白的基因和三基因块(triple gene block)。代替包被蛋白和三基因块的是一对亚克隆位点(PacI和AvrII)，其允许ORF在PacI位点之后从N'至C'亚克隆，以用于高水平的瞬时病毒表达。这种“解除武装”的病毒基因组阻止植物间的传播。除了亚克隆以表达各种具有被二元或三元可切割连接肽插入的TP的蛋白的FECT载体外，还共表达了编码P19(来自番茄丛矮病毒的RNA沉默抑制蛋白)的第二FECT载体，以防止所引入的T-DNA的转录后基因沉默(PTGS)。如下所述，将含有瞬时植物表达系统的农杆菌属注入烟草(本氏烟(Nicotianabenthamiana))叶中。
参考图2-5，示出了杀昆虫和/或杀线虫蛋白以及编码杀昆虫和/或杀线虫蛋白的DNA构建体的各种设计。在一些实例中，显示了具有插入的二元或三元可切割连接肽的TP重复序列。可根据这里提供的示例性实施方案使用的说明性ERSP基序是大麦α-淀粉酶信号肽(BAAS)，其由24种氨基酸构成，如下所示(N'至C'，单字母代码)：
MANKHLSLSLFLVLLGLSASLASG(SEQ ID NO:4)。
在一些蛋白中使用的玉米(Zea mays)泛素单体由75个氨基酸构成，如下所示(N'至C'，单字母代码)：
QIFVKTLTGKTITLEVESSDTIDNVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLADYNIQKESTLHLVLRLRGG(登录号XP_020404049.1，SEQ ID NO:1759)。
在本文描述的实例中可用的示例性TP可包括：U-ACTX-Hv1a，其具有以下氨基酸序列(N'至C'，单字母代码)：
QYCVPVDQPCSLNTQPCCDDATCTQERNENGHTVYYCRA(SEQ ID NO:6)或U+2-ACTX-Hv1a，其具有以下氨基酸序列(N'至C'，单字母代码)：
GSQYCVPVDQPCSLNTQPCCDDATCTQERNENGHTVYYCRA(SEQ ID NO:5)。
在单独的实施例中，使用三种不同的间插二元或三元可切割连接肽(由速记形式L1-L4表示)(N'至C'，一单字母代码)：
IGER(L1)(SEQ ID NO:1)
ALKLFVGS(L2)(SEQ ID NO:1660)
IFVRLRGS(L3)(SEQ ID NO:1674)
ALKFLVGS(L4)(SEQ ID NO:1658)。
另外，具有以下氨基酸序列(N'至C'，单字母代码)：HHHHHHH HHH(SEQ ID NO:1760)的组氨酸标签用作所构建的杀昆虫和/或杀线虫蛋白的一部分。将如图6A和图6B中示意性示出的以下杀昆虫和/或杀线虫蛋白：BAAS:UBI:U+2-ACTX-Hv1a:(L:U-ACTX-Hv1a)3:His10和BAAS:(U-ACTX-Hv1a:L)3:U-ACTX-Hv1a:H10 ORF DNA(其中BAAS是ERSP；并且L是二元或三元可切割连接肽)克隆到F ECT表达载体的Pac I和Avr II限制性位点中以产生瞬时载体，然后使用如下的冻融方法将其转化到根癌农杆菌菌株GV3101细胞中：将储存的感受态GV3101细胞在冰上解冻，然后与1-5μg纯瞬时载体D NA混合。然后将细胞-DNA混合物在冰上保持5分钟，再转移至-80℃下保持5分钟，然后在37℃水浴中温育5分钟。然后将冻融处理的细胞稀释到1mL LB培养基中并在摇床上在室温下振荡2-4小时。然后将细胞-LB混合物以5,000rcf离心2分钟以沉淀细胞，然后除去800μL LB上清液。然后将细胞重悬在剩余的液体中，再将整个体积(约200μL)的转化细胞-LB混合物涂布到具有适当抗生素(10μg/mL利福平、25μg/mL庆大霉素和50μg/mL卡那霉素)的LB琼脂板上，并在28℃下温育两天。然后挑取所得的转化菌落，并在具有适当抗生素的6mL LB培养基等分试样中培养，以用于转化的DNA分析并制备转化的GV3101细胞的甘油储备液。
将转化的GV3101细胞从其甘油储备液划线到具有适当抗生素(如上所述)的LB板上，并在28℃下温育两天。使用转化的GV3101细胞的集落接种5mL LB-MESA培养基(补充有10mM MES、20μM乙酰丁香酮的LB培养基)和上述相同的抗生素，并在28℃下生长过夜。将过夜培养物的细胞通过以5000rpm离心10分钟而收集，并重悬于诱导培养基(10mM MES、10mMMgCl2、100μM乙酰丁香酮)中，最终OD600为1.0。然后将细胞在诱导培养基中温育2小时至室温下过夜，然后准备好用于烟叶的瞬时转化。因为FECT使用P19表达和目的基因表达的混合物，所以将pFECT-P19转化的GV3101细胞的培养物和目的基因培养物以相等的量混合在一起，用于在注射到植物叶片之前渗透烟叶。使用不连接针头的3mL注射器通过注射将处理过的细胞渗入本氏烟植物的附着叶片的下侧。在渗透后6-8天评估烟叶中的蛋白表达。
通过使用注射器真空提取技术从烟草中纯化全长目的基因蛋白。将叶组织卷起，连同10mL缓冲液(35mM NaCl，5mM EDTA，1Roche cOmplete Tab蛋白酶抑制剂tab，使用HCl调至pH 1.2)置于60mL注射器的针筒内(针头端口被盖上)。然后将柱塞插入针筒中，倒置使针头端口向上，取下盖子并通过迫使柱塞进入而除去多余的空气。一旦大部分空气被除去，便将注射器盖上盖子并将柱塞尽可能地向后拉，从而产生真空，并保持30秒。然后通过使柱塞返回到没有真空的点来缓慢释放真空。然后再重复三次。在第三次之后，通过向叶片施加轻微压力将液体从注射器中排出，保存液体，再次重复该过程，然后丢弃叶片。然后使用Pall 0.2μm尼龙注射器式过滤器对提取的液体进行无菌过滤，再在GE Healthcare VivaSpin 500(10K截留分子量)中浓缩，用另外20mL缓冲液冲洗样品并将样品离心直至它们浓缩约30倍。
然后使用标准蛋白质印迹技术分析样品。通过将10μL蛋白样品与9μL Invitrogen2X SDS上样缓冲液和2μL Novex 10X还原剂混合并在85℃下将样品加热5分钟来制备用于蛋白凝胶的样品。然后加载样品并在顶部罐中的含有0.1％硫代乙醇酸钠的1x InvitrogenTricine运行缓冲液中的Novex预制16％Tricine凝胶上运行。凝胶在150V下运行75分钟。然后使用iBLOT系统上的7分钟转移程序将凝胶转移到新PVDF膜上。转移完成后，接着将印迹膜移至容器中并用缓冲液A(由Quality Biological的10x TBS(0.25M tris碱，1.37MNaCl，0.03M KCL，pH 7.4)制备的1x TBS)通过在室温下轻轻摇动而洗涤五分钟。然后使用缓冲液B(含有1％BSA的缓冲液A)进行1小时的封闭步骤。然后用5分钟的缓冲液C(含有0.05％吐温20的缓冲液B)洗涤将印迹漂洗三次。然后在缓冲液C中用1:10000稀释的MaineBiotech Anti-His抗体处理1小时。再用缓冲液C将印迹漂洗三次，每次5分钟。然后在缓冲液C中用1:3000稀释的BioRad山羊抗小鼠AP缀合抗体(二抗)处理1小时。然后用缓冲液C将印迹漂洗两次，每次5分钟，再用缓冲液A漂洗一次，持续5分钟。然后用BioRad AP显影剂将印迹显影，并用水冲洗以终止。然后验证浓缩样品的条带，并稀释以使条带的强度/浓度相似。然后通过iELISA验证样品的浓度为10-20ng/ul。
