CN103354833B - 细菌核糖核酸细胞壁组合物及其制备和使用方法 - Google Patents

细菌核糖核酸细胞壁组合物及其制备和使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103354833B
CN103354833B CN201180059883.8A CN201180059883A CN103354833B CN 103354833 B CN103354833 B CN 103354833B CN 201180059883 A CN201180059883 A CN 201180059883A CN 103354833 B CN103354833 B CN 103354833B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mprnc
cell
compositions
mycobacterium
mycobacteria
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201180059883.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103354833A (zh
Inventor
N.C.菲利普斯
D.柯
Z.R.霍兰
M.C.菲利翁
M.埃尔拉菲
I.维尔吉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tele Star Therapy For Intellectual Property
Original Assignee
Tele Star Therapy For Intellectual Property
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tele Star Therapy For Intellectual Property filed Critical Tele Star Therapy For Intellectual Property
Priority to CN201610282359.1A priority Critical patent/CN105943559A/zh
Publication of CN103354833A publication Critical patent/CN103354833A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103354833B publication Critical patent/CN103354833B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7084—Compounds having two nucleosides or nucleotides, e.g. nicotinamide-adenine dinucleotide, flavine-adenine dinucleotide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/04—Mycobacterium, e.g. Mycobacterium tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/06—Lysis of microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/06—Lysis of microorganisms
    • C12N1/066—Lysis of microorganisms by physical methods
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55588—Adjuvants of undefined constitution
    • A61K2039/55594—Adjuvants of undefined constitution from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及新颖的含有RNA和细胞壁的细菌和分枝杆菌组合物以及制备和使用这些组合物的方法。这些组合物具有免疫刺激和抗癌活性。本发明还涉及用于培养分枝杆菌的合成培养基。

Description

细菌核糖核酸细胞壁组合物及其制备和使用方法
技术领域
本发明涉及新颖的包含细菌RNA和细菌细胞壁的组合物以及用于制备和使用这些组合物的方法。这些组合物具有免疫刺激和抗癌活性。
背景技术
癌症的治疗继续是临床和兽医医学的一个问题。目前可利用的治疗方案包括外科手术、辐射、化学疗法、免疫疗法(包括自体和异源细胞疗法)或它们的组合。
外科手术经常由于肿瘤组织未被识别和未被切除而失败。辐射和化学疗法也经常失败，并且所述治疗的副作用经常降低患者的生活质量。外科手术和化学疗法与免疫系统的显著的且经常非特异性的抑制有关(Hammer等人，Eur.Surg.Res.，1992 24：133-137；Joos和Tam，Proc.Am.Thorac.Soc.，2005 2：445-448)。这种免疫抑制经常与机会性感染的发生有关，正如接受高剂量全身辐照的个体中已知的高传染性并发症比率所证实的(Gil等人，Infection，2007 35：421-427)。辐射、外科手术和化学疗法另外与多谱系造血的和骨髓的抑制(骨髓抑制)有关，例如，但不限于，白细胞减少症、嗜中性粒细胞减少症、血小板减少症和/或贫血(Montoya.J.Infus.Nurs.2007 30：168-172)。这些病症对于患者而言可能是危及生命的。化学疗法经常由于抗性的存在或随后形成而失效，所述抗性经常可以跨不同种类的药物(多药抗药性)。
癌症的免疫疗法已经使用了许多年。首选的免疫治疗之一是混合的细菌疫苗(Coley氏疫苗)，其活性成分是细菌脂多糖。应当指出，由于脂多糖的不希望的且经常有毒的效应，管理机构努力限制或消除脂多糖在药剂中的存在。近年来，被辐照过的恶性黑素瘤细胞的混合物已经用于在具有恶性黑素瘤的患者中诱导免疫应答，这增加了几位患者的存活期(Morton，等人.Ann.Surg.1992，216：463-482)。由免疫治疗(免疫疗法)提供的一个重大益处是，它通常不伴有外科手术、辐射或化学疗法的副作用。在3项在癌症患者中使用树突细胞免疫疗法的研究中，报告了极微 小的副作用至没有副作用(Hsu，等人.NatureMedicine，1996 2：52-58；Murphy，等人。The Prostate，1996 29：371-380；Nestle，等人.Nature Medicine，1998，4(3)：328-332)。
已知分枝杆菌细胞壁会刺激宿主免疫防御机制(先天性防御机制，通过与病原体相关分子模式受体(PAMP)的相互作用；和获得性防御机制，通过免疫原性的分子物质的存在)。使用完整的、存活的分枝杆菌的免疫疗法在临床上被用于治疗膀胱癌。将分枝杆菌卡介苗(BCG)(即一种减毒的牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)菌株)重复滴注进具有膀胱癌的个体的膀胱中，在可能且优选的情况下，在通过外科手术切除肿瘤以后在佐剂环境中(如例如欧洲泌尿科学会指南(European Association of Urology Guidelines)2007版第8-9页所述)。但是，它的应用伴有用它的存活性质有关的许多不利副作用(Koya，等人.J.Urology 2006，175：2004-2010)，以及经常较低的临床效力和应答持续时间比率，特别是在经历治疗复发的患者中(Witjes和Hendricksen.Eur.Urol.2008，53：24-26)。它的用于治疗其它癌症的用途被禁止，因为它含有活分枝杆菌，且可以引起致命的全身性感染(Orifice，等人.Tumori 1978，64：437-443)。已经使用分枝杆菌牝牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae)尝试了使用完整的、但是灭活的分枝杆菌的癌症免疫疗法，但是迄今为止尚未在临床研究中鉴别出在使用它以后确定的长期存活(参见Stanford等人，Eur.J.Cancer 2008，44：224-227)。显然，完整分枝杆菌(不论存活的还是灭活的)不代表用于癌症治疗的最有效形式的免疫疗法。
已经在动物肿瘤模型中、在癌症患者中(美国专利号4,503,048，5,759,554和6,326,357)，并且作为诸如细菌和病毒感染等感染性疾病的治疗(美国专利号3,172,815和4,744,984)，充分评价了利用细菌细胞壁和细菌提取物的免疫疗法。
具有免疫刺激和抗癌活性的分枝杆菌细胞壁组合物(例如如在美国专利号.4,503,048，5,759,554，6,329,347和/或在Ribi等人，J.Bacteriol.中所述1965，91：975-983)具有下述缺点：它们的制备需要生物试剂和材料、化学试剂、溶剂或稀释剂和酶处理，具有有害的化学试剂和外来蛋白污染的潜力。此外，已经报道，为了得到最佳的抗癌活性，需要作为油乳状液的高纯度的分枝杆菌细胞壁(主要由充分的化学和酶处理以后剩下的细胞壁骨架组成)制剂(Yarkoni和Rapp，Cancer Res.，1979 39：535-7)。含有分枝杆菌细胞壁的油乳状液经常是物理上不稳定的，且难以再现地制备，并且可以对受体是有毒的(因为众所周知的诱发超敏反应的潜力)。还已经描述了含有生物活性的复合DNA的分枝杆菌细胞壁，其具有免疫治疗和抗癌活性，并且其不依赖于油的存在(美国专利号6,326,357)，但是这些仍然具有下述缺点：它们的制备需要化学和酶处理，具有有害的化学试剂和外来蛋白污染的潜力。另外，使用这样的组合物，尚未证实可能优先地优化免疫治疗活性或抗癌活性。
本领域技术人员认识到，使用小样品体积和在40,000-45,000磅/平方英寸(PSI，等于276-317mpa)(参见Ribi等人，J.Bacterial.，1966，91：975-983)高压的冷却的压力盒(诸如Sorvall压力盒)，可以实现微生物的裂解。这样的方法耗时、低效且具有小体积，并且另外受到这类设备的当前不能利用性的阻碍。已经描述了使用高压均质化的更有效的方法用于从遗传工程改造的微生物中分离蛋白(作为包涵体)(参见Peternel和Komel：Isolation of biologically active nanomaterial[inclusion bodies]from bacterialcells.Microbial Cell Factories 2010 9：66)。但是，本领域技术人员公知，革兰氏阳性生物由于它们的肽聚糖含量和结构而对这样的方法具有抗性(参见Diels和Michaels：Highpressure homogenization as a non-thermal technique for the inactivation ofmicroorganisms.Crit.Rev.Microbiol.，2006；32：201-216)。本领域技术人员也教导了使均质化循环数目最小化的技术的应用(参见Bailey等人，Improved homogenization ofrecombinant Escherichia coli following pretreatment with guanidiniumchloride：Biotech.Prog.，1995；11：533-539)。这样的操作的应用实际上明显地是用于除去细胞壁碎片，而不是保留它们。使用高压破碎技术时，诸如DNA等核酸的存在被另外教导为要除去(而不是保留)的污染物(参见Rathore等人，Analysis for residual host cellproteins and DNA in process streams of a recombinant protein productexpressed in Escherichia coli cells：J.Pharm.Biomed.Anal.，2003；32：1199-1211)。需要这样的用于制备新细菌核酸组合物的新操作：其使用在几mL至几升体积范围内的可缩放的工作体积，并导致新的细菌核酸和细胞壁组合物的有效生产。
已知的是，分枝杆菌细胞壁及其组分可以刺激和活化巨噬细胞、单核细胞和树突细胞以产生生物活性分子，所述生物活性分子可以引起、加速、放大和刺激免疫系统的应答细胞，从而实现免疫刺激效应。这些 生物活性分子包括，但不限于：造血和骨髓生长因子、细胞因子和趋化因子。
生长因子是结合细胞表面上的受体的蛋白，主要结果是活化细胞的增殖和/或分化。细胞因子是一个独特的调节蛋白家族。主要从免疫系统的细胞(诸如但不限于白细胞)分泌、并充当细胞间介质的细胞因子会刺激体液和细胞免疫应答以及吞噬细胞的活化。从淋巴细胞分泌的细胞因子被称作淋巴因子，而由单核细胞或巨噬细胞分泌的细胞因子被称作单核因子。许多淋巴因子也被称作白介素(IL)，因为它们不仅由白细胞分泌，而且能够影响白细胞的细胞应答。趋化因子是这样的一类细胞因子：其具有吸引和活化白细胞的能力，特别是响应于感染(一个被称作趋化性的过程)。根据共有半胱氨酸基序中的变异，可以将它们分成至少3个结构分支：c(趋化因子、c)、cc(趋化因子、cc)和cxc(趋化因子，cxc)(Johrer等人.Exp.Opin.Biol.Ther.2008 8：269-290.)。化学治疗剂或辐射疗法对负责产生这些造血和骨髓生长因子、细胞因子和趋化因子的免疫系统细胞的生产的有害影响，会导致增加的机会性感染的易感性。
癌症(其中存在超过100种疾病)是非典型细胞的异常净积累，其源自失控的细胞分裂、细胞凋亡的缺乏或缺陷、或前述二者的组合。细胞凋亡相关基因(例如，但不限于，Fas、TNFR1和p53/p21)中的突变已经各自涉入癌症的发病机制(Levine，A.Cell88：323-331，1997；Fisher，D.Cell 78：529-542，1994)。异常的细胞凋亡不仅对于癌症的发病机制而言是重要的，而且对于癌症对许多抗癌疗法的抗性的可能性而言也是重要的。
对细胞凋亡诱导的抗性已经作为重要的多药抗药性(MDR)种类而出现，其可能解释高比例的治疗失败。MDR(同时对结构上和功能上无关的化学治疗剂类别的抗性)可以是先天性的和获得性的。也就是说，有些癌症从不对治疗做出应答，而其它癌症(最初对治疗敏感的)随后通过抗性克隆的选择而形成抗药性。由于化学治疗剂的治疗效果主要依赖于在癌细胞中诱导细胞凋亡，抗药性(其会降低化学治疗剂的有效性)会直接地或间接地导致减少的细胞凋亡，且通常与多种癌症的临床预后不良有关。
已经证实，现有技术的抗癌剂对于临床应用而言是不充分的。这些药剂中的许多是无效的(Bischoff等人.Science274：373-376，1996)或有毒 的，具有显著的副作用(Lamm等人.Journal of Urology 153：1444-1450，1995)，导致抗药性或免疫致敏和超敏反应的形成，并弱化受体。
因此，需要这样的新颖的治疗性组合物：其刺激免疫系统的应答细胞以产生细胞因子、趋化因子和造血和骨髓生长因子，抑制癌细胞的增殖，并诱导癌细胞的细胞凋亡。这些治疗性组合物应当自身可用作抗癌剂，以及就其它抗癌剂而言具有佐剂活性。该治疗性组合物应当可用于预防或治疗与癌症、外科手术、辐射或化学疗法有关的骨髓抑制。此外，这样的治疗性组合物应当可简单地且相对廉价地制备，它的活性应当在制品之间是可再现的，它的活性应当随时间保持稳定，并且它对癌细胞的作用应当可用具有最小不利反应性和毒性的给药方案来实现。另外，需要制备新颖的治疗性组合物的方法，所述组合物是有效的，且不会导致在它们的制备中使用的酶或化学试剂的存在。
还需要新颖的治疗性组合物，其治疗、预防、减轻或改善自身免疫障碍、炎症性或传染性疾病、骨髓抑制或造血和骨髓异常。所述治疗性组合物应当可与其它治疗剂一起用作佐剂。此外，这样的治疗性组合物应当可简单地且相对廉价地制备，它的活性应当在制品之间是可再现的，它的活性应当随时间保持稳定，并且它的作用应当可用具有最小毒性的给药方案来实现。
发明内容
本发明通过提供新颖组合物满足了上述要求，所述组合物包含源自细菌或分枝杆菌的核糖核酸(RNA)和细胞壁(在本文中定义为RNC)。本发明通过提供包含细菌核糖核酸(RNA)和细菌细胞壁(定义为BRNC)的新颖组合物和制备和使用这些组合物的方法满足了上述要求。本发明还通过提供包含分枝杆菌RNA和分枝杆菌细胞壁(定义为MRNC)的新颖组合物和制备和使用这些组合物的方法满足了上述要求。这些新颖组合物包含：分离自细菌或分枝杆菌的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸形式的细菌或分枝杆菌RNA和细菌或分枝杆菌细胞壁，其中所述RNA可以作为单链(ss)、双链(ds)或单链-双链杂合链(hs)存在，其中所述RNA配制在药学上可接受的媒介物中或与药学上可接受的载体系统复合(其中术语复合用于描述2种或更多种分子物质的化学结合)。尽管可以使用本领域技术人员已知的药用载体系统，在一个实施方案中，所述载体系统是 基于细菌细胞壁或分枝杆菌细胞壁。本发明的组合物还可以含有完整的细菌或分枝杆菌细胞，其含量针对期望的治疗目的进行选择。
本发明的组合物具有抗癌活性。本发明的组合物也含有免疫系统刺激活性。本发明的组合物也可作为其它治疗方式的佐剂。
在本申请中使用3种不同的名称来描述这些新颖组合物。首先，术语细菌RNA组合物(BRNC)通常用于描述由不同的细菌物种制成的组合物。BRNC可以用本文公开的方法从不同的革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌制备。其次，术语分枝杆菌RNA组合物(MRNC)用于描述由不同的分枝杆菌制成的组合物。在不同的实施方案中，MRNC可以从任何分枝杆菌制备。第三，在其它实施方案中，使用具体的分枝杆菌种、分枝杆菌复合物或分枝杆菌菌株来制备MRNC。这些的例子是，但不限于：鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)(包括副结核亚种，通常称作MAP)、牛分枝杆菌BCG(Mycobacterium bovis BCG)、草分枝杆菌(Mycobacteriumphlei)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)或牝牛分枝杆菌(Mycobacteriumvaccae)，利用本文公开的方法。本领域技术人员会认识到，制备本文所述的组合物的方法可用于从除了在详细描述和实施例中描述的那些以外的分枝杆菌制备MRNC。
术语分枝杆菌RNA组合物(MpRNC)用于描述包含从草分枝杆菌制备的RNA和细胞壁的组合物。术语牛分枝杆菌菌株BCG RNA组合物(MbRNC)、耻垢分枝杆菌RNA组合物(MsRNC)、鸟分枝杆菌副结核亚种(MAP)RNA组合物(MapRNC)和牝牛分枝杆菌RNA组合物(MvRNC)分别用于描述包含从牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种和牝牛分枝杆菌制备的RNA和细胞壁的组合物。在每种组合物MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC中，使用导致寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸的有效产生的操作，从分枝杆菌分离出RNA。
在另一个实施方案中，每种MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC还可以含有不同量的完整分枝杆菌细胞。完整细胞可以以下述量存在于MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC中：按重量计大约0-99％，0.05-95％，0.07-50％，0.1-20％或0.19-19％的量，或在这些范围中的任一个内的量，或按重量计小于或0.75％小于0.2％。
在另一个实施方案中，这些新颖组合物具有一定含量(其可以在总核酸含量的大约30％至100％范围内)的2-4000个碱基长度的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸形式的RNA。在另一个实施方案中，这些新颖组合物具有一定含量(总核酸含量的大约30-100％)的2-150个碱基长度的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸形式的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸。在另一个实施方案中，这些新颖组合物具有一定含量(总核酸含量的大约30-100％)的大于150或151-4000个碱基长度的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸形式的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸。在另一个实施方案中，这些新颖组合物具有一定含量(总核酸含量的大约30-100％)的主要是20-40个碱基长度的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸形式的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸。
当存在最小含量的完整分枝杆菌细胞时，本发明的组合物的抗癌活性最大化。当存在5-50％w/w范围内的完整分枝杆菌细胞含量时，免疫刺激活性最大化。通过控制在实施例中详述的制备方法，或通过向MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC中添加完整的分枝杆菌、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌细胞，可以实现期望的完整的分枝杆菌、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌细胞的含量。MRNC可以作为从一种分枝杆菌种、菌株、亚株或复合物制备的组合物单独使用，或者与得自其它分枝杆菌种、菌株、亚株或复合物的MRNC联合使用。例如，MpRNC和MvRNC的组合将产生免疫刺激和细胞因子诱导的最佳NOD2和TLR2活化。类似地，MpRNC和MvRNC的组合将产生最佳抗癌活性和免疫刺激。
这些新组合物具有免疫刺激活性、抗癌活性和造血的和骨髓的干细胞生长因子刺激活性。与现有技术制品不同，这些新组合物含有寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸(诸如但不限于单链(ss)、双链(ds)或它们的混合物)，且含有适用于预期用途的水平的完整分枝杆菌。并且，与现有技术不同，在需要合成试剂的组合(参见Uehara等人，Muramyldipeptideand diaminopimelic acid-containing desmuramylpeptides in combination withchemically synthesized Toll-like receptor agonists synergistically inducedproduction of interleukin-8 in a NOD2-and NOD-dependent manner，respectively，in human monocytic cells in culture：Cell.Microbiol.，2005；7：53-61)的情况下，这些新组合物具有活化核苷酸结合寡聚化结构域2(NOD2)和Toll-样受体2(TLR2)受体的能力，从而证实了对免疫系统受体的意外的双功能激动剂活性，其可用于在预防性或治疗性处理方案中刺激免疫系统、刺激造血干细胞和骨髓干细胞增殖以及治疗癌症。在不同的实施方案中，这些组合物可有效地诱导动物的免疫系统的应答细胞的应答、诱导细胞周期停滞或细胞凋亡以及抑制细胞增殖。这些组合物会诱导免疫系统的应答细胞产生细胞因子、趋化因子以及造血干细胞和骨髓干细胞生长因子。
MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC可相对廉价地制备，并且它们的活性可在制品中再现。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC随时间保持稳定且有效，且在具有最小毒性的给药方案。
在本发明的一个实施方案中，MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC分别如下从分枝杆菌或草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌制备：培养并收获所述分枝杆菌。通过利用高压均质化，破碎分枝杆菌以根据需要除去完整分枝杆菌，随后进行离心过程以根据需要消除任何残余的完整分枝杆菌细胞。重要的是，使用无RNA酶的和/或非特异性的无核酸酶的试剂来优化RNC的回收。
根据需要使用低相对离心力来除去完整分枝杆菌。然后可以使用常规萃取技术(例如硫氰酸胍-苯酚-氯仿萃取)分离出寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸，或者在除去完整分枝杆菌以后对上清液施加高相对离心力，以分离出在细胞破碎以后仍然与分枝杆菌细胞壁混合在一起的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸。重要的是，使用不含核酸酶污染(非特异性的内切和外切核酸酶或核糖核酸酶)的试剂来消除或最小化RNA降解，并由此优化制备步骤中的产量。
在预防、治疗和消除多种疾病和减轻疾病的影响中，MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC是有效的治疗剂，所述疾病包括、但不限于，恶性的、自身免疫性和免疫缺陷性疾病、骨髓抑制和造血和骨髓异常。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC特别适用于治疗由不希望的和失控的细胞增殖介导的疾病和过程，诸如癌症。这些组合物还可作为佐剂有效地增强其它抗癌剂的有 效性。这样的抗癌剂包括，但不限于：药物、免疫刺激物、抗原、抗体、疫苗、辐射、化学治疗剂、基因试剂、生物学上工程改造的试剂和化学合成的试剂、以及靶向细胞死亡分子进行活化或灭活的试剂、抑制癌细胞增殖的试剂和诱导癌细胞的细胞凋亡的试剂。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC还可有效地用于预防或治疗与癌症治疗有关的骨髓抑制(单核细胞减少症和/或嗜中性粒细胞减少症)或癌症本身，以及用于预防或治疗与药物治疗或疾病有关的不同的造血和骨髓异常，所述疾病例如、但不限于获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、骨髓增生异常综合征、自身免疫疾病、终末期肾疾病或病毒感染。
在药学上可接受的载体中的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC可以以有效地刺激免疫系统的应答细胞的应答、和抑制应答细胞的增殖、和诱导应答细胞的细胞凋亡的剂量施用给动物或人。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC可以通过下述方法施用：包括、但不限于，悬浮在水性制剂中、在乳膏剂和凝胶中，通过在油或其它疏水的液体制剂中乳化，包封在脂质体中，和与天然的或人工的载体、与组织-或细胞-特异性的配体、或与组织-或细胞-特异性的抗体形成复合物。
在一个实施方案中，本发明提供了包含BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC的新颖组合物和制备这些组合物的方法。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于制备BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC组合物的新颖制备方法，所述方法优化用于制备分枝杆菌细胞群的培养基中的碳源、氮源和铁源的含量。
在另一个实施方案中，本发明提供了可用于培养分枝杆菌细胞群的新颖合成培养基。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于制备BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC组合物的新颖制备方法，所述方法优化培养基中的碳、氮和铁的含量，并消除对用于制备分枝杆菌细胞群的外源性生物材料的需求，并消除外源性生物试剂或化学试剂在下游制备方法中的应用。
在另一个实施方案中，本发明提供了在药学上可接受的载体中的新 颖的治疗性的BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC的治疗性组合物以及使用这些治疗性组合物诱导动物或人的应答细胞的治疗应答的方法。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种通过给动物或人施用这些治疗性组合物来刺激免疫系统的应答细胞的方法。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种通过给动物或人施用这些治疗性组合物来刺激免疫系统的应答细胞产生生物活性分子(诸如细胞因子、趋化因子、白介素和/或造血和骨髓生长因子)的方法。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种通过给动物或人施用这些治疗性组合物来有效地治疗动物或人的疾病的方法。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种通过给动物或人施用这些治疗性组合物来有效地治疗动物或人的癌症的方法。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物和方法，其抑制动物的应答细胞的增殖。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物和方法，其诱导动物的应答细胞的细胞凋亡。
在另一个实施方案中，本发明提供了组合物和方法，其可有效地用作其它抗癌疗法的佐剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物和方法，其可有效地用作其它免疫刺激疗法的佐剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物和方法，其可有效地用于治疗免疫缺陷疾病。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物和方法，其可有效地用于预防或治疗骨髓抑制(白细胞减少症、嗜中性粒细胞减少症、血小板减少症或贫血)或造血和骨髓异常。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物和方法，其可有效地用作用于预防或治疗骨髓抑制或造血和骨髓异常的其它疗法的佐剂。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种通过给动物或人施用这些治疗性组合物来有效地治疗动物或人的自身免疫病的方法。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种制备方法，其不会导致化 学试剂或酶在组合物中的存在。
在阅读公开的实施方案的下述详细描述和所附权利要求书以后，将会明白本发明的这些和其它目的、特征和优点。
附图说明
图1。草分枝杆菌(1a)、MCWE(1b)、MCC(1c)、MpRNC低(1d)、MpRNC中间(1e)和MpRNC高(1f)的透射电子显微照片(TEM)。条是1μm(对于1a、1b和1c)和2μm(对于1d、1e和1f)。
图2。核酸寡核苷酸长度的电泳分析。2a.使用RNA纳米6000试剂盒，在高压灭菌之前的RNA梯标准品和MpRNC中间。2b.使用小RNA试剂盒在高压灭菌以后含有不同比例的高压灭菌的草分枝杆菌细胞的MpRNC(MpRNC高-、MpRNC低-或/和MpRNC中间-)(在4个核苷酸处的峰是内部寡核苷酸标准品，且与MpRNC中的核酸无关。FU＝荧光单位，nt＝核苷酸长度
图3。在RNA酶-A处理之前和之后测得的含有不同比例的高压灭菌的完整草分枝杆菌细胞(3a高-、3b低-或3c中间)和高压灭菌的草分枝杆菌(3d)的MpRNC的RNA和DNA含量。
图4。在MpRNC、MbRNC、MsRNC和MvRNC中的RNA酶敏感的核酸(NA)。4a：提取的对照处理的和RNA酶处理的核酸的脲-PAGE凝胶电泳；4b：通过扫描密度测定法测得的提取的核酸中的RNA的比例。
图5。MpRNC中间的分枝菌酸谱。5a：使用用于定量可提取脂类的山嵛酸标准品得到的分枝菌酸谱；5b：使用用于定量可皂化脂类的低和高分枝菌酸碳数标准品(估测为～C40和～C110)得到的分枝菌酸谱。
图6。分枝杆菌RNC的NOD2活化。使用表达NOD2的HEK293细胞确定从4种分枝杆菌种(草分枝杆菌、牛分枝杆菌菌株BCG、耻垢分枝杆菌和牝牛分枝杆菌)制备的RNC的NOD2激动剂活性。NOD2活化导致NF-κB-驱动的分泌型胚性碱性磷酸酶(SEAP)诱导。在用细胞培养上清液中的SEAP水解底物以后，将酶活性表达为在630nm的O.D.，且与NOD2活化成比例。一式三份测定的平均值±。
图7。分枝杆菌RNC的TLR2活化。使用表达TLR2受体的HEK293细胞确定从4种分枝杆菌种(草分枝杆菌、牛分枝杆菌菌株BCG、耻垢 分枝杆菌和牝牛分枝杆菌)制备的MRNC的TLR2激动剂活性。TLR2活化导致NF-κB-驱动的SEAP诱导。在用细胞培养上清液中的SEAP水解底物以后，将酶活性表达为在630nm的O.D.，且与NOD2活化成比例。一式三份测定的平均值±。
图8。含有不同比例的高压灭菌的完整草分枝杆菌的MpRNC中间对人外周血单核细胞(PBMC)中的IL-10和IL-12产生的刺激。通过ELISA测定在用MpRNC和高压灭菌的草分枝杆菌处理以后由人PBMC产生的IL-10和IL-12p40亚基。
具体实施方式
本发明提供了新颖组合物，其包含源自细菌或分枝杆菌的核糖核酸(RNA)和细胞壁(在本文中定义为RNC)。本发明提供了包含细菌RNA和细菌细胞壁的新颖组合物(定义为BRNC)以及制备和使用这些组合物的方法。本发明也提供了包含分枝杆菌RNA和分枝杆菌细胞壁的新颖组合物(定义为MRNC)以及制备和使用这些组合物的方法。这些组合物可以与载体和/或细胞一起配制。这些新颖组合物包含得自细菌或分枝杆菌的细胞壁以及得自细菌或分枝杆菌RNA的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸形式的RNA，其中所述寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸可以作为单链(ss)、双链(ds)或单链-双链杂合链(hs)存在。这些组合物可以在药学上可接受的媒介物中配制或与药学上可接受的载体系统复合(其中术语复合用于描述2种或更多种分子物质的化学结合)。本发明的组合物还可以含有完整的细菌或分枝杆菌细胞，其含量针对期望的治疗目的进行优化。
这些新组合物具有免疫刺激活性、抗癌活性和造血的和骨髓的干细胞生长因子刺激活性。与现有技术制品不同，这些新组合物含有寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸(诸如但不限于单链(ss)、双链(ds)或它们的混合物)，并且任选地含有适用于预期用途的选定水平的完整分枝杆菌。并且，与现有技术不同，在需要合成试剂的组合(参见Uehara等人，Muramyldipeptide and diaminopimelic acid-containing desmuramylpeptides incombination with chemically synthesized Toll-like receptor agonistssynergistically induced production of interleukin-8 in a NOD2-and NOD-dependent manner，respectively，in human monocytic cells in culture：Cell.Microbiol.，2005；7：53-61)的情况下，这些新组合物 具有活化核苷酸结合寡聚化结构域2(NOD2)和Toll-样受体2(TLR2)受体的能力，从而证实了对免疫系统受体的意外的双功能激动剂活性，其可用于在预防性或治疗性处理方案中刺激免疫系统、刺激造血干细胞和骨髓干细胞增殖以及治疗癌症。在不同的实施方案中，这些组合物可有效地诱导动物的免疫系统的应答细胞的应答、诱导细胞周期停滞或细胞凋亡以及抑制细胞增殖。这些组合物会诱导免疫系统的应答细胞产生细胞因子、趋化因子以及造血干细胞和骨髓干细胞生长因子。
在预防、治疗和消除多种疾病和减轻疾病的影响中，MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC是有效的治疗剂，所述疾病包括、但不限于，恶性的、自身免疫性和免疫缺陷性疾病、骨髓抑制和造血和骨髓异常。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC特别适用于治疗由不希望的和失控的细胞增殖介导的疾病和过程，诸如癌症。这些组合物还可作为佐剂有效地增强其它抗癌剂的有效性。这样的抗癌剂包括，但不限于：药物、免疫刺激物、抗原、抗体、疫苗、辐射、化学治疗剂、基因试剂、生物学上工程改造的试剂和化学合成的试剂、以及靶向细胞死亡分子进行活化或灭活的试剂、抑制癌细胞增殖的试剂和诱导癌细胞的细胞凋亡的试剂。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC还可有效地用于预防或治疗与癌症治疗有关的骨髓抑制(单核细胞减少症和/或嗜中性粒细胞减少症)或癌症本身，以及用于预防或治疗与药物治疗或疾病有关的不同的造血和骨髓异常，所述疾病例如、但不限于获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、骨髓增生异常综合征、自身免疫疾病、终末期肾疾病或病毒感染。
在药学上可接受的载体中的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC可以以有效地刺激免疫系统的应答细胞的应答、和抑制应答细胞的增殖、和诱导应答细胞的细胞凋亡的剂量施用给动物或人。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC可以通过下述方法施用：包括、但不限于，悬浮在水性制剂中、在乳膏剂和凝胶中，通过在油或其它疏水的液体制剂中乳化，包封在脂质体中，和与天然的或人工的载体、与组织-或细胞-特异性的配体、或与组织-或细胞-特异性的抗体形成复合物。
定义
术语制备方法的优化用于描述这样的过程：其中获得分枝杆菌细胞群的发酵利用培养基，所述培养基中存在适当的碳、氮和铁含量，从而导致提高的分枝杆菌细胞群产量。
术语制备方法的优化也表示，在分枝杆菌细胞壁组合物的制备中，消除对化学试剂或酶的应用的需求。
在本申请中使用3种不同的名称来描述这些新颖组合物。首先，术语细菌RNA组合物(BRNC)通常用于描述由不同的细菌物种制成的组合物。BRNC可以用本文公开的方法从不同的革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌制备。其次，术语分枝杆菌RNA组合物(MRNC)用于描述由不同的分枝杆菌制成的组合物。在不同的实施方案中，MRNC可以从任何分枝杆菌制备。第三，在其它实施方案中，使用具体的分枝杆菌种、分枝杆菌复合物或分枝杆菌菌株来制备MRNC。这些的例子是，但不限于：鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)(包括副结核亚种，通常称作MAP)、牛分枝杆菌BCG(Mycobacterium bovis BCG)、草分枝杆菌(Mycobacteriumphlei)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)或牝牛分枝杆菌(Mycobacteriumvaccae)，利用本文公开的方法。本领域技术人员会认识到，制备本文所述的组合物的方法可用于从除了在详细描述和实施例中描述的那些以外的分枝杆菌制备MRNC。
术语分枝杆菌RNA组合物(MpRNC)用于描述包含从草分枝杆菌制备的RNA和细胞壁的组合物。术语牛分枝杆菌菌株BCG RNA组合物(MbRNC)、耻垢分枝杆菌RNA组合物(MsRNC)、鸟分枝杆菌副结核亚种(MAP)RNA组合物(MapRNC)和牝牛分枝杆菌RNA组合物(MvRNC)分别用于描述包含从牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种和牝牛分枝杆菌制备的RNA和细胞壁的组合物。在每种组合物MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC中，使用导致寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸的有效产生的操作，从分枝杆菌分离出RNA。
术语分枝杆菌RNA组合物(MRNC)用于描述由不同的分枝杆菌制成的组合物。在不同的实施方案中，MRNC可以从任何分枝杆菌制备。在其它实施方案中，使用具体的分枝杆菌种、分枝杆菌复合物或分枝杆菌菌株来制备MRNC。这些的例子是，但不限于：鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)(包括副结核亚种，通常称作MAP)、牛分枝杆 菌BCG(Mycobacterium bovis BCG)、草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)或牝牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae)，利用本文公开的方法。本领域技术人员会认识到，制备本文所述的组合物的方法可用于从除了在详细描述和实施例中描述的那些以外的分枝杆菌制备细胞壁组合物。
术语草分枝杆菌RNA组合物(MpRNC)用于描述从草分枝杆菌制成的组合物。术语牛分枝杆菌菌株BCG RNA组合物(MbRNC)、耻垢分枝杆菌RNA组合物(MsRNC)、鸟分枝杆菌副结核亚种(MAP)RNA组合物(MapRNC)和牝牛分枝杆菌RNA组合物(MvRNC)分别用于描述从牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种和牝牛分枝杆菌制成的组合物。在每种组合物MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC中，使用导致寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸的有效产生的操作，从分枝杆菌分离出RNA。
如本文所定义的，分枝杆菌培养基组合物(MCMC)表示含有优化的碳源、氮源和铁源的新颖的合成培养基，其用于制备分枝杆菌细胞群，且其中所述培养基的碳、氮和铁含量使得存在最佳的碳利用和最佳的分枝杆菌湿细胞群产量。
如本文所定义的，培养表示产生分枝杆菌细胞群的过程，其中在培养基中培养分枝杆菌，所述培养基优化过碳、氮和铁含量但不限于此，以确保细菌或分枝杆菌的最佳分裂。可以使用的设备和培养条件是本领域技术人员已知的。
如本文所定义的，下游处理或制备表示这样的过程：收获通过培养制备的分枝杆菌细胞群，通过使用高压均质化、差速离心和热处理的适当组合，制备含有RNA的组合物或含有RNA的细胞壁组合物。可以使用本领域技术人员已知的能够实现高压均质化的技术，而不脱离本发明的范围或教导。
如本文所定义的，细菌细胞壁表示得自含有细胞壁分子组分的细菌界成员的细胞壁，且其中这些分子至少包含多糖和含有丙氨酸(ALA)的肽链，二者共同称作肽聚糖。
如本文所定义的，分枝杆菌细胞壁表示从至少含有肽聚糖和分枝菌酸的分枝杆菌科和分枝杆菌属的成员制备的任意细胞壁组合物，且其中所述肽聚糖由聚合物组成，所述聚合物由[N-乙酰基葡糖胺-N-酰基胞壁 酸]n的重复单位组成，其中N-酰基是N-乙酰基或N-羟乙酰基，且其中所述聚合链通过肽桥相连，且其中所述分枝菌酸是α-取代的β-羟基化的极长链脂肪酸。这些肽桥的确切氨基酸组成在不同的分枝杆菌种和它们的菌株之间是高度保守的，且是本领域技术人员已知的，但是经常包括二氨基庚二酸(DAP)，并且在已知的范围内，总是包括通过乳酸部分与N-酰基胞壁酸相连的丙氨酸(ALA)。分枝菌酸的类型是对各个分枝杆菌种特异性的，并根据分子的长度(范围为～60-90个碳原子)细分成簇。
如本文所定义的，外源性污染表示任何外源物的存在，所述外源物包括、但不限于蛋白、生化制品或化学试剂，其常规地用于制备细菌-或分枝杆菌-衍生的组合物(包括制备细菌或分枝杆菌细胞生物质和细菌或分枝杆菌细胞壁组合物)。与以前的制备细菌和分枝杆菌细胞壁组合物的方法不同，用本发明的方法制备的与RNC组合物有关的细菌和分枝杆菌蛋白被保留，因为没有外源性蛋白水解酶处理。与以前的制备细菌和分枝杆菌细胞壁组合物的方法不同，所述细菌和分枝杆菌细胞壁脂类被保留，因为没有外源性去脂质化溶剂处理。
如本文所定义的，术语制备表示用于分离RNC的过程，其中破碎完整的细菌或分枝杆菌细胞以形成细胞壁碎片，且其中然后将这样的碎片与RNA组合地分离，以得到细菌或分枝杆菌细胞壁RNC。
如本文所定义的，术语寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸分别是指，从细菌、分枝杆菌、草分枝杆菌、牛分枝杆菌菌株BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌得到的2至大约20个碱基或20至大约4000个碱基长度的RNA分子。RNA与细菌或分枝杆菌细胞壁一起被定义为RNC。所述RNA可以由单链(ss)、双链(ds)、单链-双链杂合链(hs)组成，且所述RNA得自细菌，更优选地得自分枝杆菌，最优选地得自草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌。所述RNC可以包含一种或多种得自不同的细菌或分枝杆菌的RNC，且可以另外包含得自不同的细菌或分枝杆菌的完整细胞。还可以使用得自一种或多种细菌或分枝杆菌的细胞壁配制RNC。
如本文所定义的，细菌或分枝杆菌的高压均质化表示这样的过程：其中使完整的细菌或分枝杆菌在水性赋形剂中的悬浮液在压力下穿过阀门中的建立高湍流和剪切力条件的微小缝隙，这会造成细菌或分枝杆菌裂解成细胞壁碎片并释放出细胞质组分，包括蛋白质和脂质。
如本文所定义的，低速离心表示足以沉淀未破碎的细菌或分枝杆菌的相对离心力(RCF)。
如本文所定义的，高速离心表示足以沉淀细菌或分枝杆菌细胞壁RNC的相对离心力。
如本文所定义的，免疫刺激表示刺激先天性和/或获得性免疫系统，从而引起免疫应答。该免疫应答可以包括、但不限于下述的一种或多种：免疫细胞分化和分裂、Toll-样受体的活化、NOD受体的活化、除了Toll-样或NOD以外的受体的活化、趋化因子和细胞因子合成的诱导、生长因子合成的诱导、增加的细胞表面标志物表达、减少的细胞表面标志物表达、杀细胞活性或细胞毒性活性的活化、抗体产生的刺激或细胞介导的免疫的刺激。
如本文所定义的，抗癌活性表示，导致癌细胞的抑制和/或死亡的任何过程。这样的抗癌活性可以是对癌细胞靶标的直接作用的结果，或者是由免疫系统的刺激引起的间接作用的结果。
