RU2230781C1 - Штамм дрожжей saccharomyces cerevisiae 1-60-д578 (msil), - продуцент рекомбинантного интерлейкина-2 человека и способ его получения - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии и может быть использовано в микробиологической и медицинской промышленности. Путем скрещивания штаммов 33-Д373 (МАТ α pheA10 ade2-144,717 his7-1 lys9-A21 ura3-52 trp1-289 leu2-3,112) и 5-Д502 (МАТа arg6 pho3) получают штамм 60-Д578, который затем трансформируют полученным из плазмиды pADP1 линейным фрагментом гена РЕР4, инактивированного встройкой гена ADE2. Использование предложенного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae 1-60-Д578 обеспечивает высокий уровень продукции интерлейкина-2 человека. 2 с.п. ф-лы, 1 ил.

Description

Изобретение относится к биотехнологии, к генной инженерии, микробиологической и медицинской промышленности и представляет собой дрожжевой штамм - продуцент интерлейкина-2 человека и способ его получения.

Интерлейкин-2 человека относится к семейству цитокинов, сигнальных молекул иммунной системы, которые участвуют в формировании и регуляции защитных реакций организма. В рамках иммунной системы цитокины осуществляют взаимосвязь между неспецифическими защитными реакциями и специфическим иммунитетом. На уровне организма цитокины обеспечивают связь между иммунной, нервной, эндокринной и кроветворной системами (Симбирцев А.С. Цитокины и воспаление, 2002, т.1, с.9-16).

Благодаря использованию методов генной инженерии и биотехнологии многие цитокины получены в виде рекомбинантных препаратов, некоторые из них применяются в клинической практике в виде лекарственных средств (Кетлинский С.А. и др. Эндогенные иммуномодуляторы. СПб., 1992). Использование рекомбинантных цитокинов восполняет дефицит эндогенных молекул, повышает эффективность иммунотерапии за счет адекватной и целенаправленной медикаментозной коррекции иммунной дисфункции. В настоящее время иммунотерапия рекомбинантными цитокинами является одним из наиболее перспективных и постоянно расширяющихся направлений иммунофармакологии.

Основная функция интерлейкина-2 состоит в обеспечении клеточной составляющей адаптивного иммунитета. Интерлейкин-2 является фактором роста и дифференцировки Т-лимфоцитов, NK-клеток, обеспечивает дифференцировку Т-киллеров и способствует проявлению функциональной активности Т-хелперов. Интерлейкин-2 усиливает синтез иммуноглобулинов предварительно активированными В-лимфоцитами. Он непосредственно воздействует на моноциты, экспрессирующие рецептор интерлейкина-2. Широкий спектр биологических активностей интерлейкина-2 делает его ключевым компонентом иммунной системы (Taniguchi Т. and Minani Y., Cell, 1993, v.73, p.5-8; Jeal W. and Goa K.L., BioDrugs, 1997, v.7, p.285-317; Rodriquez Z.M. et al. Infection, 1996, v.24, p.115-120; Ярилин А.А. Основы иммунологии. М., 1999).

Наиболее перспективным подходом для получения цитокинов в значительных количествах является использование микроорганизмов в качестве продуцентов этих белков. Применение непатогенных микроорганизмов (дрожжей), не содержащих токсических и пирогенных факторов, в качестве продуцентов белков человека позволяет использовать рекомбинантные белки в клинической практике. Созданный ранее в лаборатории биохимической генетики БиНИИ СПбГУ штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-791 - продуцент интерлейкина-2 человека синтезировал 30-50 мг биологически активного рекомбинантного белка на литр культуральной среды (Мясников А.Н. и др. Патент SU № 1770359, приоритет от 24 марта 1988). Лекарственная форма рекомбинантного дрожжевого интерлейкина-2 человека Ронколейкин успешно используется для лечения септических состояний, ряда онкологических и инфекционных заболеваний (Ронколейкин® - рекомбинантный интерлейкин-2 человека. Под ред. Козлова В.К. СПб., 2001). Перспектива широкого применения рекомбинантного дрожжевого интерлейкина-2 человека в клинической практике ставит задачу повышения уровня продукции этого белка в клетках дрожжей.

Задачей, на решение которой направлены предлагаемые изобретения, является создание штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae - продуцента рекомбинантного интерлейкина-2 человека и разработки способа его получения.

