CN101410529A - 白细胞介素-2制剂的制备方法及可用该方法制备的制剂 - Google Patents

白细胞介素-2制剂的制备方法及可用该方法制备的制剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种白细胞介素－2(IL－2)制剂的制备方法，该方法包括：同时将目的蛋白保存在IL－2的酵母生产菌的破碎的细胞中和分离的水不溶性成分中，所述IL－2的酵母生产菌合成目的蛋白(IL－2)且不分泌所述目的蛋白，该方法的特征在于，所述制剂中保存了破碎的细胞的水不溶性组分。在一个优选的实施方式中，所述酵母生产菌为在全俄微生物菌种保藏中心以编号No.Y－791保藏的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株，该菌株为人白细胞介素－2生产菌。用本发明的方法制备的所述白细胞介素－2制剂与公知的制剂相比，制备成本低，口服给药时具有活性，并且在某些情况下，该制剂比其中去除了酵母膜成分组分的白细胞介素－2制剂更有活性。

Description

白细胞介素-2制剂的制备方法及可用该方法制备的制剂
技术领域
本发明涉及通过生物技术方法制备免疫调节药物，可用于制药工业中。具体来说，本发明涉及制备白细胞介素-2制剂的方法。上述制剂可用于免疫导向治疗，特别是用于肿瘤、传染性疾病、自身免疫疾病和过敏性疾病的治疗。
背景技术
白细胞介素-2(IL-2)的发现追溯到二十世纪六十年代，当时很多离体研究表明激活的淋巴细胞分泌可在体内和体外刺激大量免疫反应的介质。直到1976年这种介质才被证明为T-细胞生长因子，在1979年被命名为白细胞介素-2。从激活的人淋巴细胞的培养产生和纯化IL-2的专业技术得到发展，从而可以首次获得用于科学和临床目的的IL-2的制剂。这些制剂被命名为“淋巴细胞的”或“天然的”IL-2。同时，规模放大其生产的有限可能性阻碍了其应用，直到1983年，用于产生重组蛋白的技术得到发展，具体来说，通过基因工程和生物技术的方法得到IL-2的技术得到了发展。
还已知从供体血液制备IL-2制剂的方法。但是，含有人血液成分的制剂存在潜在危险。
另外还已知IL-2的基因工程制备方法。许多公司(Cetus Corp.，Amgen，Inc.，Hoffman-La Roche，Inc.)已经用基因工程和生物技术方法生产重组IL-2来作为用于治疗各种类型肿瘤疾病的药物。
在IL-2的一种制备方法中，大肠杆菌(Escherichia coli)被用作生产菌。大肠杆菌为机会性菌群。因此，由E.coli制备的制剂必须完全纯化并且可能有毒性。
酵母细胞是异源IL-2的更好的生产菌。
已知用酵母生产菌(EP 0162898A1，公开于12/04/1985)制备IL-2制剂的方法。按照该方法，IL-2被分泌到培养基中，然后需要通过色谱、过滤、抽提等方法从培养基中将其纯化。上述方法的缺点在于，通过酵母分泌的蛋白被糖基化，即在分泌过程中酵母糖链出现在它们的结构中。这种糖蛋白对于人来说具有强免疫原性，这成为随后治疗应用中的问题，例如，对这种糖蛋白的抗体在人体内的积聚。
除此之外，还已知一种IL-2制剂的制备方法(EP 0152358，公开于08/21/1985)，该方法中，将已进行IL-2合成的酵母细胞破碎，将破碎后的细胞离心，用十二烷基硫酸钠溶液对离心后得到的沉淀进行处理来将IL-2转移到液相中，从该液相中抽提IL-2。该方法中IL-2的抽提是一个费力的操作且非常耗时，需要特殊的设备和/或试剂。
大体上所有至今已知的重组IL-2制剂都非常昂贵，而且极大部分成本是由从细胞生产菌将其纯化的技术所造成的。
发明内容
本发明的目的在于，开发一种更适于工业生产的IL-2制剂的制备方法，该方法可以得到一种在活性和治疗时机方面与公知药物同等的药物，同时适于大规模生产且生产成本低。
