CN117186183B

CN117186183B - 一种人参来源的活性肽及其制备方法和肠道损伤保护的应用

Info

Publication number: CN117186183B
Application number: CN202311462797.2A
Authority: CN
Inventors: 宗树伟; 石丰
Original assignee: Jilin Peptide Valley Bioengineering Co ltd
Current assignee: Jilin Peptide Valley Bioengineering Co ltd
Priority date: 2023-11-06
Filing date: 2023-11-06
Publication date: 2024-01-09
Anticipated expiration: 2043-11-06
Also published as: CN117186183A

Abstract

本发明公开了一种人参来源的活性肽及其制备方法和肠道损伤保护的应用，涉及小分子活性肽技术领域，其中，所述活性肽的氨基酸序列为：Val‑Gly‑Asp‑Leu‑Lys‑Phe‑His‑Cys。本发明通过实验发现实验结果表明，人参来源的活性肽，该人参来源的活性肽干预可改变肠道屏障水通蛋白的表达，并对于肠道细胞周期具有一定影响，抑制了增殖且促进肠道黏液的分泌，此外，该人参来源的活性肽干预具有增强肠道细胞抗氧化的能力。

Description

一种人参来源的活性肽及其制备方法和肠道损伤保护的应用

技术领域

本发明涉及小分子活性肽技术领域，具体是涉及一种人参来源的活性肽及其制备方法和肠道损伤保护的应用。

背景技术

肠道损伤是一种常见却严重的健康问题，可以由多种因素引起，包括但不限于炎症、缺血再灌注、化疗和放疗等。这种损伤可能导致胃肠道屏障功能受损，引发炎症反应，最终导致严重的健康问题，甚至危及生命。因此，寻找一种有效的方法来预防和治疗肠道损伤是当今医学研究的热点之一。

人参是一种被广泛用于传统医学中的植物，被认为具有多种药理活性，因此，其一直作为热门研究对象。近年来，科学研究发现，人参中含有多种活性肽，具有多种功效，并对应产生多种应用。但目前尚未见报道人参来源的活性肽在肠道损伤保护的用途。

发明内容

本发明目的是克服现有技术的不足，提供一种多肽在制备用于治疗慢性荨麻疹药物中的用途。为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

第一方面，本发明提供了人参来源的活性肽，所述活性肽的氨基酸序列为：Val-Gly-Asp-Leu-Lys-Phe-His-Cys。

第二方面，本发明还提供了一种人参来源的活性肽的制备方法，包括以下步骤：

取新鲜人参，洗净、沥干后切成小段，与蒸馏水按1:10的质量比混合，采用破壁机打成人参浆液；

调节人参浆液的pH至6.5，向人参浆液中加入人参质量1.0%的纤维素酶，在45°C的温度下酶解8小时，然后将pH调整为7.0、温度调整为35°C，搅拌浸提12小时，利用3500rpm转速离心20min，取上清液；将温度调整为20°C，向上清液加入其体积60%的乙醇，搅拌均匀，将混合液置于4°C的冷藏条件下静置20小时；在2000rpm转速离心10min取沉淀，多次重复洗涤后合并沉淀，获取人参蛋白；

将人参蛋白与蒸馏水按照1:20的质量比混合，搅拌均匀得到人参蛋白液，将pH调整为8.0，加入异肽酶和葡萄糖醛酸酶混合均匀，置于高静水压反应器中施加高静水压500MPa，并在40°C的温度下反应10小时，获取第一酶解液，所述人参蛋白、异肽酶和葡萄糖醛酸酶的比例为100：2：1；

将第一酶解液pH调整为6.5，加入木聚糖酶和葡聚糖酶混合均匀，置于高静水压反应器中施加高静水压700 MPa，并在50°C的温度下反应16小时，获取第二酶解液，所述人参蛋白、木聚糖酶和葡聚糖酶的比例为100：1.5：1；

灭酶后得到人参酶解液，过滤后浓缩，浓缩液通过截留分子量为3000Da的膜进行超滤，干燥后获得人参低聚肽粉；

将人参低聚肽粉加水溶解，配制成浓度为100 mg/mL的溶液，使用C18柱进行反相高效液相色谱层析，流动相A为0.05%TFA水溶液，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱：0～10min，5%B；10～15min，5%～15%B；15～20min，15%B～25%B；20～25min，25%B～35%B，流速为01.0mL/min，监测波长为280nm，根据HPLC波谱峰进行分数采集，收集目标波谱峰对应的部分，使用高效液相色谱-质谱联用进行目标肽的再次分离和纯化，使用C18柱，流动相和梯度洗脱条件重复，通过LC-MS/MS技术进行活性肽的氨基酸序列鉴定，确认所得肽段的结构符合目标序列Val-Gly-Asp-Leu-Lys-Phe-His-Cys，采用核磁共振对纯化得到的活性肽进行结构验证，确认其结构准确。

