RU2322452C2

RU2322452C2 - Иммуномодулирующая композиция

Info

Publication number: RU2322452C2
Application number: RU2006110507/13A
Authority: RU
Inventors: Михаил Николаевич Смирнов (RU); Михаил Николаевич Смирнов; Зо Калениковна Николаева (RU); Зоя Калениковна Николаева; Вера Сергеевна Яковлева (RU); Вера Сергеевна Яковлева
Original assignee: Михаил Николаевич Смирнов
Priority date: 2006-03-27
Filing date: 2006-03-27
Publication date: 2008-04-20
Also published as: RU2006110507A; WO2007111535A1; CN101410409A; EP1939216A1; EP1939216A4

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к иммуномодулирующим лекарственным средствам, и может быть использовано в области медицины и ветеринарии при лечении онкологических, инфекционных, аутоиммунных и аллергических заболеваний. Композиция содержит водонерастворимую фракцию разрушенных клеток дрожжевого продуцента гетерологичного гидрофобного белка-цитокина, солюбилизатор и воду. В частности, белок-цитокин представляет собой интерлейкин-2 (ИЛ-2), а дрожжевой продуцент представляет собой штамм Saccharomyces cerevisiae, депонированный во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером Y-791. Полученную композицию применяют перорально для лечения иммунодефицитного состояния. Изобретение позволяет с максимальной эффективностью использовать терапевтический потенциал дрожжевого продуцента гетерологичного цитокина, при этом избежать сложной процедуры очистки цитокина, что существенно удешевляет полученную композицию, а также получить препарат, который можно вводить без нарушения целостности кожных покровов, а именно перорально. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 4 табл.

Description

Изобретение относится к иммуномодулирующим лекарственным средствам и может быть использовано в области медицины и ветеринарии. В частности, данное изобретение относится к иммуномодулирующей композиции, которая может быть использована в целях иммуноориентированной терапии и, в частности, при лечении онкологических, инфекционных, аутоиммунных и аллергических заболеваний.

Неспособность иммунной системы эффективно выполнять основные функции приводит к формированию различных видов вторичной иммунной недостаточности, клинически проявляющейся несколькими классическими синдромами - инфекционным, аллергическим (атопическим), аутоиммунным и лимфопролиферативным.

На сегодняшний день известно, что большинство распространенных заболеваний и функциональных расстройств сопровождаются иммунодефицитами. Иммуносупрессия сопутствует не только СПИДу, но и многим инфекционным и онкологическим заболеваниям, травмам, ожогам, ранениям. Ее наблюдают при септических состояниях различной этиологии, старении, родах, недоношенности новорожденных, при хирургических вмешательствах.

Использование средств иммуноориентированной терапии является отличительной особенностью современной практической медицины. Лечение многих заболеваний без применения этих средств невозможно и они входят в качестве обязательной составляющей в комплексную терапию. Спектр лекарственных средств, обладающих иммунотропной активностью, достаточно широк и разнообразен.

Из уровня техники (патент США US 4138479, опубликованный 06.02.1979) известен водорастворимый иммунопотенциирующий агент, представляющий собой продукт экстракции из разрушенных стенок дрожжевых клеток.

Известна иммуномодулирующая композиция (патент США US 6509313, опубликованный 21.01.2003), содержащая агент, имеющий цитокиновую активность, который может представлять собой природный, рекомбинантный или мутированный цитокин. Она применяется для стимуляции, поддержания или ингибирования иммунного ответа.

В описании изобретения к патенту US 6509313 отмечена возможность перорального применения композиции, содержащей агент, имеющий цитокиновую активность. Однако, судя по приведенным примерам, такая композиция применялась с помощью подкожной инъекции либо с помощью пластыря или ингалятора и даже отмечено, что следует избегать «гидролизующих условий желудочно-кишечного тракта» (конец предпоследнего абзаца в колонке 15).

Следует также отметить, что известные до сих пор агенты, имеющие цитокиновую активность, представляют собой высокоочищенные природные или рекомбинантные белки, стоимость получения которых чрезвычайно высока.

Известна также композиция (патент США US 6919082, опубликованный 19.07.2005), содержащая в качестве активного компонента фракцию клеточных стенок дрожжей. Она применяется перорально и проявляет терапевтический эффект, в частности, при лечении аллергических заболеваний. Указанная фракция способствует синтезу короткоцепочечных жирных кислот, роль которых в поддержании здорового состояния кишечника человека была в последнее время по достоинству оценена. Данная композиция не использует мощный потенциал дрожжей как продуцентов гетерологичных белков.