Для решения поставленной задачи создан штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae - продуцент рекомбинантного интерлейкина-2 человека и разработан способ получения штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae - продуцента рекомбинантного интерлейкина-2.

Штамм 1-60-Д578 получают из штамма 60-Д578, который трансформируют плазмидой pADPI с целью нарушения гена РЕР4. Для получения штамма 60-Д578 скрещивают штаммы 33-Д373 (MAT α pheA10 ade2-144,717 his7-l lys9-A21 ura3-52 trp1-289 leu2-3,112) и 5-Д502 (MATa arg6 pho3) Петергофской генетической коллекции (Андрианова В.М., Инге-Вечтомов С.Г. Каталог (указатель) Петергофской генетической коллекции дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Л., 1988). В споровом потомстве отбирают штамм 60-Д578, содержащий мутации ade2-144,717, leu2-3,112, lys9-A21, arg6, pho3.

Для целенаправленного нарушения гена РЕР4 в штамме 60-Д578 конструируют плазмиду pADP1.

На чертеже представлена схема конструирования плазмиды pADP1.

На первом этапе синтезируют ген РЕР4 с помощью ПЦР, используя в качестве позитивного праймера последовательность 5'-ggaattcatgttcagcttga-3', содержащую сайт рестрикции для EcoRI, и в качестве негативного праймера последовательность 5'-tcccccgggtttagctcaaa-3', содержащую сайт рестрикции для SmaI, в качестве матрицы используют хромосомную ДНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Синтезированный ген РЕР4 (1,23 т.п.о.) выделяют при помощи электрофореза в 0,7% агарозном геле, обрабатывают рестриктазами EcoRI и SmaI и лигируют с плазмидой pUC19 (2,7 т.п.о.) (Roberts R.J. Nucl. Acids Res., 1984, v.12, suppl. p.167-204), предварительно обработанной этими же рестриктазами. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки штамма DH5α Escherichia coli (F'/endAl hsdR17 (r $\genfrac{}{}{0ex}{}{\text{-}}{\text{k}}$ m $\genfrac{}{}{0ex}{}{\text{+}}{\text{k}}$ ) supE44 thi-1 recAl gyrA (Nal^r) relAl Δ(lacZYA-argF)U169 deoR (φ80dlacΔ(lacZ)M15), с помощью рестрикционного анализа отбирают трансформанты, содержащие плазмиду pUC19-PEP4 (3,93 т.п.о.). Для доказательства идентичности гена РЕР4, синтезированного при помощи ПЦР, нативному гену РЕР4 Saccharomyces cerevisiae проводят определение его нуклеотидной последовательности (Sanger F.S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci., 1977, v.74, p.5463-5467).

Плазмиду pUC19-PEP4 обрабатывают рестриктазой EcoRV и лигируют с фрагментом ДНК, содержащим ген ADE2. Этот фрагмент получают при рестрикции плазмиды pTL1 (Останин К.В. и др. Биополимеры и клетка, 1988, т.4, с.272-279) рестриктазой Pst1, разделения фрагментов ДНК с помощью электрофореза в 0,7% агарозном геле, выделения фрагмента размером 2,80 т.п.о., затупления липких концов с помощью ДНК полимеразой I фага Т4. После лигирования полученной смесью трансформируют клетки штамма DH5α Escherichia coli (F'/endAl hsdR17 (r $\genfrac{}{}{0ex}{}{\text{-}}{\text{k}}$ m $\genfrac{}{}{0ex}{}{\text{+}}{\text{k}}$ ) supE44 thi-1 recAl gyrA (Nal^r) relAl Δ(lacZYA-argF)U169 deoR (φ80dlacΔ(lacZ)M15) и с помощью рестрикционного анализа отбирают трансформанты, содержащие плазмиду pADP1. Данную плазмиду обрабатывают рестриктазой PvuII и при помощи электрофореза в 0,7% агарозном геле выделяют фрагмент размером 4,33 т.п.о., содержащий PEP4::ADE2, который используют для трансформации штамма 60-Д578. Трансформанты отбирают на селективной среде, не содержащей аденина. Нарушение гена РЕР4 проверяют по снижению активности репрессибельной щелочной фосфатазы на среде, не содержащей неорганического фосфата (ПЕП) (Hemmings B.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1981, v.78, p.435-439). Факт интеграции PEP4::ADE2 в хромосому доказывают при помощи ПЦР, используя вышеуказанные праймеры к гену РЕР4 и хромосомную ДНК трансформантов в качестве матрицы.