在本申请中，术语动物包括人。
在本申请中，术语产生是指合成和/或释放。
用于培养分枝杆菌的新颖组合物
本发明提供了用于培养分枝杆菌的新颖培养基，其含有优化水平和比例的碳、氮和铁，用于以适时的方式产生分枝杆菌细胞群。这些新颖培养基利用有机氮源或无机氮源，并提供这样的操作：其中额外的碳、氮和铁可以在一个分子内提供。这些新颖培养基不需要添加外源性蛋白诸如牛白蛋白或过氧化氢酶就可有效地生产分枝杆菌细胞群。
在一个实施方案中，所述优化的氮通过添加无机铵盐(包括、但不限于硫酸铵)来提供。所述优化的碳通过添加有机分子来提供，所述有机分子包括、但不限于糖类诸如葡萄糖(右旋糖)、二醇类诸如甘油或酸类诸如柠檬酸，且其含有可被分枝杆菌代谢的碳。
在另一个实施方案中，所述优化的氮和碳由含有两种原子的分子提供，所述分子包括、但不限于柠檬酸(二)铵或氨基酸诸如但不限于天冬酰胺。
在另一个实施方案中，所述优化的碳、氮和铁由含有所有三种原子的分子提供，所述分子包括、但不限于柠檬酸铁铵。
在另一个实施方案中，可以使用这样的培养基：其提供优化的碳、氮和铁以及额外的二价阳离子(包括、但不限于钙和镁)。
在另一个实施方案中，在没有额外外源性生物试剂存在下配制所述培养基，所述外源性生物试剂包括、但不限于白蛋白、酶或生长促进剂(包括、但不限于分枝杆菌素)。
在另一个实施方案中，可以使用混合和通气操作来优化氧的供给，以确保细菌或分枝杆菌的快速的好氧性生长。
新颖的细菌和分枝杆菌组合物
本发明提供了新颖的细菌和分枝杆菌组合物，其包含分离自细菌或分枝杆菌的RNA、细菌或分枝杆菌细胞壁。这些组合物包括如前面定义的BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC。这些组合物任选地含有不同量的完整的细菌或分枝杆菌细胞。在另一个实施方案中，每种组合物MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC还可以含有不同量的完整的分枝杆菌、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌细胞。完整细胞可以以下述量存在于MRNC、MpRNC、MbRNC MsRNC、MapRNC或MvRNC中：按重量计，0-99％、0.05-95％、0.07-50％、0.1-20％或0.19-19％，或在这些范围中的任一个内的量。
在另一个实施方案中，这些新颖组合物具有一定含量(其可以在总核酸含量的大约30％至100％范围内)的2-4000个碱基长度的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸形式的RNA组合物。在另一个实施方案中，这些新颖组合物具有一定含量(总核酸含量的30-100％)的大于150个碱基或151-4000个碱基长度的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸形式的RNA。在另一个实施方案中，这些新颖组合物具有一定含量(总核酸含量的30-100％)的主要为20-40个碱基长度的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸形式的RNA。
在一个实施方案中，通过使用例如硫氰酸胍-苯酚-氯仿萃取从分枝杆菌、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种(MAP)或牝牛分枝杆菌中提取RNA，制备含有约90％或更多的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸形式的RNA的新颖RNC组合物。可以对这样的RNA制品进行热处理(通过例如但不限于在121℃保持5-30min)， 以便得到这样的RNC组合物：其中寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸链长度是在2-4000个碱基之间。该RNC组合物可以与药学上可接受的载体相组合。
当存在最小含量的完整分枝杆菌细胞时，会优化抗癌活性。当存在5-50％w/w范围内的完整分枝杆菌细胞含量时，会优化免疫刺激活性。通过控制在实施例中详述的制备方法，或通过向MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC中添加完整的分枝杆菌、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种(MAP)或牝牛分枝杆菌细胞，可以调控完整的细菌、分枝杆菌、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种(MAP)或牝牛分枝杆菌细胞的数目。
这些新颖组合物MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC具有免疫刺激活性、抗癌活性和造血细胞和骨髓细胞生长因子刺激活性。与现有技术制品不同，这些新组合物含有单独的单链(ss)、双链(ds)和单链-双链杂合链(hs)，为免疫刺激活性和抗癌活性进行了优化，并与分枝杆菌、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种(MAP)或牝牛分枝杆菌细胞壁一起配制。在一个实施方案中，这些组合物另外包含适用于预期用途的一定水平的完整分枝杆菌细胞。
本发明的组合物可有效地刺激免疫系统、刺激造血和骨髓生长因子合成和治疗癌症。在不同的实施方案中，这些组合物可有效地诱导动物的免疫系统的应答细胞的应答、诱导细胞周期停滞或细胞凋亡、和抑制细胞增殖。这些组合物诱导免疫系统的应答细胞以产生细胞因子、趋化因子和造血和骨髓生长因子。
当与药学上可接受的载体相组合以形成治疗性组合物并施用给动物时，本发明的组合物可有效地刺激免疫系统和治疗癌症。在不同的实施方案中，这些治疗性组合物诱导动物的免疫系统的应答细胞的应答、诱导细胞周期停滞或细胞凋亡、和抑制癌细胞增殖。这些组合物诱导免疫系统的应答细胞以产生细胞因子、趋化因子和造血和骨髓细胞生长因子。
在预防、治疗、减轻和消除多种疾病疾病中，MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC是有效的治疗剂，所述疾病包 括、但不限于，恶性的、自身免疫性和免疫缺陷性疾病、骨髓抑制和造血和骨髓异常。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC特别适用于治疗由不希望的和失控的细胞增殖介导的疾病和过程，诸如但不限于癌症。这些组合物还可作为佐剂有效地增强其它抗癌剂的有效性。这样的抗癌剂包括，但不限于：药物、免疫功能刺激物、免疫功能抑制剂、抗原、抗体、疫苗、辐射、化学治疗剂(单独的，或在本领域技术人员已知的适当组合中)、基因试剂、生物学上工程改造的试剂和化学合成的试剂、以及靶向细胞死亡分子进行活化或灭活的试剂、抑制癌细胞增殖的试剂和诱导癌细胞的细胞凋亡的试剂。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC还可有效地用于预防或治疗与癌症治疗有关的或癌症本身诱发的骨髓抑制(白细胞减少症、嗜中性粒细胞减少症)，以及用于预防或治疗与药物治疗或疾病有关的不同的造血和骨髓异常，所述疾病例如、但不限于获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、骨髓增生异常综合征、自身免疫疾病、终末期肾疾病或病毒感染。本发明的2种或更多种组合物的组合可以用于优化免疫系统的调节和治疗癌症。例如，MpRNC和MvRNC的组合将产生最佳的NOD2和TLR2活化用于免疫刺激和细胞因子诱导。类似地，MpRNC和MvRNC的组合将产生最佳的抗癌活性和免疫刺激。
在一个实施方案中，可以使用细菌来提供BRNC组合物，其包含寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸形式的细菌RNA、细菌细胞壁和药用载体、赋形剂或媒介物。在另一个实施方案中，可以使用分枝杆菌来提供MRNC组合物，其包含寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸形式的分枝杆菌RNA、分枝杆菌细胞壁和药用载体或媒介物。在另一个实施方案中，MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC组合物分别包含寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸形式的草分枝杆菌RNA、牛分枝杆菌BCGRNA、耻垢分枝杆菌RNA、鸟分枝杆菌副结核亚种RNA或牝牛分枝杆菌RNA，所述RNA与得自这些物种的细胞壁和药用载体、赋形剂或媒介物相组合。
在一个实施方案中，用药物递送系统(诸如但不限于聚氨基葡糖纳米颗粒或阳离子脂质体)配制BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC或MvRNC组合物。
这些组合物BRNC、MRNAC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC 和MvRNC中的每一种可以与可接受的载体(诸如药学上可接受的载体、赋形剂、媒介物或本领域技术人员已知的的其它递送系统)相组合，以形成可以施用给动物或人的组合物。这些组合物BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC中的每一种可以分别与选定量的完整的细菌细胞、分枝杆菌细胞、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌细胞相组合，以形成可以施用给动物或人的组合物。
BRNC、MRNAC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC可在动物中有效地诱导免疫系统的应答细胞以产生细胞因子、趋化因子和造血和骨髓生长因子，并抑制应答细胞的增殖和诱导应答细胞的细胞凋亡，所述应答细胞包括、但不限于癌细胞。
真细菌种可以用于实践本发明来制备BRNC或MRNC，包括、但不限于，棒状杆菌种、棒杆菌属各种、红球菌属各种、博德特菌属各种、埃希氏菌属各种、利斯特菌属各种、诺卡尔菌属各种和分枝杆菌种。分枝杆菌种，包括、但不限于，耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)、偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacteriumkansaii)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、牝牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)和有关的亚种和草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)，可以用于制备MRNC。在另一个实施方案中，分枝杆菌种草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌用于制备MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC或MvRNC。在另一个实施方案中，古细菌物种可以用于制备BRNC。
用于制备含有分枝杆菌细胞壁RNA的组合物(MRNC)的方法
本发明另外提供了一种从任意分枝杆菌种制备分枝杆菌细胞壁RNA组合物的方法。使用本发明的方法可以用于制备分枝杆菌细胞壁-RNA的许多分枝杆菌种、分枝杆菌复合物、分枝杆菌亚种和分枝杆菌菌株，由例如美国的NCBI(参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov)维持且可从它容易地得到。尽管本发明提供了从所有分枝杆菌种和菌株制备MRNC的方法，优选的分枝杆菌种和菌株是这样的：已知其在培养中快 速地生长，且因而能够在短时间段内提供分枝杆菌细胞生物质。也优选的是，已知快速地生长且另外对免疫感受态个体非致病性的那些分枝杆菌种和菌株。
BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC可相对廉价地制备，它们的活性在制品之间是可再现的，并且它们的活性随时间保持稳定，并且它们未被外源物污染，所述外源物包括、但不限于本领域技术人员用于制备分枝杆菌细胞壁组合物的蛋白、酶、生化制品或化学试剂。此外，BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC制品对受体具有最小的毒性(如果有的话)。
为了制备BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC，分别在适当的液体培养基中培养细菌物种、分枝杆菌种、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌，并收获，所述培养基具有优化的碳、氮和铁含量，以确保碳源的完全利用。氨基酸提供氮源。二碱基氨基酸(包括、但不限于天冬酰胺)是优选的氮源。其它氮源包括铵盐或它们的等效物。额外的铁源是无机盐或有机盐，包括、但不限于柠檬酸盐，其提供额外的碳源。铁复合物，包括、但不限于柠檬酸铁铵(柠檬酸铵铁)，会提供额外的铁、氮和碳源。优选的碳(作为葡萄糖或其它可代谢利用的碳源)浓度是500-2500mMol/升。在不同的实施方案中，C与N之比是约1∶0.0095至1∶0.06、约1∶0.02至1∶0.06、或在1∶0.06或约1∶0.06。在不同的实施方案中，C与Fe之比是在或约1∶1.8x10-4至1∶3.2x10-3、在或约1∶1.8x10-3至2.7x10-4、或在或约1∶2.7x10-4。可以利用本领域技术人员已知的任何可接受的碳源、氮源或铁源。这样的培养基还可以含有额外的盐以及维生素，并预见到，根据特定需要调节这些的存在和浓度。
破碎细菌或分枝杆菌，以释放出RNA，并确保完整的细菌、分枝杆菌、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌细胞的受控除去。通过使用高压均质化方法进行破碎，随后进行离心过程。低相对离心力会除去完整的细菌或分枝杆菌。使用硫氰酸胍-苯酚-氯仿或本领域技术人员已知的类似操作，可以在该阶段从BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC中提取RNA。可替换地，可以使用高相对离心力分离与在细菌或分枝杆菌细胞的破碎以后与细菌、分枝杆菌、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、 耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌细胞壁混合在一起的BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC。重要的是，使用无核酸酶、和无DNA酶/RNA酶(内切和外切核酸酶活性)的试剂，并且所述方法在或约4℃进行，以使制备步骤中的RNA降解最小化。
细菌RNA的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸序列、寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸长度、和寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸结构(诸如但不限于单链分子、双链分子、含有单链和双链的杂合体、或者寡核糖核苷酸内和多核糖核苷酸内碱基配对的结构)是BRNC的生物活性所必需的。更具体地，分枝杆菌RNA的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸序列、寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸长度、和寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸结构(诸如但不限于单链分子、双链分子、含有单链和双链的杂合体、或者寡核糖核苷酸内和多核糖核苷酸内碱基配对的结构)是MRNC的生物活性所必需的。将细菌、分枝杆菌或草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌用于配制BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC细胞壁的用途，会产生对于使BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的生物活性(免疫刺激和抗癌活性)最大化而言重要的生物载体和递送系统。
制备含有不同数目的完整的细菌或分枝杆菌细胞的BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的方法
本发明另外提供了一种从任意细菌物种和菌株制备BRNC的方法。另外，本发明另外提供了一种从任意分枝杆菌种制备MRNC的方法。使用本发明的方法可以用于制备分枝杆菌细胞壁-RNC的许多分枝杆菌种、分枝杆菌复合物、分枝杆菌亚种和分枝杆菌菌株，由例如美国的NCBI(参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov)维持且可从它容易地得到。优选的分枝杆菌种是这样的：已知其在培养中快速地生长，且因而能够在短时间段内提供分枝杆菌细胞生物质。也优选的是，已知快速地生长且被认为对免疫感受态个体非致病性的物种。
在一个实施方案中，通过在均质化过程中适当地使用确定的高压，并与在含有细菌、分枝杆菌或草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝 杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌细胞壁的BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC制剂的制备中使用的确定的均质化循环的数目相结合，可以控制在BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC中存在的完整细菌细胞的数目。发明人已经意外地发现，改变在BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC中存在的完整细菌细胞的数目，可以影响这些组合物的免疫刺激活性和抗癌活性，从而可以实现期望的和最佳的免疫调节、或期望的和最佳的抗癌活性。
在一个实施方案中，与没有经历高压均质化和低速离心处理的相当分枝杆菌样品相比，在MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的分枝杆菌、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌细胞壁制剂中的完整分枝杆菌细胞的数目可以减少至少20倍。在另一个实施方案中，与没有经历高压均质化、低速离心和随后对细菌细胞制品进行额外高压均质化处理的相当分枝杆菌、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌样品相比，在MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC中的完整分枝杆菌细胞的数目可以减少至少30倍。在另一个实施方案中，与没有经历高压均质化、低速离心和随后对分枝杆菌或草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌细胞制品进行额外高压均质化处理的相当分枝杆菌样品相比，在MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC中的完整的分枝杆菌、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌细胞的数目可以减少至少35倍。
在一个实施方案中，可以制备这样的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC组合物：其分别含有高水平的完整分枝杆菌细胞含量或草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌细胞含量(例如超过大约1-50％w/w)。这样的技术包括例如4个高压均质化循环，其中所述4个高压均质化循环中的2个在高速离心步骤之前进行，并且所述高压均质化循环中的2个在高速离心步骤之后进行。
在另一个实施方案中，可以制备这样的MRNC、MpRNC、MbRNC、 MsRNC、MapRNC和MvRNC制品：其分别含有中间水平的完整分枝杆菌细胞含量、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌细胞含量(例如在约0.2至约0.9％w/w之间)。这样的技术包括例如7个高压均质化循环，其中所述7个高压均质化循环中的5个在高速离心步骤之前进行，并且2个高压均质化步骤在高速离心步骤之后进行。
在另一个实施方案中，可以制备这样的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC制品：其含有超低水平的完整分枝杆菌细胞含量、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌细胞含量(例如小于约0.2％w/w)。这样的技术包括例如10个高压均质化循环，其中所述10个高压均质化循环中的5个在低速离心步骤之前进行，3个高压均质化循环在低速离心之后进行，并且2个高压均质化步骤在高速离心步骤之后进行。
在上述技术中，‘高压均质化’是指这样的高压均质化循环：其足以造成分枝杆菌、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌的有效破裂，从而得到含有RNA的细胞壁碎片组合物。还可以使用与高压均质化相当的其它操作，例如，但不限于，微流化。应当理解，细菌和分枝杆菌细胞破碎领域的普通技术人员在阅读本发明以后可以容易地确定对于要破碎的具体分枝杆菌种、菌株、次代株或复合物而言最佳的压力。
如本文所定义的，低速离心表示足以沉淀未破碎的细菌、分枝杆菌、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌的相对离心力(RCF)。应当理解，离心领域的普通技术人员在阅读本发明以后可以容易地确定对于沉降在如上所述的细胞破碎以后剩余的任何完整的细菌或分枝杆菌而言最佳的RCF。
本文定义的高速离心表示足以沉淀细菌、分枝杆菌、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌细胞壁的相对离心力。预见到，离心领域的普通技术人员在阅读本发明以后可以容易地确定，在破碎并通过如上所述的低速离心除去期望的量的完整的细菌和分枝杆菌以后，对于沉降得自细菌或分枝杆菌的细胞壁而言最佳的相对离心力。
上述高压均质化技术的应用可以用于制备含有不同水平(例如，高、 中间或低)的完整分枝杆菌的MRNC，其中适当地使用高压均质化压力、低速离心和高速离心或它们的组合。另外，所述的高压均质化技术已经用于制备这样的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC：其分别含有高、低或中间水平的分枝杆菌、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌。