Задачей данного изобретения является создание недорогого препарата, который можно было бы использовать в целях иммуноориентированной терапии и, в частности, при лечении онкологических, инфекционных, аутоиммунных и аллергических заболеваний и вводить пациенту без нарушения целостности кожных покровов. Учитывая факт, что иммунная система пациентов по неизвестным причинам не распознает уже присутствующий и вызывающий заболевание чужеродный агент, перед авторами изобретения стояла задача создать такой препарат, который бы позволил дополнительно провести антигенную стимуляцию для осуществления первого этапа иммунного ответа с последующей стимуляцией пролиферации различных иммунных клеток. Таким образом, еще одной задачей настоящего изобретения является создание фармацевтической композиции, содержащей факторы активации и пролиферации иммунных клеток человека и животных.

Данная задача решается тем, что предложена композиция, содержащая водонерастворимую фракцию разрушенных клеток дрожжевого продуцента гетерологичного гидрофобного белка-цитокина, причем в этом продуценте был осуществлен синтез целевого гидрофобного белка-цитокина. В частности, белок-цитокин представляет собой интерлейкин-2 (ИЛ-2), а дрожжевой продуцент представляет собой штамм Saccharomyces cerevisiae, депонированный во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером Y-791.

Такая композиция сама по себе не является активной, но может быть использована в целях иммуномодулирования после добавления к ней солюбилизатора и воды с получением иммуномодулирующей композиции по изобретению.

В альтернативном и, пожалуй, наиболее предпочтительном случае композиция по изобретению содержит водонерастворимую фракцию разрушенных клеток дрожжевого продуцента, в котором был осуществлен синтез целевого гетерологичного гидрофобного белка-цитокина, в частности интерлейкина-2 (ИЛ-2), и солюбилизатор, в частности додецилсульфат натрия. Для ее превращения в активную композицию достаточно добавить воду.

Наконец, поставленная задача решается тем, что предложена композиция, содержащая водонерастворимую фракцию разрушенных клеток дрожжевого продуцента гетерологичного гидрофобного белка-цитокина, солюбилизатор и воду, причем в этом продуценте был осуществлен синтез целевого гидрофобного белка-цитокина. В частности, предложена композиция, содержащая водонерастворимую фракцию разрушенных клеток дрожжевого продуцента, в котором был осуществлен синтез гетерологичного интерлейкина-2 (ИЛ-2), солюбилизатор и воду. Данная композиция имеет иммуномодулирующую активность.

В предпочтительном варианте реализации изобретения дрожжевой продуцент представляет собой штамм Saccharomyces cerevisiae, депонированный во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером Y-791, являющийся продуцентом человеческого рекомбинантного ИЛ-2.

Солюбилизатор, используемый в композиции по изобретению, предпочтительно представляет собой додецилсульфат натрия.

Предложенная композиция позволяет с максимальной эффективностью использовать терапевтический потенциал дрожжевого продуцента гетерологичного цитокина, при этом избежать сложной процедуры очистки цитокина, что существенно удешевляет полученную композицию, с получением препарата, который можно вводить без нарушения целостности кожных покровов, а именно перорально.

Предложенная композиция представляет собой совершенно новое решение в области иммуномодулирующих средств. Она объединяет терапевтические эффекты дрожжей и цитокинов, причем предложенное решение, которое кажется таким простым, является совершенно неожиданным в данной области. Создание такой композиции может в корне изменить подход к терапии цитокинами, так как столь естественным образом полученная композиция позволяет решить сразу же несколько проблем, в том числе понизить стоимость цитокиновой терапии, упростить применение лекарства (пероральное вместо подкожного или внутривенного), а также повысить эффективность терапии, особенно в случае невосприимчивости к монотерапии цитокином.

Судя по результатам испытаний композиции по изобретению, она не уступает по эффективности известным цитокиновым препаратам, в частности препаратам интерейкина-2, причем по предварительным данным водонерастворимая фракция разрушенных дрожжевых клеток представляет собой такой фактор активации, без которого не оказывает терапевтического действия фактор пролиферации, представленный цитокином, в частности интерлейкином-2.

В контексте данного описания под иммуномодуляцией понимают три типа воздействия на иммунную систему: иммунопротекцию, иммунокоррекцию и иммунореставрацию.

Иммунопротекция - это предотвращение развития иммунной недостаточности как компонента полиорганной несостоятельности при воздействии таких экстраординарных факторов или ситуаций, как тяжелая механическая травма, обширное оперативное вмешательство, массированные ожоги. В этих случаях иммунная недостаточность, в большой степени связанная с неадекватной работой систем генерализации воспаления, наряду с кровопотерей, шоком, гипоксией и эндотоксикозом оказывается значимым компонентом патогенеза остроразвивающихся тяжелых полиорганных дисфункций - угрожающего жизни состояния, часто приводящего к смерти пациентов.

Иммунокоррекция - это компенсация проявлений иммунной недостаточности, связанной с клеточным компонентом иммунной системы, и ликвидация дисбаланса этого компонента.