Для получения штамма-продуцента интерлейкина-2 человека в штамм 1-60-Д578 вводят плазмиду pJDB(MSIL) (Мясников А.Н., Смирнов М.Н., Авот А.Я. и др. Патент РФ SU 1770359, БИ № 39, 1992) и отбирают трансформанты на среде без аденина и лейцина.

Экспрессия гена интерлейкина-2 человека в составе плазмиды pJDB(MSIL) находится под контролем дрожжевого промотора РНO5, содержащим области, обеспечивающие активацию транскрипции при отсутствии неорганического фосфата в культуральной среде, а также область инициации транскрипции. Промотор гена РНO5 относится к числу наиболее сильных дрожжевых промоторов. Уровень экспрессии генов, находящихся под контролем РНO5 промотора, эффективно регулируется экзогенным неорганическим фосфатом. Плазмида pJDB(MSIL) получена на основе челночного бактериально-дрожжевого вектора pJDB207, который является одним из наиболее стабильных и высококопийных векторов дрожжей. В его состав входит ген LEU2 дрожжей, являющийся селективным маркером для отбора трансформантов.

Штамм-реципиент 1-60-Д578 несет мутацию в гене LEU2, что позволяет отбирать трансформантов, несущих плазмиду pJDB(MSIL). Кроме того, он содержит нарушенный ген РЕР4. Мутация в этом гене приводит к отсутствию активности протеаз А и В, а также карбоксипептидазы Y в клетках дрожжей, что сопровождается повышением стабильности гетерологичных рекомбинантных белков (Hisch H.H. et al. In: Walton E.F., Yarranton G.T., Eds., Molecular and Cell Biology of Yeast, 1989, p.134-200). В отличие от штамма-прототипа ВКПМ Y-791, штамм 1-60-Д578 не несет мутации в гене РНO80. Мутация в этом гене сопровождается конститутивной экспрессией гена интерлейкина-2 человека независимо от концентрации неорганического фосфата. Синтез гетерологичного белка в течение всего периода культивирования штамма-продуцента является метаболической нагрузкой для клетки дрожжей и часто приводит к митотической нестабильности рекомбинантной плазмиды (Miyanohara A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1983, v.80, p.1-5).

Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae 1-60-Д578 (MSIL) характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки.

Клетки округлой, слегка овальной формы, размером 5-10 мкм, часть клеток имеет на поверхности почки или соединена с дочерними клетками.

Культуральные признаки.

Клетки хорошо растут на полных органических средах:

ПЕП - 2% пептона, 2% глюкозы,

ПЕПФО - 2% пептона, 2% глюкозы, 0,1% однозамещенного фосфата калия,

YEPD - 2% пептона, 2% глюкозы, 1% дрожжевого экстракта.

Кроме того, клетки хорошо растут на минеральной среде SC: 0,67% Yeast Nitrogen Base (“Difco”, США), 2% глюкозы, 30 мг/л лизина, 30 мг/л аргинина, а также на других синтетических средах для дрожжей, содержащих 30 мг/л лизина, 30 мг/л аргинина.

При росте на твердых средах клетки образуют гладкие, круглые колонии с матовой поверхностью, светло-кремового цвета, край ровный.

При росте в жидких средах образуют интенсивную ровную суспензию. Культура имеет характерный запах дрожжей.

Физиолого-биохимические признаки.

Клетки растут в пределах от 4 до 37°. Оптимальной температурой выращивания является 30°. При росте в аэробных условиях клетки значительно закисляют среду. Оптимум рН для роста составляет 3,5-5,5.

В качестве источника углерода клетки могут использовать многие простые соединения, такие как глюкоза, сахароза, глицерин.

В качестве источника азота при условии добавки лизина и аргинина клетки используют минеральные соли в аммонийной форме, аминокислоты, мочевину.

Клетки способны к аэробному и анаэробному росту.

Существенными признаками штамма является ауксотрофность по лизину и аргинину и отсутствие потребности в лейцине и аденине.

Для получения штамма 1-60-Д578 с нарушенным геном РЕР4 используют плазмиду pADP1.

ПРИМЕР ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ СПОСОБА

На первом этапе синтезируют ген РЕР4 с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы хромосомную ДНК дрожжей Saccharomyces cerevisiae (см. чертеж). К 0,1 мкг хромосомной ДНК, растворенной в 5 мкл буфера ТЕ, добавляют 1 мкл 0.5 М NaOH и нагревают при 85° в течение 3 мин. Затем пробу быстро переносят в лед, добавляют 1 мкл 0.5 М НСl и далее используют в ПЦР.

