CN113683671B - 一种紫点海葵多肽毒素的制备方法及其抗肿瘤应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种紫点海葵多肽毒素的制备方法及其应用，其制备方法包括以下步骤：1、海葵粗毒液的提取：活海葵经过饥饿期后，使用手动挤压法或/和电刺激法提取含有海葵粗毒的水溶液，将含有海葵粗毒的水溶液进行冷冻干燥，使用生物CE膜透析袋透析脱盐；2、海葵粗毒分子滤过：将提取得到的海葵粗毒液，使用超滤管进行离心，得到滤过组分；3、海葵毒素的纯化：将步骤2得到的滤过组分经微孔滤膜过滤，通过反相高效液相色谱仪梯度洗脱得到F1‑F3组分，收集F1组分进行冷冻干燥，得到纯化后的紫点海葵多肽毒素。本发明制得紫点海葵多肽毒素不仅可以抑制结肠癌细胞HCT‑116活性而且能够促进结肠癌细胞HCT‑116的凋亡。

Description

一种紫点海葵多肽毒素的制备方法及其抗肿瘤应用

技术领域

本发明涉及海葵技术领域，特别涉及一种紫点海葵多肽毒素的制备方法及其抗肿瘤应用。

背景技术

海葵具有用于捕食和防御功能的触手刺细胞，其分泌的毒液主要包含多肽和蛋白类的神经毒素和溶细胞素，迄今为止，已从海葵中分离并鉴定了100多种多肽毒素，能够作用于各种细胞膜离子通道并且具有强心药物和神经毒素的特征。

国内于90年代初期开始了对海葵多肽毒素的研究，研究表明海葵多肽RSAP Ⅰ和RSAPⅡ对豚鼠心室肌细胞钠通道表现出活性，且二者所起的作用恰好相反。从舟山黄海葵中分离纯化了一种新的多肽毒素AX-1，不仅能使大鼠背根神经节细胞的钠离子通道的失活得到抑制，而且能使钠离子通道的电流得到显著增加，具有较好的兴奋性作用，有望开发成为强心类药物。从青岛侧花海葵中提取的毒素ApQ具有明显的增强心肌收缩的作用。从湛江的侧花海葵中分离得到了多个海葵神经毒素基因,其中重组海葵神经毒素Hk2a能够明显改善慢性充血性心力衰竭(CCHF)新西兰兔的左心室功能。因此，海葵神经毒素一方面可以作为分子探针,研究钠离子通道的结构与功能，另一方面，可以作为一种治疗心力衰竭的药物先导物，研制开发新的治疗心衰的药物。迄今为止，结直肠癌 (colorectal cancer，CRC)是世界上第三常见的恶性肿瘤。在我国，随着饮食结构和生活习惯的变化，患CRC的风险随之增加，应引起足够的关注和重视。

现有技术中也有利用海葵提取物添加到药物治疗中，例如CN112458138A 公开一种紫点海葵酶解多肽的制备方法及其应用，该发明制得紫点海葵多肽具有抗结肠癌的作用。该发明需要使用较多的化学试剂和生物试剂进行制备，制得紫点海葵多肽没有说明具有促进结肠癌细胞HCT-116的凋亡的作用。 CN105030838A公开海葵粗提物的制备方法及其抗肿癌应用，制得海葵粗毒应用在抗肺癌药物的制备中。该发明通过反复对海葵进行冻融处理的到海葵粗毒，该方法制得的海葵粗毒杂质较多，增加后续操作步骤。本发明通过手动挤压法或/和电刺激法获得海葵粗毒，不仅杂质较少，后续不需要过多步骤即可提取到紫点海葵毒素，而且将提取完毒素的海葵放回海洋环境中，海葵还可以存活。

因此，急需一种可以使海葵反复利用、操作简易的制备方法提取紫点海葵多肽毒素，通过该方法制备出的紫点海葵多肽毒素不仅有效抑制结肠癌细胞 HCT-116活性而且能够促进结肠癌细胞HCT-116的凋亡，且呈剂量依赖性。