Иммунореставрация - это воссоздание всей совокупности пула иммунокомпетентных клеток, прежде всего Т-лимфоцитов, а также восстановление морфологической и функциональной целостности иммунной системы.

В норме активация иммунного ответа в организме происходит вследствие проникновения в него вирусных, бактериальных, микотических агентов, а также вследствие образования в организме опухолевых клеток, то есть иммунный ответ активируется антигеном.

Однако зачастую врачи сталкиваются с ситуацией, когда по неизвестным причинам организм пациента не реагирует на антигенную стимуляцию и у пациента развивается хроническое заболевание с постоянным носительством чужеродного агента (такие заболевания, как туберкулез, гепатиты В и С, синуситы, рецидивирующие аллергические заболевания, хронический хламидиоз и микоплазмоз, хроническое вирусоносительство, упорные пиодермии, пиелонефрит, микотические инфекции и прочее), сопровождающееся иммунодефицитным состоянием.

Отсюда можно сделать вывод, что применение для иммуномодуляции только фактора пролиферации в ряде случаев является недостаточным и нужен еще и фактор активации.

В частности, механизм действия эндогенного ИЛ-2 заключается в стимуляции антиген-зависимой пролиферации CD4+ и CD8+ лимфоцитов. Иными словами, для успешной пролиферации вышеуказанных Т-лимфоцитов и последующего запуска каскада иммунологических событий (секреции многих цитокинов, экспрессии соответствующих рецепторов, формирования иммунного ответа) требуется как присутствие фактора активации (антиген-стимуляция), так и наличие фактора пролиферации (интерлейкин-2) (Smith К.A. "T-cell growth factor". // Immunol. Rev. - 1980. - 51. - p.337-357. Rubin J.T. "lnterleukin-2: its biology and clinical application in patients with cancer". // Cancer investigation. - 1993. - 11 (4). - p.460-472).

Как уже было отмечено выше, в зависимости от клинической патологии активация иммунного ответа антигеном может происходить вследствие проникновения в организм вирусных, бактериальных, микотических агентов, а также вследствие образования в организме опухолевых клеток.

Если в этих условиях ввести в организм ИЛ-2, он будет стимулировать пролиферацию только антиген-активированных клеток, т.к. его биологическая активность проявляется в результате взаимодействия со специфическим рецептором, экспрессирующимся только активированными клетками-мишенями.

Предложенная композиция обладает иммуномодулирующим действием и может быть использована при лечении онкологических заболеваний; различных инфекций: сепсиса, перитонита, панкреатита, остеомиелита, пиодермии, эндометрита, энтерита, микоза, инфекций, устойчивых к антибиотикам; туберкулеза, псевдотуберкулеза; гепатита В и С, ВИЧ-инфекции, хламидиоза; аутоиммунных заболеваний: рассеянного склероза, амиотрофического латерального склероза, гломерулонефрита, болезни Крона, нейродермитов; аллергических заболеваний: аллергии на пыльцу, на мех животных, аллергической астмы, контактной аллергии, пищевой аллергии.

Известно, что генетически модифицированные микроорганизмы и, в частности, дрожжи могут являться продуцентами гетерологичных белков. В частности, методами генетической инженерии и биотехнологии можно получать рекомбинантные дрожжевые продуценты белков, обладающих цитокиновой активностью.

Большинство цитокинов млекопитающих является секреторными белками. В процессе секреции природные белки-цитокины приобретают свой углеводный остаток, становясь гликопротеинами, правильную пространственную конфигурацию, биологическую активность и становятся растворимыми. При этом известно, что довольно часто гетерологичные белки в клетках микроорганизма-продуцента находятся в виде «телец включения». В «тельцах включения» целевые рекомбинантные белки находятся в нерастворимой (гидрофобной) и неактивной форме. В частности, это происходит из-за того, что гетерологичные белки не принимают правильную конформацию при синтезе внутри клетки микроорганизма-продуцента.

Предлагаются различные методы растворения гидрофобных гетерологичных белков (заявка на патент США US 20060052583, опубликованная 09.03.2006) с целью создания условий для принятия ими правильной конформации. Однако в данном изобретении указанным свойством целевых белков предлагается воспользоваться для создания новой композиции. Гиброфобные рекомбинантные белки, к числу которых относится рекомбинантный интерлейкин-2, продуцируемый дрожжами, имеют тенденцию оставаться в осадке после центрифугирования разрушенных клеток-продуцентов (последний абзац на с.4 ЕР 0152358).