В качестве позитивного праймера использовали последовательность 5'-ggaattcatgttcagcttga-3', содержащая сайт рестрикции для EcoRI, и в качестве негативного праймера - последовательность 5'-tcccccgggtttagctcaaa-3', содержащую сайт рестрикции для SmaI. Проба для ПЦР содержит 5 мкл матрицы, 30 рМ каждого праймера (по 2 мкл), 10 мкл 10-кратного раствора дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ), содержащего 1.25 мМ каждого дНТФ (дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ), 10 мкл 10-кратного буфера для ПЦР (100 mM КСl, 100 тМ (NH₄)₂SO₄, 200 тМ Трис-HCl, рН 8,8, 20 mM MgSO₄, 1% тритон Х-100). В пробу добавляется дистиллированная H₂O до конечного объема 100 мкл.

Далее пробу прогревают 5 мин при 95°С, охлаждают, добавляют 2.5 ед. (2.5 мкл) Вент-ДНК-полимеразы (“BioLabs”) и проводят 50 циклов ПЦР в следующих условиях: 1 мин при 95° (плавление цепей ДНК), 1 мин при 56° (отжиг праймеров), 1 мин при 72° (полимеразная реакция). После окончания ПЦР пробу инкубируют при 72° 5 мин.

Для доказательства того, что в ходе ПЦР синтезируется ген РЕР4, проводят электрофорез в 0,7% агарозном геле в буфере ТВЕ (0,1М трис-боратный буфер, рН 8,3, содержащий 1 мМ ЭДТА). Реакционную смесь вносят в лунки агарозного геля и проводят разделение фрагментов ДНК в течение 1-2 ч. По окончании разделения вырезают полоску геля, содержащую фрагмент ДНК размером 1,23 т.п.о., соответствующий гену РЕР4 Saccharomyces cerevisiae. Выделение ДНК из агарозного геля проводят по методике, разработанной фирмой QIAGEN. Полоску геля с фрагментом ДНК помещают в пробирку и добавляют раствор QX1 (300 мкл на 100 мг геля). Пробу нагревают до 50°, добавляют реактив QIAEX (10 мкл на 5 мкг ДНК) и инкубируют при 50° в течение 10 мин, периодически перемешивая. Далее центрифугируют 30 с при 15000 об/мин, супернатант отбрасывают, осадок дважды экстрагируют растворами QX2 и QX3, удаляют супернатант центрифугированием при 15000 об/мин в течение 30 с. Осадок высушивают на воздухе, растворяют в 20 мкл буфера ТЕ, центрифугируют 30 с при 15000 об/мин, супернатант переносят в новую пробирку.

Гидролиз фрагмента ДНК, содержащего синтезированный ген РЕР4 Saccharomyces cerevisiae, рестриктазами EcoRI и SmaI проводят в 10 мМ трис-хлоридном буфере (рН 7,5), содержащем 50 мМ хлористого натрия, 10 мМ хлористого магния и 1 мМ дитиотреитол. К 5 мкг плазмидной ДНК в объеме 20 мкл добавляют по 5 ед. каждой рестриктазы, после чего пробу инкубируют в течение 25 ч при 37°. Далее проводят лигирование с плазмидой pUC19, предварительно обработанной этими же рестриктазами.