在一个实施方案中，与没有经历差速离心以从制品中除去完整分枝杆菌细胞、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌细胞(即，没有高压均质化处理)的分枝杆菌制品相比，通过上述的高压均质化方法制备的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC制品分别含有减少数目的完整分枝杆菌细胞、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌细胞。在一个实施方案中，每种MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC制品(w/w)的完整分枝杆菌细胞、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌细胞的百分比分别小于约50％w/w、小于约40％w/w、小于约30％w/w、小于约20％w/w、小于约10％w/w、小于约5％w/w、小于约1％w/w、或小于约0.5％w/w。
在另一个实施方案中，对MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC制品进行热处理过程，诸如但不限于，例如，在95℃加热5-30min，或例如在121℃加热5-30min，其足以灭活在所述组合物中剩余的任何完整的分枝杆菌、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌。
在另一个实施方案中，使用MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC制品的热处理(例如在121℃保持5-30min或本领域技术人员已知的其它条件)来制备在约2-150个、约10-100个或约20-40个碱基长度范围内的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸。
在一个实施方案中，制备MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的方法包括：破碎分枝杆菌细胞生物质、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌，以从其制备细胞壁和有关的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸，分离完整的未破碎的分枝杆菌、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌细胞；和将破碎的细菌分 枝杆菌、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌细胞部分的可溶性的细胞溶质内容物与细胞壁和寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸分离，以得到细菌、分枝杆菌、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌细胞壁RNC(BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC)。
在另一个实施方案中，制备MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC制品的方法包括：破碎分枝杆菌细胞生物质以释放寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸；将寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸与未破碎的完整的分枝杆菌、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌细胞分离；重复所述步骤以控制完整的分枝杆菌、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌细胞的数目；然后，加热寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸至足以得到约20-40个核苷酸碱基的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸长度的温度。
组合物的核酸含量
这些组合物MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的核酸含量是约500-50000ng/mg、约500-5000ng/mg或约500-3000ng/mg。在不同的实施方案中，MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的提取的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸的长度是约2至约4000个碱基长度、约2至约150个碱基长度、或大于150个碱基长度。在不同的实施方案中，MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的提取的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸的长度是约150个碱基至约4000个碱基长度、或约10至约50个碱基长度、或约20至约40个碱基长度。在不同的实施方案中，MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的提取的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸的长度小于150个碱基或小于100个碱基。
本领域技术人员会理解，可以修改上述操作，使得包括其它步骤，只要它们不会不利地影响MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的质量和总回收率。
在高压均质化和低速离心以后，MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、 MapRNC和MvRNC的治疗有效性会增加，因为所述高压均质化操作会通过产生寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸而减小提取的RNA分子的长度，并从各种制品中除去完整的分枝杆菌、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌细胞。通过使用但不限于热处理(例如，在121℃热处理30min)，或通过适当地使用碱基序列限制的内切核酸酶，可以容易地实现寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸长度的进一步减小。发明人已经意外地发现，在消化RNA的RNA酶处理以后，MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC制品的充当免疫刺激物或抗癌剂的能力显著减小。因此，MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC制品在RNA酶处理或无意暴露于核糖核酸酶以后具有有限的治疗有效性，除非通过使用制剂和载体系统来保护RNA，所述制剂和载体系统限制RNA对RNA酶(内切或外切)或核酸酶的降解作用的接近。
MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的免疫刺激活性和抗癌活性
已经发现，在MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC制品中存在的完整的分枝杆菌、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌细胞的总数的减少，对通过细胞因子诱导测定测得的免疫刺激活性具有显著影响。还已经发现，在MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC中存在的完整分枝杆菌细胞的总数的减少，对免疫刺激活性具有显著的积极影响，诸如外周血单核细胞中增加的IL-10和IL-12p40诱导。此外，发现在上述制品中存在的完整的分枝杆菌、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种或牝牛分枝杆菌细胞的总数的减少，对通过癌细胞增殖的抑制测得的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的抗癌活性具有积极的增强作用。
在一个实施方案中，使用细胞因子诱导测定，可以测量MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC对动物或人的造血和骨髓生长因子的免疫刺激活性。在另一个实施方案中，MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC会诱导细胞因子(包括、但不限于，IL-10和IL-12)的免疫刺激活性。
在另一个实施方案中，包含MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的治疗性组合物具有抗癌活性。在一个实施方案中，使用本领域技术人员已知的癌细胞增殖测定，可以测定MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的抗癌活性。本领域技术人员已知这样的测定用于鉴别抗癌活性的用途，其预测体内抗癌活性。
在预防性或治疗性场合中施用包含MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的组合物本身不是免疫接种过程。它是刺激免疫系统的应答细胞的应答以及抑制应答细胞(诸如但不限于癌细胞)的增殖和诱导其细胞凋亡的预防性或治疗性处理。该预防性或治疗性处理可用于预防、治疗、减轻或消除疾病，包括、但不限于癌症。
但是认识到，MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC制品的施用会引起针对在制剂中使用的分枝杆菌细胞壁组分的免疫应答，所述免疫应答被MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的免疫刺激活性额外地增强(免疫佐剂效应)。本领域技术人员会认识到，当从其制备MRNC时，这样的应答可有效地治疗机会性或致病性分枝杆菌感染。具体地，需要能够减少与结核病、约内氏病或克罗恩氏病(但不限于此)有关的炎症和发病的治疗。更具体地，可以使用包含具有优化的免疫刺激活性和疫苗抗原活性和疫苗佐剂活性的MapRNC的组合物，其具有预防或治疗牛和人类的MAP感染的优点。可以使用包含得自超过一种分枝杆菌种(其含有与MAP的那些交叉反应的抗原)的RNC的组合物来产生保护性应答，后者导致MAP感染的控制。
包含MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的组合物的治疗效果包括，但不限于：刺激免疫系统的应答细胞以产生细胞因子，所述细胞因子可以导致免疫系统细胞的活化和随后的细胞裂解，或者活化应答细胞中的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶和细胞凋亡。细胞裂解和细胞凋亡单独地或组合地具有抗癌活性和佐剂活性。也就是说，包含MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC和MvRNC的治疗性组合物可以作为抗癌剂单独施用，并且包含MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的组合物可以在其它抗癌剂之前、同时或之后施用以增加治疗有效性。
在预防、治疗、减轻和消除多种疾病疾病中，MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC是有效的预防剂和治疗剂，所述疾病包括、但不限于，恶性的、自身免疫性和免疫缺陷性疾病、骨髓抑制和造血和骨髓异常。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC还可作为佐剂有效地增强其它试剂的有效性。这样的试剂包括，但不限于：药物、抗生素、其它免疫刺激物、抗原、抗体、疫苗、辐射和化疗、基因试剂、生物学上工程改造的试剂和化学合成的试剂、以及靶向细胞死亡分子进行活化或灭活的试剂、抑制癌细胞增殖的试剂和诱导癌细胞的细胞凋亡的试剂。
在本发明的每个前述方面和实施方案中，也在本文中具体地预见到除了上述的那些以外的组合佐剂或疗法。
在一个实施方案中，本发明的组合物可以与一种或多种本领域技术人员已知的目前可得到的化学治疗剂一起施用。
在另一个实施方案中，本发明的组合物可以与一种或多种抗生素、抗-杀真菌剂、抗病毒剂、抗寄生虫剂、抗炎药或免疫刺激药或本领域技术人员已知的试剂一起施用。
在另一个实施方案中，本发明的组合物可以与一种或多种本领域技术人员已知的用于预防或治疗骨髓抑制或造血和骨髓异常的药物或试剂一起施用。
本发明的组合物可以用于治疗动物受试者或患者，且更优选哺乳动物，包括人类，以及哺乳动物诸如非人灵长类动物、狗、猫、马、牛、猪、啮齿类动物和鱼。
药学上可接受的载体和施用组合物的方法
可以用药学上可接受的载体容易地配制、制备或施用MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的组合物。这样的制品可以通过各种技术来制备。这样的技术包括：使MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的组合物和它的载体相混合。在一个实施方案中，如下制备MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC组合物：使MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC组合物与液体载体、固体载体或两种载体均匀地且亲密地混合。液体载体包括，但不限于：水性制剂、非水性制剂或二者。 固体载体包括，但不限于：生物载体、化学载体或二者。
MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC组合物可以在水性悬浮液、油乳状液、油包水乳状液和水包油包水乳状液中和在载体中施用，所述载体包括、但不限于，乳膏剂、凝胶、脂质体(中性的、阴离子的或阳离子的)、脂质纳米球或微球、中性的、阴离子的或阳离子的聚合纳米颗粒或微粒、位点特异性的乳状液、长期保留的乳状液、粘性的乳状液、微型乳状液、纳米乳状液、微球、纳米球、纳米颗粒和微型泵，且具有允许持续释放组合物的不同的天然的或合成的聚合物，包括阴离子的、中性的或阳离子的多糖和阴离子的、中性的、阳离子的聚合物或共聚物，所述微型泵或聚合物植入在需要递送组合物的位置附近。聚合物和它们的应用描述在，例如，Brem等人(Journal of Neurosurgery 1991，74：441-446)。此外，MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC可以与任意一种载体或载体的任意组合一起使用。这些包括，但不限于：抗氧化剂、缓冲剂和抑制细菌剂，且可以包括助悬剂和增稠剂。
在一个实施方案中，MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC组合物或基于载体的制品作为无RNA酶的水性悬浮液施用。就作为水性悬浮液施用而言，将MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC悬浮于无RNA酶的且无核酸酶的药学上可接受的赋形剂、缓冲液或载体中，包括、但不限于，注射用水、生理盐水或葡萄糖溶液，或通过下述技术：包括、但不限于，高压均质化、超声处理和微流化，且可以无菌处理或最终灭菌。在另一个实施例中，可以在密封的安瓿或管形瓶中保存冷冻干燥的(低压冻干的)MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC，只需要在即将使用之前加入药学上可接受的赋形剂、缓冲液或载体，例如无RNA酶的和无核酸酶的无菌水。
就在非水性的载体中施用而言，可以用矿物油或用中性油乳化MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC，所述中性油例如，但不限于，甘油二酯、甘油三酯、磷脂、脂质、油及其混合物，其中所述油含有多不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸的适当混合物。例子包括，但不限于：大豆油、芥花油、棕榈油、橄榄油和myglyol，其中脂肪酸碳的数目是在12-22之间，且其中所述脂肪酸可以是饱和的或不饱 和的。任选地，带电荷的脂质或磷脂可以悬浮于中性油中。更具体地，可以使用磷脂酰丝氨酸，其靶向在巨噬细胞上的受体。使用本领域技术人员已知的技术，可以在制备乳状液时使用在水性介质中配制的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC，或低压冻干的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC粉末。
本发明因而提供了MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC组合物以及一种或多种药学上可接受的载体和任选的其它治疗成分和/或预防成分。所述载体和其它治疗成分必须是可接受的，其含义是，与组合物的其它成分相容，且对其受体无害。
以在动物(包括人)中有效地诱导治疗应答的量，施用MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC组合物。施用的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC组合物的剂量将取决于要治疗的病症、具体的制剂和其它临床因素，诸如受体的体重和状况以及给药途径。在一个实施方案中，施用的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的量是每剂约0.00001mg/kg至约100mg/kg。在另一个实施方案中，施用的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的量是每剂约0.0001mg/kg至约50mg/kg。在另一个实施方案中，施用的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的量是每剂约0.001mg/kg至约10mg/kg。在另一个实施方案中，施用的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的量是每剂约0.01mg/kg至约5mg/kg。在另一个实施方案中，施用的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的量是每剂约0.1mg/kg至约1mg/kg。
通过对比它们的体外活性和在动物模型中的体内活性，可以确定本发明的化合物的有用剂量。将在小鼠和其它动物中的有效剂量外推至人类的方法是本领域已知的；例如，参见美国专利号4,938,949。
在下面举例说明在本发明中使用的组合物的施用模式。但是，所述组合物可以通过多种途径中的任一种来递送，所述途径包括：通过注射(例如，皮下注射、肌肉内注射、静脉内注射、动脉内注射、腹膜内注射)，通过连续静脉内输注，皮肤途径，真皮途径，透皮途径，口服途径(例如，片剂、丸剂、液体药物、可食用的膜条)，通过植入的渗透泵，通过栓剂或气溶胶喷雾。施用途径包括，但不限于：局部途径、真皮内途径、鞘 内途径、病灶内途径、瘤内途径、膀胱内途径、阴道内途径、眼内途径、直肠内途径、肺内途径、椎管内途径、真皮途径、真皮下途径、关节内途径、放置在体腔内、鼻吸入、肺吸入、印在皮肤中和电穿孔。
根据给药途径，每剂包含在可接受的载体中的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的组合物的体积是约0.001ml至约100ml。在一个实施方案中，每剂包含在可接受的载体中的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的组合物的体积是约0.01ml至约50ml。在另一个实施方案中，每剂包含在可接受的载体中的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的组合物的体积是约0.1ml至约30ml。包含在可接受的载体中的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的组合物可以在单次剂量治疗中或在多次剂量治疗中按照计划表施用，或者在适合要治疗的疾病、受体的状况和给药途径的时间段内施用。期望的剂量可以方便地呈现在单次剂量中，或者作为以适当的间隔施用的分份剂量，例如，作为每个的2个、3个、4个或更多个亚剂量。所述亚剂量本身可以进一步分成例如许多离散的松散间隔的施用。
用于活化免疫系统受体的方法
本发明提供了用于活化免疫系统受体的方法，所述方法包括：给有此需要的受试者施用治疗有效量的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC和药学上可接受的载体。通过本发明可以活化的免疫系统受体是(但不限于)：核苷酸结合寡聚化结构域2(NOD2)，即负责感知病原体相关分子模式(PAMP)分子胞壁酰二肽(即具有免疫刺激活性的细菌肽聚糖的最小结构组分)的模式识别受体(PRR)，和Toll-样受体2(TLR2)，即负责感知多种病原体相关分子模式(PAMP)分子(诸如肽聚糖、脂甘露聚糖(LM)、脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)和含有(棕榈酸)n-衍生的一个或多个N-端半胱氨酸的脂蛋白和脂肽)的模式识别受体(PRR)。本领域技术人员已知，这2种免疫系统受体的活化会导致抗癌活性和抗感染活性(包括、但不限于细菌、真菌和病毒感染)的产生以及疫苗佐剂活性的刺激和人骨髓CD14+细胞的分化。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的起这2种受体的激动剂作用的能力，会提供未满足的需求，并进一步提供胜过在肿瘤学、感染性疾 病或疫苗领域中用作治疗剂的单功能NOD2或TLR2激动剂的显著优点。
用于治疗包括癌症和免疫系统障碍在内的疾病的方法
本发明提供了用于治疗癌症的方法，所述方法包括：给有此需要的受试者施用治疗有效量的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC和药学上可接受的载体。
在另一个方面，本发明的方法和组合物可用于癌症和免疫系统疾病或障碍的治疗性处理。在另一个实施方案中，在征状或征象发作之前，或在癌症疾病的严重征状或征象发作之前，通过适时施用组合物作为预防剂，可以预防某些癌症。因而，可以用一种或多种本发明的组合物治疗处于特定癌症疾病风险中的患者作为预防措施。
在另一个方面，本发明涉及一种在罹患上面指出的癌症疾病或癌症适应症中的任意一种或多种的受试者中减轻或改善癌症或肿瘤发展、转移、癌细胞的细胞增殖和/或抑制与上面指出的癌症疾病和/或癌症适应症中的任意一种或多种有关的征状的方法。该方法包括：给有此需要的受试者施用在药学上可接受的载体中的治疗有效量的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC可以与药学上可接受的载体一起单独施用，或者与一种或多种抗炎化合物、免疫刺激剂或抗癌剂联合施用，其中所述MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC足以抑制癌症或肿瘤发展、转移和/或癌细胞的细胞增殖。
MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC可作为治疗剂有效地治疗、减轻或消除疾病，所述疾病包括、但不限于癌症。癌症包括，但不限于：原发性或转移性癌症、鳞状细胞癌、纤维肉瘤、肉状瘤癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌、结直肠癌、肾癌、骨肉瘤、皮肤黑素瘤、基底细胞癌、胰腺癌、膀胱癌、尿道癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、前列腺癌、白血病、淋巴瘤和源自它们的转移。
在一个方面，使用本发明的MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC组合物可以治疗的癌症疾病和癌症障碍包括，例如，但不限于，AIDS相关的癌症、膀胱癌、骨癌、脑和脊髓癌、转移性脑肿瘤、儿科脑肿瘤、乳腺癌、男性乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内 膜癌和其它子宫癌、食管癌、胆囊和胆管癌、胃癌、头颈癌、肾癌、白血病、肝癌、肝转移、肺癌、淋巴瘤、乳腺癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、神经母细胞瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、儿科癌、垂体肿瘤、前列腺癌、血液学病症、肉瘤、实体瘤、视网膜母细胞瘤、皮肤癌、软组织肉瘤、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、威尔曼瘤、支气管癌、结肠和直肠癌、尿道癌、非霍奇金淋巴瘤、皮肤黑素瘤、肾和肾癌、骨盆癌、胰腺癌、口腔癌和咽癌、胃食管癌、肝内胆管癌、喉癌、急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、软组织癌包括心脏、GIST(胃肠间质瘤)、小肠癌、慢性髓性白血病、急性淋巴细胞白血病、肛门和肛管癌、肛门直肠癌、外阴癌、胸膜癌、恶性间皮瘤、骨和关节癌、下咽癌、眼和眼眶癌、鼻和鼻腔癌、中耳癌、鼻咽癌、输尿管癌、腹膜癌、网膜和肠系膜癌和胃肠类癌瘤或它们的任意组合。
在另一个方面，使用本发明可以治疗的癌症疾病和癌症障碍包括，但不限于：结直肠癌、胃癌、卵巢癌、骨肉瘤、肝细胞癌、伯基特淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、血管免疫母细胞淋巴结病、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)相关的淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤、口腔毛状白斑、淋巴组织增生病、淋巴上皮癌、基于体腔的淋巴瘤或B-细胞淋巴瘤、非角质化癌、鳞状细胞鼻咽癌、肾移植相关的上皮肿瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、血管淋巴样增生、前列腺肿瘤、视网膜母细胞瘤、李弗劳明综合征、加德纳氏综合征、维尔纳氏综合征、类神经(nervoid)基底细胞癌综合征、1型神经纤维瘤病、宫颈发育不良、神经母细胞瘤、原发性巨球蛋白血症、胰岛素瘤、蕈样肉芽肿病、成骨性肉瘤、恶化前的皮肤病变(局部的)、横纹肌肉瘤、骨源性、真性红细胞增多症、特发性血小板增多症或它们的任意组合。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC可以用作抗感染剂。本发明也可用于保护暴露于致病性物质(诸如病毒和细菌)以后的动物。本发明可用于调节哺乳动物血细胞生成，或在从辐照、外科手术或化学疗法治疗恢复的患有癌症的动物中诱导造血和骨髓恢复(白细胞减少症、嗜中性粒细胞减少症、血小板减少症或贫血)。本发明可用于预防或治疗与药物治疗或疾病有关的多种造血和骨髓异常，所述疾病例如、但不限于获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、骨髓增生异常综合征、自身免疫疾病、终末期肾疾病或病毒感染。
本发明还可用于治疗或减轻自身免疫障碍、炎症性疾病和感染性疾 病。MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC可以用于治疗由病毒、细菌、分枝杆菌(诸如但不限于结核分枝杆菌或鸟分枝杆菌副结核亚种)或细胞内生物造成的多种感染，包括、但不限于，疱疹病毒的感染，诸如马鼻肺炎、传染性牛鼻气管炎、子宫内膜炎、单纯疱疹、带状疱疹、眼部疱疹、猫病毒性鼻气管炎，和感染猫呼吸道的疱疹病毒。本发明也可有效地治疗狗仔的细小病毒感染。本发明的组合物可有效地作为人类的生殖器疱疹感染和获得性免疫缺陷综合征以及动物和人类的其它病毒感染的治疗剂。例如，MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC可以用于治疗病毒、细菌、原生动物和真菌感染，例如，但不限于，马疱疹病毒、马流感病毒、单纯疱疹、链球菌物种诸如但不限于兽瘟链球菌、大肠杆菌和骆马巴贝虫(LlamaBabesia)。
下述实施例将用于进一步例证本发明，但是，与此同时，并不构成对本发明的任何限制。相反，显而易见的是，本领域技术人员在阅读本文的描述以后，可以明白不同的其它实施方案、修改及其等同方案，而不脱离本发明的精神和/或所附权利要求的范围。应当理解，本领域技术人员在阅读本发明的详细描述和实施例以后将会将其中的发现应用于从革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌制备免疫刺激的和抗癌的RNC，而不脱离本发明的精神和意图或所附权利要求的范围。
实施例1
在合成培养基中培养分枝杆菌
在美国专利号4,744,984和美国专利号6,326,357中教导的分枝杆菌细胞壁组合物的制备详细说明了BACTOTM AC培养液(Difco Labs，现在的Becton Dickenson)用于制备分枝杆菌细胞群的用途。该培养液含有眎蛋白胨No.3、牛肉膏、酵母浸出物和麦芽浸出物(DifcoTM&BBLTMManual of Microbiological Culture Media，第2版，2009，第35-36页)。另外，在制备生物质之前，在牛奶中保存在这些专利中用作实施例的草分枝杆菌的种子储备物。前述专利还教导，培养是静止的，并且分枝杆菌培养物作为在培养基上的表面菌膜生长。
为了消除前述物质污染分枝杆菌生物质的可能性，开发了新颖的合成培养基用于培养分枝杆菌。本领域技术人员已知Middlebrook 7H9培养液适用于培养纯的分枝杆菌培养物，但是需要添加含有动物源材料的 补充物(含有牛血清白蛋白和过氧化氢酶的Middlebrook ADC富集物)，并且另外受益于聚山梨酯80或甘油的使用(DifcoTM&BBLTMManual of Microbiological Culture Media，第2版，2009，第355-356页)。但是，意外地发现，在不使用存在于Middlebrook ADC富集培养基中的外源性蛋白牛白蛋白或过氧化氢酶时，或不使用非离子去污剂聚山梨酯80时，分枝杆菌在Middlebrook 7H9中有效地生长。还意外地发现，与用单独的Middlebrook 7H9培养液培养相比，额外的铁(作为柠檬酸铁铵)和额外的碳和氮源(诸如但不限于天冬酰胺或柠檬酸铵)的应用会导致优良的分枝杆菌群产量。使用适当比例的额外的碳、氮和铁来促进代谢活性和细胞分裂(通过优化用于合成蛋白、核酸和其它细胞组分的碳与氮之比)，以及增强代谢(通过增加的铁可用性)，从而增加分枝杆菌分裂速率和分枝杆菌细胞群。
下述结果用于证实改变培养基中的C∶N∶Fe比例对草分枝杆菌的生长的影响，所述草分枝杆菌在本文中用作代表性的分枝杆菌种的一个例子。应当认识到，使用替代性的C、N和Fe源可以重复下述的发现，且可以应用于其它分枝杆菌，而不脱离本发明的范围和意图。
在例如Difco和BBL Manual of Microbiological Culture Media，第2版，2009，第355-356页中，可以得到Middlebrook 7H9培养液和ADC的组成。在下述新开发的培养基中测定草分枝杆菌的生长，所述培养基在下文中被定义为分枝杆菌培养基组合物(MCMC)：
A.含有Middlebrook 7H9(BD Canada，Mississauga，Ontario)、葡萄糖和甘油的MCMC组合物。
B.含有Middlebrook 7H9、葡萄糖、甘油且含有额外的Fe(作为柠檬酸铁铵)和天冬酰胺作为铁源、碳源和氮源的MCMC组合物。
C.含有葡萄糖、甘油且含有Fe(作为柠檬酸铁铵)、天冬酰胺和柠檬酸(二)铵作为铁源、碳源和氮源的MCMC组合物。
D.含有葡萄糖、甘油且含有Fe(作为柠檬酸铁铵)和柠檬酸(二)铵作为铁源、碳源和氮源的MCMC组合物。
在一项单独的研究中，还使用上述的组合物C，确定了含有铁和天冬酰胺(作为L、DL或D立体异构体)的MCMC组合物的影响。
为了制备MCMC A和MCMC B Middlebrook 7H9培养液，将9.4gMiddlebrook 7H9粉末培养基与除了葡萄糖以外的添加剂相混合，与甘 油和添加剂相混合，溶解在水(900mL)中，并通过蒸汽高压灭菌进行灭菌。将葡萄糖溶解在水中，并总是分别过滤除菌，然后加入，以得到1000mL的终体积。MCMC C和MCMC D不含Middlebrook 7H9粉末培养基。表1显示了对于含有甘油、葡萄糖和上述的添加剂的Middlebrook 7H9培养液以及2种不含Middlebrook7H9培养液粉末的培养基而言，每升培养基的C、N和Fe的摩尔含量。
表1.用于制备分枝杆菌细胞群的合成培养基的C、N和Fe含量
*所有(代谢地)可利用的碳已经用于计算中。**所有(代谢地)可利用的氮已经用于计算中。***所有可利用的铁已经用于计算中。将柠檬酸铁铵定义为C6H10FeNO8。
Middlebrook 7H9粉末从BD Canada，Mississauga，Ontario得到，且是本领域技术人员已知的。用于制备约900mL DifcoTMMiddlebrook 7H9培养液的近似配方如下：硫酸铵(0.5g)、L-谷氨酸(0.5g)、柠檬酸钠(0.1g)、吡哆醇(1.0mg)、生物素(0.5mg)、磷酸氢二钠(2.5g)、磷酸二氢钾(1.0g)、柠檬酸铁铵(0.04g)、硫酸镁(0.05g)、氯化钙(0.5mg)、硫酸锌(1.0mg)、硫酸铜(1.0mg)。
所有其它试剂得自Sigma，Oakville，Ontario。
在下面显示了用于制备MCMC-A、MCMC-B、MCMC-C和MCMC-D的培养基的组成(按g/L计)。但是，应当理解，尽管列出的每个具体数字是针对MCMC-A、MCMC-B、MCMC-C和MCMC-D的一个配方，这些数字各自可以增加或减小约10％至约20％，以产生MCMC-A、MCMC-B、MCMC-C和MCMC-D培养基的变体，并且相应地改变C∶N和C∶Fe比率。
MCMC-A
MCMC-B
MCMC-C
MCMC-C(D-天冬酰胺)
MCMC-C(L天冬酰胺)
MCMC-D
下述操作描述了从草分枝杆菌制备分枝杆菌细胞群，并因此充当从一般的分枝杆菌制备分枝杆菌细胞群的一般实施例。应当认识到，本领域技术人员在阅读该实施例以后，将会适当地修改所述操作以满足各种分枝杆菌种、复合物和菌株的具体需要。
将草分枝杆菌(菌株110)作为在Petriagani斜面上的菌落在4℃保存，或者作为在含有20％甘油的Middlebrook7H9中的悬浮液在-80℃保存。使用从Petriagani斜面制备的种子培养物，确定最佳的培养碳、氮和铁比率。将得自Petriagani斜面的菌落放在1.2L M培养基中，并在分散以后培养7天(250rpm，37℃，在定轨摇床中，Lab-Line Instruments，Melrose Park，IL，美国)。在调节至标准化的OD以后，将200mL加入一系列含有1L各种MCMC的培养瓶中。继续培养(250rpm，37℃，在LAB-Line定轨摇床中)，并在10天的时段内定期取出副本烧瓶。通过低速离心洗涤，分离出分枝杆菌群，低压冻干，并测定干重。在低压冻干法不能实行的情况下，使用下述换算因子从湿细胞质量计算干重：湿细胞质量/6.81＝干细胞质量(预先通过实验确定该因子的平均值±SD是 6.81±1.16，n＝7)。
表2中的结果显示了MCMC中的不同的碳、氮和铁比率对草分枝杆菌的产量以及最佳产量的时间(按天计)的影响，表3中的结果显示了使用外消旋的DL-、D-或L-天冬酰胺对分枝杆菌细胞群的产量的影响。应当理解，这些研究在不同的时间进行，并且分枝杆菌细胞群的绝对产量在研究与研究之间变化。
表2.C、N和Fe含量对草分枝杆菌细胞群产量的影响
*将产量表示为g草分枝杆菌干重/升培养液。
表3.天冬酰胺立体异构体D、L或DL外消旋混合物对草分枝杆菌的产量的影响
在表2中显示的结果证实，增加可利用的碳、氮和铁的量会引起细胞群产量的增加，以及减少获得最大产量所需的时间。所述结果也表明，例如、但不限于天冬酰胺或柠檬酸铵(即，可利用的氮源，无论它是有机分子还是无机分子形式)的应用会增加产量。与柠檬酸铵(而不是硫酸铵)的应用有关的2个优点是，柠檬酸盐(弱酸的盐，其会为培养基提供大量缓冲能力)的碳的相对缓慢的代谢，和在培养过程中观察到的培养液pH的减少的波动，这与从不可代谢的硫酸盐(强酸的盐)产生硫酸相一致。
在表3中显示的结果证实，与使用L-立体异构体相比，D-天冬酰胺 或外消旋混合物(如果是DL天冬酰胺)的应用会产生更低的分枝杆菌细胞群产量。这些数据与天冬酰胺的L-立体异构体(而不是D-立体异构体或外消旋混合物)的更有效利用相一致。柠檬酸铵作为氮源似乎具有其它优点，因为铵离子不是外消旋的。
使用优化的MCMC-C进行了第三项研究，其中对比了草分枝杆菌和耻垢分枝杆菌产量。如关于草分枝杆菌所述，制备耻垢分枝杆菌(ATCC，马纳萨斯，VA，菌株ATCC14468)，并如上所述进行直接比较(head-to-head)培养。
表4.MCMC-C用于制备草分枝杆菌和耻垢分枝杆菌细胞群的用途
分枝杆菌 产量，g干重/L 最佳产量，天
草分枝杆菌 7.6 6
耻垢分枝杆菌 9.6 6
在表4中显示的结果证实，MCMC组合物C的应用在相对较短的时间段内产生大量分枝杆菌细胞群，并且这样的产量不限于草分枝杆菌。
进行了一项单独的研究，以便确定在培养过程中对培养基额外通气的影响。如上所述培养草分枝杆菌，但是使用带有3组挡板的Fermbach烧瓶，以便增加培养基的混合和对大气氧的利用。将草分枝杆菌在MCMC-C培养基中的生长与它在BactoTMAC培养液和MCMC-A中的生长进行对比。将在120小时时的草分枝杆菌细胞群产量确定为g干重分枝杆菌细胞群/升培养基。结果表明，使用BactoTMAC培养液，产量为5.0g/L，使用MCMC-A，产量为3.15g/L，使用MCMC-C，产量为9.2g/L(相对于MCMC-A增加2.9倍，相对于BactoTMAC培养液增加1.84倍)。这些数据证实，在增加混合和通气(诸如但不限于Fermbach烧瓶)的培养条件下，草分枝杆菌的产量进一步增加，并且在新培养基组合物中的产量大于用BactoTMAC培养液或MCMC-A得到的产量。
使用从冷冻储备物制备的分枝杆菌的种子培养物，制备本发明的分枝杆菌细胞壁RNC。如下从冷冻储备物制备种子培养物：将1瓶冷冻储备物加入600mL改良培养基中，并在160-250rpm在定轨摇床(Lab-Line，Melrose Park，IL，美国)中在振荡下在37℃培养7天。然后将种子培养物 以1∶10稀释度接种至更大的培养体积，并使用相同的条件培养7天。通过低速离心洗涤，收获分枝杆菌生物质，此后将沉淀的分枝杆菌再悬浮于注射用水(无核酸酶)中，得到10％w/v悬浮液。如在下面的实施例中所述，从该悬浮液制备本发明的组合物。
通常，如在美国专利号6,326,357中所述，培养草分枝杆菌7-10天(对于制备种子培养物而言)和额外的10-20天(对于制备分枝杆菌细胞生物质而言，培养总时间为17-30天)。该制备方法的产量是大约20g草分枝杆菌湿重/升培养基，相当于大约2-3g草分枝杆菌干重/升。上述的使用MCMC组合物和培养条件的新制备方法共需要14天，产量为大约6.5-7.6g草分枝杆菌干重/升，由此使制备生物质所需的时间显著减少，并使分枝杆菌细胞群的产量显著增加。与以前的教导相比，这样的改善意外地使生物质生产效率增加。
应当认识到，在本实施例中描述的重要原理是，使用的用于制备分枝杆菌细胞群的培养基不含外源性动物、植物或真菌材料，并且培养过程通过使用优化的培养基以及维持分枝杆菌悬浮(而不是作为静止生长培养条件特有的菌膜)的振荡来优化分枝杆菌的生长。本领域技术人员在阅读本实施例以后可以修改这些原理，以导致特定分枝杆菌种、复合物或菌株的最佳生长，而不背离本发明的精神和/或所附权利要求的范围。
实施例2
在制备免疫刺激和抗癌组合物过程中控制完整分枝杆菌的数目
下述实施例鉴定了用于制备本发明的组合物的新操作，其使用在几mL至几升体积范围内的可缩放的工作体积，并且导致包含核酸和细胞壁的新细菌组合物的有效生产。
如在实施例1中所述，制备分枝杆菌细胞群(草分枝杆菌用作分枝杆菌细胞群的示例性的和代表性的例子)。在通过低速离心进行沉淀以除去培养基组分以后，使用AvestinEmulsiFlex-C5高压匀浆器(Avestin，Ottawa，Ontario，加拿大)，通过高压均质化(18,000磅/平方英寸[PSI]，5个循环，在4℃的温度)，破碎草分枝杆菌细胞(制备为在无DNA酶的且无RNA酶的注射用水中的10％w/v悬浮液)。可以使用类似的或等效的系统，而不脱离本发明。然后在认为对于完整分枝杆菌的除去而言最佳 的相对离心力(在4℃在3,160xg离心30min)，离心匀浆物。在本实施例中，将10％w/v草分枝杆菌悬浮液的样品、高压均质化以后的匀浆物、得自低速离心的上清液(含有完整的和污染的草分枝杆菌)和已经进行额外高压均质化循环的得自低速离心的上清液连续稀释(在注射用水中10-2至10-7的稀释度)，并如下确定菌落形成单位(CFU)的数目：在胰蛋白酶大豆琼脂生长培养基上铺板，在37℃温育72-96h，并计数菌落，将它们表达为CFU/mL。
已经报道，Avestin高压均质化系统会在1-3个循环以后实现酵母和大肠杆菌细胞的～100％破碎 (http://www.avestin.com/English/efapplications.html#Rupture)。5个均质化步骤没有实现草分枝杆菌的100％破碎将提示本领域技术人员，这是该微生物的效率限度。但是意外地发现，对含有明显耐受5个高压均质化循环的完整草分枝杆菌细胞的低速离心上清液进行在4℃温度在18,000PSI的额外高压均质化步骤(2-3)，会导致完整草分枝杆菌细胞的进一步减少(表5)。额外高压均质化步骤的意外益处是，完整草分枝杆菌细胞的数目的进一步受控减少和分枝杆菌细胞壁-RNC的产量的增加。
由于草分枝杆菌在悬浮培养中以细胞聚集体的形式生长，不可能直接确定分枝杆菌悬浮液中的CFU的数目(经确定低估大约100倍)。使用如下确定的计算估测：图1所示的微生物的大小与大肠杆菌的大小(0.5x2μm：Imaging whole Escherichia coli bacteria byusing single-particle x-ray diffraction.Miao J，等人.PNAS 2003，100：110-112)类似，因而允许基于单个大肠杆菌的重量(其为665飞克(fg)(Single cell detection withmicromechanical oscillators.Illic，B，等人，J.Vac.Sci.Technol.B.2001，19(6)：2825-2828))计算出10％w/v草分枝杆菌悬浮液的估测CFU。
表5.高压均质化对完整分枝杆菌的数目的影响
在表5中显示的结果证实，5个高压均质化循环的应用与悬浮液中的分枝杆菌的有效破碎(99.42％-基于上述计算)相一致。在5个高压均质化循环以后的低速离心导致完整的活分枝杆菌细胞的数目比没有经历高压均质化的等同草分枝杆菌样品减少了5,000倍。使用得自低速离心的上清液的进一步高压均质化步骤的应用，产生额外的0.007％含量，其代表完整的活分枝杆菌细胞的数目比没有经历高压均质化的等同草分枝杆菌样品减少了2,895倍。
应当认识到，在本实施例中证实的重要原理是，由使用额外的均质化步骤产生的意外益处是完整分枝杆菌(其是被认为耐受高压均质化的革兰氏阳性微生物)的进一步破碎，以及通过使用不同的均质化步骤控制在低速离心上清液中含有的分枝杆菌细胞壁RNC级分的完整分枝杆菌水平的能力。
实施例3
包含分枝杆菌细胞壁和RNA的组合物(MpRNC)的制备
为了进一步证实上述的新方案用于制备分枝杆菌细胞壁组合物的实用性，开发了需要使用不同的均质化压力和均质化循环次数的新方法，其能够制备含有分枝杆菌细胞壁的新分枝杆菌细胞壁-RNA组合物(MRNC)，并且包括：a)完整分枝杆菌细胞含量的受控减小；b)确定长度的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸的产生；和c)意外的免疫刺激活性的产生。
在本实施例中，如在实施例1中所述制备分枝杆菌细胞群(使用草分枝杆菌作为分枝杆菌细胞群的示例性的和代表性的例子，并且应当认识到，在本实施例中描述的制备方法适用于细菌和分枝杆菌)。首先通过低速离心洗涤完整草分枝杆菌细胞以除去培养基组分，然后使用Avestin EmulsiFlex-C5高压匀浆器(Avestin，Ottawa，Ontario，加拿大)使用高压均质化破碎。在高压均质化以后，使用相对离心力通过差速离心除去剩余的完整分枝杆菌细胞，所述相对离心力针对任何残余的、完整的且未破碎的分枝杆菌的受控除去以及可溶物(细胞质内容物，包括蛋白)的消除进行了优化。通过在更高的相对离心力离心洗涤，进一步纯化不含完整分枝杆菌细胞的制品，所述制品包含与分枝杆菌细胞壁碎片相混合的呈寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸形式的分枝杆菌RNA，以便除去可溶性的污染物。在高相对离心力离心洗涤以后，MpRNC级分分离为沉淀物。如下确定MpRNC级分中的活分枝杆菌的数目：将不含分枝杆菌完整细胞的级分的系列稀释物铺板在胰蛋白酶大豆琼脂生长培养基上，在37℃温育72-96h，并确定菌落形成单位(CFU)的数目。然后将MpRNC悬浮液在121℃热处理5-30min。表6显示了用于制备具有高、中间或低完整分枝杆菌细胞含量的MpRNC(以后分别称作MpRNC高、MpRNC中间和MpRNC低)的步骤。
表6.含有高、中间和低水平的完整草分枝杆菌的MpRNC的制备
在表7中显示的结果显示了使用表6所述的操作制备的MpRNC中的CFU的数目。
表7.具有不同的完整分枝杆菌细胞含量水平的MpRNC的制备
*基于665fg/细菌的完整细菌重量(Single cell detection withmicromechanical oscillators.Illic，B，等人，J.Vac.Sci.Technol.2001，B.19(6)：2825-2828)
数据表明，通过增加均质化压力和MpRNC经历的均质化循环的数目，在MpRNC中存在的活完整草分枝杆菌细胞的数目发生显著的且更重要的是受控的减少。完整分枝杆菌的重量百分比的计算(基于665fg的细菌重量)表明＜0.2％(MpRNC低)至19.6％(MpRNC高)的受控范围。 本领域技术人员会认识到，通过适当地使用确定的方法，诸如均质化压力的受控应用、均质化循环的数目和在本发明中描述的差速离心的应用，因此可以将MpRNC中的活分枝杆菌细胞的数目容易地控制在100倍范围内。
实施例4
从牛分枝杆菌菌株BCG、耻垢分枝杆菌和牝牛分枝杆菌制备MRNC
在本实施例中，使用3种不同的分枝杆菌(1种已知在培养时缓慢生长，2种已知在培养时快速生长)，来制备不同的MRNC组合物。这样，本实施例连同本发明的实施例1、2和3教导了本领域技术人员如何从任意分枝杆菌种或菌株制备MRNC。为了保留核酸成分，在到处使用无核酸酶的(无RNA酶的且无DNA酶的)试剂。本领域技术人员在阅读本发明以后还会认识到，如在用于从草分枝杆菌制备MpRNC的实施例1、2和3中详细描述的不同的均质化循环和压力的应用和差速离心的选择性应用，使得能够从用于期望用途的其它物种制备含有最佳完整分枝杆菌细胞水平的RNC组合物。