该目的通过提出一种IL-2制剂的制备方法来解决，其中，破碎酵母IL-2生产菌细胞，并保证目的蛋白的完整性，且其中目的蛋白(IL-2)已被合成，其中，细胞不分泌目的蛋白，分离水不溶性成分，而破碎的细胞的水不溶性混合物则被保留在制剂中。
具体来讲，根据本方法，酵母生产菌为一种酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株，以编号No.Y-791被保藏在全俄微生物菌种保藏中心，其为人白细胞介素-2(IL-2)的生产菌。
不考虑现有的对重组蛋白的小心纯化的必要性的观点，本发明人意外的发现酵母细胞壁残留物存在于重组IL-2制剂中不仅可以简化其制备方案、得到更廉价的药物，而且可以得到治疗特性在某些方面超过已知的IL-2制剂特性的高效药物。
不将IL-2抽提(转移)到液相中，也不进行其随后的从液相的抽提而实现制备所述制剂的方法可以得到意想不到的结果。该方法得到一种全新的IL-2制剂，而不是一种提纯不足的制剂。在所述制剂中微量残余的酵母细胞壁的不溶性成分不仅不会阻碍IL-2的效果，而且作为一种佐剂发挥作用，即作为在哺乳动物中刺激T-细胞免疫激活的辅助化合物。在本发明之前将水不溶性IL-2转移到液相中以及其随后的抽提被认为是绝对必需的，科学家也致力于发展改善纯化的方法。提出本发明之后，很明显，IL-2制剂必须在不除去酵母细胞壁的水不溶性成分的情况下来制备，而且可以将更多的精力集中在提高细胞壁成分本身的质量方面。
在该制剂中如此制备的IL-2为无活性的，这可以确保其长期保存。将增溶剂和水加入到制剂中以活化IL-2。
因为能够破坏目的蛋白的蛋白酶确实在酵母细胞的破碎过程中被释放，所以适宜在蛋白酶抑制剂存在下破碎细胞。
优选，在蛋白酶抑制剂的存在下，使用带玻璃珠的高速破碎机破碎细胞，因为在这种情况下细胞以更大的程度破碎，而且目的产物是完整的。
优选，在分离后洗涤水不溶性成分以更完全地除去水溶性组分。这使得水溶性蛋白酶和其它的酵母蛋白、RNA、染色体DNA和质粒DNA可以更完全地除去。
优选将分离的水不溶性成分干燥。干燥可以在分离或洗涤之后进行。
更优选在分离后用丙酮处理水不溶性成分，随后除去丙酮成分。在此阶段中，破碎的酵母细胞被脱水。此阶段中也可以除去水不溶性成分的脂质成分，从而制备具有强化的物理性质、便于利用并且在治疗应用中可以更好地耐受的制剂。
当如上所述用丙酮进行处理时，制备该水不溶性成分的悬浮液，并以悬浮液与丙酮的体积比为1∶5～1∶20、优选1∶10的比例将其加入到丙酮中，得到在丙酮中的悬浮液，然后将该悬浮液过滤并将过滤器中的残留物干燥。用丙酮处理之前，可以洗涤水不溶性成分，即在分离水不溶性成分之后、制备其水悬浮液之前进行洗涤。
上述方法的优选实施方式中，在所述水不溶性成分干燥之后，将一种干燥的增溶剂加入到所述水不溶性成分中。这样，所述制剂被制备为干燥的水不溶性成分和增溶剂的组合物。如此制备的制剂含有无活性形式的IL-2，这确保了它的长期保存。为了活化IL-2，应将水加入到这种制剂中。加入水后，溶液中的增溶剂浓度变得最理想，这可以保证正确的蛋白构象的形成以及生物活性制剂的制备。
适宜使用十二烷基硫酸钠作为增溶剂。
本方法的一种实施方式提出，在制备IL-2制剂的过程中，在加入增溶剂之后加入一些水。这可以制备其中IL-2为具有最优构象的活性蛋白的制剂，该制剂可以立即使用。
根据本发明，以由上述方法制备的制剂的任何变体来提供IL-2制剂。该制剂具有低生产成本，且在治疗中可以口服给药，这对于患者来说是更优选的。意想不到地是，这种制剂表现出超过基于用公知的方法制备的纯化IL-2的制剂的典型治疗效果。
具体实施方式
在当前的生物技术和基因工程阶段中，IL-2的酵母生产菌是众所周知的，并且可以由保藏中心得到或新制备得到。