如下进行间接ELISA(iELISA)测定以定量评估来自用FECT表达系统瞬时转化的烟叶的ICK基序TP。将1μL叶片提取的蛋白稀释到Immulon 2HD 96孔板的孔中的99μL CB2溶液(Immunochemistry Technologies)中，根据需要进行连续稀释。然后使来自提取物样品的叶蛋白在室温下在暗处包被孔壁3小时，接着除去CB2溶液，并用200μL PBS(Gibco)洗涤各孔两次。然后将150μL封闭溶液(含有5％脱脂奶粉的PBS中的封闭BSA)加入每个孔中，并在室温下在暗处温育1小时。除去封闭溶液并从孔中洗去PBS后，向每个孔中加入100μL兔抗U-ACTX-Hv1a抗体(一抗)(在封闭溶液中1:250稀释)并在室温下在暗处温育1小时。然后除去第一抗体，用PBS洗涤各孔4次。然后将100μL HRP缀合山羊抗兔抗体(二抗，在封闭溶液中以1:1000稀释使用)加入每个孔中，并在室温下在暗处温育1小时。除去二抗并用PBS洗涤孔后，向每个孔中加入100μL底物溶液(ABTS过氧化物酶底物溶液A和溶液B的1:1混合物，KPL)，并使显色反应进行直至出现足够的显色。然后向每个孔中加入100μL过氧化物酶终止溶液以终止反应。使用SpectroMax-M2酶标仪在405nm处读取板中每种反应混合物的吸光度，其中将SoftMax Pro用作控制软件。以与上述iELISA测定中相同的方式处理连续稀释的已知浓度的纯U-ACTX-Hv1a样品，以产生用于定量分析的质量-吸光度标准曲线。
为了确定接头的胃蛋白酶可切割性，用模拟胃液(SGF，35mM NaCl，pH 1.2，含有来自猪胃粘膜的1mg/ml胃蛋白酶)消化肽。将纯化的蛋白样品按1:3的SGF:蛋白(v:v)混合，并在37℃下振荡温育。在0、2和10分钟时取样，立即制备用于蛋白凝胶测定(参见上文)。然后使用上述技术在蛋白质印迹上运行样品。参见图6。
为了确定二元肽/三元肽的昆虫可切割性，用从南方玉米根虫(Diabroticaundecimpunctata)分离的肠道提取物消化蛋白。在实施例
A.1中解释了肠道内容物的分离。在肽消化之前，使用GE Healthcare Viva Spin20将蛋白进行缓冲液交换到100mM磷酸盐缓冲液、150mM NaCl(pH 5.83)中，使最终体积与起始体积相同。使用SCR肠道提取物按1:3的SCR肠道提取物储备液:蛋白稀释度(v:v)以500rpm在25℃下振荡而进行消化。在0、30和210分钟时取样。然后如上所述制备样品用于SDS-PAGE和蛋白质印迹的样品。
还测试了二元肽/三元肽针对CEW肠道提取物的可切割性(描述于实施例A.1中)。与上述SCR测定法一样，将肽进行缓冲液交换到200mM Tris-HCl pH 8.1 150mM NaCl中。如上所列，对用于SCR肠道提取物消化的测定条件进行重复。
这些方案产生并验证了在植物中表达的间插TP拷贝的候选三元可切割连接肽。需要额外的间隔区来增强可切割性，它们在章节1.3中详述。
实施例4.FRET研究和构成多个候选三元可切割连接肽的间隔区
从上文进行和描述的实验中，两种示例性有效二元肽ALKLFV和IFVRLR在人(SGF)以及昆虫(LEP)和(COLEOP)模拟肠道环境中给出了肽的快速SGF切割以及快速LEP和COLEOP切割。
为了使二元可切割连接肽切割，蛋白水解酶必须能够识别序列并落在识别的序列上。如果空间太紧或太小，则可能导致消化效率较慢或较低。通过使用对条件最有利的氨基酸制备二元肽成为三元肽，肽切割的速度应该增加。“间隔区”的使用可以实现这种增加的肽酶切割和增加的杀昆虫活性。
间隔区
为了筛选潜在的间隔区，将FRET肽按照二元肽ALKLFVZ1Z2以及位置Z1和Z2中的不同氨基酸排序。一些氨基酸作为个体筛选，一些作为池筛选。使用50％的乙腈水溶液重悬肽，每种肽的浓度为2μM。对于含有一种以上FRET肽的那些，将它们重悬，使得每种肽均为2μM(假设每种肽均等)。然后如上面针对第1轮所述将它们重悬并筛选。数据确实证实Z位置的一些氨基酸比其他氨基酸更有利。表7显示了基于FRET肽切割速度数据的Z1和Z2的代表性氨基酸。表7中的斜率值越大，氨基酸作为间隔区一部分时的活性越大。表7中标记为“斜率”的列表示接头的切割速度。
表7.用于提高采用二元肽ALKLFV的X和Y两种条件的切割速度的代表性间隔区序列
用于瞬时烟草表达系统的基因构建的实例可见于图6A和图6B。例如，如图6A所示，接头序列ALKLFVGS和IFVRLRGS作为(L)在图6A的部分中表示。在凝胶中，如图7所示，这些显示为完整4x(具有和不具有泛素)的前2个条带。示例接头序列IGER由图6B的部分表示。在凝胶中，它显示为完整4x的第1个条带。
实施例5.包含二元和三元可切割连接肽的杀昆虫转基因蛋白的克隆和表达
该实施例详述了再生转基因玉米植物的方法的实例，所述转基因玉米植物具有含包含二元和三元可切割连接肽和TP的杀昆虫和/或杀线虫蛋白的稳定表达。在该实施例中有三个组成部分：(1)载体设计，(2)植物转化和再生，以及(3)完整蛋白表达的验证。
第一个组成部分是玉米转化所需的(标准二元)载体设计，其涉及产生具有两个区域的载体：骨架(图8：白色箭头)和t-DNA区域(图8：黑色箭头)。骨架具有两个组成部分：复制起点(Ori或ori)和选择性标记。本实施例中描述的骨架具有两个Ori，因此它可以在用于亚克隆目的的大肠埃希菌(例如ColE1，一种高拷贝Ori)和用于质粒传播的农杆菌属(例如OriV，一种低拷贝ori，及其trfA起动蛋白)中复制。该实施例中描述的骨架具有抵抗卡那霉素的细菌新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因。该基因允许选择用质粒转化的大肠埃希菌或农杆菌属。t-DNA区含有三个组成部分：边界，用于在组织培养基上选择转基因植物细胞的表达盒，以及用于稳定表达转基因启动子的表达盒。T-DNA边界是位于T-DNA侧翼的正向重复序列(25bp)，并描绘了毒力基因将复制并包装用于遗传转化的区域。在该实施例中，骨架和T-DNA序列由Coutu等人在Transgenic Res(2007)16:771–781中公开，其公开内容通过引用整体并入本文。在该实施例中，选择性标记和目的基因(包含二元和三元可切割连接肽和TP的杀昆虫或杀线虫杀昆虫和/或杀线虫蛋白)的表达盒在设计上相似，仅在编码其相应蛋白的开放阅读框(ORF)的区域中不同。