第三方面，本发明还提供了上述人参来源的活性肽在制备肠道损伤保护药物的应用。

第四方面，本发明还提供了上述人参来源的活性肽在制备肠道损伤保护保健品的应用。

第五方面，本发明提供了一种活性肽，所述活性肽的氨基酸序列为：Val-Gly-Asp-Leu-Lys-Phe-His-Cys。

第六方面，本发明还提供了活性肽在制备肠道损伤保护药物的应用，所述所述活性肽的氨基酸序列为：Val-Gly-Asp-Leu-Lys-Phe-His-Cys。

第七方面，本发明还提供了活性肽在制备肠道损伤保护保健品的应用，所述活性肽的氨基酸序列为：Val-Gly-Asp-Leu-Lys-Phe-His-Cys。

本发明与现有技术不同之处在于本发明取得了如下技术效果：

本发明通过实验发现实验结果表明，人参来源的活性肽，所述活性肽的氨基酸序列为：Val-Gly-Asp-Leu-Lys-Phe-His-Cys，该人参来源的活性肽干预可改变肠道屏障水通蛋白的表达，并对于肠道细胞周期具有一定影响，抑制了增殖且促进肠道黏液的分泌，此外，该人参来源的活性肽干预具有增强肠道细胞抗氧化的能力。

附图说明

图1是本发明人参来源的活性肽干预对肠道屏障完整性的影响；

图2是本发明人参来源的活性肽干预对肠道荧光黄渗透率的影响；

图3是本发明人参来源的活性肽干预对跨膜电阻值的影响；

图4是本发明人参来源的活性肽干预对肠道屏障水通AQP3的蛋白表达的影响；

图5是本发明人参来源的活性肽干预对肠道细胞生理的影响；

图6是本发明人参来源的活性肽干预对肠道分泌的影响；

图7是本发明人参来源的活性肽干预对肠道MUC2蛋白荧光的影响；

图8是本发明人参来源的活性肽干预对肠道紧密连接蛋白表达的影响；

图9是本发明人参来源的活性肽干预对肠道紧密连接的影响；

图10是本发明人参来源的活性肽干预对肠道氧化应激的影响；

图11是本发明人参来源的活性肽干预对肠道 IFN-γ水平的影响；

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用材料、试剂等，如无特别说明，均可从商业途径获得。

实施例1

本发明实施例公开了一种人参来源的活性肽，所述活性肽的氨基酸序列为：Val-Gly-Asp-Leu-Lys-Phe-His-Cys，其分子质量为917Da。

实施例2

本发明实施例公开了实施例1人参来源的活性肽的制备方法，包括以下步骤：

实施例3

（一）肠道损伤保护：

1、构建人结肠类器官屏障模型

复苏人正常结肠类器官，进行扩培稳定状态。

在器官芯片中构建人结肠类器官屏障模型，并培养至其分化成熟。

2、构建结肠类器官屏障损伤模型

人结肠类器官屏障模型构建成功后，加入100μM、200μM、400μM、800μM和1000μM 的过氧化氢处理48h以模拟肠道损伤，评价用药后肠道屏障功能，选取200μM过氧化氢损伤浓度。

3、实施例1人参来源的活性肽的干预分组

1) 阴性对照组：人结肠类器官模型正常培养，不加入任何干预物；

2) 过氧化氢处理组：人结肠类器官模型正常培养，加入200μM过氧化氢培养48h；

3) 过氧化氢和活性肽共处理组：人结肠类器官模型正常培养，加入200μM 过氧化氢+400μg/mL 的活性肽共同培养48h。

4. 检测指标

1)明场照片：在干预 0、4、24和48小时分别使用高内涵成像拍摄类器官图像。

2) 跨膜电阻值（TEER）：使用跨膜电阻仪在干预前和结束后检测类器官屏障的跨膜电阻值。

3) 细胞活力：在干预 0、24 和48小时 ATP 检测细胞活力。

4) 屏障表观渗透率：在干预结束后使用荧光黄渗透率评价类器官屏障的表观渗透率。

5）免疫荧光染色：干预结束后进行细胞固定和免疫荧光染色，检测Occludin和MUC-2 蛋白的表达。

6) RT-qPCR：干预终点裂解回收细胞，进行 qPCR 检测p16、p21、Ki67、Lgr5、AQP3、MUC2、P-gp、ZO-1、Occludin和Claudin-1基因表达。