Таким образом, в данном изобретении под «дрожжевым продуцентом гетерологичного гидрофобного белка-цитокина» понимается штамм дрожжей, в который методами генной инженерии был внедрен ген, кодирующий цитокин; продукция такого белка не свойственна указанному штамму дрожжей, поэтому белок называется гетерологичным. Изобретение касается только тех белков, которые, будучи синтезированы в клетках рекомбинантного штамма-продуцента, накапливаются внутриклеточно и проявляют гидрофобные свойства. Несмотря на то, что в естественных условиях цитокины являются гликозилированными, секретируемыми и гидрофильными, в микроорганизмах-продуцентах цитокины могут накапливаться внутриклеточно и, следовательно, не гликозилироваться и быть гидрофобными. При синтезе клеткой-продуцентом такого рекомбинантного белка не происходит корректного формирования его пространственной конфигурации, причем главной особенностью таких белков является то, что после разрушения клеток-продуцентов они остаются в водонерастворимой фракции.

Под белками-цитокинами понимают факторы роста, которые регулируют пролиферацию, дифференциацию и функционирование клеток крови и иммунной системы (Sedlacek Н. - Н., Могоу Т. "Immune reactions: headlines, overviews, tables and graphics". // Springer - Verlag Berlin Heidelberg. - 1995. - p.1-53). К цитокинам относятся интерфероны, колониестимулирующие факторы (КСФ), хемокины, трансформирующие ростовые факторы, фактор некроза опухолей, интерлейкины и некоторые другие (А.С.Симбирцев. «Цитокины: классификация и биологические функции». // Цитокины и воспаление. - 2004. - Том 3, №2, - стр.16-22).

Если говорить подробнее, то цитокины - это небольшие белки (с молекулярной массой от 8 до 80 КДа), действующие аутокринно (то есть на клетку, которая их продуцирует) и/или паракринно (на клетки, расположенные вблизи). Цитокины в основном секретируются клетками крови и иммунной системы и участвуют в межклеточной передаче сигналов в иммунной системе. Для выполнения своей функции цитокинам необходимо связаться со специфическими рецепторами на мембранах их клеток-мишеней и активировать их. Цитокины, которые синтезируются лимфоцитами и являются регуляторами пролиферации и дифференцировки, в частности, гематопоэтических клеток и клеток иммунной системы, называют также лимфокинами. Они включают в себя интерлейкины (ИЛ) (от inter - между, leukins белые клетки крови), интерфероны и колониестимулирующие факторы.

Механизм действия одного из цитокинов, интерлейкина-2 (ИЛ-2), заключается в стимуляции антиген-зависимой пролиферации CD4+ и CD8+ лимфоцитов. Другими важными свойствами ИЛ-2 является его влияние на Th1/Th2 баланс, аутокринное воздействие на Тh1 клетки и паракринное - на субпопуляцию Тh2 клеток (Carol В. and Kendall A.S., 2002. Sedlacek H. - H., Moroy Т. "Immune reactions: headlines, overviews, tables and graphics". // Springer-Verlag Berlin Heidelberg. - 1995. - p.15-21). Влияя на выбор типа и длительность иммунного ответа, ИЛ-2 проявляет поистине многогранные иммунобиологические свойства.

Терапевтическому применению цитокинов и, в частности ИЛ-2, в последние десятилетия уделяется большое внимание. Достигнуты также большие успехи в получении рекомбинантных цитокинов в различных продуцентах.

Хотя наиболее распространенным дрожжевым продуцентом является Saccharomyces cerevisiae, такими продуцентами могут быть любые другие непатогенные дрожжи, например Saccharomyces bulardi или дрожжи рода Pichia, например Pichia pastoris, рода Kluyveromyces, например Kluyveromyces lactis, рода Hansenula, например Hansenula polymorpha, и тому подобные.

В частности, примером дрожжевых продуцентов человеческого ИЛ-2 является штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae, депонированный во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером Y-791.

В зависимости от конструкции вектора экспрессии, введенного в штамм-продуцент, целевые гетерологичные белки могут быть секретируемыми, а могут оставаться внутри клетки. Если белок остается внутри клетки, то его дальнейшее выделение должно производиться с разрушением клеток штамма-продуцента.

Разрушение дрожжевых клеток может быть осуществлено любыми известными способами, обеспечивающими сохранение целевого белка. В частности, физическими способами, например, с использованием высокоскоростного измельчителя со стеклянными шариками, с использованием высокого давления, методом замораживания-оттаивания.

При этом обеспечение сохранности целевого продукта достигается добавлением к суспензии разрушаемых клеток ингибиторов протеаз, чтобы протеазы дрожжей, освобождающиеся при разрушении клеток, не разрушили целевой белок, в частности ИЛ-2. Ферментативный способ разрушения дрожжевых клеток также возможен, если удастся избежать протеолитического действия используемого агента на целевой белок.