该表达盒的一个很好的实例是由Christensen和Quail在Transgenic Res.1996年5月；5(3):213-8中定义的玉米Ubi-1启动子和表达盒，其公开内容通过引用整体并入本文。来自植物的组成型表达基因盒的启动子区域能够被亚克隆且移除基因并由多克隆位点(MCS)代替以落入其他目的基因中。就Ubi-1实例而言，906bp启动子区域(UBI-1prom)促进81bp 5’非翻译区(5'UTR)和Ubi-1 1025bp内含子(UBI-1内含子)的转录，该内含子之后是MCS。通过插入终止子序列终止盒，在该实施例中，终止子序列是约250bp的胭脂碱合酶(NOS)3'非翻译序列和多聚腺苷酸化信号。对于选择性标记盒，可以使用赋予植物对除草化学品抗性的基因的插入，使得表达该盒的细胞将对组织培养基中包含除草化学品具有抗性。在该实施例中，选择性标记基因可以是编码草胺膦乙酰转移酶活性的基因(参见专利US5648477，其公开内容通过引用整体并入本文)。本文举例说明了包含二元和三元可切割连接肽和TP的杀昆虫转基因蛋白的表达，特别是在实施例A中，其中这种基因在烟草中瞬时表达。整个带标记的示例性玉米转化载体实例的线性组成可见于图8。
该实施例的第二组成部分是通过标准二元载体转化玉米植物，和随后的转基因植物再生，转基因植物再生是本领域熟知的并由Frame等人，Plant Physiology,2002年5月,第129卷,第13-22页和Vega等人,Plant Cell Rep(2008)27:297-305进行了定义和记载，它们的公开内容通过引用整体并入本文。遵循这些方案将导致具有上述t-DNA的转基因植物的再生。
本章节的第三个组成部分是对完整蛋白的表达的验证。可以制备转基因植物组织以分离总可溶性蛋白，然后可以在iELISA上使用特异性结合重组产生的TP的一抗(如本文提供的实施例A中所定义)对此定量。蛋白的完整性质可以使用类似的总可溶性蛋白分离，然后进行蛋白凝胶和蛋白质印迹程序(也如本文实施例A中定义和举例说明)来验证。
实施例6.亚克隆和表达包含Bt Cry杀昆虫蛋白以包含二元和三元可切割连接肽
在一些代表性实例中，本文提供了用于表达和合成经修饰的TP的方案。在下面进一步详述的一个实施例中，描述了经修饰的Bt蛋白，当暴露于昆虫和线虫以及人肠道环境的内容物时，Bt蛋白被昆虫或线虫蛋白酶成分更有效地切割。二元或三元可切割肽的存在导致Bt蛋白的稳定化或非活性区域的更完全解离，从而导致杀昆虫和杀线虫TP的产生增加。
该实施例详述了如何亚克隆示例性Bt cry TP以包含二元和三元可切割连接肽(L)。该实施例有两个步骤：转化Bt cry TP基因序列以在非杀昆虫域(Bt非活性)与杀昆虫域(Bt活性)基因之间包含二元或三元可切割连接肽(L)，并产生表达该基因的植物。
将二元或三元可切割肽(L)插入cry基因的最简单方法是有序合成编码具有插入序列的整个基因的DNA。
Bt cry TP基因可以是任意数量的基因；Bt TP基因的一个很好的实例是Cry3a基因。Cry3a基因的变体可以在Genbank中以登记号AX712174找到：来自专利WO03018810的序列8(可访问blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM＝blastn&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome)，该专利通过引用整体并入本文。该序列源自以下出版物：Walters等人,Appl.Environ.Microbiol.2008年1月，第74卷第2期，367-374，该出版物的公开内容通过引用整体并入本文。在该出版物中，作者在α-螺旋3与α-螺旋4之间的域I环中用“AAPF”四氨基酸序列代替“VSS”野生型三氨基酸序列，以增加从杀昆虫或活性55kDa剩余物切割非活性12kDa域I。作者假设该AAPF被叶甲属肠道中的胰凝乳蛋白酶/组织蛋白酶G酶识别，并导致全长67kDa蛋白更快地转化成切割和55kDa的形式，该形式是杀昆虫成熟蛋白并且与67kDa形式相比表现出与西方玉米根虫刷状缘膜的特异性结合。将该AAPF氨基酸序列通过FRET和由酵母产生的被我们现有的AAPF氨基酸分开的TP“U+2-ACTX-Hv1a”二聚体进行分析，FRET和蛋白均未显示出被人胃肠蛋白酶的任何可切割性(数据未显示)。因此，上文引用的Walters等人的参考文献中所用的肽氨基酸序列AAPF既不是如本文所述的二元可切割连接肽也不是三元可切割连接肽。
对于将Cry3a基因转化为具有插入的二元或三元可切割连接肽的基因的实例，进行了Walters等人描述的DNA序列克隆，使得编码AAPF氨基酸的碱基对被除去，而在它们的位置中(框内)是编码二元可切割连接肽ALKLFV或三元可切割连接肽ALKLFVGS的氨基酸的密码子。这将在原肽(Bt非活性)与Bt活性毒素(Bt活性)之间插入可切割二元肽或三元肽，如图3B所示，其中可切割二元肽或三元肽位于Bt TP的非活性部分(Bt非活性)与Bt TP的活性部分(Bt活性)之间的框内。
为了表达Bt Cry TP以包含二元和/或三元可切割连接肽，将上述DNA亚克隆到杀昆虫基因表达盒内的多克隆位点，并如前面由实施例B所述在玉米中转化。
实施例7.示例性二元肽
在一些实施方案中，本发明的二元肽是具有以下氨基酸序列的二元肽，所述氨基酸序列可以通过组合来自SGF筛选Y组和昆虫可切割性X组的序列而由X序列和Y序列按X-Y或Y-X方向组装。
从SGF筛选Y中发现的序列的一个实施方案是：AFF、AFG、AFI、AFL、AFV、AFY、AGF、AGL、AIF、AIL、ALF、ALG、ALI、ALL、ALY、AYF、AYL、DFF、DFG、DFI、DFL、DFY、DGF、DGL、DIF、DLF、DLG、DLY、DYF、DYL、EFF、EFG、EFI、EFL、EFY、EGF、EGL、EIF、ELF、ELG、ELY、EYF、EYL、FF、FFA、FFD、FFE、FFF、FFG、FFI、FFK、FFL、FFR、FFS、FFT、FFV、FFY、FGA、FGD、FGE、FGF、FGI、FGK、FGL、FGR、FGS、FGT、FGV、FGY、FLV、FLR、FYA、FYD、FYE、FYF、FYG、FYI、FYK、FYL、FYR、FYS、FYT、FYV、FYY、GFA、GFD、GFE、GFF、GFI、GFK、GFL、GFR、GFS、GFT、GFV、GFY、GGL、GIF、GIL、GLF、GLI、GLL、GLY、GYF、GYL、IF、IFA、IFF、IFG、IFI、IFL、IFV、IFY、IGF、IGL、IIF、IIL、ILF、ILG、ILI、ILL、ILY、IYF、IYL、LFA、LFF、LFG、LFI、LFL、LFV、LFY、LG、LGA、LGE、LGF、LGI、LGL、LGV、LGY、LIF、LIG、LII、LIL、LIY、LLF、LLG、LLI、LLL、LLY、LYA、LYF、LYG、LYI、LYL、LYV、LYY、NFF、NFG、NFI、NFL、NFY、NGF、NGL、NIL、NLG、NLI、NLL、NYF、NYL、QFF、QFG、QFI、QFL、QFY、QGF、QGL、QIL、QLG、QLI、QLL、QYF、QYL、SFF、SFG、SFI、SFL、SFY、SGF、SGL、SIF、SIL、SLF、SLG、SLI、SLL、SLY、SYF、SYL、TFF、TFG、TFI、TFL、TFY、TGF、TGL、TIF、TIL、TLF、TLG、TLI、TLL、TLY、TYF、TYL、VFF、VFG、VFI、VFL、VFY、VGF、VGL、VIF、VIL、VLF、VLG、VLI、VLL、VLY、VYF、VYL、YFA、YFD、YFE、YFF、YFG、YFI、YFK、YFL、YFR、YFS、YFT、YFV、YFY、YGF、YGL、YYF、YYL。