Плазмиду pUC19 (2,7 т.п.о.) выделяют из клеток бактерий Escherichia coli, которые выращивают в течение ночи в 1 л питательной среды LB (1% пептона, 0,5% дрожжевого экстракта, 1% хлористого натрия), содержащей ампициллин в концентрации 50 мг/л. Клетки собирают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин при 4°, суспендируют в 20 мл 25 мМ трис-хлоридного буфера (рН 8,0), содержащего 10 мМ ЭДТА и 50 мМ глюкозы, добавляют 30 мг лизоцима и инкубируют 10 мин при комнатной температуре. Далее добавляют 40 мл 0,2 М гидроокиси натрия, содержащей 1% додецилсульфата натрия, осторожно перемешивают и инкубируют в течение 10 мин при 4°. Раствор нейтрализуют добавлением 30 мл 3 М ацетата натрия (рН5,0) и выдерживают в течение 10 мин при 4°. После этого центрифугируют при 14000 об/мин в течение 40 мин при 4°. К супернатанту добавляют 0,6 объема изопропилового спирта, выдерживают 20 мин при комнатной температуре и центрифугируют при 14000 об/мин в течение 20 мин при 20°. Полученный осадок промывают 70% этиловым спиртом, высушивают в вакууме и растворяют в 4 мл дистиллированной воды. Далее добавляют 4,2 г хлористого цезия и 0,36 мл раствора бромистого этидия (10 мг/мл). Полученный раствор выдерживают в течение 1 ч при 4°, затем центрифугируют при 15000 об/мин в течение 15 мин. Супернатант центрифугируют при 70000 об/мин в течение 16 ч в центрифуге TL100 (Beckman). После центрифугирования отбирают полосу плазмидной ДНК (нижнюю из двух флюоресцирующих в ультрафиолетовом свете полос), дважды экстрагируют бромистый этидий равным объемом изоамилового спирта, разбавляют в два раза дистиллированной водой и осаждают плазмидную ДНК двумя объемами этилового спирта и 1/15 объема 3 М ацетата натрия (рН 5,0). Осадок собирают центрифугированием при 10000 об/мин в течение 10 мин, промывают 70% этиловым спиртом и растворяют в 0,5-1 мл буфера ТЕ (10 мМ трис-хлоридный буфер, рН 8,0, содержащий 1 мМ ЭДТА). Концентрацию плазмидной ДНК определяют по поглощению раствора при длине волны 260 нм. Чистоту препарата контролируют при помощи электрофореза в 0,7% агарозном геле в буфере ТВЕ.

Гидролиз плазмиды pUC19 рестриктазами EcoRI и SmaI осуществляют в условиях, описанных для расщепления синтезированного при помощи ПЦР гена РЕР4 Saccharomyces cerevisiae. Линеаризованную плазмидную ДНК выделяют по описанной выше методике фирмы QIAGEN, исключая стадию нагревания.

Для получения плазмиды pUC19-PEP4 проводят лигирование плазмиды pUC19, гидролизованной рестриктазами EcoRI и SmaI, и EcoRI/SmaI фрагмента гена PEP 4 Saccharomyces cerevisiae, синтезированного при помощи ПЦР. Для этого смешивают 0,5 мкг ДНК вектора и 0,1 мкг ДНК встройки в 10 мкл 70 мМ трис-хлоридного буфера (рН 7,6), содержащего 5 мМ дитиотреитола, 5 мМ хлористого магния, 1 мМ АТФ, добавляют 10 ед. ДНК-лигазы фага Т4 и инкубируют при 14° в течение ночи.

Полученной лигазной смесью трансформируют клетки штамма DH5α Escherichia coli (F’/endAl hsdR17 (r $\genfrac{}{}{0ex}{}{\text{-}}{\text{k}}$ m $\genfrac{}{}{0ex}{}{\text{+}}{\text{k}}$ ) supE44 thi-1 recAl gyrA (Nal^r) relAl Δ(lacZYA-argF)U169 deoR (φ80dlacΔ(lacZ)M15). Для этого клетки Escherichia coli выращивают в 100 мл среды LB при 37° до достижения культурой густоты клеточной суспензии, соответствующей 0,4-0,6 ед. оптической плотности при длине волны 550 нм. Клеточную суспензию охлаждают в ледяной бане, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 10 мин при 4°. Клетки супендируют в 100 мл 10 мМ хлористого натрия, собирают центрифугированием в тех же условиях. Далее клетки суспендируют в 50 мл 75 мМ хлористого кальция, выдерживают в ледяной бане в течение 40 мин, осаждают центрифугированием в тех же условиях и суспендируют в 1 мл 75 мМ хлористого кальция. К суспензии компетентных клеток добавляют глицерин до конечной концентрации 15%, разделяют на аликвоты и хранят при -70°. Перед трансформацией суспензию компетентных клеток размораживают в ледяной бане, добавляют лигазную смесь и инкубируют в ледяной бане в течение 40 мин. Далее клетки подвергают действию теплового шока при 42° в течение 2 мин, после чего инкубируют в 1,5 мл среды LB при 37° в течение 1 ч. Клетки собирают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин и высевают на чашки Петри со средой LB, содержащей 2% агара и 50 мг/л ампициллина. Чашки инкубируют при 37° в течение 12-16 ч.