发明内容

鉴以此，本发明提出一种紫点海葵多肽毒素的制备方法，制得紫点海葵多肽毒素具有高效的抗肿瘤活性，特异性作用于结肠癌细胞HCT-116，不仅有效抑制结肠癌细胞HCT-116活性而且能够促进结肠癌细胞HCT-116的凋亡，且呈剂量依赖性。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种紫点海葵多肽毒素的制备方法，包括以下步骤：

(1)海葵粗毒液的提取：活海葵经过饥饿期后，使用手动挤压法或/和电刺激法提取含有海葵粗毒的水溶液，将含有海葵粗毒的水溶液冷冻干燥，使用生物CE膜透析袋透析脱盐。

(2)海葵粗毒的分子滤过：将提取得到的海葵粗毒液，使用超滤管离心分离，得到滤过组分。

(3)海葵多肽毒素的分离纯化：将步骤(2)得到滤过组分经微孔滤膜过滤，通过反相高效液相色谱梯度洗脱得到F1-F3组分，收集F1组分进行冷冻干燥，得到纯化后的紫点海葵多肽毒素。

进一步的，步骤(1)中，所述活海葵饥饿期时长为24～48h。

进一步的，步骤(1)中，所述手动挤压法的操作为将活海葵清洗干净后手动挤压刺激海葵诱导其刺丝囊释放粗毒液，手动挤压方式为上下搓揉3～7次，每次2～4min。

进一步的，步骤(1)中，所述手动挤压法的操作为将海葵清洗干净后手动挤压海葵诱导其刺丝囊释放粗毒液，手动挤压方式为手动上下搓揉5次，每次 3min。

进一步的，步骤(1)中，所述电刺激法的操作步骤为：

(1)预处理：将活海葵放在烧杯中，用镊子去除污染物，丢弃在此过程中排出的腔肠液；

(2)海葵粗毒液水溶液的提取：将活海葵浸泡在装有人工海水的烧杯中，活海葵与人工海水的体积比为1:0.5～1.5，使用两个碳电极对其进行电刺激，电压为80～120V，电流频率为15～25Hz，间歇时间为8～12ms，持续时间为50～70 s，阴极放置在海葵消化循环腔中，阳极放置在海葵柱体和触手附近。

进一步的，步骤(1)中，活海葵与人工海水的体积比为1:1。

进一步的，步骤(1)中，所述电刺激法电压为100V，电流频率为20Hz，间歇时间为10ms，持续时间为60s。

进一步的，步骤(1)中，冷冻干燥的条件为温度为-60～-100℃，压力为 12～20Pa，时间为18～30h。

进一步的，步骤(1)中，冷冻干燥的条件为温度为-80℃，压力为16Pa，时间为24h。

进一步的，步骤(1)中，使用生物CE膜透析袋在4℃透析脱盐。

进一步的，步骤(2)中，使用30kD、10kD和3kD超滤管依次滤过，离心参数为3500～4500r/min，时间为3～5h。

进一步的，步骤(2)中，离心参数为4000r/min，时间4h。

进一步的，步骤(3)中，使用反相液相色谱仪进行分离的色谱条件：检测波长为210～220nm，反相色谱柱为C18半制备柱，洗脱液A液为体积百分比 0.08～0.12％三氟乙酸水溶液，B液为乙腈，流速为0.8～1.2mL/min，梯度洗脱程序为：

1、进一步的，步骤(3)中，使用反相液相色谱仪进行分离的色谱条件：检测波长为214nm，反相色谱柱为C18半制备柱，色谱柱长250mm，内径10mm，洗脱液A液为体积百分比0.10％三氟乙酸水溶液，B液为乙腈，流速为1.0 mL/min。

2、进一步的，步骤(3)中，冷冻干燥的条件为温度为-60～-100℃，压力为 12～20Pa，时间为8～16h。

3、进一步的，步骤(3)中，冷冻干燥的条件为温度为-80℃，压力为16Pa，时间为12h。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)采用本发明方法制备紫点海葵多肽毒素，不仅绿色环保，而且制得紫点海葵多肽毒素具有高效的抗肿瘤活性，特异性作用于结肠癌细胞HCT-116，不仅有效抑制结肠癌细胞HCT-116活性而且能够促进结肠癌细胞HCT-116的凋亡，且呈剂量依赖性。