虽然酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是最普遍的酵母生产菌，其它一些非致病性酵母也可以成为这样的生产菌，例如布拉氏酵母(Saccharomyces boulardii)，或毕赤酵母属(Pichia)酵母如毕赤酵母(Pichiapastoris)，克鲁维酵母属(Kluyveromyces)如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)或汉逊酵母属(Hansenula)如多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)等。众所周知产生含有IL-2基因，特别是人IL-2基因的重组质粒的方法。获得含有这种重组质粒的菌株的方法也是众所周知的。
具体来说，在全俄微生物菌种保藏中心以编号No.Y-791保藏的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株是人IL-2的酵母生产菌的一个实例。该菌株为人IL-2生产菌。被导入到生产菌菌株中的表达载体的结构为使得细胞不分泌目的蛋白的结构。也可以使用产生异源IL-2的任意其它菌株。
各种生产菌进行IL-2合成的最优条件是已知的。IL-2的合成可以是组成型表达，或需要诱导或脱阻遏来表达，这取决于生产菌菌株的基因设计。大体上，考虑到所选择菌株的特性，所属技术领域的技术人员可以选择培养条件，以得到其中合成了IL-2的酵母细胞的培养物。
具体来说，在抑制IL-2的合成下Y-791菌株首先在含有组氨酸的最小矿物培养基Sd1中生长至光密度OD600为2.5～4.0、更优选OD600＝3.0。IL-2的合成被存在于培养基中的磷酸盐抑制。然后将得到的接种物在更大体积的第二种培养基中进行传代培养，其中，IL-2合成被去阻遏并培养至稳定期初期，即达到光密度OD600为6.0～9.0，优选OD600＝7.5。培养基Sd2或培养基PEP(含有20g/l蛋白胨和20g/l葡萄糖)可以被用作第二种培养基。
培养结束时，细胞可以通过离心或过滤从培养基中分离。进一步对细胞进行处理，除去培养基。使用Y-791菌株时，一般每升营养培养基可以得到8～12g细胞。
得到的生物质可以立即用于上述方法中，或进行冷冻以便今后用于上述方法中。
应当注意含有未破碎的细胞的制剂与从破碎的细胞得到的制剂相比仅有微量活性。
酵母细胞可以用能确保目的蛋白完整性的任意已知方法破碎。特别是通过物理方法，例如在高压下通过冻-融法利用带玻璃珠的高速破碎机破碎。在本说明书中，通过将蛋白酶抑制剂添加到破碎细胞的悬浮液中来确保目的产物的完整性，从而在酵母细胞破碎时释放的酵母蛋白酶不会破坏目的蛋白，尤其是IL-2。若可以避免所使用的试剂对目的蛋白的蛋白水解作用，则用酶法来破碎酵母细胞也是可行的。
也可以通过在+2℃～+8℃的低温下，尤其是+4℃下应用该方法来确保目的产物的完整性。
破碎机DynoMill可以作为带有玻璃珠的高速破碎机的一个实例被采用。优选在+2℃～+10℃的温度、4000～6000rpm的离心速度下破碎细胞。
通常使用PMSF(苯甲基磺酰氟)作为酵母蛋白酶的抑制剂，但是，也可以使用任意其它的抑制剂或蛋白酶抑制剂组。使用1mM的PMSF可以满足需要。但是，也可以使用蛋白酶抑制剂的任意其它适宜量，这些使用量可以根据通过聚丙烯酰胺凝胶电泳方法得到的在制剂中的IL-2含量测定结果来决定。
可以通过离心来分离水不溶性成分。因此，酵母细胞内容物的几乎所有水溶性组分被转移到上清液(上清)中，然后被除去，而水不溶性成分被沉淀。通过离心除去蛋白酶、可溶性蛋白、核糖核酸(RNA)、染色体DNA和质粒DNA。也可以通过其它可行的方法、特别是过滤来进行水不溶性成分的分离。
优选在低温(例如+4℃)下，以4000～10000rpm的转子旋转速度进行离心。
在提出的方法中，可以对水不溶性成分进行进一步处理以完全除去水溶性组分，即通过用缓冲溶液洗涤来完全除去该水溶性组分。0.005M Tris-HCl、pH为7.2的缓冲溶液可以被用作这种缓冲溶液。