Из выросших отдельных клонов трансформантов выделяют плазмидную ДНК pUC19-PEP4 (3,93 т.п.о.) при помощи методики, использованной для получения плазмиды pUC19, за исключением того что клетки Escherichia coli выращивают в 10 мл LB, и, соответственно, объемы всех растворов уменьшают в 100 раз. Кроме того, вместо стадии центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия проводят обработку ДНК панкреатической РНКазой. Для этого нуклеиновые кислоты, осажденные изопропиловым спиртом, растворяют в 100 мкл буфера ТЕ, добавляют 10 мкл раствора РНКазы (1мг/мл) и инкубируют 30 мин при 37°.

Далее плазмиду pUC19-PEP4 обрабатывают рестриктазой EcoRV в условиях, описанных для расщепления синтезированного при помощи ПЦР гена РЕР4 Saccharomyces cerevisiae, линеаризованную плазмидную ДНК выделяют по описанной выше методике фирмы QIAGEN, исключая стадию нагревания, и лигируют с фрагментом ДНК, содержащим ген ADE2 Saccharomyces cerevisiae. Этот фрагмент получают при рестрикции плазмиды pTL1 рестриктазой Pst1. Выделение плазмиды pTL1 и гидролиз ее рестриктазой Pst1 проводят в условиях, описанных выше для плазмиды pUC19. После гидролиза плазмиды pTL1 рестриктазой Pst1 проводят разделение фрагментов ДНК с помощью электрофореза в 0,7% агарозном геле и выделяют фрагмент 2,8 т.п.о. по описанной выше методике фирмы QIAGEN.

Полученный фрагмент обрабатывают ДНК полимеразой I фага Т4 в 50 мМ трис-хлоридном буфере (рН 7,8), содержащем 10мМ хлористого магния, 10 мМ дитиотреитола, 1 мМ АТФ, 25 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина. К 5 мкг ДНК в объеме 20 мкл добавляют 5 ед. ДНК полимеразой I фага Т4, после чего пробу инкубируют в течение 8 ч при 16°С. и лигируют с плазмидой pUC19-PEP4, обработанной рестриктазой EcoRV. Лигазной смесью трансформируют клетки штамма DH5α Escherichia coli (F'/endAl hsdR17 (r $\genfrac{}{}{0ex}{}{\text{-}}{\text{k}}$ m $\genfrac{}{}{0ex}{}{\text{+}}{\text{k}}$ ) supE44 thi-1 recAl gyrA (Nal^r) relAl Δ(lacZYA-argF)U169 deoR (φ80dlacΔ(lacZ)M15, и с помощью рестрикционного анализа отбирают трансформанты, содержащие плазмиду pADP1 (6,73 т.п.о.). Данную плазмиду обрабатывают рестриктазой PvuII и при помощи электрофореза в агарозном геле выделяют фрагмент размером 4,33 т.п.о., содержащий ген РЕР4 со встроенным в него геном ADE2.

Полученным линейным фрагментом плазмиды pADP1 размером 4,33 т.п.о. трансформируют клетки штамма 60-Д578 для получения штамма 1-60-Д578 с нарушенным геном РЕР4.

Для получения штамма 60-Д578 скрещивают штаммы 33-Д373 (MAT α pheAl0 ade2-144,717 his7-1 lys9-A21 urа3-52 trpl-289 leu2-3,112) и 5-Д502 (МАТа arg6 pho3) Петергофской генетической коллекции. Полученный диплоид растет на минеральной среде без добавления аминокислот. Диплоид переносят на среду с ацетатом натрия (1% ацетат натрия, 0,5% хлористый калий) и через 4-5 дней спорулирующую культуру используют для изоляции гаплоидных спор. Спорулирующую культуру обрабатывают медицинским эфиром в течение 5 мин и высевают на полную среду YEPD. Выросшие на среде YEPD споры пересевают на полную среду и через 2 суток методом отпечатков переносят на селективные среды, определяют фенотип сегрегантов и отбирают штамм 60-Д578, содержащий мутации ade2-144,717, leu2-3,112, lys9-A21, arg6, pho3.