从SGF筛选Y中发现的序列的另一个实施方案是：AFF、AFI、AFL、AFY、AIF、AIL、ALF、ALI、ALL、ALY、AYF、AYL、DFF、DFI、DFL、DFY、DIF、DLF、DLY、DYF、DYL、YFL、EFF、EFI、EFL、0、EFY、EIF、ELF、ELY、EYF、EYL、FFA、FFD、FFE、FFF、FFI、FFK、FFL、FFR、FFS、FFT、FFV、FFY、FYA、FYD、FYE、FYF、FYI、FYK、FYL、FYR、FYS、FYT、FYV、FYY、IFA、IFF、IFI、IFL、IFV、IFY、IIF、IIL、ILF、ILI、ILL、ILY、IYF、IYL、LFA、LFF、LFI、LFL、LFV、LFY、LIF、LII、LIL、LIY、LLF、LLI、LLL、LLY、LYA、LYF、LYI、LYL、LYV、LYY、NFF、NFI、NFL、NFY、NIL、NLI、NLL、NYF、NYL、QFF、QFI、QFL、QFY、QIL、QLI、QLL、QYF、QYL、SFF、SFI、SFL、SFY、SIF、SIL、SLF、SLI、SLL、SLY、SYF、SYL、TFF、TFI、TFL、TFY、TIF、TIL、TLF、TLI、TLL、TLY、TYF、TYL、VFF、VFI、VFL、VFY、VIF、VIL、VLF、VLI、VLL、VLY、VYF、VYL、YFA、YFD、YFE、YFF、YFI、YFK、YFL、YFR、YFS、YFT、YFV、YFY、YYF、YYL。
从昆虫可切割性X中发现的序列的一个实施方案是：AAG、AAK、AAR、AFG、AFK、AFR、AGF、AGI、AGK、AGL、AGN、AGQ、AGR、AGS、AGT、AGY、AIG、AIK、AIN、AIQ、AIR、AKF、AKG、AKI、AKK、AKL、AKN、AKQ、AKR、AKS、AKT、AKY、ALG、ALK、ALN、ALQ、ALR、APF、APG、APK、APR、ARF、ARG、ARI、ARK、ARL、ARN、ARQ、ARR、ARS、ART、ARY、ASG、ASK、ASR、ATG、ATK、ATR、AVG、AVK、AVR、AYG、AYK、AYR、DGK、DGR、DIG、DIK、DIR、DLG、DLK、DLR、EGK、EGR、EIG、EIK、EIR、ELG、ELK、ELR、ER、FVR、GAF、GAI、GAK、GAL、GAR、GAY、GFK、GFR、GIK、GIN、GIQ、GIR、GKA、GKD、GKE、GKF、GKI、GKK、GKL、GKN、GKQ、GKR、GKS、GKT、GKV、GKY、GLK、GLN、GLQ、GLR、GNA、GNK、GNR、GNV、GPK、GPR、GQA、GQK、GQR、GQV、GRA、GRD、GRE、GRF、GRI、GRK、GRL、GRN、GRQ、GRR、GRS、GRT、GRV、GRY、GSI、GSK、GSL、GSR、GTI、GTK、GTL、GTR、GVF、GVI、GVK、GVL、GVR、GVY、GYK、GYR、IGA、IGF、IGI、IGK、IGL、IGN、IGQ、IGR、IGS、IGT、IGV、IGY、IIG、IIK、IIR、IKA、IKF、IKG、IKI、IKK、IKL、IKN、IKQ、IKR、IKS、IKT、IKV、IKY、ILG、ILK、ILR、INA、ING、INK、INR、INV、IPG、IPK、IPR、IQA、IQG、IQK、IQR、IQV、IRA、IRF、IRG、IRI、IRK、IRL、IRN、IRQ、IRR、IRS、IRT、IRV、IRY、ISG、ISK、ISR、ITG、ITK、ITR、KAF、KAG、KAI、KAK、KAL、KAR、KAY、KFF、KFG、KFK、KFR、KGA、KGD、KGE、KGF、KGI、KGK、KGL、KGN、KGQ、KGR、KGS、KGT、KGV、KGY、KIG、KIK、KIN、KIQ、KIR、KKA、KKD、KKE、KKF、KKG、KKN、KKQ、KKS、KKT、KKV、KKY、KLG、KLK、KLN、KLQ、KLR、KNG、KNK、KNR、KPG、KPK、KPR、KQG、KQK、KQR、KRA、KRD、KRE、KRF、KRG、KRN、KRQ、KRS、KRT、KRV、KRY、KSG、KSI、KSK、KSL、KSR、KTG、KTI、KTK、KTL、KTR、KVF、KVG、KVI、KVK、KVL、KVR、KVY、KYG、KYK、KYR、LFR、LGA、LGF、LGI、LGK、LGL、LGN、LGQ、LGR、LGS、LGT、LGV、LGY、LIG、LIK、LIR、LK、LKA、LKF、LKG、LKI、LKK、LKL、LKN、LKQ、LKR、LKS、LKT、LKV、LKY、LLG、LLK、LLR、LNA、LNG、LNK、LNR、LNV、LPG、LPK、LPR、LQA、LQG、LQK、LQR、LQV、LRA、LRF、LRG、LRI、LRK、LRL、LRN、LRQ、LRR、LRS、LRT、LRV、LRY、LSG、LSK、LSR、LTG、LTK、LTR、NGK、NGR、NIG、NIK、NIR、NLG、NLK、NLR、PGK、PGR、PIG、PIK、PIR、PKG、PKK、PKR、PLG、PLK、PLR、PRG、PRK、PRR、QGK、QGR、QIG、QIK、QIR、QLG、QLK、QLR、RAF、RAG、RAI、RAK、RAL、RAR、RAY、RFF、RFG、RFK、RFR、RGA、RGD、RGE、RGF、RGI、RGK、RGL、RGN、RGQ、RGR、RGS、RGT、RGV、RGY、RIG、RIK、RIN、RIQ、RIR、RKA、RKD、RKE、RKF、RKG、RKK、RKN、RKQ、RKS、RKT、RKV、RKY、RLF、RLFL、RLG、RLK、RLN、RLQ、RLR、RNG、RNK、RNR、RPG、RPK、RPR、RQG、RQK、RQR、RRA、RRD、RRE、RRF、RRG、RRK、RRN、RRQ、RRR、RRS、RRT、RRV、RRY、RSG、RSI、RSK、RSL、RSR、RTG、RTI、RTK、RTL、RTR、RVF、RVG、RVI、RVK、RVL、RVR、RVY、RYG、RYK、RYR、VAG、VAK、VAR、VFG、VFK、VFR、VGF、VGI、VGK、VGL、VGN、VGQ、VGR、VGS、VGT、VGY、VIG、VIK、VIN、VIQ、VIR、VKF、VKG、VKI、VKK、VKL、VKN、VKQ、VKR、VKS、VKT、VKY、VLG、VLK、VLN、VLQ、VLR、VPG、VPK、VPR、VR、VRF、VRG、VRI、VRK、VRL、VRN、VRQ、VRR、VRS、VRT、VRY、VSG、VSK、VSR、VTG、VTK、VTR、VVG、VVK、VVR、VYG、VYK、VYR。