（二）实验结果

1.活性肽干预对肠道屏障完整性的影响

如图1所示，结肠屏障整体在48小时处理间保持完整，三维绒毛样结构无显著变化。

2. 活性肽干预对肠道屏障渗透率的影响

如图2所示，过氧化氢造模组的荧光黄渗透率相比空白对照组有一定上升趋势；与此同时，活性肽干预组的荧光黄渗透率相比H₂O₂造模组无明显变化。

3. 活性肽对跨膜电阻值的影响

如图3 所示，结肠屏障在48小时200μM 过氧化氢处理后，跨膜电阻值显著下降。活性肽干预组相比H2O2造模组，TEER值的变化无显著差异。

4. 活性肽干预对肠道屏障水通道的影响

如图4所示，过氧化氢造模组水通道蛋白AQP3 的表达相比空白对照组有一定下降趋势；活性肽干预组水通道蛋白 AQP3 的表达相比对照组和过氧化氢造模组明显下降。

5. 活性肽干预对肠道细胞生理的影响

如图5所示，细胞周期方面：过氧化氢造模组相较于对照组p21的表达没有明显差异，而活性肽干预组的p21表达显著高于对照组和过氧化氢造模组。细胞增殖方面：过氧化氢造模组相比空白对照组，Ki67和LGR5有一定下调趋势，但没有统计学意义。活性肽干预组相比过氧化氢造模组，Ki67与LGR5 的表达显著下调。

6. 活性肽干预对肠道分泌的影响

如图6所示，糖蛋白方面：与对照组相比，过氧化氢造模组糖蛋白表达无明显差异；活性肽干预组糖蛋白的表达与过氧化氢造模组也无明显差异。肠道黏液方面：与对照组相比，过氧化氢造模组MUC2表达有上升的趋势；活性肽干预组MUC2表达显著高于对照组和过氧化氢造模组。

如图7所示，MUC2在空白对照组、过氧化氢造模组及活性肽干预组中均有强表达，定位于细胞膜表面；通过总荧光亮度分析发现，各组间无明显蛋白表达差异。

7. 活性肽干预对肠道紧密连接的影响

如图8所示，与对照组相比，过氧化氢造模组Occludin和ZO-1的表达无明显差异，Claudin-1的表达有所下降。活性肽干预组相比于过氧化氢造模组，紧密连接蛋白的表达无明显变化。

如图9 所示，Occludin在空白对照组、过氧化氢造模组及人活性肽干预组中均有强表达，且定位于胞间；总荧光亮度分析显示，各组间无明显蛋白表达差异。

8. 活性肽干预对肠道氧化应激和炎症水平的影响

如图10所示，与对照组相比，过氧化氢造模组SOD活力上升；与过氧化氢造模组相比，人参低聚肽干预组GSH-Px和SOD的活力均显著升高。

如图11所示，与对照组相比，过氧化氢造模IFN-γ的含量有上升趋势，但没有统计学差异；与过氧化氢造模组相比，活性肽干预组IFN-γ的含量有下降趋势，但没有统计学差异。

（三）实验结论

本发明成功构建人结肠类器官屏障模型，使用过氧化氢进行干预构建肠道损伤模型，以探究上述结构的人参来源的活性肽对肠道损伤的保护作用。

实验结果表明，上述结构的人参来源的活性肽可改变肠道屏障水通道蛋白的表达，并对于肠道细胞周期具有一定影响，抑制了细胞增殖，且促进了肠道细胞黏液的分泌。此外，上述结构的人参来源的活性肽干预具有增强肠道细胞抗氧化的能力。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.人参来源的活性肽，其特征在于，所述活性肽的氨基酸序列为：Val-Gly-Asp-Leu-Lys-Phe-His-Cys。

2.一种权利要求1所述的人参来源的活性肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将人参蛋白与蒸馏水按照1:20的质量比混合，搅拌均匀得到人参蛋白液，将pH调整为8.0，加入异肽酶和葡萄糖醛酸酶混合均匀，置于高静水压反应器中施加高静水压500 MPa，并在40°C的温度下反应10小时，获取第一酶解液，所述人参蛋白、异肽酶和葡萄糖醛酸酶的比例为100：2：1；

将人参低聚肽粉加水溶解，配制成浓度为100 mg/mL的溶液，使用C18柱进行反相高效液相色谱层析，流动相A为0.05%TFA水溶液，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱：0～10 min，5%B；10～15min，5%～15%B；15～20min，15%B～25%B；20～25min，25%B～35%B，流速为01.0mL/min，监测波长为280nm，根据HPLC波谱峰进行分数采集，收集目标波谱峰对应的部分，使用高效液相色谱-质谱联用进行目标肽的再次分离和纯化，使用C18柱，流动相和梯度洗脱条件重复，通过LC-MS/MS技术进行活性肽的氨基酸序列鉴定，确认所得肽段的结构符合目标序列Val-Gly-Asp-Leu-Lys-Phe-His-Cys，采用核磁共振对纯化得到的活性肽进行结构验证，确认其结构准确。

3.一种如权利要求1所述的人参来源的活性肽在制备肠道损伤保护药物的应用。