Для целенаправленного нарушения гена РЕР4 штамм 60-Д578 трансформируют линейным фрагментом плазмиды pADP1 размером 4,33 т.п.о., который содержит ген РЕР4 со встроенным геном ADE2. Клетки дрожжей штамма 60-Д578 выращивают в 100 мл среды YEPD до достижения культурой оптической плотности, соответствующей 2-4 ед. поглощения при длине волны 600 нм. Клетки дважды промывают стерильной водой, после чего суспендируют в 0,3 мл 100 мМ раствора ацетата лития и инкубируют при 30° в течение 30 мин. К 50 мкл полученной суспензии клеток добавляют 0,1-1 мкг плазмидной ДНК, 50 мкг ДНК спермы лосося, предварительно денатурированной нагреванием (10 мин при 100°), и 0,3 мл раствора 100 мМ ацетата лития, содержащего 40% полиэтиленгликоля 4000. Далее пробу инкубируют 30 мин при 30° и 20 мин при 42°, помещают на 15 с в ледяную баню и центрифугируют 10 с при 10000 об/мин. Клетки суспендируют в 1 мл стерильной воды и высевают на твердую среду SC, содержащую содержащих 30 мг/л лизина, 30 мг/л аргинина, 60 мг/л лейцина. Трансформанты отбирают по способности расти на среде, не содержащей аденина. Клоны трансформантов вырастают через 4-6 суток.

Нарушение гена РЕР4 проверяют по снижению активности репрессибельной щелочной фосфатазы на среде ПЕП. Факт интеграции PEP4::ADE2 в хромосому доказывают, при помощи ПЦР, используя праймеры к гену РЕР4. В качестве матрицы используют хромосомную ДНК трансформантов.

Затем полученным штаммом 1-60-Д578 с нарушенным геном РЕР4 создают штамм - продуцент интерлейкина-2 человека.

Для получения штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae 1-60-Д578 (MSIL) - продуцента интерлейкина-2 человека, клетки дрожжей штамма 1-60-Д578 трансформируют плазмидой pJDB(MSIL). Клетки дрожжей выращивают в 100 мл среды YEPD до достижения культурой оптической плотности, соответствующей 2-4 ед. поглощения при длине волны 600 нм. Клетки дважды промывают стерильной водой, после чего суспендируют в 0,3 мл 100 мМ раствора ацетата лития и инкубируют при 30° в течение 30 мин. К 50 мкл полученной суспензии клеток добавляют 0,1-1 мкг плазмидной ДНК, 50 мкг ДНК спермы лосося, предварительно денатурированной нагреванием (10 мин при 100°), и 0,3 мл раствора 100 мМ ацетата лития, содержащего 40% полиэтиленгликоля 4000. Далее пробу инкубируют 30 мин при 30° и 20 мин при 42°, помещают на 15 с в ледяную баню и центрифугируют 10 с при 10000 об/мин. Клетки суспендируют в 1 мл стерильной воды и высевают на твердую среду SC, содержащую 30 мг/л лизина, 30 мг/л аргинина. Клоны трансформантов вырастают через 4-6 суток.