得自分枝杆菌生物质或得自商购可得的来源的牛分枝杆菌BCG可以用于制备MbRNC组合物。在本实施例中，使用BCG的Connaught菌株。BCG可作为含有2-10x108CFU/mg的低压冻干的粉末(Immucyst，Aventis，Toronto，ON，加拿大)商业得到。首先将所述低压冻干的粉末再悬浮于注射用水(Wisent)中在20℃保持30min，间隙地涡旋。通过低速离心，沉淀悬浮的细胞，然后使用Avestin EmulsiFlex-C5高压匀浆器使用高压均质化破碎，随后如关于MpRNC中间缩合上，经过少许修改，进行差速离心以分离MbRNC。具体地，对在注射用水中的0.243％w/v牛分枝杆菌BCG悬浮液在4℃进行5个18,000psi高压均质化循环，并用热交换器循环水。然后将匀浆物在3,160xg离心30min，以沉淀任何残余的、完整的且未破碎的牛分枝杆菌BCG。然后将上清液(其含有与分枝杆菌细胞壁碎片混合的分枝杆菌RNC)在38,400xg离心1小时，以除去可溶性的污染物，并沉淀RNC和牛分枝杆菌BCG细胞壁(MbRNC)。然后将沉淀物再悬浮于注射用水中，并如上所述均质化2个额外的循环。将含有牛分枝杆菌MbRNC的悬浮液在121℃热处理5-30min。
使用得自培养的分枝杆菌生物质的耻垢分枝杆菌(得自ATCC，马纳萨斯，VA，菌株14468)来制备MsRNC。如在实施例1中所述，制备耻垢分枝杆菌细胞。首先通过低速离心洗涤完整分枝杆菌(耻垢分枝杆菌)以除去培养基组分，然后使用Avestin EmulsiFlex-C5高压匀浆器使用高压均质化破碎，随后如关于MpRNC所述差速离心。详细而言，对在注射用水中的10％w/v耻垢分枝杆菌细胞悬浮液进行5个18,000psi高压均质化循环。然后将匀浆物在4℃在3,160xg离心30min，以沉淀完整的且未破碎的分枝杆菌。然后将上清液(其含有与分枝杆菌细胞壁碎片混合的分枝杆菌RNA)在4℃在38,400xg离心1小时以除去可溶性的污染物，并沉淀MsRNC。然后将MsRNC沉淀物再悬浮于注射用水中，并如上所述均质化2个额外循环。将含有耻垢分枝杆菌RNC(MsRNC)的悬浮液在121℃热处理5-30min。
在补充了OADC富集物(BD Diagnostic System，Sparks，马里兰州，美国)的Middlebrook7H9培养液中培养牝牛分枝杆菌(菌株ATCC15483，美国弗吉尼亚州马纳萨斯美国典型培养物保藏中心(American TypingCulture Collections))。将沉淀的细菌在-20℃保存备用。由于迄今未知的生长因子在OADC富集物中的存在，补充了OADC富集物(BD)的Middlebrook 7H9培养液的应用，允许与在合成培养基中的生长相比牝牛分枝杆菌的最佳生长。在本实施例中，使用本文所述的新制备方法来确保没有向外源物的额外暴露。首先通过低速离心洗涤所述细胞以除去培养基组分，然后使用Avestin EmulsiFlex-C5高压匀浆器使用高压均质化破碎，随后如关于MpRNC所述进行差速离心。详细而言，对在注射用水中的10％w/v牝牛分枝杆菌悬浮液进行5次18,000psi高压均质化循环。然后将上清液(其含有与分枝杆菌细胞壁碎片混合的分枝杆菌RNA)在4℃在38,400xg离心1小时以除去可溶性的污染物，并沉淀MvRNC。然后将所述沉淀物再悬浮于注射用水中，并如上所述均质化2个额外循环。将含有牝牛分枝杆菌RNC(MvRNC)的悬浮液在121℃热处理5-30min。
实施例5
从革兰氏阴性细菌制备BRNC
可以如下从一种或几种革兰氏阴性细菌制备本发明的BRNC组合 物：例如，破碎细菌，随后进行苯酚/氯仿/异戊醇萃取和乙醇沉淀(参见：Short Protocols in MolecularBiology，第3版，Ausubel等人.编，John Wiley&Sons Inc.，New York，美国)。可以使用酶方法，所述酶方法用于在提取含有核酸的组合物之前消化不希望的化学物质，并由此优化产量。例如，将革兰氏阴性细菌悬浮于5mL无RNA酶的50mM Tris-HCl、5mM EDTA、pH8.0中，加入无RNA酶的溶菌酶(Sigma-Aldrich)至1mg/mL的浓度，并在37℃温育90min。然后加入无RNA酶的蛋白水解酶K(Invitrogen，Burlington，Ontario，加拿大)至得到0.1mg/mL的终浓度，加入无RNA酶的十二烷基硫酸钠(BioRad，Richmond，California)至得到1％w/v的终浓度，并继续在65℃温育10min。然后通过苯酚/氯仿/异戊醇萃取，分离核酸。可以任选地处理含有RNA的组合物(例如，通过使用高压均质化、机械剪切、超声处理或高压灭菌)，以得到本发明的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸。
通过使用如在本发明的实施例1、2、3和4中描述的高压均质化和差速离心和热处理，可以任选地使用细菌RNA来制备细菌细胞壁RNC制剂(BRNC)，使得它们具有抗癌和免疫刺激活性。所述BRNC可以另外与药用载体相组合，所述药用载体例如但不限于如在实施例36和37中描述的阳离子脂质体或纳米颗粒。
实施例6
从革兰氏阳性细菌制备BRNC或MRNC
可以如下从一种或几种革兰氏阳性细菌(包括分枝杆菌)制备本发明的BRNC组合物和MRNC组合物：例如，破碎细菌或分枝杆菌，随后进行苯酚/氯仿/异戊醇萃取和乙醇沉淀(参见：Short Protocols in Molecular Biology，第3版，Ausubel等人.编，John Wiley&Sons Inc.，New York，美国)。可以使用酶方法，所述酶方法用于在提取RNA之前消化不希望的化学物质，并由此优化产量。作为上述的新颖方法的适用性的一个例子。将革兰氏阳性细菌悬浮于5mL无RNA酶的50mM Tris-HCl、5mM EDTA、pH8.0中，加入无RNA酶的溶菌酶(Sigma-Aldrich)至1mg/mL的浓度，并在37℃温育90min。然后加入无RNA酶的蛋白水解酶K(制备自Tritirachium album.Invitrogen，Burlington，Ontario，加拿大)至得到0.1mg/mL的终浓度，加入无RNA酶的十二烷基硫酸钠(BioRad， Richmond，California)至得到1％w/v的终浓度，并继续在65℃温育10min。然后通过苯酚/氯仿/异戊醇萃取和乙醇沉淀，分离RNA。
可以任选地处理BRNC和MRNC(例如，通过使用高压均质化、机械剪切、超声处理或热处理)，以得到本发明的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸。
通过使用如在本发明的实施例1、2、3和4中描述的高压均质化和差速离心和热处理，可以任选地使用细菌RNA来制备BRNC制剂，使得它们具有抗癌和免疫刺激活性。所述细菌RNC可以另外与药用载体相组合，所述药用载体例如但不限于如在实施例36和37中描述的阳离子脂质体或纳米颗粒。
通过使用如在本发明的实施例1、2、3和4中描述的高压均质化和差速离心和热处理，可以任选地使用分枝杆菌RNA来制备MRNC制剂，使得它们具有抗癌和免疫刺激活性。所述MRNC可以另外与药用载体相组合，所述药用载体例如但不限于如在实施例36和37中描述的阳离子脂质体或纳米颗粒。
实施例7
分枝杆菌细胞壁组合物中的完整分枝杆菌细胞的形态学检查
使用透射电子显微术(TEM)，进行分枝杆菌细胞壁组合物的形态学对比。应当认识到，在本实施例中，使用MpRNC作为BRNC和MRNC的完整细胞含量的一个示例性的和代表性的例子。
如在实施例1中所述制备草分枝杆菌生物质的样品，如在实施例3中所述制备MpRNC高、中间和低的样品，如在美国专利号6,326,357中所述制备MCC的样品，如在美国专利号5,759,554中所述制备MCWE的样品。后两种制备方法都使用利用链霉蛋白酶/胰蛋白酶消化和苯酚/脲处理的操作。使用TEM检查所有样品的形态。将制备为在注射用水中的悬浮液的样品(1mg/mL w/v)用5％w/v戊二醛预缀合(体积比：1∶1)1小时。离心(8,000xg离心10min)以后，将沉淀物悬浮于新鲜的2.5％v/v戊二醛中，并在4℃温育过夜。温育以后，用洗涤缓冲液洗涤样品，并在进一步处理之前在4℃保存在洗涤缓冲液中。在洗涤缓冲液中洗涤3次以后，用四氧化锇和亚铁氰化钾将样品预染色2小时，洗涤，并在丙酮中脱水。然后用在丙酮中的递增浓度的EponTM渗透样品，并在58℃ 聚合48小时。将厚切片(90-100nm)放在200-目铜网格上，并用乙酸双氧铀、随后用Reynolds铅染色。在JEOL JEM-2011 200kV w/Fas TEM w/Quartz XOne Microanalytical System和Gatan DualView 300W1.3kx1kCCD照相机或配有AMT2kx2k CCD照相机的Philips CM200 200 kVTEM中检查样品。
形态学分析的结果显示在图1中。图1a显示了完整草分枝杆菌(用作参比物质)，图1b显示了根据美国专利号6,326,357制备的MCC，且图1c显示了根据美国专利号5,759,554制备的MCWE。将未破碎的草分枝杆菌细胞观察为电子致密结构，且含有非常少的(如果有的话)细胞膜或细胞壁碎片。意外地观察到，由于在MCWE和MCC的制备中使用的差速离心步骤，它们的组合物是电子致密的和电子透明的结构的混合物，这与完整分枝杆菌和细胞壁碎片的混合物相一致(据估测分别为8.5和3.0％的完整细菌)。图1d、1e和1f表明，通过使用在本发明的实施例3中的制备方法，可以控制分别在MpRNC低、中间和高中的完整分枝杆菌的数目(据估测分别为0.0、2.5和12.5％)。
该形态学分析的结果证实，本发明的制备方法会导致MpRNC制剂的可控的完整分枝杆菌细胞含量。
实施例8
在分枝杆菌细胞壁组合物中的制备污染物
根据美国专利号5,759,554(MCWE)和美国专利号6,326,357(MCC)的分枝杆菌细胞壁制备都使用与苯酚/脲处理步骤相结合的蛋白水解酶消化(灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)链霉蛋白酶/牛胰蛋白酶)。这样的操作会导致蛋白水解酶和苯酚对最终的细胞壁组合物的污染，尽管这2篇专利都教导了洗涤操作用于消除这些和其它污染物的用途。
在本实施例中，通过HPLC，测定根据美国专利号5,759,554、美国专利号6,326,357制备的分枝杆菌细胞壁和根据本发明的实施例3制备的MRNC的苯酚含量/污染。使用MpRNC中间作为MRNC的一个代表性例子，并且应当认识到，在本发明的实施例3中教导的制备原理可适用于所有MRNC以及BRNC。
用12M HCl在100℃处理不同的分枝杆菌细胞壁组合物(1mg/mL，在注射用水中)或适当苯酚标准品(0-10μg/mL)在水中的悬浮液60min。 冷却后，用乙醚(2mL乙醚/mg细胞壁组合物)萃取分枝杆菌细胞壁组合物或苯酚标准品。除去乙醚相，并与0.05M NaOH在甲醇中的溶液混合(3mL/mg细胞壁组合物)。使用氮气流蒸发至干燥以后，将残余物溶解在水中(0.2mL/mg分枝杆菌细胞壁)，并通过HPLC分析100μL的苯酚含量。用于分析的HPLC系统利用Waters Breeze HPLC系统，该系统包括：717plus自动取样器、Waters 1525二元HPLC泵和Waters 248L双波长吸光度检测器，该系统连接至C-18反相分析型4.6x150mm柱(Waters，Nova-Pak C18，WAT 044375)，该柱填充了4μm硅胶(silica)(Waters Ltd.，Lachine，Quebec，加拿大)。使用100μL样品体积，在1.0mL/min的流量，使用下述梯度洗脱条件，在室温进行HPLC分离：洗脱液A是用1％醋酸(v/v)酸化的水，洗脱液B是100％乙腈。将洗脱液A在95％维持2min，然后历时15min线性地下降至60％，在此浓度保持3min。在270nm进行苯酚的紫外检测。
就外源性蛋白的检测而言，将20mL不同的分枝杆菌细胞壁组合物低压冻干72h的时段。使用改良的RIPA提取缓冲液(1％Triton X-100，0.5％NP-40％，1％ SDS，150mMNaCl，1mM EDTA，10mM Tris pH 7,5at 4℃)，从低压冻干的分枝杆菌细胞壁组合物中提取蛋白质。根据Macart方法(Macart和Gerbaut，1982 Clin.Chim.Acta 122：93-101)，测量提取物的总蛋白含量。用Laemmli样品缓冲液(62.5mM Tris-HCl，pH6.8，2％SDS，25％甘油，0.01％溴酚蓝和5％巯基乙醇)稀释样品，得到1mg蛋白/mL的浓度。将共60μL稀释的样品加载上10％-20％梯度SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad，Mississauga，Ontario，加拿大)，并在室温在140V电泳6h-8h小时。就校准而言，与样品平行地电泳分子量标准品混合物(Bio-Rad，Mississauga，Ontario，加拿大)。使用胶体蓝染色(Invitrogen，Carlsbad，CA，美国)，将凝胶中的蛋白在室温染色38h。从凝胶切离目标带(80，含有不同分子量的蛋白质)，并放入96-孔平板中，然后用水洗涤。根据生产商的说明书，在MassPrep液体处理机器人(Waters，Milford，MA，美国)上进行胰蛋白酶消化。简而言之，用10mM DTT还原蛋白质，并用55mM碘代乙酰胺烷基化。使用105mM改良的猪胰蛋白酶(测序级，Promega，Madison，WI，美国)，在58℃进行胰蛋白酶消化1h。用1％甲酸、2％乙腈、随后用1％甲酸、50％乙腈，提取消化产物。合并回收的提取物，真空离心干燥，然后悬浮于8μL0.1％甲酸中，并通过质谱 法分析4μL。通过在线反相(RP)纳米级毛细管液相色谱法(nanoLC)分离肽样品，并通过电喷射质谱法(ESMS/MS)进行分析。用Thermo Surveyor MS泵进行实验，所述泵连接至配备纳米电喷射离子源(ThermoFisher)的LTQ线性离子阱质谱仪(ThermoFisher，San Jose，CA，美国)。用历时30min的2-50％溶剂B(乙腈，0.1％甲酸)的线性梯度，在200nL/min(通过分流得到)，在PicoFrit柱BioBasic C18，10cmx0.075mm内径(New Objective，Woburn，MA)上进行肽分离。使用Xcalibur软件2.0版，使用数据依赖性的获取模式，获得质谱图。每个全扫描质谱图(400-2000m/z)之后进行7种最强离子的碰撞诱发的解离。启动动态排除(30秒排除持续时间)功能，并将相对碰撞碎片能量设定为35％。使用Mascot(Matrix Science，伦敦，UK；2.2.0版)，分析所有MS/MS样品。假定消化酶为胰蛋白酶，配置Mascot来检索Uniref100数据库。Mascot用0.50Da的碎片离子质量容差和2.0Da的母离子容差进行检索。将半胱氨酸的碘代乙酰胺衍生物指定为固定的修饰，并将甲硫氨酸的氧化指定为可变的修饰。允许2个丢失的胰蛋白酶消化切割位点。使用Scaffold(Proteome Software Inc.，Portland，OR)来验证基于MS/MS的肽和蛋白身份。如果按照肽预测(Peptide Prophet)算法(Keller，A等人Anal.Chem.2002；74(20)：5383-92)的规定，可以以大于95.0％概率确定它们，则接受肽身份。如果可以以大于95.0％概率确定它们，且其含有至少2个经鉴定的肽，则接受蛋白身份。通过蛋白预测(Protein Prophet)算法(Nesvizhskii，AI Anal Chem.2003 Sep 1；75(17)：4646-58)，指定蛋白概率。将含有类似肽且不能基于单独的MS/MS分析来区分的蛋白质分组，以产生最少数目的蛋白质。
得到的结果(表8)表明，MCWE和MCC被苯酚和蛋白酶氨肽酶(在灰色链霉菌的链霉蛋白酶中发现的主要蛋白水解酶)污染。如在实施例3、表7中所述制备的MpRNC不含苯酚或任何可检测的链霉蛋白酶组分。
表8.分枝杆菌细胞壁组合物的苯酚、链霉蛋白酶和胰蛋白酶污染
在表8中的数据证实，苯酚在分枝杆菌细胞壁的制备中的应用会导致可检测的苯酚和外源性蛋白(链霉蛋白酶氨肽酶)污染，其在MCWE和MCC的情况下是可比较的。使用本发明的制备方法(其中仅使用无RNA酶的注射用水来得到MRNC组合物)的一个优点是，得到的组合物没有苯酚和外源性蛋白污染。
苯酚是两亲的，并且它随后在分枝杆菌细胞壁中的存在与在分枝杆菌细胞壁的疏水区(共价连接的分枝菌酸)中的定位相一致，尽管有重复的基于离心的洗涤，它仍然保持捕集在所述疏水区中。
在MCWE和MCC中的污染蛋白质(特别是灰色链霉菌氨肽酶)的分析是阳性的，从而证实，在分枝杆菌细胞壁的制备中使用的酶处理会导致外源的且潜在免疫原性的蛋白质的存在。
实施例9
通过电泳确定的MpRNC组合物的核酸含量和分布
使用MpRNC中间作为MRNC的一个代表性例子，并且应当认识到，在本实施例中教导的分析可适用于所有的MRNC和BRNC组合物。
使用Bioanalyze系统(Bioanalyze#2100型，Agilent，Santa Clara，CA，美国)，电泳分析在热处理(121℃，30min)之前和之后收集的MpRNC中间在注射用水中的悬浮液的核酸分布。如在实施例6中所述，得到核酸级分。将核酸级分稀释至30ng/μL的浓度。使用RNA6000纳米试剂盒(Agilent#5067-1511)，用Bioanalyze电泳单元完成提取的核酸的长度的电泳分析。该试剂盒会提供关于在25-6000个核苷酸范围内的RNA的质 量的信息。然后使用小RNA试剂盒(Agilent Technologies Canada Inc.，St.Laurent，Québec，加拿大，试剂盒编号5067-1548)，进一步分析高压灭菌以后的MpRNC中间，所述试剂盒设计用于分析在6-150个核苷酸的大小范围内的小核酸。还使用小RNA试剂盒(Agilent)，分析在热处理(121℃，30min)以后的MpRNC高和MpRNC低。不同的电泳分析的结果显示在图2a和图2b中。
图2a证实，当使用RNA纳米6000试剂盒分析时，在高压灭菌之前的MpRNC中间具有在大约25个碱基至4000个碱基之间且接近后者的核酸分布。结果证实，高压均质化步骤(不同的循环压力和次数)用于制备MpRNC中间的用途，会产生含有链长度为25-4000个碱基的多核糖核苷酸的组合物。在高压灭菌之后，MpRNC中间显示出在25个碱基至200个碱基范围内的更紧凑的核酸分布(图2b)。使用小RNA试剂盒的进一步分析证实，与在高压灭菌之前从制品得到的分布相比，所有MpRNC制品(高、中间和低)具有可比较的(图2b)、但是在量上存在差别(高＞中间＞低)的核酸分布。
图2b证实，MpRNC中间具有最大值在20-40个碱基之间的寡核糖核苷酸峰，且具有在5-60个碱基长度之间的核酸分布。MpRNC组合物仅具有少量在100个碱基处洗脱的核酸材料，且具有甚至更少的在约150个碱基长度洗脱的寡核糖核苷酸材料。结果证实，高压均质化和热处理步骤(不同的循环压力和次数以及热处理)用于制备MpRNC的用途，会产生含有链长度小于60个碱基的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸的组合物。还在MpRNC低和MpRNC高中观察到可比较的核酸分布(图2b)。
实施例10
草分枝杆菌和MpRNC组合物中的核酸的分析
在本实施例中，确定了草分枝杆菌和MpRNC组合物(高-、低-和中间-)的核酸含量。如在实施例3中所述制备MpRNC组合物。应当认识到，在本实施例中，使用MpRNC作为MRNC的核酸含量的一个示例性的和代表性的例子。
使用下述操作，从各种组合物提取核酸。用无DNA酶的且无RNA酶的溶菌酶消化各种组合物的等分试样(700μL，在1mg/ml的浓度)，随 后灭活，并进一步用无DNA酶的且无RNA酶的蛋白水解酶K(二者得自Sigma-Aldrich Canada，Oakville，Ontario)消化。用苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1 v/v)萃取核酸，并通过加入糖原、醋酸钠和乙醇进行沉淀。用80％冰冷的乙醇洗涤沉淀物，并溶解在50μL蒸馏水中。通过在紫外分光光度计中测量在260/280nm的吸光度，确定浓度。每种组合物的核酸含量显示在表9中。
表9.MpRNC的核酸含量
组合物 核酸含量，ng/mg
草分枝杆菌 44,786
MpRNC低 2,683
MpRNC中间 4,470
MpRNC高 15,686
这些结果证实，在MpRNC(例如MpRNC高)中递增的完整分枝杆菌细胞的量与在MpRNC组合物中递增的核酸的量有关。结果也表明，MpRNC的核酸含量(2,683-15,686ng/mg)明显不同于完整草分枝杆菌的核酸含量(44,786ng/mg)。
实施例11
在MpRNC和高压灭菌的草分枝杆菌中的DNA与RNA之比的确定
使用MpRNC组合物作为MRNC的代表性例子并且应当认识到，在本实施例中教导的分析可适用于所有的MRNC和BRNC组合物。
首先如下分析在实施例3中制备的MpRNC高、MpRNC中间和MpRNC低以及高压灭菌的草分枝杆菌细胞(如在实施例1中所述制备)的DNA与RNA之比：使用RNA酶-A对提取的核酸进行酶消化，随后进行Bioanalyze 2100电泳分析，并使用Agilent小RNA试剂盒(试剂盒编号5067-1548)定量寡核糖核苷酸含量。
使用无DNA酶的核糖核酸酶A(RNA酶-A，在100℃处理30min以除去DNA酶活性)，进行提取的核酸(1260ng/μL，在RNA酶缓冲液中)的RNA酶-A消化(0.1μg酶，2h，在37℃)。所述RNA酶-A从Ameresco(Solon，OH，美国)得到。使用Bioanalyze，分析RNA酶A处理过的核酸 样品(20ng/μL)。使用下述方程式，确定MpRNC高、MpRNC中间和MpRNC低以及高压灭菌的完整草分枝杆菌细胞中的DNA和RNA的量：
DNA含量＝(总核酸含量-RNA酶-A处理以后的核酸含量)。
Bioanalyze分析的结果显示在图3a(关于MpRNC高)、图3b(关于MpRNC中间)、图3c(关于MpRNC低)和图3d(关于高压灭菌的草分枝杆菌完整细胞)中。对MpRNC(高-、低-和中间-)的关于RNA和DNA含量的分析结果显示在表10中。
表10.MpRNC组合物的DNA和RNA含量
组合物 DNA含量(％总核酸) RNA含量(％总核酸)
MpRNC低 0 100
MpRNC中间 0.24 99.76
MpRNC高 3.6 96.4
高压灭菌的草分枝杆菌 4.0 96.0
其次，如下使用更灵敏的定量方法，分析本发明的MpRNC(低、中间和高)的核酸含量和DNA与RNA之比：使用Microsep 1K单元(分子量截止＝1000Da，Sciences，Ann Arbor，MI，美国)，通过超滤来回收在实施例6中得到的核酸级分。然后按照Liang报道的操作(Liang等人，Ann.Chim.Acta2009，650：106-110)，使用核酸酶P1(Sigma-Aldrich，Oakville，ON，加拿大)将核酸溶液消化成5’-单磷酸核苷的混合物。为了确保最佳的核酸酶P1消化，将共50μL要消化的核酸水溶液在95-100℃在水浴中加热10min，随后立即在冰上冷却。在30mM的含有0.5mM ZnCl2的醋酸钠缓冲液(pH5.3)中，制备5单位/μL的核酸酶P1。对于酶消化，将50μL核酸水溶液与相同体积的核酸酶P1溶液混合，然后在50℃温育30min。将得到的混合物冷却至室温，并通过在10,000g在室温离心20min，穿过Nanosep 10K过滤器过滤，然后进行HPLC分析。