(2)本发明采用手动挤压法或/和电刺激法提取海葵粗毒，减少杂质的种类，操作简单，安全性高，对海葵伤害小，易获得粗毒样品。本发明提取方法不会伤害紫点海葵生命，将提取结束的紫点海葵放回海洋生态环境培育，经过一段时间，可再次提取海葵粗毒液。本发明实现紫点海葵反复使用的目的。而且，优选手动挤压法提取海葵粗毒，该方法提取的海葵粗毒液经过SDS-PAGE 法检测，提取的海葵粗毒液电泳条带更清晰。

(3)本发明利用反相高效液相色谱梯度洗脱，色谱条件为检测波长为 210～220nm，反相色谱柱为C18半制备柱，洗脱液A液为体积百分比0.08～0.12％三氟乙酸水溶液，B液为乙腈，流速为0.8～1.2mL/min，本实施例优选梯度洗脱程序为

时间	A(V/V)	B(V/V)
			0	100	0
5	100	0
			10	86	14
40	58	42

该色谱条件下F1～F3组分峰峰型较好、F1、F2、F3峰与相邻峰之间均无干扰。而且，优选的F1组分峰保留时间为3min左右，缩短本发明制备紫点海葵多肽毒素的时间。

附图说明

图1不同方法提取海葵粗毒液电泳图

(A)手动按摩法提取海葵粗毒液(B)电刺激法提取海葵粗毒液

注：M:低分子量蛋白Marker；1、2、3:海葵粗毒蛋白

图2毒液3kD滤过组分的高效液相色谱图

(A)毒液3kD滤过组分的HPLC图；(B)毒液3kD滤过组分F1的HPLC图

图3毒液3kD滤过组分的质谱图

(A)毒液3kD滤过组分F1的质谱图；(B)毒液3kD滤过组分F2的质谱图；(C)毒液3kD滤过组分F3的质谱图

图4紫点海葵粗毒组分对结肠癌HCT-116细胞活力的影响

(A)紫点海葵粗毒4个组分对结肠癌HCT-116细胞活力的影响；(B)紫点海葵3kDa滤过组分对结肠癌HCT-116细胞活力的影响；(C)F1组分以100μg/mL、200μg/mL和400μ g/mL的浓度对HCT-116细胞给药，不同浓度的F1组分对结肠癌HCT-116细胞活力的影响。图5紫点海葵多肽毒素对结肠癌HCT-116细胞凋亡的影响

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明实施例使用材料与仪器:

(1)材料

色谱级三氟乙酸(Trifluoroaceticacid，TFA)和色谱级乙腈(Acetonitrile，ACN)购自ThermoFisherScientific公司；CCK-8试剂盒(Cell Counting Kit-8， CCK-8)购自Biosharp公司；DMEM基础培养基、胎牛血清、青霉素及链霉素购自Gibco公司；SunfireTMC18(10×250mm)半制备柱购自Waters公司；质粒抽提试剂盒等常规分子生物学试剂购自天根生物工程有限公司。

(2)仪器

CEM全自动微波多肽合成仪(LibertyBlue，美国)；反相高效液相色谱 (Agilent，美国)；三重四极杆液相色谱质谱联用仪(岛津，日本)；真空冷冻干燥机(西蒙，美国)；酶标仪(赛默飞，美国)。