Водонерастворимая фракция может быть отделена с помощью центрифугирования. При этом практически все водорастворимые компоненты содержимого дрожжевых клеток переходят в надосадочную жидкость (супернатант), которая отбрасывается, а в осадке остаются водонерастворимые компоненты. При центрифугировании удаляются протеазы, растворимые белки, РНК, хромосомная и плазмидная ДНК. Отделение водонерастворимой фракции может быть осуществлено и другими доступными методами, в частности фильтрацией.

Отделенная водонерастворимая фракция может быть подвергнута какой-либо обработке с целью улучшения ее физических свойств. Например, она может быть один или несколько раз промыта 0,005 М трис-HCl буферным раствором. Может быть лиофильно высушена. Эта фракция может быть обработана ацетоном, что приводит к ее полному обезвоживанию, и после удаления ацетоновой фракции остаток может быть легко высушен с получением порошкообразной массы.

В сухом остатке водонерастворимой фракции массовая доля целевого белка-цитокина составляет 1-4%. Количество белка-цитокина можно определить любым стандартным способом определения целевого белка, например методом электрофореза в полиакриламидном геле (Laemmli U. "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4". // Nature. - 1970. - 227, - p.680-685), или с применением иммуноферментного анализа (Gehman L.O. and Robb R.J. "An ELISA-based assay for quantitation of human interleukin-2." // J.Immunol. Methods. - 1984. - vol.74, - p.39) и др.

Доза композиции для введения определяется исходя из активности полученного цитокина. Для этого водонерастворимую фракцию солюбилизируют и определяют активность белка-цитокина, находящегося в жидкой фазе, в каком-либо стандартном тесте.

Для каждого цитокина разработаны свои стандартные тесты по оценке активности.

Например, оценку биологической активности полученного препарата ИЛ-2 можно провести в международном стандартном тесте с культурой интерлейкин-2-зависимых опухолеспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов мыши линии CTLL-2 (Hammerling U. et al. «Development and validation bioassay for interleukin-2». // J.Pharmaceut. & Biochem. Analysis, - 1992. - vol.10. - p.547. Gearing A.J.H. and Thorpe R. «The international standard for human interleukin-2. Calibration by international collaborative study.» // J.Immunol. Methods. - 1984. - vol.74. - p.39). Биологически активный рекомбинантный ИЛ-2 должен стимулировать пролиферацию этих клеток. Определение биологической активности проводят с использованием колориметрического метода с тетразолиевым красителем МТТ. Жизнеспособные клетки, стимулированные ИЛ-2, поглощают краситель и накапливают в цитоплазме нерастворимые в воде темно-синие кристаллы формазана (восстановленный МТТ). После удаления культуральной среды и полного растворения кристаллов в диметилсульфоксиде измеряют оптическую плотность полученного раствора на компьютеризованном фотометре при длине волны 530 и 690 нм. Темно-синее окрашивание раствора в пробах, содержащих ИЛ-2, должно быть зависимым от концентрации ИЛ-2, внесенного в культуральную среду. Сравнивая оптическую плотность пробы и стандарта активности ИЛ-2, определяют биологическую активность ИЛ-2 в инкубационной пробе.

В частности, для ИЛ-2 100 мг сухой водонерастворимой фракции дает активность 4-5 млн ME. Таким образом, если необходимо использовать дозу 1 млн ME ИЛ-2, берут 20-25 мг сухой водонерастворимой фракции.

Добавление солюбилизатора и воды к водонерастворимой фракции, в составе которой находится гетерологичный гидрофобный белок-цитокин, приводит к переходу этого белка в активную форму.

Солюбилизатор (детергент) представляет собой вещество, которое способствует растворению в воде гидрофобных веществ. В качестве солюбилизатора могут быть использованы додецилсульфат натрия, лаурилсаркозинат, дезоксихолат, мочевина, Triton-Х100.

Рекомбинантный ИЛ-2, синтезируемый внутри дрожжевой клетки, является водонерастворимым и связан с клеточной стенкой. Было обнаружено, что солюбилизатор также позволяет отделить ИЛ-2 от клеточной стенки.

Солюбилизатор может находиться в составе композиции в количестве от 4,0 до 20,0% от массы сухой водонерастворимой фракции, предпочтительно 12%.

Композиция, состоящая из указанной водонерастворимой фракции и солюбилизатора, представляет собой иммуномодулирующее средство, к которому перед использованием нужно добавить воду.

Добавление воды к композиции, содержащей сухую водонерастворимую фракцию и солюбилизатор, приводит к растворению гидрофобного гетерологичного белка, образованию правильной конформации гетерологичного белка и, соответственно, получению активного цитокина. На 100 мг водонерастворимой фракции можно добавить от 1 до 10 мл воды.

Композиция также может дополнительно содержать любые фармацевтически приемлемые эксципиенты, которые пригодны для образования удобной фармацевтической формы данной композиции. Это могут быть наполнители, традиционно используемые в фармацевтической промышленности, стабилизаторы, антиоксиданты и т.п.