可取的是将所述制剂彻底干燥。进行制剂的干燥，是为了确保其保存和进一步的使用。干燥的制剂含有酵母细胞壁的残留物和目的蛋白。该方法不包括从水不溶性成分中抽提目的蛋白的阶段，这被认为是该科学领域所意想不到的方法，因为通常大量的工作正好就集中在这个阶段。该制剂中含有的所有水不溶性成分在特定条件下不会阻碍目的性质的表现，有时有助于目的性质的表现。
通常使用冷冻干燥，但是也可以应用其它合适的干燥方法。
所提出的方法还提供一种另外的用丙酮对水不溶性成分进行处理的方法。在用丙酮处理之前，可以用缓冲溶液洗涤所述水不溶性成分。丙酮处理包括下述阶段。水不溶性成分用于制备水中的悬浮液，然后，搅拌的同时将该悬浮液加入到丙酮中来与丙酮混合。水悬浮液与丙酮的比例为1∶5～1∶20，优选为1∶10。该悬浮液应具有足够的粘性(viscous)，约为60～80％、优选为75％。在-20℃的温度下对丙酮进行处理。通过真空过滤或在-10℃～-30℃的温度、2000～5000rpm的转速下离心来从丙酮中分离脱水的破碎酵母细胞。得到的破碎酵母细胞沉淀物可以用2倍～10倍(优选5倍)体积的丙酮洗涤，并再次通过真空过滤或在-10℃～-30℃的温度、2000～5000rpm的转速下离心而从丙酮中分离。将沉淀物在通风橱中于室温下干燥20～30小时。丙酮使细胞的制备物脱水，这样，无需冷冻干燥来获得干燥制剂。
根据本方法的实施方式，该制剂被加工为破碎细胞的干燥水不溶性成分和干燥增溶剂的组合物。
增溶剂是一种有助于水不溶性物质溶解在水中的物质。在酵母细胞内合成的重组IL-2为水不溶性的，其与细胞壁相结合。发现增溶剂还可以将IL-2与细胞壁脱离。十二烷基硫酸钠、十二烷基肌氨酸盐、脱氧胆酸盐、脲和Triton-X100可以被用作增溶剂。若十二烷基硫酸钠被用作增溶剂，则其加入量为干燥的水不溶性成分重量的4.0％～20.0％(优选为12％)。
当IL-2制剂为破碎细胞的干燥水不溶性成分和增溶剂的组合物时，可以通过加入一些水来制备IL-2以供使用。向100mg所述制剂中加入1～10ml(优选为5ml)水即足够。
干燥制剂可以在不加入特殊的稳定剂或防腐剂的情况下在+4～-20℃温度下保存两年。在即将使用前需要向该制剂中添加水。
若必要，可以将稳定剂、抗氧化剂、赋形剂和其它物质加入到所述制剂中以赋予该药物以适当的药物形式。
因此该方法可以以下述任意方式进行：破碎酵母细胞、分离并进一步干燥水不溶性成分；或破碎酵母细胞、分离水不溶性成分、对该成分进行洗涤和干燥；或破碎酵母细胞、分离水不溶性成分(可以对其进行进一步洗涤)、用丙酮处理然后除去丙酮成分并对沉淀物进行干燥，优选在任意上述变体干燥后将所述制剂制成含有干燥增溶剂的组合物。
IL-2制剂的生物活性可以通过国际标准试验来评价，所述国际标准试验使用具有IL-2-依赖性肿瘤特异性细胞毒性的小鼠T-淋巴细胞的CTLL-2细胞系(Hammerling U.et al.<<Development and validation bioassay forinterleukin-2>>.//J.Pharmaceut.&Biochem.Analysis，-1992.-vol.10.-p.547.Gearing A.J.H.and Thorpe R.<<The international standard for humaninterleukin-2.Calibration by international collaborative study.>>//J.Immunol.Methods.-1984.-vol.74.-p.39)。有生物活性的重组IL-2应刺激这些细胞的增殖。生物活性测定通过使用四唑染料MTT的比色法来进行。该IL-2刺激的存活细胞吸收该染料并在细胞质中蓄积水不溶性暗蓝色甲
Figure A20078001148400111