实施例1海葵粗毒液的提取

1、提取过程

(1)活海葵经过48h饥饿期后分别采用手动挤压法和电刺激法提取海葵粗毒液。

(2)手动挤压法：将活海葵用水清洗干净，放入封口袋手动上下揉搓5次，每次3min刺激海葵诱导其刺丝囊释放粗毒液。

(3)电刺激法：将活海葵放在烧杯中，用镊子清洁以去除污染物，去除在此过程中排出的腔肠液。然后将海葵浸泡在装有人工海水的烧杯中，活海葵与人工海水的体积比为1:0.5～1.5，本实施例优选活海葵与人工海水的体积比为1:1，并使用两个碳电极对其进行电刺激，电压为80～120V，电流频率为15～25Hz，间歇时间为8～12ms，持续时间为50～70s，本实施例优选电压为100V，电流频率为20Hz，间歇时间为10ms，持续时间为60s，阴极在海葵消化循环腔中，阳极在水中靠近海葵柱体和触手。

(4)将含有海葵粗毒的水溶液冷冻干燥，温度为-60～-100℃，压力为 12～20Pa，时间为18～30h，本实施例优选温度为-80℃，压力为16Pa，时间为24h，使用生物CE膜透析袋在4℃透析脱盐。

2、检测方法

采用SDS-PAGE法检测两种方法提取的海葵粗毒液。按照SDS-PAGE试剂盒按说明书制胶，取10μL方法(2)中获得的海葵粗毒液与10μL2× LoadingBuffer缓冲液混匀，置水浴锅中于95℃煮沸5min。取10μL的低分子量蛋白Marker上样，用12.0％SDS-PAGE凝胶以恒压80V持续30min和120V持续2h的电泳条件分离蛋白。经考马斯亮蓝染色和脱色观察，最终使用凝胶成像系统观察并记录电泳结果

3、结果分析

结果表明(图1)手动挤压法操作简单，安全性高，对海葵伤害小，易获得粗毒样品，条带更清晰。

实施例2海葵粗毒液的分离与细胞活性检测

1、分离方法

将海葵粗毒液依次经30kD、10kD和3kD超滤管以离心参数为3500～4500 r/min，时间为3～5h，本实施例优选转数4000r/min，时间4h进行离心，得到4 个组分，分别为3kD滤过组分、3kD截留10kD滤过组分、10kD截留30kD 滤过组分和30kD截留组分。

2、CCK-8法检测海葵多肽对HCT-116细胞增殖抑制活性

结肠癌细胞HCT-116细胞培养基由DMEM基础培养基、10％(v/v)胎牛血清以及重量百分比1％的青霉素、链霉素混合液组成，于37℃、CO2浓度为 5％的细胞培养箱中培养。收集处于对数生长期且密度达到80％-90％的细胞于96 孔板中，每孔约1×10⁵个细胞。细胞培养12h后，设置空白组(完全培养基)、对照组(完全培养基+细胞)以及药物组，药物组分别加入浓度为100μg/mL的3kD 滤过组分、3kD截留10kD滤过组分、10kD截留30kD滤过组分和30kD截留组分。培养24h后加入10μLCCK-8溶液并孵育0.5h。使用酶标仪在450nm处测各孔的吸光值。(图4A)

细胞存活率(％)＝(实验组-空白组/对照组-空白组)×100％

3、结果分析

结果表明3kD滤过组分对HCT-116细胞有明显的抑制作用。

实施例3海葵粗毒液的纯化与检测

1、纯化步骤

(1)取3kD滤过组分经0.45μm微孔滤膜过滤，进行反相高效液相色谱分离。色谱条件为检测波长为210～220nm，反相色谱柱为C18半制备柱，洗脱液 A液为体积百分比0.08～0.12％三氟乙酸水溶液，B液为乙腈，流速为0.8～1.2 mL/min，本实施例优选检测波长为214nm，反相色谱柱为C18半制备柱，洗脱液A液为体积百分比0.1％三氟乙酸水溶液，B液为乙腈，流速为1.0mL/min，梯度洗脱为：

时间	A(％，V/V)	B(％，V/V)
			0	100	0
5	100	0
			10	86	14
40	58	42

(2)得到F1-F3组分，收集F1、F2、F3组分进行冷冻干燥，干燥温度为 -60～-100℃，压力为12～20Pa，时间为8～16h，本实施例优选干燥时间为12h，压力为16Pa，温度为-80℃。得到纯化后的紫点海葵多肽毒素。