В общем, композиция по изобретению альтернативно может включать в себя, состоять или по существу состоять из любых подходящих компонентов, раскрытых в данном описании, и такая композиция по изобретению может дополнительно или альтернативно быть приготовлена так, что из нее исключен какой-либо компонент, материал, ингредиент или объект, который был использован в препарате, известном из уровня техники, или который не является необходимым для достижения технического результата данного изобретения.

Пример 1. Получение композиции

Для получения композиции берут аликвоту штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae Y-791, хранящуюся при -70°С в глицерине, и засевают в питательную минеральную среду Sd1, содержащую 50 мг/л гистидина. Состав среды Sd1: 0,67% Yeast nitrogen base ("Difco Laboratories", Detroit, Ml), 2% глюкозы. Соотношение массы клеток к объему среды Sd1 приблизительно составляет 0,2 г к 1 литру.

Культивирование в среде Sd1 ведут до значения оптической плотности OD₆₀₀ от 2,5 до 4,0, предпочтительно OD₆₀₀=3,0.

По достижении требуемого значения оптической плотности переносят полученный таким образом инокулят в десятикратно больший объем среды Sd2 и ведут культивирование до значения OD₆₀₀ от 6,0 до 9,0, предпочтительно OD₆₀₀=7,5. Состав среды Sd2 приведен в таблице 1.

Таблица 1
Состав питательной среды Sd2
Компонент среды	Количество на 1 л
Гистидин	0,05 г
(NH₄)-цитрат (безводный)	7,6 г
MgSO₄	0,5 г
NaCl	0,1 г
CaCl₂×6H₂O	0,1 г
KCl	1,5 г
КН₂PO₄	0,03 г
Глюкоза	20 г
Н₃ВО₃	0,5 мг
CuSO₄×5H₂O	0,04 мг
Kl	0,1 мг
FeCl₃×6Н₂O	0,2 мг
MnSO₄	0,4 мг
NaMoO₄×2H₂O	0,2 мг
ZnSO₄×7H₂O	0,4 мг
Биотин	0,02 мг
Кальция пантотенат	2 мг
Фолиевая кислота	0,002 мг
Инозит	10 мг
Никотиновая кислота	0,4 мг
П-аминобензойная кислота	0,2 мг
Пиридоксина гидрохлорид	0,4 мг
Рибофлавин	0,2 мг
Тиамин	0,4 мг

Можно заменить культивирование в среде Sd2 культивированием в аналогичном объеме среды ПЕП до тех же значений оптической плотности. Состав среды ПЕП приведен в таблице 2.

Таблица 2
Состав питательной среды ПЕП
Наименование компонентов	Содержание в среде ПЕП, г/л
Пептон	20
Глюкоза	20

По окончании культивирования в среде Sd2 (либо в среде ПЕП) клетки отделяют от культуральной среды (центрифугированием или фильтрованием), причем получают, как правило, 8-12 г клеток на 1 л питательной среды. Все дальнейшие манипуляции проводят с клетками, а культуральную среду отбрасывают.

Готовят 50% суспензию клеток на буфере А с добавлением ФМСФ (фенилметилсульфонилфторида) до конечной концентрации 1 мМ. Буфер А представляет собой 0,005 М трис-HCl буферный раствор, рН 7,2.

Проводят разрушение дрожжевых клеток на дезинтеграторе Dyno Mill при температуре от 2 до 10°С и скорости вращения шнека 3000 об/мин.

Суспензию разрушенных клеток дрожжей центрифугируют при температуре 4°С и скорости вращения ротора от 4000 до 10000 об/мин.

Супернатант отбрасывают, а осадок промывают буфером А для удаления протеаз дрожжей, РНК, хромосомной и плазмидной ДНК, растворимых дрожжевых белков, после чего вновь центрифугируют при температуре 4°С и скорости вращения ротора от 4000 до 10000 об/мин. Супернатант отбрасывают. Вместо центрифугирования отделение водонерастворимой фракции дрожжей можно осуществить фильтрованием.

Полученный на этом этапе влажный осадок представляет собой один из вариантов реализации композиции по изобретению. Для терапевтического использования к нему надо добавить солюбилизатор и воду, как описано ниже. Таким образом может быть получена композиция по изобретению в жидкой форме.

Порошок, полученный из указанного осадка разрушенных клеток, высушенных любым доступным способом, например с применением лиофильной сушки, представляет собой другой вариант реализации изобретения. Для получения еще одного варианта композиции по изобретению к высушенному осадку добавляют солюбилизатор в количестве от 4 до 20% от массы сухого продукта разрушенных дрожжей, предпочтительно 12%.