还对含有100、10、5、2.5、1ng/μL的每种单核苷酸(存在于DNA和RNA中)的单核苷酸标准品(脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸， Sigma-Aldrich)的混合物的系列稀释物进行核酸酶P1处理，并过滤，用作HPLC分析中的标准品。通过对比各种核苷酸在相同HPLC条件下的保留时间，确认这些核苷酸的洗脱次序。使用1200系列HPLC系统(Agilent，St-Laurent，Quebec，加拿大)进行HPLC分析，所述系统配备具有脱气器的四元泵、自动取样器、柱加热器和多波长紫外检测器。使用Zorbax Bonus-RP柱(Agilent)，流动相包含10mM磷酸钾缓冲液(pH7.2)和甲醇(0-10％甲醇)的线性梯度。在260nm检测单核苷酸。
在定量DNA和RNA脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸以后，确定DNA∶RNA比(表11)。
表11.在MpRNC高、MpRNC中间和MpRNC低中的量和DNA/RNA比
这些结果证实，按照从MpRNC高至MpRNC低的顺序，核酸含量总体减少了～50％，这与减少的完整草分枝杆菌细胞含量相一致。在该分析中的所有MpRNC组合物具有在MpRNC中间和MpRNC低中可比较的DNA与RNA之比。这些数据与下述事实相一致：按照从MpRNC高至MpRNC低的顺序，全部分枝杆菌细胞核酸被除去，使得MpRNC中的RNA与细胞壁结合，并因此就生物活性而言是最佳活性的。
实施例12
MpRNC、MbRNC、MsRNC和MvRNC的RNA与DNA比率
使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，对分枝杆菌RNC组合物进行它们的RNA∶DNA比率的电泳分析。应当理解，在本实施例中使用的分枝杆菌用作一般分枝杆菌的代表。如在实施例3和4中所述，从草分枝杆菌、牛分枝杆菌菌株BCG、耻垢分枝杆菌和牝牛分枝杆菌制备MRNC。如在实施例6中所述，制备核酸级分。将核酸级分(50μL)分成 各25μL的2个等分试样。用10μg RNA酶A(Amresco，Solon，Ohio，美国)处理1个等分试样，并用注射用水(Wisent，RNA酶且无DNA酶的)处理另一个，所述处理在37℃进行2小时，然后加载上在25V/cm预电泳的变性脲-PAGE凝胶保持2.5小时。用在1x Tris硼酸盐缓冲液(89mMTris，89mM硼酸，2mMEDTA，pH8.0)中10,000倍稀释的溶液(Invitrogen)，将凝胶染色15min，然后在312nm的波长进行紫外显影。使用得自NIH的ImageJ图像处理和分析软件(Bethesda，马里兰州，美国)，将凝胶图像数字化。结果显示在图4中。通过如在实施例11中关于草分枝杆菌RNC所述的微流体芯片RNA分析，确认通过变性PAGE电泳表现出的核酸的大小分布(图4a)。
RNA酶敏感的RNA的比例显示在图4b中。用RNA酶A处理分枝杆菌RNC的RNA级分，会导致MbRNC的信号强度下降26.3％，MsRNC的信号强度下降46.1％，MpRNC的信号强度下降53％，和耻垢分枝杆菌RNC的信号强度下降60％。因此，本发明的MRNC组合物含有RNA酶敏感的RNA。
牝牛分枝杆菌RNC、草分枝杆菌RNC和耻垢分枝杆菌RNC的RNA比例高于牛分枝杆菌BCG RNC，这与下述事实相一致：草分枝杆菌、耻垢分枝杆菌和牝牛分枝杆菌都是比牛分枝杆菌BCG生长得更快的物种，并且它们具有更强的核糖体RNA表达启动子和额外的核糖体RNA操纵子(Gonzalez-Y-Merchand，等人.1997.J.Bacteriol.179(22)：6949-6958)。这样的数据与增加的代谢要求相一致，所述增加的代谢要求表现为在更快生长的分枝杆菌种的mRNA和rRNA集合中增加的RNA水平。
实施例13
MpRNC的脂质含量
确定了在MpRNC中存在的分子种类的脂质含量。应当认识到，在本实施例中，使用MpRNC中间作为用本发明的实施例2和3所述的操作制备的MRNC的脂质含量的一个示例性的和代表性的例子。还应当认识到，不同的分枝杆菌种具有不同的分枝菌酸谱，但是在本实施例中教导的原理可适用于分枝杆菌科和分枝杆菌属。
在从分枝杆菌制备细胞壁组合物时，经常用溶剂处理它们以除去脂 质(参见例如Ribi等人，1966，J.Bacteriol.，91：975-983，其中描述了石油醚或丙酮的应用)。由于化学试剂对共价地连接的和不可提取的脂质物质的溶解，这样的操作具有溶剂污染的风险。分枝杆菌的脂质常规地分成2类：非共价地结合并因此是有机溶剂或去污剂可提取的脂质(包括海藻糖单和二霉菌酸酯和脂蛋白质)，和与细胞壁共价地结合的脂质(分枝菌酸)。除非进行皂化，否则有机溶剂或去污剂提取仅会除去非共价地结合的脂质。确定了在本发明的实施例3中描述的MpRNC的制备方法对MpRNC的脂质含量的影响。
使用改进的Dole操作，其用于提取非共价地结合的游离脂质，包括磷脂、糖脂和游离脂肪酸(Dole和Meinertz，1960，J.Biol.Chem.235：2595-2599，所述改进参见Puttmann等人，1993Clin.Chem.39：825-832)。将1mL MpRNC中间沉淀物或上清液(得自实施例3的制备方法的步骤3，从10mg/mL的MpRNC中间在注射用水中的悬浮液制备，并进行高速离心)加入3mL溶剂混合物正庚烷/异丙醇/磷酸(10/40/1，v/v/v)中，并在具有螺口帽的玻璃试管中剧烈混合。将所述混合物在室温温育30min。加入1mL正庚烷、随后加入1mL水以后，拧紧试管的帽，彻底混合，并静置沉降。收集上面的有机相，通过加入1mL庚烷，萃取含有去脂质化的细胞壁或上清液的剩余水相。然后合并2个庚烷相(其含有可萃取的非共价地结合的游离脂质)，并在具有螺口帽的玻璃试管中在氮气流下在50℃干燥，直到彻底干燥。在衍生化之前，在4℃避光保存干燥的脂质萃取物。收集含有除去游离脂质的MpRNC的残余物，在-20℃保存，并用于萃取共价地结合的脂质(定义为共价地连接的分枝菌酸细胞壁级分)。
如下进行用于HPLC的脂肪酸的衍生化。首先，将0.1mL KHCO3溶液(4g KHCO3溶解在98mL水和98mL甲醇中)加入干燥的游离脂质萃取物中，并在过滤空气流下在50℃风干。然后，加入1mL正庚烷和50μl对-溴苯酰基-8试剂(Pierce Chemical Co.Rockford，IL，美国)，并彻底混合。密封所述试管，并在85℃加热30min。冷却至室温以后，通过加入1mL HCl(6M)-甲醇-水混合物(1∶2∶1)，澄清溶液，并剧烈涡旋。将所述试管静置5min，然后将有机层收集在玻璃瓶中，并在氮气流下干燥。在反相-HPLC与紫外检测分析联用(RP-HPLC-UV)之前，将干燥的对-溴苯酰基衍生化的游离脂质在4℃避光保存。
使用具有二元泵和双波长吸光度紫外检测器的Waters Breeze HPLC系统(WatersLtd.，Lachine，Quebec，加拿大)，进行非共价地结合的脂质和游离脂肪酸的对-溴苯酰酯衍生物的RP-HPLC-UV分析。使用4微米反相分离柱(Waters，Nova-Pak，C184.6mmx150mm)进行分析。将干燥的对-溴苯酰酯脂肪酸衍生物溶解在100μL乙腈中，并将5μL注射进柱中用于分离，其中在0-20min使用77％乙腈和23％水的梯度混合物：从20min至25min，使乙腈的浓度从77％升高至96％，然后在分析的最后5min，从96％下降至77％，流速为0.25mL/min。柱温度为30℃，在254nm检测到峰。使用肉豆蔻酸(C14:0)(Sigma-Aldrich，Oakville，Ontario，加拿大)作为用于定量游离脂质的脂肪酸标准品。
在氮气流下在50℃干燥萃取非共价地结合的脂质以后剩余的步骤3沉淀物和步骤3上清液的级分，然后在具有螺口帽的玻璃试管中，用2mL水解试剂(50％w/v的氢氧化钾在水中的溶液和50％甲醇，1∶1，v/v)在100℃水解1小时，以释放共价地结合的脂质。冷却至室温以后，加入2mL氯仿，随后加入1.5mL酸化试剂(浓HCl/甲醇(1∶1，v/v))。在剧烈混合以后，将所述试管静置5min进行相分离。回收氯仿相(下面的相)，并转移进具有-螺口帽的新玻璃试管中。然后用1mL氯仿重新萃取剩余的水相另外2次。合并3个氯仿相，并在氮气流下在80℃干燥，在衍生化之前在4℃避光保存。
如关于可提取脂类所述，但是用氯仿替代正庚烷，进行水解的共价结合的脂肪酸的衍生化。在RP-HPLC-UV游离脂质分析之前，在4℃避光保存干燥的对-溴苯酰基衍生化的脂肪酸。
使用具有二元泵和双波长吸光度紫外检测器的Waters Breeze HPLC系统，进行共价结合的脂质的对-溴苯酰酯衍生物(在该分析定义为分枝菌酸级分)的RP-HPLC-UV分析。使用4微米反相分离柱(Waters，Nova-Pak，C18 4.6mmx150mm)进行分离。将干燥的对-溴苯酰酯分枝菌酸衍生物溶解在100μL二氯甲烷中，将20μL注射进柱中，并在254nm检测。使用山嵛酸(C22:0，Sigma-Aldrich)作为用于定量共价地结合的脂质的内部标准品。使用甲醇/二氯甲烷梯度(历时20min从98％甲醇/2％二氯甲烷至20％甲醇/80％二氯甲烷)，以2.5mL/min的流速，洗脱该柱。使用山嵛酸(C22:00，Sigma-Aldrich，Oakville，Ontario，加拿大)作为用于定量的内部标准品，并使用内部低和高分枝菌酸标准品(普遍认为分 别是～C40:n和～C110:n，最初得自Corixa Corporation Seattle，Washington，美国)来估测第1簇和第2簇中的分枝菌酸的碳链长度。
MpRNC中间的非共价地连接的脂质(可提取的)和共价地连接的脂质分析的结果显示在图5a和图5b中以及表5中。图5A表明，在提取和水解以后结合的脂质主要由碳链长度小于C22的短链脂肪酸构成，并且存在草分枝杆菌特有的2个分枝菌酸簇。图5B表明，在皂化以后得到的可水解的脂质由低和高分子量物质组成，并且2个分枝菌酸簇是在2种分枝菌酸标准品之间(图5b)。分枝菌酸标准品的保留时间和碳链长度之间的关联经确定是线性的。
在皂化以后得到的脂质峰被分类为具有0.5-5min的洗脱时间的短链脂肪酸(在该分析中定义为，在水解过程中，分枝菌酸蜡酯分解为更低分子量的二羧酸和醇的结果)、分枝菌酸第1簇(洗脱时间7-9min，包含45-55个碳的分枝菌酸)和分枝菌酸第2簇(洗脱时间10.5-13.5min，包含70-85个碳的分枝菌酸)。这些级分各自在在步骤3沉淀物和上清液中的量显示在表12中。
表12.在MpRNC中间中的非共价地和共价地结合的脂质
得自实施例3的步骤3的MpRNC中间的高速离心沉淀物(其含有MpRNC组合物)含有可提取的脂质以及共价地结合的脂质。所述共价地结合的脂质(被认为代表分枝菌酸)占总脂质的90％。相比而言，高速上清液含有极少的共价地结合的脂质，大部分脂质是非共价地结合的(93％)。
在另一个实验中，在氮气流下在50℃干燥共30mg MpRNC中间和MCC，然后在具有螺口帽的玻璃试管中用2mL水解试剂(50％w/v氢氧化钾水溶液和50％甲醇，1∶1，v/v)在100℃水解1小时，以释放共价地结合的脂质。冷却至室温以后，加入2mL氯仿，随后加入1.5mL酸化试剂(浓HCl/甲醇(1∶1，v/v))。在剧烈混合以后，将所述试管静置5min进行相分离。回收氯仿相(下面的相)，并转移进具有-螺口帽的新玻璃试管中。然后用1mL氯仿重新萃取剩余的水相另外2次。合并3个氯仿相，并在氮气流下在80℃干燥，称重。进行萃取2次，脂质含量为14.1±5.1mg/30mg MCC和9.7±0.14mg/30mg MpRNC中间。
这样的高脂质含量(和低分枝菌酸含量)在上清液中的存在与通过高压均质化破碎分枝杆菌以后非细胞壁脂质(可提取的、非共价地结合的脂肪酸和非共价地连接的霉菌酸酯)的释放相一致，且其通过实施例3所述的差速高速离心步骤从细胞壁组合物中除去。因此，该操作消除了为减少分枝杆菌细胞壁组合物的脂质含量而用有机溶剂或去污剂提取的必要性和污染风险。但是，实施例3的制备方法会保留共价结合的分枝菌酸(分枝杆菌细胞壁的镶嵌组分)，从而提供了通过分枝菌酸簇分析确定地鉴别来自给定的分枝杆菌种的细胞壁的益处。
实施例14
MpRNC高、MpRNC中间、MpRNC低和高压灭菌的草分枝杆菌的二氨基庚二酸(DAP)和丙氨酸含量
在本实施例中，使用MpRNC中间组合物作为MRNC的一个代表性例子，并且应当认识到，在本实施例中教导的分析可适用于所有的MRNC，且许多BRNC组合物从但不限于诺卡尔菌属各种、红球菌属各种和棒杆菌属各种制备。
二氨基庚二酸(2，6-二氨基庚二酸，DAP)和丙氨酸(ALA)是草分枝杆菌的肽聚糖的主要组分。肽聚糖本身是分枝杆菌细胞壁的主要组分。DAP参与肽链间连接，且ALA是肽聚糖的肽链的组分。因此，DAP和ALA含量的测量会提供完整分枝杆菌细胞含量程度的间接测定，其中增加的分枝杆菌细胞含量会导致降低的DAP含量。通过HPLC分析，确定MpRNC高、MpRNC中间、MpRNC低和高压灭菌的草分枝杆菌细胞的DAP和ALA含量。在HPLC级水中稀释MpRNC高、MpRNC中间、 MpRNC低和高压灭菌的草分枝杆菌细胞至0.2mg/mL的浓度。将每个稀释的样品制品的20μL等分试样连同各自的水解空白和牛血清白蛋白对照在热解试管中在真空下干燥，并使用6M HCl蒸汽在165℃水解60min。用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)(AccQ Fluor Reagent试剂盒，Waters，Milford，MA，美国)衍生化DAP和ALA。使用合成的和商购可得的DAP和ALA，制备标准曲线。使用一式三份样品，通过HPLC(每种样品5μL注射体积，使用ACCQ-Tag Novo-Pak C184μm，3.9x150mm柱[Waters]和配有荧光和紫外检测器的Agilent Model 1100，Santa Clara，CA，USA HPLC)测定MpRNC高、MpRNC中间、MpRNC低和高压灭菌的草分枝杆菌细胞的DAP和ALA含量。DAP和ALA含量测定结果显示在表13中。
表13.MpRNC高、MpRNC中间、MpRNC低和高压灭菌的草分枝杆菌的DAP和ALA含量
组合物 ALA(mol％)* DAP(mol％)*
MpRNC高 15.8 2.6
MpRNC中间 21.6 7.0
MpRNC低 23.8 10.1
高压灭菌的草分枝杆菌 14.8 2.7
*将ALA和DAP的结果表示为氨基酸分析的mol％
表13证实，随着在MpRNC(高至低)中存在的完整分枝杆菌细胞的数目的减少，ALA和DAP含量相应地增加。结果与下述事实相一致：按照从MpRNC高至MpRNC低的次序，MpRNC组合物中的细胞壁肽聚糖含量的增加伴随着完整分枝杆菌细胞的减少。表11和表13还一起表明，含有细胞壁的寡核糖核苷酸/多核糖核苷酸制剂组合物的分离与增加的肽聚糖量(通过DAP和丙氨酸测量来确定，或通过丙氨酸测量(对于不含DAP的那些细菌和分枝杆菌)来确定)有关，并且减少的DAP和丙氨酸的量与增加的完整分枝杆菌水平有关。因此，这样的测量可以用于准确地证实和控制这样的组合物的完整分枝杆菌(或细菌)含量。
实施例15
MpRNC蛋白含量
在本实施例中，使用MpRNC中间组合物作为MRNC的一个代表性例子，应当认识到，在本实施例中教导的分析可适用于所有的MRNC和BRNC组合物。
将如本发明的实施例3所述制备的MpRNC中间的蛋白含量与草分枝杆菌细胞的含量进行对比。为了确保蛋白含量的准确测定，将样品制成在注射用水中的1mg/mL悬浮液，并进行探头超声处理，以确保任何完整分枝杆菌的破碎，并由此确保蛋白的准确测定。在超声处理之前和之后，测定蛋白含量。对草分枝杆菌完整细胞(使用MCMC-C，根据本发明的实施例1培养)和根据本发明的实施例3制备的MpRNC中间(二者在1mg/mL的浓度，在注射用水中)进行探头超声处理(Misonix Inc，％”探头，设置8，在冰上1-15min)。使用Macart方法，在不同的时间取出样品用于蛋白分析。简而言之，如下测定蛋白含量：在微孔滴定板的孔中，将15μL适当的草分枝杆菌或MpRNC中间与300μL MACART溶液(L.Gerbaut和M.Macart，Clinical Chemistry(1982)32，353-355)混合，并在室温温育5min，此后使用微量培养板读数器在630nm测定OD。使用牛血清白蛋白的系列稀释物(2mg/mL蛋白质标准品，Sigma)作为参照，测定每个样品中的蛋白的量。分析结果显示在表14中。
表14.草分枝杆菌和MpRNC中间的蛋白含量
*一式三份分析的平均蛋白含量。
在表14中显示的数据表明，根据实施例3所述的方法制备的 MpRNC中间具有与草分枝杆菌相比明显不同的蛋白含量(分别是13％w/v相对于45％w/v)，从而证实，所述制备方法导致蛋白含量与起始细胞生物质相比的下降。这些数据还表明，在不使用额外破碎操作的情况下，MpRNC的蛋白含量被低估了大约30％。在MpRNC中间的超声处理以后得到的蛋白的轻微增加，与3个含有蛋白的隔室的存在相一致：蛋白分析试剂可接近的细胞壁碎片蛋白质，蛋白分析试剂不可接近的在细胞壁碎片内的蛋白质，和在残余的完整分枝杆菌内并且蛋白分析试剂也不可接近的蛋白质。在通过超声处理或其它方式破碎细胞壁碎片或细胞以后，这些蛋白质变得可接近。应当理解，MpRNC低和MpRNC中间和MpRNC高的蛋白水平将反映各种制剂中完整细胞与细胞壁碎片的比率。
实施例16
MpRNC会诱导人病原体相关分子模式受体(PAMP)NOD2的活化
核苷酸结合寡聚化结构域2(NOD2)是一种模式识别受体(PRR)，即负责感知与微生物病原体或细胞应激有关的病原体相关分子模式(PAMP)的不同受体家族之一。NOD2是胞壁酰二肽(MDP)的受体，已知所述胞壁酰二肽是具有免疫刺激活性的细菌肽聚糖的最小结构。已知NOD2MDP激动剂会活化先天性的免疫系统细胞(单核细胞、巨噬细胞和树突细胞)、调节炎症、具有镇痛活性、具有抗癌活性、具有抗感染活性、诱导人骨髓CD34+细胞的分化和通过它们的免疫佐剂活性而增加疫苗保护。已经证实，MDP和大量类似物和衍生物是用于治疗癌症和感染的有效试剂，且可以充当疫苗佐剂。
使用经工程改造成表达人NOD2受体和下游信号传递标志物IL-8(在NOD2驱动的NF-κB的控制下)的HEK-293细胞，评价了MpRNC的NOD2活化活性。应当理解，使用MpRNC作为MRNC的一个例子，并且在本实施例中教导的原理可适用于得自分枝杆菌科的MRNC。将MpRNC中间的活化NOD2的能力与根据美国专利号6,326,357制备的MCC进行了对比。
在含有5％CO2的增湿气氛下，在补充了10％胎牛血清(得自Wisent，St-Bruno，Québec，加拿大)、100μg/mL NormocinTM和10μg/mL杀稻瘟素(二者得自InvivoGen)的高葡萄糖DMEM(得自Wisent，St-Bruno，Québec， 加拿大)中，在37℃培养和维持人HEK293-NOD2细胞系(InvivoGen，San Diego，CA，美国)。以5x105个细胞/mL，将HEK293-NOD2细胞接种于在无菌的96-孔平底组织培养微量培养板内的0.2mL体积的上述细胞培养基中，并在含有5％CO2的增湿气氛下，与0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80和160μg/mL的MpRNC中间或MCC一起在37℃温育48小时。在温育以后，收集上清液，在4℃在4,000xRCF离心5min以除去细胞和碎片，并在-20℃保存上清液用于分析。借助于得自BioSource，Camarillo，CA，USA的商业的酶联免疫吸附测定(ELISA)，在与MpRNC中间悬浮液一起培养48小时以后，测量上清液中的人IL-8。使用KCJunior软件包(BioTek Instruments，Winooski，VT，美国)，从ELISA平板读数器(ELx-808IU BioTek Instruments，Winooski，VT，美国)捕获数据，并表示为pg/mL的合成的IL-8。
表15表明，MpRNC中间通过以浓度依赖性的方式诱导NOD2驱动的IL-8释放，以剂量相关的方式作为有效的NOD激动剂起作用，而根据美国专利号6,326,357制备的MCC作为NOD激动剂的有效性明显更低，仅在最高试验浓度观察到边缘活性。
表15.分枝杆菌细胞壁组合物的NOD2活化活性
显然，就通过NOD2受体介导的免疫刺激活性而言，MpRNC具有胜过其它分枝杆菌细胞壁组合物诸如MCC的显著的且意外的优点。
在一项单独的研究中，通过测定MpRNC高和MpRNC低相对于MpRNC中间的效能，对比了MpRNC高、MpRNC中间和MpRNC低的NOD2活化活性。如上所述在0.625、1.25、2.5、5、10、20、40和80μg/mL的剂量范围内测定了NOD2活化活性，并使用PHARM/PCS 4.2版软件(Microcomputer Specialists，Philadelphia，PA，美国)计算相对效能。在表16中显示的结果证实，MpRNC高和MpRNC低的NOD2活化活性与 MpRNC中间的活性没有不同。
表16.MpRNC(高、中间和低)用于活化NOD2的相对效能
MpRNC 相对效能
MpRNC中间 1.0
MpRNC高 0.9
MpRNC低 1.1
这些数据证实，完整分枝杆菌在不同的MpRNC组合物中的不同存在水平，对它们的活化NOD2的能力没有影响，并且所有的MpRNC组合物(高、中间和低)具有相同的活化该先天性免疫系统受体的能力。
实施例17
分枝杆菌RNC会诱导人病原体相关分子模式受体(PAMP)NOD2的活化
使用HEK-BlueTM-NOD2细胞，将从牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌和牝牛分枝杆菌制备的分枝杆菌RNC的NOD2活化活性与得自草分枝杆菌的RNC进行了对比，所述HEK-BlueTM-NOD2细胞被工程改造成表达人NOD2受体(InvivoGen，San Diego，CA，美国)，后者的活化会驱动在NOD2驱动的NF-κB控制下的分泌型胚性碱性磷酸酶(secretory embryonicalkaline phosphate，SEAP)的合成。上清液中的SEAP的测量，会提供NOD2活化的量度。
应当理解，使用得自草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌和牝牛分枝杆菌的MRNC作为分枝杆菌科的代表性例子，并且在本实施例中教导的原理和显示的数据可适用于得自其它分枝杆菌的MRNC。鉴于在实施例16中证实了MpRNC高、中间和低之间的活性的可比性，在本实施例中使用得自草分枝杆菌的MRNC中间组合物(MpRNC)。
在含有5％CO2的增湿气氛下，在补充了10％胎牛血清(得自Wisent，St-Bruno，Québec，加拿大)、30μg/mL杀稻瘟素、100μg/mL NormocinTM和ZeocinTM(二者得自InvivoGen)以及50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素(都得自Wisent)的高葡萄糖DMEM(得自Wisent，St-Bruno，Québec，加拿大)中，在37℃培养和维持HEK293-NOD2细胞系(Wisent，St-Bruno， Québec，加拿大)。以1x105个细胞/mL，将所述细胞接种于在无菌的96-孔平底组织培养微量培养板内的0.2mL体积的上述细胞培养基中，并与0.625、1.25、2.5、5、10、20、40和80μg/mL的MRNC中间一起温育72小时。在温育以后，收集上清液用于分析，并在4℃在4,000xRCF离心5min以除去细胞和碎片。在96-孔平底微孔滴定板中，将20μL上清液与180μL QUANTI-BlueTM(InvivoGen)在37℃混合2小时。使用KCJunior软件包(BioTek Instruments)，使用ELx-808IU微量培养板读数器(BioTek Instruments，Winooski，VT)，在630nm测量SEAP表达。图6显示了所有4种MRNC组合物对NOD2的剂量相关的活化。