2、检测方式

(1)质谱检测：采用电喷雾电离四极杆飞行时间质谱(ESI-Q-TOF-MS/MS) 进行分析。四级杆电子能量为4.0eV，碰撞诱导裂解能为8.0eV。采用电喷雾离子源(ESI)在正离子模式下扫描；干燥气体温度为250℃，干燥气体流速为 1.5L/min，ESI雾化器压力为1.5bar。

(2)不同组分对结肠癌HCT-116细胞活性检测：F1、F2和F3组分以200 μg/mL的浓度给药处理24h。

(3)紫点海葵多肽毒素HCT-116细胞活性检测：紫点海葵多肽毒素以1 mg/mL、2mg/mL和4mg/mL的浓度分别给药处理24h。

3、结果分析

(1)质谱鉴定表明(图3)化合物F1组分的具体分子量为300Da，F2的分子量为260Da，F3的分子量为557.8Da。

(2)

不同洗脱峰组分(200μg/mL)	细胞存活率(％)
		F1组分	39.43±4.34
F2组分	71.94±6.74
		F3组分	84.51±2.99

实验结果与(图4B)表明，实施例3分离出的F1、F2和F3组分对结肠癌 HCT-116细胞具有明显的抑制作用，其中，F1组分对HCT-116细胞的抑制效果更好。

紫点海葵多肽毒素浓度	细胞存活率(％)
		1mg/mL	6.61±0.39
2mg/mL	3.88±0.36
		4mg/mL	2.02±0.33

结果显示，实施例3制备紫点海葵多肽毒素对结肠癌HCT-116细胞具有较好的抑制作用，且呈药物依赖性。

实施例4紫点海葵多肽毒素对HCT-116细胞凋亡的影响

为了验证本发明的紫点海葵多肽毒素能够促进结肠癌HCT-116细胞凋亡，进行细胞凋亡检测，数据均使用统计学软件Graph Pad Prism8.0.2分析，结果以均数±标准差表示，数据进行正态检验及单因素方差分析，p<0.05表示差异具有统计学意义。

1、细胞凋亡检测：

收集处于对数生长期的结肠癌HCT-116细胞，接种于6孔板中，1×10⁵个 /mL培养12h。给药处理后培养24h，收集旧培养基于离心管中，加入不含EDTA (乙二胺四乙酸)的胰酶消化液消化，使用旧培养液中止消化并收集细胞。PBS (PBS缓冲液)洗涤细胞后以1000r/min离心5min。除去上清液，加入100μL Binding Buffer轻轻重悬细胞。先后加入5μL的Annexin V-FITC和10μL的碘化丙啶(PI)混匀。室温避光孵育15min后加入400μL BindingBuffer，1h内使用流式细胞仪检测。

2、实验结果及分析

本实验利用AnnexinV-FITC/PI试剂盒结合流式细胞仪检测F1组分给药后结肠癌HCT-116细胞的凋亡情况(图5A)。早期凋亡细胞位于右下象限(Q3)，晚期凋亡细胞位于右上象限(Q2)。结果显示，对照组凋亡率为(0.65±0.83)％， F1组分浓度为100μg/mL时凋亡率为(15.87±1.99)％、浓度为200μg/mL凋亡率为(20.98±0.42)％、浓度为400μg/mL凋亡率为(27.45±3.95)％(图5B)。结果表明本发明的海葵多肽毒素能够促进结肠癌HCT-116细胞凋亡。

实施例5

1、紫点海葵多肽毒素的制备

(1)海葵粗毒液的提取：海葵经过48h的饥饿期后，使用手动挤压法手动上下搓揉3次，每次2min提取含有海葵粗毒的水溶液，将含有海葵粗毒的水溶液进行冷冻干燥，冷冻干燥的条件为温度为-100℃，压力为20Pa，时间为30h，使用生物CE膜透析袋4℃透析脱盐；