Осадок разрушенных клеток может также быть обработан холодным ацетоном. При этом получают более мелкодисперсный порошок, далее не требующий растирания при его смешении с солюбилизатором.

Для проведения указанной обработки готовят 75% суспензию полученного осадка разрушенных клеток в охлажденной до 4°С воде. Для этого к 1 г осадка добавляют 0,3 мл воды. Приготовление суспензии проводят в ледяной бане.

Для проведения дальнейших манипуляций всю посуду и ацетон охлаждают до температуры от -10 до -30°С, предпочтительно -20°С. Объем охлажденного ацетона должен в 15-20 раз превышать объем суспензии клеток, предпочтительно 20.

Суспензию разрушенных дрожжевых клеток медленно вливают в ацетон и гомогенизируют в течение 5 минут.

Затем отделяют обезвоженные таким образом разрушенные дрожжевые клетки от ацетона путем вакуумной фильтрации либо путем центрифугирования при температуре от -10 до -30°С, предпочтительно -20°С, и оборотах от 2000 до 5000 об/мин.

Промывают полученный осадок разрушенных дрожжевых клеток двух-десятикратным (предпочтительно, пятикратным) объемом ацетона и вновь подвергают вакуумной фильтрации либо центрифугированию при температуре от -10 до -30°С, предпочтительно -20°С, и оборотах от 2000 до 5000 об/мин.

Осадок переносят в эмалированную емкость и высушивают в вытяжном шкафу при комнатной температуре в течение 15-30 часов, предпочтительно 18 часов.

В результате из 1 г исходных целых клеток дрожжей получают 80-160 мг мелкодисперсного порошка, содержащего водонерастворимую фракцию разрушенных клеток продуцента интерлейкина-2.

Полученный на этом этапе порошок представляет собой один из вариантов реализации композиции по изобретению. Для терапевтического использования к нему надо добавить солюбилизатор и воду.

Для получения еще одного варианта композиции по изобретению к этому порошку добавляют солюбилизатор в количестве от 4 до 20% от массы порошка, предпочтительно 12%.

Для того чтобы применять композицию, содержащую водонерастворимую фракцию в виде порошка и солюбилизатор, необходимо перемешать 100 мг полученной композиции с 5 мл воды, что соответствует дозе 4-5 млн ME ИЛ-2.

Пример 2. Моноиммунотерапия при ВИЧ-инфекции

Схема лечения

Лечение осуществлялось курсами. Каждый курс длился 5 дней и состоял из ежедневного однократного приема препарата ИЛ-2. Было проведено 4 курса с интервалом между курсами 2 месяца. Через 4 недели после каждого курса выполнялись исследования, в том числе иммунограмма, клинический и биохимический анализ крови, вирусная нагрузка ВИЧ. Первые два курса проведены с ИЛ-2 для инъекций Ронколейкин^® (Биотех, Россия), представляющих собой очищенный белок, в количестве 1 млн ME, вторые два курса с композицией по изобретению, по 20 мг композиции в 5 мл воды перорально, что соответствует дозе 1 млн ME ИЛ-2.

Пациент: Мужчина 38 лет, у которого за 4 месяца до начала лечения с применением композиции по изобретению была обнаружена ВИЧ-инфекция. Длительность заболевания неизвестна.

Перед началом лечения:

- количество CD4+ лимфоцитов В крови 418 в мкл

- вирусная нагрузка ВИЧ 41000 копий в мл

- урогенитальный хламидиоз.

Содержание CD4+ Т-лимфоцитов говорит о степени выраженности вызванного ВИЧ поражения иммунной системы, которое уже произошло. Регулярные периодические измерения уровня РНК ВИЧ в плазме крови и содержания CD4+ Т-лимфоцитов необходимы для определения риска прогрессии заболевания у ВИЧ-инфицированного.

Содержание CD4+ менее 500/мкл и вирусная нагрузка более 10000 копий/мл являются показаниями для начала антивирусной терапии при бессимтомном течении ВИЧ.

Результаты

Курс лечения пациент перенес удовлетворительно, жалоб и побочных реакций не наблюдалось. Полностью вылечена хламидийная инфекция. Субъективно чувствует увеличение трудоспособности.

Таблица 3
Динамика CD4+ и вирусной нагрузки ВИЧ
Показатель	До начала лечения	После двух курсов Ронколейкина^®	После 3 курса препарата по изобретению	После 4 курса препарата по изобретению
CD4+ (ед/мкл)	418	480	756	1066
ВИЧ (копий/мл)	41000	20000	1500	950

Имеются данные о том, что применение препаратов ИЛ-2 в ряде случаев увеличивает вирусную нагрузку. Отсутствие такого эффекта при данном лечении и даже существенное снижение вирусной нагрузки свидетельствуют о терапевтических перспективах данных препаратов.

Динамика как первого этапа лечения (с Ронколейкином^®), так и второго (с препаратом по изобретению) является хорошей.