(formazan)晶体(还原的MTT)。在除去培养基后并将该晶体完全溶解在二甲基亚砜中后，在波长530nm和690nm下通过计算机辅助的光度计方法测定得到溶液的光密度。含有IL-2的样品中溶液的暗蓝色呈色应该取决加入到培养基中的IL-2浓度。通过对比样品的光密度和IL-2的活性标准的光密度，测定培养样品中的IL-2的生物活性。
IL-2的量可以通过任意一种用于检测目的蛋白的标准方法来测定，例如通过聚丙烯酰胺凝胶电泳法(Laemmli U.“Cleavage of structural proteinsduring the assembly of the head of bacteriophage T4”.//Nature.-1970.-227.-p.680-685)或使用免疫酶分析法(Gehman L.O.and Robb R.J.“AnELISA-based assay for quantitation of human interleukin-2.”//J.Immunol.Methods.-1984.-vol.74.-p.39)等测定。
概括的说，根据本发明的方法可选择性地包括在此公开的任何适宜的阶段、由在此公开的任何适宜的阶段组成或者主要由在此公开的任何适宜的阶段组成，而且该发明方法可以另外，或者说选择性地，除去任意阶段或在公知方法中使用的物质或者对于达到本发明目的不是必须的物质。
同样的原则也可适用于本发明的制剂，所述制剂可选择性地包括在此公开的任何适当组分、由在此公开的任何适当组分组成或主要由在此公开的任意适当组分组成，而且该制剂可以另外，或者说选择性地，以其中已知的或对于实现本发明的目的来说不是必须的任何组分、材料、成分或物质可以从中排除的方式来制备。
通过下述实施例对本发明进行更具体的说明，但是这些实施例并不限制本发明的范围。
实施例1白细胞介素-2制剂的制备
1.1合成目的蛋白(IL-2)的IL-2酵母生产菌生物质的制备
将等分部分的-70℃下保存在甘油中的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Y-791菌株接种到含有50mg/l组氨酸的营养培养基Sd1中。Sd1培养基含有0.67％酵母氨基酸氮源(“Difco Laboratories”，Detroit，MI)、2％葡萄糖。细胞质量与Sd1培养基的体积的比例约为0.2g/升。
在Sd1培养基中进行培养直至光密度OD600为2.5～4.0(优选OD600＝3.0)。
当达到所需的光密度值，将得到的接种物转移到10倍体积的Sd2培养基中并培养直至OD600＝7.5。
在Sd2培养基中的培养结束时，将细胞通过离心从培养基中分离，从每1升营养培养基中得到10g细胞。除去培养基，对细胞进行所有进一步的操作。
营养培养基Sd2的组成
  培养基组分   每升的量
  L-组氨酸   0.05g
  (NH4)-柠檬酸盐(无水)   7.6g
  MgSO4   0.5g
  NaCl   0.1g
  CaCl2·6H2O   0.1g
  KCl   1.5g
  KH2PO4   0.03g
  葡萄糖   20g
  H3BO3   0.5mg
  CuSO4·5H2O   0.04mg
  KI   0.1mg
  FeCl3·6H2O   0.2mg
  MnSO4   0.4mg
  NaMoO4·2H2O   0.2mg
  ZnSO4·7H2O   0.4mg
  生物素   0.02mg
  泛酸钙   2mg
  叶酸   0.002mg
  肌醇   10mg
  烟酸   0.4mg
  对氨基苯甲酸   0.2mg
  盐酸吡哆醇   0.4mg
  核黄素   0.2mg
  硫胺素   0.4mg
1.2IL-2酵母生产菌细胞的破碎方法，所述生产菌中合成目的蛋白(IL-2)