(2)海葵粗毒的分子滤过：将海葵粗毒液依次经30kD、10kD和3kD 超滤管以转数3500r/min，时间3h进行离心，得到3kD滤过组分；

(3)海葵多肽毒素的纯化：将步骤(2)得到3kD滤过组分经0.45μm微孔滤膜过滤，通过反相高效液相色谱梯度洗脱，反相色谱柱为SunfireTM C18 (10×250mm)，检测波长为220nm，洗脱液A液为体积百分比0.12％三氟乙酸水溶液，B液为乙腈，流速为1.2mL/min，梯度洗脱程序为

时间	A(％，V/V)	B(％，V/V)
			0	100	0
5	100	0
			10	86	14
40	58	42

收集F1组分进行冷冻干燥，冷冻干燥的条件为温度为-100℃，压力为20Pa，时间为16h，得到纯化后的紫点海葵多肽毒素。

2、检测方法

(1)紫点海葵多肽毒素结肠癌HCT-116细胞活性检测：紫点海葵多肽毒素的浓度为1mg/mL给药处理。

(2)细胞凋亡检测：紫点海葵多肽毒素的浓度为100μg/mL给药处理。

3、实验结果

(1)紫点海葵多肽毒素结肠癌HCT-116细胞活性检测结果：

紫点海葵多肽毒素浓度	细胞存活率(％)
		1mg/mL	6.70±0.35

(2)细胞凋亡检测结果

紫点海葵多肽毒素浓度	细胞凋亡率(％)
		100μg/mL	15.43±0.35

实施例6

1、紫点海葵多肽毒素的制备

(1)海葵粗毒液的提取：海葵经过24h的饥饿期后，使用手动挤压法用手上下搓揉7次，每次4min提取含有海葵粗毒的水溶液，将含有海葵粗毒的水溶液进行冷冻干燥，冷冻干燥的条件为温度为-60℃，压力为12Pa，时间为18h，使用生物CE膜透析袋4℃透析脱盐；

(2)海葵粗毒的分子滤过：将海葵粗毒液依次经30kD、10kD和3kD 超滤管以转数4500r/min，时间5h进行离心，得到3kD滤过组分；

(3)海葵多肽毒素的纯化：将步骤(2)得到3kD滤过组分经0.45μm微孔滤膜过滤，通过反相高效液相色谱梯度洗脱，反相色谱柱为SunfireTM C18 (10×250mm)，检测波长为210nm，洗脱液A液为体积百分比0.08％三氟乙酸水溶液，B液为乙腈，流速为0.8mL/min，梯度洗脱为

时间	A(％，V/V)	B(％，V/V)
			0	100	0
5	100	0
			10	86	14
40	58	42

收集F1组分进行冷冻干燥，冷冻干燥8h(-60℃，12Pa)，得到纯化后的紫点海葵多肽毒素。

2、检测方法

(1)紫点海葵多肽毒素结肠癌HCT-116细胞活性检测：紫点海葵多肽毒素的浓度为1mg/mL给药处理。

(2)细胞凋亡检测：紫点海葵多肽毒素的浓度为100μg/mL给药处理。

3、实验结果

(1)紫点海葵多肽毒素结肠癌HCT-116细胞活性检测结果：

紫点海葵多肽毒素浓度	细胞存活率(％)
		1mg/mL	6.75±0.31

(2)细胞凋亡检测结果

对比例1

1、制备流程：参照专利CN202011374405.3一种紫点海葵酶解多肽的制备方法及其应用制备紫点海葵酶解寡肽。

(1)海葵总蛋白的提取：收集海南紫点海葵(Heteractis crispa)，海葵以去离子水洗净后剪碎，超声破碎至溶液浑浊，浸泡于异丙醇中去脂，每4h更换一次，连续换3次，再用纯水将异丙醇冲洗干净。置于通风橱中沥干，分装标记，于-20℃保存备用，即得紫点海葵脱脂样品。取紫点海葵脱脂样品19g置于小烧杯中，加入混合后的RIPA裂解液(强)500μL与PMSF 5μL蛋白酶抑制剂共505 μL(比例为100:1)，静置半小时后超声破碎至溶液浑浊。离心5min(4℃、 10000r/min)，收集上清液得到粗品，保存至-80℃冰箱，进行真空冷冻干燥，冻成干粉，于-20℃保存备用，即得海葵蛋白冻干粉。