Существенное улучшение по динамике содержания CD4+ при применении композиции по изобретению по сравнению с чистым ИЛ-2 для инъекций может быть вызвано тем, что препарат обладает дополнительной стимулирующей активностью.

Пример 3. Моноиммунотерапия при ВИЧ-инфекции

Схема лечения

Лечение осуществлялось курсами. Каждый курс длился 5 дней и состоял из 5 приемов препарата по изобретению ежедневно по 100 мг в 5 мл воды перорально, что соответствует дозе 4-5 млн ME ИЛ-2. Было проведено 2 курса с интервалом между курсами 4 месяца.

Пациент: мужчина, 25 лет, ВИЧ-инфекция с персистирующей генерализованной лимфоаденопатией.

Результаты

Через 4 недели после каждого курса снималась иммунограмма. Иммунограмма показывает относительное (процент содержания антиген-положительных клеток в субпопуляции Т-лимфоцитов крови) содержание CD3+, CD4+ и CD8+ лимфоцитов, а также иммунорегулирующий индекс, представляющий собой соотношение содержания CD4+ к CD8+ лимфоцитам.

Таблица 4
Динамика CD3+, CD4+ и CD8+ и иммунорегулирующего индекса
Показатель	В начале лечения	После 1 курса	После 2 курса	Норма
CD3+	82%	83%	82%	60-76%
CD4+	25%	31%	39%	30-46%
CD8+	52%	53%	52%	25-40%
CD4+/CD8+	0,48	0,6	0,75	1,0-1,7

Результаты иммунограммы свидетельствуют о том, что лечение привело к улучшению иммунного статуса пациента, что уменьшило восприимчивость пациента к инфекционным агентам и повысило качество жизни.

Пример 4. Лечение аллергии

Схема лечения

Курс лечения осуществлялся по следующей схеме: контакт с аллергеном производился через день, при этом в момент появления аллергической симптоматики пациент принимал композицию по изобретению 100 мг в 5 мл воды, что соответствует дозе 4-5 млн ME ИЛ-2.

1. Пациент: женщина 36 лет. В течение 12 лет страдает аллергией на пищевые продукты. Пищевая аллергия диагностирована на основании клинической картины и подкожных провокационных тестов. По PRICK-тесту установлена реакция на 8 аллергенов.

В данном испытании проводилось лечение по поводу одного аллергена - зеленого яблока. Курс лечения составлял 5 дней по указанной выше схеме, контакт с зеленым яблоком и прием композиции по изобретению был осуществлен 3 раза.

Результаты

На 15-й день после начала испытания повторен PRICK-тест. Он показал отсутствие реакции на зеленое яблоко и позитивную реакцию на 7 остальных аллергенов.

Контроль через 6 месяцев дал те же результаты.

2. Пациент: девушка 14 лет. В течение 4 лет - аллергия на шерсть кошки. Клинический диагноз установлен на основе наблюдения непосредственного контакта с кошкой.

Курс лечения составлял 5 дней.

Результаты: на 9-й день аллергических симптомов при контакте с кошкой не выявлено.

Таким образом, продемонстрировано, что композиция по изобретению обладает терапевтическим эффектом и с успехом может применяться для лечения широкого ряда заболеваний, среди которых есть и такие, которые ранее не предполагалось лечить при помощи цитокиновой терапии.

Claims

1. Иммуномодулирующая композиция для перорального введения, содержащая водонерастворимую фракцию разрушенных клеток дрожжевого продуцента гетерологичного гидрофобного белка-цитокина, солюбилизатор и воду, причем в этом продуценте был осуществлен синтез целевого гидрофобного белка-цитокина.

2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что белок-цитокин представляет собой интерлейкин-2 (ИЛ-2).

3. Композиция по п.2, отличающаяся тем, что дрожжевой продуцент представляет собой штамм Saccharomyces cerevisiae, депонированный во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером Y-791.

4. Композиция по пп.1-3, отличающаяся тем, что солюбилизатор представляет собой додецилсульфат натрия.

5. Применение водонерастворимой фракции разрушенных клеток дрожжевого продуцента гетерологичного гидрофобного белка-цитокина, причем в этом продуценте был осуществлен синтез целевого гидрофобного белка-цитокина, для приготовления иммуномодулирующей композиции по п.1.

6. Применение по п.5, причем белок-цитокин представляет собой интерлейкин-2 (ИЛ-2).

7. Применение по п.6, причем дрожжевой продуцент представляет собой штамм Saccharomyces cerevisiae, депонированный во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером Y-791.

8. Применение иммуномодулирующей композиции по п.1 для лечения иммунодефицитного состояния.

9. Применение по п.8 для лечения ВИЧ-инфекции, гепатита С или аллергии.