从昆虫可切割性X中发现的序列的另一个实施方案是：AAK、AAR、AFK、AFR、AIK、AIN、AIQ、AIR、AKF、AKI、AKK、AKL、AKN、AKQ、AKR、AKS、AKT、AKY、ALK、ALN、ALQ、ALR、APK、APR、ARF、ARI、ARK、ARL、ARN、ARQ、ARR、ARS、ART、ARY、ASK、ASR、ATK、ATR、AVK、AVR、AYK、AYR、DIK、DIR、DLK、DLR、EIK、EIR、ELK、ELR、IIK、IIR、IKA、IKF、IKI、IKK、IKL、IKN、IKQ、IKR、IKS、IKT、IKV、IKY、ILK、ILR、INA、INK、INR、INV、IPK、IPR、IQA、IQK、IQR、IQV、IRA、IRF、IRI、IRK、IRL、IRN、IRQ、IRR、IRS、IRT、IRV、IRY、ISK、ISR、ITK、ITR、KAF、KAI、KAK、KAL、KAR、KAY、KFK、KFR、KIK、KIN、KIQ、KIR、KKA、KKD、KKE、KKF、KKN、KKQ、KKS、KKT、KKV、KKY、KLK、KLN、KLQ、KLR、KNK、KNR、KPK、KPR、KQK、KQR、KRA、KRD、KRE、KRF、KRN、KRQ、KRS、KRT、KRV、KRY、KSI、KSK、KSL、KSR、KTI、KTK、KTL、KTR、KVF、KVI、KVK、KVL、KVR、KVY、KYK、KYR、LIK、LIR、LKA、LKF、LKI、LKK、LKL、LKN、LKQ、LKR、LKS、LKT、LKV、LKY、LLK、LLR、LNA、LNK、LNR、LNV、LPK、LPR、LQA、LQK、LQR、LQV、LRA、LRF、LRI、LRK、LRL、LRN、LRQ、LRR、LRS、LRT、LRV、LRY、LSK、LSR、LTK、LTR、NIK、NIR、NLK、NLR、PIK、PIR、PKK、PKR、PLK、PLR、PRK、PRR、QIK、QIR、QLK、QLR、RAF、RAI、RAK、RAL、RAR、RAY、RFK、RFR、RIK、RIN、RIQ、RIR、RKA、RKD、RKE、RKF、RKN、RKQ、RKS、RKT、RKV、RKY、RLK、RLN、RLQ、RLR、RNK、RNR、RPK、RPR、RQK、RQR、RRA、RRD、RRE、RRF、RRN、RRQ、RRS、RRT、RRV、RRY、RSI、RSK、RSL、RSR、RTI、RTK、RTL、RTR、RVF、RVI、RVK、RVL、RVR、RVY、RYK、RYR、VAK、VAR、VFK、VFR、VIK、VIN、VIQ、VIR、VKF、VKI、VKK、VKL、VKN、VKQ、VKR、VKS、VKT、VKY、VLK、VLN、VLQ、VLR、VPK、VPR、VRF、VRI、VRK、VRL、VRN、VRQ、VRR、VRS、VRT、VRY、VSK、VSR、VTK、VTR、VVK、VVR、VYK、VYR。
实施例8.表达本发明的杀昆虫和/或杀线虫蛋白的转基因植物的杀昆虫功效
使用图8中描述的载体制备转基因玉米植物。包含组分STA、L和TP的ORF由图6B定义，且制备成可操作以转化到玉米植物细胞中的多核苷酸。通过以6英寸的间隔、每行125粒种子、重复6次来种植种子而进行了田间试验。UTC玉米株系是用作玉米转化的外植体的亲本株系，转基因玉米株系是表达图6B的转基因的所得转基因植物。每株植物用600只西方玉米根虫卵侵染，然后在作物成熟后进行评分。以0-3的量表进行评分，其中使用(Oleson,J.D.,Y.Park,T.M.Nowatzki和J.J.Tollefson.2005.J.Econ Entomol.98(1):1-8)对地下根的三个根环进行损害评分。0分表示没有损害。3分表示所有3个根环都被破坏。图9所示的非转基因和转基因玉米植物的田间试验数据(其中转基因植物显示出减少的西方玉米根虫损害)是30株植物的平均得分，其中随机挑选6次重复中的每个重复中的5株。包含图6B中所示的杀昆虫和/或杀线虫蛋白的转基因植物与用作外植体以产生转基因玉米株系的未转化玉米株系中的1.90损害相比，损害得分为1.55。使用图6B中所示的杀昆虫和/或杀线虫蛋白当转化到玉米中时显示出转基因在控制玉米有害生物即西方玉米根虫方面的功效。

Claims (60)

1.一种由二元肽或三元肽组成的肽，所述肽包含至少4个氨基酸且最多16个氨基酸，由2或3个不同的区域组成，其中所述二元肽具有2个不同的区域而所述三元肽具有3个不同的区域；其中，所述二元肽和三元肽能够被动物肠道蛋白酶和昆虫或线虫肠道蛋白酶二者切割。
2.如权利要求1所述的肽，其中所述二元肽包含至少4个氨基酸且最多8个氨基酸；并且所述肽包含2个不同的区域，其中所述区域中的一个能够被动物肠道蛋白酶切割而另一个区域能够被昆虫或线虫肠道蛋白酶切割。
3.如权利要求1所述的肽，其中所述三元肽包含至少5个氨基酸，最多16个氨基酸；并且所述三元肽包含二元肽和1至4个氨基酸的间隔区。
4.如权利要求3所述的肽，其中所述间隔区包含氨基酸序列GS、WN、WQ、MA、MV、AM、LH、MN、ES、WQ或DT。
5.如权利要求1-4中任一项所述的二元肽，其中所述二元肽包含选自以下的氨基酸序列：X1-X2-Y1-Y2、X1-X2-X3-Y1-Y2、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2、X1-X2-Y1-Y2-Y3、X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3、X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4、X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4、Y1-Y2-X1-X2、Y1-Y2-X1-X2-X3、Y1-Y2-X1-X2-X3-X4、Y1-Y2-Y3-X1-X2、Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3、Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4，其中每个Xn和每个Yn均为氨基酸，并且其中每个Xn和每个Yn均为氨基酸，并且其中X1选自：(全部为单字母氨基酸格式)A、D、E、G、I、K、L、N、P、Q、R和V；X2选自A、F、G、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V和Y；X3选自A、D、E、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V和Y；X4选自：R、H、K、D、E、S、T、N、Q、G、A、I、L、M、F、W、Y和V。在一些实施方案中，Y1选自：(全部为单字母氨基酸格式)A、D、E、F、G、I、L、N、Q、S、T、V和Y；Y2选自F、G、I、L和Y；以及Y3选自A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V和Y；并且Y4选自：R、H、K、D、E、S、T、N、Q、G、A、I、L、M、F、W、Y和V。