加入PMSF(苯甲基磺酰氟)至终浓度为1mM，制备细胞与缓冲溶液A的50％悬浮液。缓冲溶液A为0.005M Tris-HCl缓冲溶液、pH为7.2。在+2℃～+10℃的温度、3000rpm离心速度的条件下，使用Dyno Mill破碎机破碎酵母细胞。破碎的细胞的悬浮液被收集到离心管中。
1.3水不溶性成分的分离
将1.2阶段中得到的悬浮液在+4℃的温度、10000rpm离心速度的条件下离心45分钟。除去上清液。
1.4干燥水不溶性成分
将沉淀物在冷冻干燥设备中干燥24小时。从1g细胞培养物中产生100mg的片状玻璃态和更易碎的灰白-浅黄褐色冷冻干燥物。
实施例2白细胞介素-2制剂的制备
进行实施例1中的1.1～1.3阶段。接着用pH为7.2的0.005M Tris-HCl缓冲溶液洗涤所述沉淀，然后，将产物在+4℃的温度、10000rpm转速下离心45分钟。除去上清液。进一步进行1.4中所述的阶段。
实施例3白细胞介素-2制剂的制备
进行实施例1中的1.1～1.3阶段。接着用pH为7.2的0.005M Tris-HCl缓冲溶液洗涤沉淀，然后，将产物在+4℃的温度、10000rpm转子转速下离心45分钟。除去上清液。
用冷却到+4℃的水制备得到的破碎细胞沉淀物的75％悬浮液，例如，将0.3ml水加入到1g沉淀物中。在冰浴中制备上述悬浮液。
为了进一步进行处理，将玻璃器具以及丙酮冷却到-10℃～-30℃。悬浮液与丙酮的体积比为1∶10，例如，对于1ml悬浮液需要10ml丙酮。
将破碎酵母细胞的悬浮液缓慢导入到丙酮中并均化5分钟。
然后，在-10℃～-30℃的温度下通过过滤从丙酮中分离破碎的酵母细胞。
在-10℃～-30℃的温度下再次用5倍体积的丙酮洗涤得到的破碎酵母细胞沉淀物并过滤。
将沉淀物转移到搪瓷容器中并在排气通风橱中于室温下干燥18小时。
最终，从10g湿的酵母细胞得到1g均匀的苍白-浅黄褐色细粉形式的破碎酵母细胞的干燥沉淀物。
实施例4增溶剂的添加
将约120mg十二烷基硫酸钠(SDS)加入到1g在实施例3中得到的粉末中并进行混合。要使用在这一阶段制备的制剂的话，有必需加入一些水。
实施例5水的添加
将约5ml水加入到100mg在实施例4中制备的制剂中并进行混合直至得到悬浮液。
实施例6制备悬浮液以测定IL-2的量和活性
将在实施例5中制备的悬浮液在10000rpm下离心5分钟，并抽提上清液。除去沉淀。为了分析得到的抽提物的IL-2的特异性活性和含量进行分析，有必要取其等分部分，如10μl。
通过电泳确定在制备的抽提物中IL-2的存在和含量，而其生物活性通过使用CTLL-2细胞系的常规试验来证实。
实施例7十二烷基硫酸钠存在下的聚丙烯酰胺凝胶电泳
除了抽提物样品之外，也将牛血清白蛋白的测试溶液加入试验中，以1、2、4、6和8μg/泳道的量建立标准曲线的同时建立蛋白94、67、43、30、20.1和14.4kDa的分子量标记。
电泳图像的分析证明IL-2在样品中的存在(与蛋白分子量标记相比分子量15.3kDa)，且可以用牛血清白蛋白的标准曲线测定IL-2的量。
实施例8IL-2制剂的生物活性
将由一种国际参照试剂标定，并在-70℃温度下保存且仅解冻一次的IL-2样品作为实施例6中得到的抽提物中含有的IL-2的活性测定的标准来进行试验。
将用培养基RPMI 1640(1×105个活细胞/ml)洗涤的CTLL-2细胞约100μl加入到分别带有标准溶液和含有实施例6中得到的抽提物10μl的样品的各个孔中，用非密封的盖封闭培养板。将该溶液在37℃下培养42小时。在含有IL-2的样品中，CTLL-2细胞增殖。培养后向每孔中注入10μl的MTT溶液进一步再培养6小时。在通过IL-2刺激的存活细胞中形成甲
Figure A20078001148400151
的水不溶性暗蓝色晶体。
将所述板在2000rpm下离心5分钟，通过剧烈震荡液体从孔中除去上清液。向每孔中加入约100μl的二甲基亚砜，用震荡器震荡板直至甲的晶体完全溶解(约15分钟)。