用超纯水将海葵蛋白冻干粉复溶，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒法及 SDS-PAGE法检测蛋白含量、分子量分布。海葵总蛋白含量测定(BCA法)：以 5mg/μl的牛血清蛋白(BSA)溶液为母液，配制一组梯度浓度的BSA溶液，在 562nm处测定这组溶液的吸光度，得到蛋白质浓度对吸光度的一条标准曲线，测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线得到蛋白质的浓度。由标准曲线得总蛋白浓度为60.3mg/mL，蛋白总量为0.2g。

(2)酶解：取步骤S2的海葵蛋白冻干粉用纯水溶解，加入碱性蛋白酶，进行酶解，加入酶量为4000U/g，酶解条件为：pH为8、温度为60℃、时间为 6h，酶解后煮沸灭活15min，得到酶解产物经3kD超滤管离心，收集滤液(小于 3kD小分子多肽)，冷冻干燥保存至-20℃冰箱备用，即得紫点海葵多肽。

2、检测方式：参照实施例2中CCK-8法进行给药，寡肽浓度分别为1 mg/mL、2mg/mL和4mg/mL。

3、实验结果

寡肽浓度	细胞存活率(％)
		1mg/mL	50.30±1.70
2mg/mL	38.22±0.78
		4mg/mL	28.00±2.35

结果表明，本发明制备的紫点海葵多肽毒素对结肠癌HCT-116细胞的抑制效果优于对比例制备的紫点海葵酶解多肽。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.紫点海葵多肽毒素的应用，其特征在于，所述紫点海葵多肽毒素的制备方法包括以下步骤：

（1）海葵粗毒液的提取：活海葵经过饥饿期后，使用手动挤压法提取含有海葵粗毒的水溶液，将含有海葵粗毒的水溶液进行冷冻干燥，使用生物CE膜透析袋透析脱盐，手动挤压法的操作为将活海葵清洗干净进行手动挤压刺激海葵诱导其刺丝囊释放毒液，手动挤压方式为上下搓揉3~7次，每次2~4min；

（2）海葵粗毒分子滤过：将提取得到的海葵粗毒液，使用超滤管离心分离，选用3~30 kD超滤管，离心参数为3500~4500 r/min，时间为3~5 h，得到滤过组分；

（3）海葵毒素的纯化：将步骤（2）得到的滤过组分经微孔滤膜过滤，通过反相高效液相色谱仪梯度洗脱得到F1-F3组分，收集F1组分进行冷冻干燥，得到纯化后的紫点海葵多肽毒素；

使用反相液相色谱仪进行分离的色谱条件：检测波长为210~220 nm，反相色谱柱为C18半制备柱，洗脱液A液为体积百分比0.08~0.12% 三氟乙酸水溶液，B液为乙腈，流速为0.8~1.2 mL/min，梯度洗脱程序为：

时间 A(%，V/V) B(%，V/V) 0 100 0 5 100 0 10 86 14 40 58 42

；

所述紫点海葵多肽毒素应用于制备结肠癌细胞HCT-116的凋亡的药物中。

2.如权利要求1所述的紫点海葵多肽毒素的应用，其特征在于，步骤（1）中，活海葵饥饿期时长为24~48h。

3.如权利要求1所述的紫点海葵多肽毒素的应用，其特征在于，步骤（1）中冷冻干燥的条件为温度为-60~-100℃，压力为12~20 Pa，时间为18~30 h。

4.如权利要求1所述的紫点海葵多肽毒素的应用，其特征在于，色谱柱长250 mm，内径10 mm。

5.如权利要求1所述的紫点海葵多肽毒素的应用，其特征在于，步骤（3）中，冷冻干燥的条件为温度为-60~-100℃，压力为12~20 Pa，时间为8~16 h。