6.如权利要求1-5中任一项所述的肽，其中所述二元肽具有以下氨基酸序列：AFVRLF、AKLFV、ALFALK、ALFLK、ALFLR、ALFR、ALFRLR、ALKALF、ALKFF、ALKFLV、ALKIFV、ALKLFV、FFADIK、FFALK、FFLK、FFLR、FFRLR、FGYRIK、FLRLF、FYARR、GGLRKK、IFVALK、IFVLK、IFVLR、IFVR、IFVRLR、ILFNIK、LFAAPF、FVALK、LFVLK、LFVLR、LFVR、LFVRLR、LFVRVFL、LGER、LKALF、LKFF、LKIFV、LKLFV、LRALF、LRFF、LRIFV、LRLFV、RALF、RIFV、RLFV、RLRALF、RLRFF、RLRIFV、RLRLFV、RRKAFV、RRKLIF、RRRFFA、VFGRKG和YFVRK。
7.如权利要求6所述的肽，其中所述二元肽具有以下氨基酸序列：IFVALK、IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV、LFAAPF、LFVALK、LRLFV、LFVRLR或LKLFV。
8.如权利要求1所述的肽，其中所述三元肽包含以下氨基酸序列：IFVALKGS、IFVRLRGS、ALKLFVGS、ALKFLVGS、RRKAFVGS、LFAAPFGS、LFVALKGS、LRLFVGS、LFVRLRGS或LKLFVGS。
9.如权利要求1-7中任一项所述的肽，其中所述二元肽具有氨基酸序列IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF。
10.如权利要求1-9所述的肽，其中所述三元肽包含以下氨基酸序列：IFVRLRGS、ALKLFVGS、ALKFLVGS、RRKAFVGS、LFAAPFGS、GSIFVRLR、GSALKLFV、GSALKFLV、GSGSRRKAFV或GSLFAAPF。
11.如权利要求1-10中任一项所述的肽，其中所述二元肽或三元肽与毒性蛋白(TP)连接。
12.如权利要求11所述的肽，其还包含与所述TP的C末端框内连接的第二二元肽或三元肽。
13.如权利要求1-12中任一项所述的肽，其中所述二元肽或三元肽与内质网信号肽(ERSP)的C末端连接。
14.一种具有一种或多种可切割连接肽的杀昆虫和/或杀线虫蛋白，所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含与二元肽或三元肽的N末端框内融合的ERSP，所述二元肽或三元肽与构建体框内融合，所述构建体包含：(L-TP)n、(L-TP)n-L、(TP-L)n或L-(TP-L)n，其中TP是毒性蛋白，L是二元肽或三元肽并且n是1至200范围内的整数。
15.如权利要求1-14中任一项所述的肽或杀昆虫和/或杀线虫蛋白，其中所述昆虫蛋白酶是源自鳞翅目或鞘翅目昆虫的种的蛋白酶。
16.如权利要求1-15中任一项所述的肽或杀昆虫和/或杀线虫蛋白，其中所述动物肠道蛋白酶是人胃肠蛋白酶。
17.如权利要求1-16中任一项所述的肽或杀昆虫和/或杀线虫蛋白，其中所述TP是选自成孔杀昆虫蛋白(PFIP)和富半胱氨酸杀昆虫蛋白(CRIP)的蛋白。
18.如权利要求1-17中任一项所述的肽或杀昆虫和/或杀线虫蛋白，其中所述TP是与具有如SEQ ID NO:5-1593和1761-1775所示的氨基酸序列的肽或蛋白具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性或序列同源性的肽或蛋白。
19.如权利要求1-18中任一项所述的肽或杀昆虫和/或杀线虫蛋白，其中所述TP是与具有如5、6和1761、1762、1767、1771-1773所示的氨基酸序列的肽或蛋白具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性或序列同源性的肽或蛋白，及其变体。
20.如权利要求19所述的肽或杀昆虫和/或杀线虫蛋白，其中所述TP是具有SEQ ID NO:5、6、1761、1762、1767、1771-1773中任一个的氨基酸序列的肽，或其变体。
21.一种多核苷酸，其编码如权利要求1-20中任一项所述的肽或杀昆虫和/或杀线虫蛋白。
22.一种载体，其包含如权利要求21所述的多核苷酸。
23.一种细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、植物宿主细胞或动物宿主细胞，其包含如权利要求22所述的载体。
24.一种DNA构建体，其包含与可操作启动子连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码：包含二元肽或三元肽的可切割肽，所述可切割肽包含至少4个氨基酸且最多16个氨基酸并且由2或3个不同的区域组成，其中所述二元肽具有2个不同的区域而所述三元肽具有3个不同的区域；其中所述可切割肽能够被动物肠道蛋白酶和昆虫或线虫肠道蛋白酶二者切割，并且所述多核苷酸还编码与所述可切割肽框内融合的毒性肽。
25.如权利要求24所述的DNA构建体，其中所述三元肽包含至少5个氨基酸，最多16个氨基酸；并且所述三元肽包含二元肽和1至4个氨基酸的间隔区。
26.如权利要求25所述的DNA构建体，其中所述间隔区包含氨基酸序列GS、WN、WQ、MA、MV、AM、LH、MN、ES、WQ或DT。
27.如权利要求24-26中任一项所述的DNA构建体，其中所述二元肽包含以下的氨基酸序列：X1-X2-Y1-Y2、X1-X2-X3-Y1-Y2、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2、X1-X2-Y1-Y2-Y3、X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3、X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4、X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4、Y1-Y2-X1-X2、Y1-Y2-X1-X2-X3、Y1-Y2-X1-X2-X3-X4、Y1-Y2-Y3-X1-X2、Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3、Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4，其中每个Xn和每个Yn均为氨基酸，并且其中每个Xn和每个Yn均为氨基酸，并且其中X1选自：(全部为单字母氨基酸格式)A、D、E、G、I、K、L、N、P、Q、R和V；X2选自A、F、G、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V和Y；X3选自A、D、E、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V和Y；X4选自：R、H、K、D、E、S、T、N、Q、G、A、I、L、M、F、W、Y和V。在一些实施方案中，Y1选自：(全部为单字母氨基酸格式)A、D、E、F、G、I、L、N、Q、S、T、V和Y；Y2选自F、G、I、L和Y；以及Y3选自A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V和Y；并且Y4选自：R、H、K、D、E、S、T、N、Q、G、A、I、L、M、F、W、Y和V。