根据对照和试验样品的分光光度数据，计算抽提物中IL-2活性，其每100g粉末的平均活性估算为总计400～500万IU。
实施例9用实施例3的制剂治疗饮食过敏
用5ml水溶解约100mg实施例4的制剂，并给药给患有绿苹果过敏的患者。根据下述方案治疗路线持续5天：安排隔天与过敏因子接触。表现出过敏症状时给予患者本发明的组合物。接触绿苹果三次、给予本发明的制剂三次。试验开始后第15天，点刺试验(PRICK-test)表明对绿苹果无反应。6个月内进行的检测试验表现出同样的结果。
这样，本发明的制剂因此证明了其对直到本发明提出之前还未完全解决的疾病的治疗有效果，这是因为，迄今为止已知的所有药物仅提供症状上的治疗。还未提供过通过大量基于重组IL-2的已知药物进行的饮食过敏的治疗，这是由于其被认为是无效的或这些药物的副作用会超过期望的益处。
实施例10用实施例4的制剂进行的HIV-感染的单一治疗
前两个疗程使用含有纯化蛋白的
Figure A20078001148400161
Figure A20078001148400162
干燥物注射剂(Biotech，俄罗斯)进行；后两个疗程使用通过本发明方法制备的制剂并口服给药来进行。
CD4+和HIV病毒负载动力学
Figure A20078001148400163
第一治疗阶段(用)与第二治疗阶段(用本发明的制剂)的动力学都被证明是优异的。
与纯IL-2注射剂相比，使用本发明的制剂时，CD4-含量动力学显著提高，这可能是由于，本发明的制剂不仅增加免疫系统细胞的增殖而且可以将其激活，因为无激活因子时有可能导致IL-2注射剂无效。
因此，除了白细胞介素-2的生物活性，本发明的制剂含有大量的佐剂，这样当用纯IL-2治疗无效时可以使用该制剂。
进一步地，该制剂可以以工业方式制备，其制备方法不需要过多时间和特殊设备。该制剂口服给药时具有活性。

Claims (13)

1、一种白细胞介素-2(IL-2)制剂的制备方法，其中，将合成目的蛋白IL-2且不分泌所述目的蛋白的IL-2生产菌酵母细胞破碎，同时确保目的蛋白完整性，分离水不溶性成分，破碎细胞的水不溶性混合物被保留在制剂中。
2、根据权利要求1所述的方法，其中，所述酵母生产菌为在全俄微生物菌种保藏中心以编号No.Y-791保藏的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae菌株，该菌株为人白细胞介素-2生产菌。
3、根据权利要求1所述的方法，其中，在酵母蛋白酶抑制剂的存在下将所述细胞破碎。
4、根据权利要求1所述的方法，其中，使用带玻璃珠的高速破碎机破碎所述细胞。
5、根据权利要求1所述的方法，其中，洗涤所述分离的水不溶性成分，以更彻底地除去水溶性组分。
6、根据权利要求1所述的方法，其中，彻底干燥所述水不溶性成分。
7、根据权利要求1所述的方法，其中，使用丙酮对所述分离的水不溶性成分进行处理，并进一步去除丙酮成分。
8、根据权利要求7所述的方法，其中，在分离水不溶性成分后制备其在水中的悬浮液，以水与丙酮的比率为1∶5～1∶20将所述悬浮液加入到丙酮中，得到在丙酮中的悬浮液，然后将所得到的丙酮悬浮液过滤，并将残留在过滤器中的沉淀干燥。
9、根据权利要求8所述的方法，其中，在分离水不溶性成分后，制备其在水中的悬浮液之前，洗涤所述悬浮液，以更彻底地除去水溶性组分。
10、根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，在干燥所述分离的水不溶性成分后，向所述干燥的沉淀物中加入干燥的增溶剂。
11、根据权利要求10所述的方法，其中，所述增溶剂为十二烷基硫酸钠。
12、根据权利要求10所述的方法，其中，在加入所述增溶剂后，加入水。
13、一种通过权利要求1～12中任一项所述的方法制备的白细胞介素-2制剂。
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