Для анализа продукции интерлейкина-2 человека клетками трансформантов их выращивают в 50 мл жидкой среды ПЕП до стационарной фазы роста. Клетки собирают центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин, промывают водой, суспендируют в 1 мл 50 мМ трис-хлоридного буфера (рН 7,5), содержащего 1 мМ ФМСФ (фенилметилсульфонилфторид), добавляют 1 г стеклянных бус (0,5 мм) и разрушают в дезинтеграторе “Braun” в течение 1 мин. Полученный гомогенат центрифугируют при 10000 об/мин в течение 10 мин, осадок промывают 10-кратным объемом того же буфера и суспендируют в 1 мл 50 мМ натрийфосфатного буфера (рН 7,0), содержащего 2% додецилсульфата натрия и 5% 2-меркаптоэтанола, и инкубируют 5 мин в кипящей водяной бане. По окончании инкубации пробу центрифугируют 15 мин при 12000 об/мин и в супернатанте определяют содержание интерлейкина-2 человека при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и последующей гибридизации со специфическими антителами к интерлейкину-2 человека. Разделение белков проводят в 15% полиакриламидном геле в стандартной системе буферов (электродный буфер: 25 мМ трис, 192 мМ глицин, 0,1% додецилсульфат натрия, рН 8,3; буфер для геля: 375 мМ трис-хлоридный буфер, рН 8,8). Параллельно проводят разделение белков контрольного штамма 1-60-Д578, выращенного и вскрытого в идентичных условиях. В качестве стандартов молекулярной массы используют карбоангидразу (31,0 кДа), ингибитор трипсина (21,5 кДа), миоглобин (16,9 кДа), лизоцим (14,4 кДа). По окончании электрофореза белки ренатурируют, выдерживая гели 15 мин в 10 мМ трис-хлоридном буфере (рН 7,5), содержащем 4М мочевину, 20 мМ ЭДТА, и переносят на нитроцеллюлозную мембрану в 25 мМ трис-192 мМ глициновом буфере (рН 8,3), содержащем 20% метилового спирта, при 30-40 В, в течение 1,5 ч. Далее мембрану выдерживают в буфере TBST (10 мМ трис-хлоридный буфер (рН 8,0), 150 мМ хлористого натрия, 0,05% твин-20, 1% бычьего сывороточного альбумина) в течение 2 ч при 37°. Затем помещают мембрану в тот же буфер, содержащий разведенные в 1000 раз мышиные моноклональные антитела к интерлейкину-2 человека (Boehringer), и инкубируют 2 ч при 37°. Далее трижды промывают мембрану буфером TBST и инкубируют 1 ч при 37° с разбавленным в 7000 раз конъюгатом видоспецифических антител к иммуноглобулинам мыши и пероксидазы хрена (Протеиновый контур, Санкт-Петербург). После отмывки мембраны буфером PBST (58 мМ двузамещенного фосфата натрия, 17 мМ однозамещенного фосфата натрия, 68 мМ хлористого натрия, 0,1% твин-20) добавляют раствор субстратов для пероксидазы: 0,02% DАВ(3,'3-диаминобензидин тетрагидрохлорид), 0,006% перекись водорода в 10 мМ трис-хлоридном буфере, рН 7,5. Параллельно окрашивают гели 0,15% раствором кумасси G250 в 25% изопропаноле и 10% уксусной кислоте и отмывают в 10% уксусной кислоте. При сравнении спектра белков у штамма 1-60-Д578 (MSIL) обнаруживают появление дополнительной белковой полосы, дающей положительную реакцию с антителами к интерлейкину-2 человека, с молекулярной массой около 15,4 кДа, что соответствует молекулярной массе интерлейкина-2. Уровень синтеза интерлейкина 2 определяют, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой стандартного интерлейкина-2 человека.

Согласно полученным данным, клетки дрожжей штамма 1-60-Д578 (MSIL) синтезируют около 60-65 мг интерлейкина-2 на литр культуры дрожжей.

Рекомбинантный интерлейкин-2 человека, синтезированный в клетках дрожжей, обладает биологической активностью, обеспечивая пролиферацию интерлейкин-2-зависимых Т-лимфоцитов мыши линии CTLL-2 (Gearing A., Thorpe R.J. Immunol. Meth., 1988, v.114, p.3-9). Активность рекомбинантного интерлейкина-2 составляет не менее 10 млн ед./л.

Суммируя вышесказанное, можно заключить, что преимуществом созданного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae 1-60-Д578 (MSIL) по сравнению с прототипом ВКПМ Y-791 является более высокий уровень продукции интерлейкина-2 человека и большая стабильность рекомбинантного белка, что позволяет повысить выход целевого продукта.

Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae 1-60-Д578 (MSIL) - продуцент интерлейкина-2 человека депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ Y-3079.

Claims (2)

1. Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae 1-60-Д578 (MSIL), депонированный во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ Y-3079, - продуцент рекомбинантного интерлейкина-2 человека.

2. Способ получения штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae 1-60-Д578 (MSIL), заключающийся в том, что штамм 33-Д373 (МАТ α pheA10 ade2-144,717 his7-1 lys9-A21 ura3-52 trp1-289 leu2-3,112) скрещивают со штаммом 5-Д502 (МАТa (arg6 pho3), из спорового потомства гибрида отбирают сегрегант 60-Д578 (ade2-144,717 leu2-3,112 lys9-A21 arg6 pho3), в полученный сегрегант вводят линейный фрагмент гена РЕР4, инактивированный встройкой гена ADE2, который получают из плазмиды рАDР1, и отбирают трансформант 1-60-Д578, растущий на селективной среде без аденина, в отобранный трансформант 1-60-Д578 вводят плазмиду рJDB (MSIL), содержащую промотор и терминатор транскрипции гена РНО5 дрожжей, кодирующую часть гена интерлейкина-2 человека, обеспечивающую синтез рекомбинантного интерлейкина-2 человека клетками дрожжей при отсутствии неорганического фосфата в культуральной среде.