28.如权利要求27所述的DNA构建体，其中所述二元肽包含以下氨基酸序列：AFVRLF、AKLFV、ALFALK、ALFLK、ALFLR、ALFR、ALFRLR、ALKALF、ALKFF、ALKFLV、ALKIFV、ALKLFV、FFADIK、FFALK、FFLK、FFLR、FFRLR、FGYRIK、FLRLF、FYARR、GGLRKK、IFVALK、IFVLK、IFVLR、IFVR、IFVRLR、ILFNIK、LFAAPF、FVALK、LFVLK、LFVLR、LFVR、LFVRLR、LFVRVFL、LGER、LKALF、LKFF、LKIFV、LKLFV、LRALF、LRFF、LRIFV、LRLFV、RALF、RIFV、RLFV、RLRALF、RLRFF、RLRIFV、RLRLFV、RRKAFV、RRKLIF、RRRFFA、VFGRKG和YFVRK。
29.如权利要求28所述的DNA构建体，其中所述二元肽包含以下氨基酸序列：IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF。
30.如权利要求24所述的DNA构建体，其中所述多核苷酸编码包含以下氨基酸序列的三元肽：AFVRLFGS、AKLFVGS、ALFALKGS、ALFLKGS、ALFLRGS、ALFRGS、ALFRLRGS、ALKALFGS、ALKFFGS、ALKFLVGS、ALKIFVGS、ALKLFVGS、FFADIKGS、FFALKGS、FFLKGS、FFLRGS、FFRLRGS、FGYRIKGS、FLRLFGS、FYARRGS、GGLRKKGS、IFVALKGS、IFVLKGS、IFVLRGS、IFVRGS、IFVRLRGS、ILFNIKGS、LFAAPFGS、LFVALKGS、LFVLKGS、LFVLRGS、LFVRGS、LFVRLRGS、LFVRVFLGS、LGERGS、LKALFGS、LKFFGS、LKIFVGS、LKLFVGS、LRALFGS、LRFFGS、LRIFVGS、LRLFVGS、RALFGS、RIFVGS、RLFVGS、RLRALFGS、RLRFFGS、RLRIFVGS、RLRLFVGS、RRKAFVGS、RRKLIFGS、RRRFFAGS、VFGRKGGS、YFVRKGS、GSAFVRLF、GSAKLFV、GSALFALK、GSALFLK、GSALFLR、GSALFR、GSALFRLR、GSALKALF、GSALKFF、GSALKFLV、GSALKIFV、GSALKLFV、GSFFADIK、GSFFALK、GSFFLK、GSFFLR、GSFFRLR、GSFGYRIK、GSFLRLF、GSFYARR、GSGGLRKK、GSIFVALK、GSIFVLK、GSIFVLR、GSIFVR、GSIFVRLR、GSILFNIK、GSLFAAPF、GSLFVALK、GSLFVLK、GSLFVLR、GSLFVR、GSLFVRLR、GSLFVRVFL、GSLGER、GSLKALF、GSLKFF、GSLKIFV、GSLKLFV、GSLRALF、GSLRFF、GSLRIFV、GSLRLFV、GSRALF、GSRIFV、GSRLFV、GSRLRALF、GSRLRFF、GSRLRIFV、GSRLRLFV、GSRRKAFV、GSRRKLIF、GSRRRFFA、GSVFGRKG和GSYFVRK。
31.如权利要求24所述的DNA构建体，其中所述昆虫蛋白酶是源自鳞翅目或鞘翅目昆虫的种的蛋白酶。
32.如权利要求24所述的DNA构建体，其中所述动物肠道蛋白酶是人胃肠蛋白酶。
33.如权利要求24-32中任一项所述的DNA构建体，其中所述TP是选自成孔杀昆虫蛋白(PFIP)和富半胱氨酸杀昆虫蛋白(CRIP)的肽或蛋白。
34.如权利要求33所述的DNA构建体，其中所述TP是与具有如SEQ ID NO:5-1593和1761-1775所示的氨基酸序列的肽或蛋白具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性或序列同源性的肽或蛋白。
35.如权利要求34所述的DNA构建体，其中所述TP是与具有如SEQ ID NO:5、6和1761、1762、1767、1771-1773所示的氨基酸序列的肽或蛋白具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性或序列同源性的肽或蛋白，及其变体。
36.如权利要求35所述的DNA构建体，其中所述TP是具有SEQ ID NO:5、6、1761、1762、1767、1771-1773中任一个的氨基酸序列的肽或蛋白，或其变体。
37.一种宿主细胞，其包含如权利要求24-36中任一项所述的DNA构建体。
38.如权利要求37所述的宿主细胞，其包含如权利要求35所述的DNA构建体。
39.如权利要求37所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞、酵母细胞、植物细胞或动物细胞。
40.如权利要求39所述的宿主细胞，其中所述细菌细胞选自农杆菌属、芽孢杆菌属、埃希氏菌属、沙门氏菌属、假单胞菌属和根瘤菌属细胞。
41.如权利要求39所述的宿主细胞，其中所述植物细胞选自：苜蓿、香蕉、大麦、豆、西兰花、卷心菜、油菜、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭菜、莴苣、火炬松、粟、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、杨树、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜属蔬菜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、西红柿、黑小麦、草坪草、西瓜和小麦植物细胞。
42.一种植物或其部分，其包含与可操作启动子连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码：包含二元肽或三元肽的可切割肽，所述可切割肽包含至少4个氨基酸且最多16个氨基酸并且由2或3个不同的区域组成，其中所述二元肽具有2个不同的区域而所述三元肽具有3个不同的区域；其中所述可切割肽能够被动物肠道蛋白酶和昆虫或线虫肠道蛋白酶二者切割，并且其中所述多核苷酸还编码与所述可切割肽框内融合的毒性肽。
43.如权利要求42所述的植物或其部分，其中所述植物选自：苜蓿、香蕉、大麦、豆、西兰花、卷心菜、油菜、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、大白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、花旗松、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭菜、莴苣、火炬松、粟、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、杨树、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜属蔬菜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、香枫、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、西红柿、黑小麦、草坪草、西瓜和小麦植物,并且其中所述部分选自叶片、茎、花、萼片、果实、根或种子。
44.一种控制植物的有害生物感染的方法，所述方法包括在所述有害生物的食物中提供植物或其部分，所述植物或其部分表达杀昆虫和/或杀线虫蛋白或至少在所述植物或其部分的一部分上涂有包含杀昆虫和/或杀线虫蛋白的组合物，其中所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白包含一种或多种可切割二元肽或三元肽和一种或多种TP，其中所述二元肽和三元肽能够被动物肠道蛋白酶和昆虫或线虫肠道蛋白酶二者切割。
45.如权利要求44所述的控制植物的有害生物感染的方法，其中所述可切割二元肽包含以下氨基酸序列：X1-X2-Y1-Y2、X1-X2-X3-Y1-Y2、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2、X1-X2-Y1-Y2-Y3、X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3、X1-X2-Y1-Y2-Y3-Y4、X1-X2-X3-Y1-Y2-Y3-Y4、X1-X2-X3-X4-Y1-Y2-Y3-Y4、Y1-Y2-X1-X2、Y1-Y2-X1-X2-X3、Y1-Y2-X1-X2-X3-X4、Y1-Y2-Y3-X1-X2、Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3、Y1-Y2-Y3-X1-X2-X3-X4、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3、Y1-Y2-Y3-Y4-X1-X2-X3-X4，其中每个Xn和每个Yn均为氨基酸，并且其中每个Xn和每个Yn均为氨基酸，并且其中X1选自：(全部为单字母氨基酸格式)A、D、E、G、I、K、L、N、P、Q、R和V；X2选自A、F、G、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V和Y；X3选自A、D、E、F、G、I、K、L、N、Q、R、S、T、V和Y；X4选自：R、H、K、D、E、S、T、N、Q、G、A、I、L、M、F、W、Y和V。在一些实施方案中，Y1选自：(全部为单字母氨基酸格式)A、D、E、F、G、I、L、N、Q、S、T、V和Y；Y2选自F、G、I、L和Y；以及Y3选自A、D、E、F、G、I、K、L、R、S、T、V和Y；并且Y4选自：R、H、K、D、E、S、T、N、Q、G、A、I、L、M、F、W、Y和V。
46.如权利要求44所述的控制植物的有害生物感染的方法，其中所述二元肽包含以下氨基酸序列：AFVRLF、AKLFV、ALFALK、ALFLK、ALFLR、ALFR、ALFRLR、ALKALF、ALKFF、ALKFLV、ALKIFV、ALKLFV、FFADIK、FFALK、FFLK、FFLR、FFRLR、FGYRIK、FLRLF、FYARR、GGLRKK、IFVALK、IFVLK、IFVLR、IFVR、IFVRLR、ILFNIK、LFAAPF、FVALK、LFVLK、LFVLR、LFVR、LFVRLR、LFVRVFL、LGER、LKALF、LKFF、LKIFV、LKLFV、LRALF、LRFF、LRIFV、LRLFV、RALF、RIFV、RLFV、RLRALF、RLRFF、RLRIFV、RLRLFV、RRKAFV、RRKLIF、RRRFFA、VFGRKG和YFVRK。
47.如权利要求46所述的控制植物的有害生物感染的方法，其中所述二元肽包含氨基酸序列IFVRLR、ALKLFV、ALKFLV、RRKAFV或LFAAPF。
48.如权利要求44所述的控制植物的有害生物感染的方法，其中所述可切割三元肽包含至少5个氨基酸，最多16个氨基酸；并且所述三元肽包含二元肽和1至4个氨基酸的间隔区。
49.如权利要求48所述的控制植物的有害生物感染的方法，其中所述三元肽包含在其C末端与二肽融合的二元肽，所述二肽包含氨基酸序列GS、WN、WQ、MA、MV、AM、LH、MN、ES、WQ或DT。
50.如权利要求44所述的控制植物的有害生物的感染的方法，其中所述昆虫蛋白酶是源自鳞翅目或鞘翅目昆虫的种的蛋白酶。
51.如权利要求44所述的控制植物的有害生物感染的方法，其中所述动物肠道蛋白酶是人胃肠蛋白酶。
52.如权利要求44-51中任一项所述的控制植物的有害生物感染的方法，其中所述TP是选自成孔杀昆虫蛋白(PFIP)和富半胱氨酸杀昆虫蛋白(CRIP)的蛋白。
53.如权利要求44所述的控制植物的有害生物感染的方法，其中所述有害生物是昆虫或线虫。
54.如权利要求53所述的控制植物的有害生物感染的方法，其中所述有害生物是来自于选自鞘翅目和鳞翅目的昆虫目的昆虫。
55.如权利要求44所述的控制植物的有害生物感染的方法，其中所述TP是选自以下的肽或蛋白：成孔杀昆虫蛋白(PFIP)和富半胱氨酸杀昆虫肽(CRIP)。
56.如权利要求55所述的控制植物的有害生物感染的方法，其中所述TP是抑制剂半胱氨酸结(ICK)基序蛋白或非ICK蛋白。
57.如权利要求56所述的控制植物的有害生物感染的方法，其中所述TP是与具有如SEQID NO:5、6和1761、1762、1767、1771-1773所示的氨基酸序列的肽或蛋白具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％序列同一性或序列同源性的肽或蛋白，或其变体。
58.如权利要求57所述的控制植物的有害生物感染的方法，其中所述TP是具有SEQ IDNO:5、6、1761、1762、1767、1771-1773中任一个的氨基酸序列的肽或蛋白，或其变体。
59.如权利要求44所述的控制植物的有害生物感染的方法，其中由所述植物提供杀有害生物有效量的所述TP，所述植物是重组植物、所述植物的一部分、或所述植物或所述植物部分的产物。
60.如权利要求44所述的控制植物的有害生物感染的方法，其中在局部施用于所述植物或所述植物的部分的一种或多种制剂中提供杀有害生物有效量的所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白，所述一种或多种制剂包含含有所述杀昆虫和/或杀线虫蛋白的细菌细胞、细菌孢子、真菌细胞、真菌孢子或伴孢晶体。
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