所有MRNC组合物表现出NOD2活化活性。草分枝杆菌RNC是最有效的NOD2活化剂，其次是耻垢分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG和牝牛分枝杆菌。牛分枝杆菌BCG和牝牛分枝杆菌在最高试验剂量(80μg/mL)表现出NOD2的边缘活化。使用PharmPC V4.2(MicrocomputerSpecialists，Philadelphia，PA)，确定分枝杆菌RNC组合物相对于草分枝杆菌RNC而言活化NOD2的效能，并显示在表17中。
表17.分枝杆菌RNC相对于草分枝杆菌MpRNC的NOD2活化
分枝杆菌RNC 相对于草分枝杆菌RNC的NOD2效能
MpRNC中间 1.00
MbRNC中间 0.014
MsRNC中间 0.021
MvRNC中间 0.013
实施例18
MpRNC会诱导人病原体相关分子模式受体(PAMP)TLR2的活化
Toll-样受体2(TLR2)是一种负责感知通常与微生物病原体有关的病原体相关分子模式(PAMP)的模式识别受体(PRR)。细菌和分枝杆菌细胞壁结构组分诸如肽聚糖、脂甘露聚糖(LM)、脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)、脂蛋白质和脂肽似乎主要负责TLR2的活化。本领域技术人员已知，TLR2在包括巨噬细胞在内的许多免疫系统细胞上表达，并且TLR2的激动剂能够诱导这类细胞对许多趋化因子和细胞因子的合成。使用经工程改造成表达人TLR2受体的HEK293细胞，对比了如在本发明的实施 例3中所述制备的MpRNC中间和根据美国专利号6,326,357制备的MCC的TLR2活化活性，从而提供了测定免疫刺激潜力的方便的且被接受的方法。
应当理解，使用MpRNC中间作为MRNC的一个例子，并且在本实施例中教导的原理可适用于得自其它分枝杆菌的MRNC以及分枝杆菌科。
人体HEK293-TLR2细胞系得自InvivoGen，San Diego，CA，USA。用置于NF-kB基因控制下的TLR2基因和受体驱动的分泌型胚性碱性磷酸酶基因(SEAP)稳定地转染HEK293-TLR2细胞。因此，TLR2的活化会导致碱性磷酸酶活性在细胞培养基中的产生，所述活性用于定量受体活化。在含有5％CO2的增湿气氛下，在补充了10％胎牛血清(得自Wisent，St-Bruno，Québec，加拿大)和1x NormocinTM(InvivoGen)的高葡萄糖DMEM(得自Wisent，St-Bruno，Québec，加拿大)中，在37℃培养和维持所述细胞。以5x105个细胞/mL，将HEK293-TLR2细胞接种于在无菌的96-孔平底组织培养微量培养板内的0.2mL体积的HEK-BlueTM检测培养基(InvivoGen)中，并在含有5％CO2的增湿气氛下，与0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80和160μg/mL的MpRNC中间或MCC一起在37℃温育18小时。在温育以后，收集上清液用于分析，并在4℃在4,000xRCF离心5min以除去细胞和碎片。加入所述孔中的HEK-BlueTM检测培养基设计用于检测NF-kB诱导的可溶性的胚性碱性磷酸酶酶活性(SEAP活性)。在温育18小时以后，使用微量培养板读数器(ELx-808IU型，BioTek Instruments，Winooski，VT，美国)，在630nm测定光密度(其与通过TLR2结合活化的NF-kB成比例)。使用KC Junior软件包(BioTekInstruments)，捕获数据。
表18显示了TLR2的活化(表示为在630nm的OD)，并证实，使用在实施例3中描述的操作制备的MpRNC中间具有剂量相关的TLR2活化活性。MpRNC中间相对于MCC的效能测定表明，尽管活性与如在美国专利号6,326,357中所述制备的MCC的活性相当，MpRNC中间作为TLR2活化剂比MCC的有效性高10.6倍(测定使用PHARM/PCS4.2版软件，MicrocomputerSpecialists，Philadelphia，PA，美国)。
表18.MpRNC中间和MCC的TLR2活化活性
这些数据与如实施例16所示的MpRNC的活化NOD2的能力的评价数据一起证实，MpRNC细胞壁组合物对先天性免疫系统的2种受体具有双重激动剂活性，具体而言，为在不借助于使用合成激动剂的情况下活化NOD2和TLR2的能力。
实施例19
分枝杆菌RNC会诱导人病原体相关分子模式受体(PAMP)TLR2的活化
使用经工程改造成表达人TLR2受体的HEK-293细胞报告系统，测定如在实施例4中制备的分枝杆菌RNC组合物的TLR2活化活性，并与草分枝杆菌RNC中间进行对比。
人体HEK293-TLR2细胞系得自InvivoGen，San Diego，CA，USA。用置于NF-kB基因控制下的TLR2基因和受体驱动的分泌型胚性碱性磷酸酶基因(SEAP)稳定地转染HEK293-TLR2细胞。因此，TLR2的活化会导致碱性磷酸酶活性在细胞培养基中的产生，所述活性用于定量受体活化。在含有5％CO2的增湿气氛下，在补充了10％胎牛血清(得自Wisent，St-Bruno，Québec，加拿大)和1x NormocinTM(InvivoGen)的高葡萄糖DMEM(得自Wisent，St-Bruno，Québec，加拿大)中，在37℃培养和维持所述细胞。以5x105个细胞/mL，将HEK293-TLR2细胞接种于在无菌的96-孔平底组织培养微量培养板内的0.2mL体积的HEK-BlueTM检测培养基(InvivoGen)中，并在含有5％CO2的增湿气氛下，与2.5、5、10、20、40和80μg/mL的分枝杆菌RNC一起在37℃温育18小时。加入所述孔中的HEK-BlueTM检测培养基设计用于检测TLR2/NF-kB诱导的可溶性的胚性碱性磷酸酶酶活性(SEAP活性)。在温育18小时以后，使用微量培养板读数器(ELx-808IU型，BioTek Instruments，Winooski，VT)，在 630nm测定光密度(其与通过TLR2结合活化的NF-kB成比例)。使用KC Junior软件包(BioTek Instruments)，捕获数据。
图7表明，所有4种分枝杆菌RNC在2.5-80μg/mL的剂量范围内以剂量相关的方式诱导TLR2的活化。牝牛分枝杆菌RNC具有最高的活性，按照活性递减的次序，其次是耻垢分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG和草分枝杆菌RNC。使用PharmPC v4.2(Microcomputer Specialists，Philadelphia，PA，美国)，确定分枝杆菌RNC组合物相对于草分枝杆菌RNC用于活化TLR2的效能，并显示在表19中。
表19.分枝杆菌RNC相对于草分枝杆菌MpRNC的TLR2活化
关于TLR2的活化所观察到的效能范围(＜6倍差异范围)指示，所有4种分枝杆菌RNC组合物具有可比较的TLR2激动剂活性。显然，本领域技术人员在阅读本申请中的该实施例和其它实施例(例如NOD2活化)以后，在确定特定分枝杆菌RNC或它们的组合用于特定的或具体的预防性或治疗性应用的适用性时，将会利用与特定分枝杆菌RNC组合物有关的免疫刺激活性和免疫系统受体激动剂功能的最适当组合。
实施例20
MpRNC中间对TLR的刺激
普遍认为TLR2激动剂与得自革兰氏阳性细菌和分枝杆菌的细胞壁PAMP有关。普遍认为TLR3激动剂是双链病毒RNA。普遍认为TLR4激动剂是脂多糖。TLR5与细菌鞭毛蛋白特异性地相互作用。普遍认为TLR7和TLR8激动剂是单链RNA。普遍认为TLR9激动剂是含有CpG二核苷酸序列(CpG基序)的未甲基化的DNA。实施例18表明，MpRNC中间会刺激TLR2。MpRNC中间也含有RNA和DNA(实施例10)。因此， 确定了MpRNC中间的刺激TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8和TLR9的能力，以观察RNA和DNA在MpRNC中间中的存在是否导致核酸-特异性的TLR或任意其它TLR的活化。应当理解，使用MpRNC中间作为MRNC的一个例子，并且在本实施例中教导的原理可适用于得自分枝杆菌科的MRNC。
在经工程改造成表达一种特定TLR的HEK293细胞(InvivoGen)上，试验了MpRNC中间的TLR刺激活性。给定的TLR的活化导致NF-κB驱动的SEAP合成，如在实施例19中所述检测上清液中的所述SEAP的酶活性。如在实施例18中所述，使用90μg/mL的终浓度，用MpRNC中间处理表达不同TLR的HEK293细胞。在该研究中使用的阳性对照TLR激动剂以及在测定中使用的终浓度显示在表20中。
表20.TLR激动剂阳性对照
评价结果显示在表21中。所有的TLR激动剂对照产生阳性应答。用MpRNC中间观察到表达TLR2的HEK293细胞的显著刺激，并且尽管观察到表达TLR3或TLR5的HEK293细胞的一些弱刺激，这显著低于各自的阳性对照聚(I:C)和鞭毛蛋白(分别是阳性对照活性的3％和4％)。随后证实了TLR3和TLR5的明显刺激不是可再现的或剂量相关的，且在标准品浓度是无活性的，并因此认为是伪像。MpRNC中间没有刺激任意其它的TLR，包括RNA-特异性的TLR7和TLR8以及DNA CpG-基序特异性的TLR9。
表21.MpRNC中间的TLR激动剂活性
*4个制备的试验样品的平均值。
从这些数据得到3个结论。首先，MpRNC仅活化TLR TLR2；其次，RNA在MpRNC中间中的存在不会导致RNA-特异性的TLR TLR3、TLR7或TLR8的活化；第三，DNA在MpRNC中间中间中的存在不会导致CpG受体TLR9的活化，这证实了功能性CpG基序在MpRNC中间中的缺失。
实施例21
完整草分枝杆菌细胞对MpRNC组合物的免疫刺激活性的影响
使用细胞因子/趋化因子-诱导测定，确定了完整草分枝杆菌细胞的存在对如实施例2所述制备的MpRNC的免疫刺激活性的影响。具体地，测定了含有不同比例的完整草分枝杆菌细胞的MpRNC组合物的免疫刺激活性。应当认识到，该实施例用作完整分枝杆菌细胞对MRNC的免疫刺激活性的影响的一个示例性的和代表性的例子。应当理解，MpRNC用作MRNC的一个例子，并且在本实施例中教导的原理可适用于得自分枝杆菌科的MRNC。
通过在蔗聚糖-泛影葡胺(GE Healthcare，Ste-Anne-de-Bellevue，Québec，加拿大)上的密度-离心，从6个健康个体分离出外周血单核细胞(PBMC)。在低速离心抗凝血(肝素的锂盐)以除去血小板，并使用蔗聚糖-泛影葡胺通过垫层离心，分离PBMC。通过低速离心(在4℃在150xRCF离心10min)，在含有10％热灭活的胎牛血清(Wisent Inc.)和 10μg/mL庆大霉素(Sigma-Aldrich，Oakville，Ontario，加拿大)的RPMI1640(Wisent Inc.，St Bruno，Québec，加拿大)中洗涤分离的PBMC，并以5x105活细胞/mL培养基的浓度悬浮。将1mL铺板在24-孔组织培养板的孔中。将细胞在5％CO2气氛中在37℃温育24小时。将MpRNC中间或含有不同量的热处理的草分枝杆菌细胞(121℃，30min)的MpRNC中间加入组织培养板(对于IL-10诱导，终浓度为10μg/mL，对于IL-12p40诱导，终浓度为1μg/mL)，并将细胞在5％CO2气氛中在37℃温育另外48小时。除去上清液，通过0.2微米膜过滤进行澄清，并使用生产商的推荐操作，通过试剂盒ELISA(BioSource，Camarillo，CA，美国，目录号分别为KHC0102和KHC0122)，测定IL-10和IL-12p40的水平。
结果显示在图8中。可以看出，含有不同比例的高压灭菌的完整草分枝杆菌细胞(试验范围是100％MpRNC中间至100％高压灭菌的完整草分枝杆菌细胞，以反映在新制备方法和组合物中固有的完整分枝杆菌的潜在水平)的MpRNC中间(含有计算的0.7％w/w完整分枝杆菌)会以钟形应答诱导IL-10产生(图8上面的图)，高压灭菌的完整草分枝杆菌细胞的最佳比例是在约5-30％w/w的范围内。发现含有约5-30％w/w比例的高压灭菌的完整草分枝杆菌细胞的MpRNC中间对IL-10的诱导高于100％MpRNC中间组合物或包含100％高压灭菌的完整草分枝杆菌细胞的组合物。
图8(下面的图)表明，含有不同比例的高压灭菌的完整草分枝杆菌细胞(试验范围：100％MpRNC中间至100％高压灭菌的完整草分枝杆菌)的MpRNC中间组合物会以钟形应答诱导IL-12p40产生，高压灭菌的完整草分枝杆菌细胞的最佳比例是在约10-50％w/w的范围内。含有约10-50％w/w比例的高压灭菌的完整草分枝杆菌细胞的MpRNC中间组合物对IL-12的诱导高于包含100％MpRNC中间的组合物或包含100％高压灭菌的完整草分枝杆菌细胞的组合物。
方差分析(没有副本的双因素方差分析)表明，在MpRNC中的完整草分枝杆菌细胞的比例显著地影响细胞因子诱导(p＜0.025，在0.05的α)，并且由MpRNC诱导的IL-10和IL-12的水平是统计上不同的(p＜0.05E-6，在0.05的α)。
实施例22
MpRNC会诱导免疫效应细胞中的趋化因子和细胞因子合成
通过使用趋化因子/细胞因子分析试剂盒，分析了MpRNC的趋化因子和细胞因子诱导活性。应当理解，使用MpRNC作为MRNC的一个例子，并且在本实施例中教导的原理可适用于得自分枝杆菌科的MRNC。
通过全血(共13个健康个体)的蔗聚糖密度-梯度离心，分离出人PBMC。在含有10％v/v热灭活的胎牛血清(56℃/30min)(得自Wisent，St-Bruno，Québec，加拿大)和50μg/mL硫酸庆大霉素(Sigma-Aldrich Canada，Oakville，Ontario，加拿大)的RPMI1640培养基(得自Wisent，St-Bruno，Québec，加拿大)中，制备PBMC。将PBMC(1x106细胞)接种在6-孔平底微量培养板的1.0mL体积中，并在含有或不含(未处理的对照)160μg/mL终浓度MpRNC中间的上述细胞培养基中在37℃/5％CO2/100％湿度温育。在Bio-Plex 200系统(BioRadLaboratories，Hercules，CA，美国)上温育48小时以后，使用用于测定人趋化因子/细胞因子的 MAP试剂盒(Millipore Corporation，Billerica，MA，美国)，测量培养基中的细胞因子、趋化因子和造血生长因子水平。将显示的结果表示为趋化因子/细胞因子水平相对于未处理的PBMC的增加倍数平均值。
在表22中显示的结果证实，MpRNC中间具有刺激在PBMC中存在的免疫效应细胞产生许多趋化因子、细胞因子和细胞生长因子的能力，从而证实了它的充当免疫刺激物用于诱导趋化因子、细胞因子和细胞生长因子的能力。
表22.MpRNC中间对趋化因子、细胞因子和细胞生长因子的诱导
实施例23
刺激of GM-CSF，MU-CSF，M-CSF，G-CSF，SDF-1a和LIF合成in人外周血单核细胞byMpRNC
多集落刺激因子(MU-CSF；也被称作IL-3)(其除了刺激红细胞、树突细胞、粒细胞、巨核细胞和单核细胞、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、间质细胞衍生的因子-1α(SDF-1a)和白血病抑制因子(LIF)的产生以外，还刺激多能造血细胞分化成骨髓祖细胞)是表现出宽范围的生物学活性的人造血生长因子，所述活性包括：不同类型的靶细胞(祖细胞)的生长促进和细胞分化，血细胞生成和干细胞动员的刺激。确定了MpRNC中间的刺激免疫细胞合成这些生长因子的能力。应当理解，使用MpRNC中间作为MRNC的一个例子，并且在本实施例中教导的原理可适用于得自分枝杆菌科的MRNC。
通过在蔗聚糖-泛影葡胺上的密度-离心，从6个健康个体分离出外周血单核细胞(PBMC)。以0.5x106个细胞/mL，在6-孔组织培养板中将PBMC与1.6-160μg/mL MpRNC中间(如本文所述制备，参见表2和3)一起温育48小时。在48小时以后，使用具有适当珠子和抗体(使用Bi-Rad 或Millipore试剂)的系统(Bio-Rad，Mississauga，Ontario，加拿大)，测量在上清液中的MU-CSF、M-CSF、GM-CSF、G-CSF、SDF-1a和LIF的水平。在用MpRNC中间处理PBMC以后，上清液中的生长因子水平相对于对照处理的细胞的50％增加(≥1.5倍增加)用于定义阳性刺激效应。
表23表明，MpRNC中间会在所有测量的生长因子的合成中诱导剂量相关的刺激(＞1.5倍增加)。
表23：MpRNC中间对人PBMC中的GM-CSF、MU-CSF、M-CSF、G-CSF、SDF-1a和LIF合成的刺激
*将增加倍数表示为平均值±SD，n＝6
得自表23的数据表明，MpRNC会刺激存在于外周血中的免疫细胞合成造血生长因子，观察到GM-CSF和G-CSF的最大增加倍数，其次是多能生长因子MU-CSF。M-CSF、SDF-1a和LIF也表现出超过定义的应答阈值水平的增加。
实施例24
MpRNC对正常人泌尿道上皮细胞中的GM-CSF、MU-CSF和LIF合成的刺激
使用人膀胱上皮细胞，检查了MpRNC中间的刺激非免疫细胞的生长因子合成的能力。使用这些作为一般上皮细胞的一个例子。应当理解，使用MpRNC中间作为MRNC的一个例子，并且在本实施例中教导的原 理可适用于得自分枝杆菌科的MRNC。
以1.0x105个细胞/mL组织培养基(按照ATCC的推荐)，在96-孔组织培养板中将正常人泌尿道上皮细胞系SV-HUC-1(得自ATCC，马纳萨斯，VA)与0.016-160μg/mL终浓度的MpRNC中间(如在实施例3中所述制备)一起温育48小时。在48小时以后，使用适当的珠子和抗体(Millipore Corporation，Billerica，Massachusetts，美国)，使用 系统(Bio-Rad Laboratories(Canada)Inc.，Mississauga，Ontario，加拿大)，测量上清液中的MU-CSF、M-CSF、GM-CSF、G-CSF、SDF-1a和LIF。生长因子水平相对于对照处理的细胞的50％增加(≥1.5倍增加)，用于鉴别在MpRNC中间处理以后的阳性刺激。
表24显示了在用MpRNC中间处理以后，正常人膀胱上皮细胞的生长因子生产的增加。
表24：在用MpRNC中间处理以后，人SV-HUC-1细胞中的生长因子合成的刺激
得自表24的数据表明，用MpRNC中间处理正常人泌尿道上皮细胞，会导致MU-CSF(钟形应答)、GM-CSF和LIF(钟形应答)的合成的剂量相关的刺激，正如＞1.5倍增加的阈值所定义。
实施例25
MpRNC对人膀胱癌细胞中的GM-CSF和MU-CSF合成的刺激
使用人膀胱癌细胞，检查了MpRNC中间的刺激非免疫细胞中的生 长因子合成的能力。使用这些作为一般癌细胞的一个例子。应当理解，使用MpRNC中间作为MRNC的一个例子，并且在本实施例中教导的原理可适用于得自分枝杆菌科的MRNC。
以1.0x105个细胞/mL，在96-孔组织培养板(使用ATCC推荐的组织培养基)中，将人膀胱癌细胞系SV-HUC-2和T24(二者得自ATCC，马纳萨斯，VA)与0.016-160μg/ml终浓度的MpRNC中间一起温育48小时。在48小时以后，使用具有适当珠子和抗体(使用Bio-Rad和/或Millipore试剂)的200系统，测量上清液中的MU-CSF、M-CSF、GM-CSF、G-CSF、SDF-1a和LIF的水平。生长因子水平相对于对照处理的细胞的50％增加(≥1.5倍增加)，用于鉴别在MpRNC中间处理以后的阳性刺激。
表25显示了在用MpRNC中间处理以后SV-HUC-2细胞的生长因子生产的增加，表23显示了在用MpRNC中间处理以后T24细胞的生长因子生产的增加。
表25：在用MpRNC处理以后人SV-HUC-2细胞中的生长因子合成的刺激
从在表26中显示的数据显而易见，用MpRNC中间温育人膀胱癌细胞系SV-HUC-2会导致GM-CSF和MU-CSF的合成的剂量相关的刺激。
表26：在用MpRNC处理以后人T24细胞中的生长因子合成的刺激
在表26中显示的数据证实，用MpRNC中间处理人膀胱癌细胞系T24会以剂量相关的方式刺激GM-CSF合成的诱导(在1.6μg/mL MpRNC时增加50％，在160μg/mL MpRNC时增加100％)。因此，MpRNC会刺激癌细胞的造血生长因子合成。
实施例26
在给小鼠腹膜内(IP)施用以后，MpRNC对集落刺激因子的刺激
本实施例用于表明，MpRNC中间会在体内刺激生长因子的产生。应当理解，使用MpRNC中间作为MRNC的一个例子，并且在本实施例中教导的原理可适用于得自分枝杆菌科的MRNC。
经由腹膜内途径，用1.0mg/kg体重的MpRNC中间(如在实施例3中所述，以1mg/mL的浓度在注射用水中制备)处理各组的2只雌性C57BL/6小鼠。在注射后1、4、7和24小时，使用具有适当珠子和抗体(Bio-Rad和/或Millipore试剂)的系统，测定血清中的粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的水平。生长因子水平相对于对照处理的小鼠的50％增加(≥1.5倍增加阈值水平)，用于鉴别MpRNC处理以后的阳性生长因子刺激。
表27显示了在注射MpRNC中间以后，处理的小鼠的血清中的GM-CSF和G-CSF水平在不同时间的增加。
表27.在给雌性C57BL/6小鼠腹膜内施用MpRNC中间以后，GM-CSF和G-CSF合成的刺激
*2只小鼠/治疗组。
得自表27的数据表明，MpRNC中间会在体内刺激GM-CSF和G-CSF的合成，GM-CSF在处理后4小时达到峰值，G-CSF在处理后4-7小时达到峰值。结果表明，与对照处理的小鼠相比，在MpRNC中间注射以后4小时，GM-CSF血清水平最大值增加了平均56倍，并且与对照小鼠相比，在注射后4-7小时，G-CSF血清水平最大值增加了平均300倍。这些数据证实，MpRNC中间在全身施用以后在体内具有免疫刺激活性(集落刺激因子诱导)。
实施例27
MpRNC的抗癌活性和完整草分枝杆菌细胞的影响
本实施例用于表明，MpRNC具有抗癌活性。应当理解，使用MpRNC中间作为MRNC的一个例子，并且在本实施例中教导的原理可适用于得自分枝杆菌科的MRNC。使用癌细胞增殖抑制测定，确定完整草分枝杆菌细胞的存在对如在实施例3中制备的MpRNC中间或MpRNC低(也就是说，使用分枝杆菌RNC细胞壁制剂)的抗癌活性的影响。应当理解，使用本实施例作为完整分枝杆菌细胞对一般MRNC的抗癌活性的影响的一个示例性的和代表性的例子。
以5x105个细胞/ml的浓度，将RT4人膀胱癌细胞(ATCC，马纳萨斯，VA，目录号HTB-2TM)铺板在96-孔组织培养板内的补充了10％热灭活的FBS(二者得自Wisent)和10μg/mL庆大霉素(Sigma-Aldrich)的DMEM培养基(50μL体积)中，并在5％CO2气氛中在37℃的温度让细胞附着孔表面过夜。将在50μL体积的组织培养基中的高压灭菌的草分 枝杆菌细胞(121℃，30min)、热处理的MpRNC中间或低(121℃，30min)、或与高压灭菌的MpRNC中间或低相混合的高压灭菌的草分枝杆菌细胞的组合加给细胞，达到0.01、0.1、1.0和10μg/mL的MpRNC终浓度。然后将细胞在5％CO2气氛中在37℃温育48小时。使用MTT((3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴化物)还原测定，确定针对RT4膀胱癌细胞系的抗增殖活性。简而言之，在温育48小时以后，将10μL MTT溶液(5mg/mL在PBS中)加入每个孔中，并继续温育另外4小时。然后通过加入100μL异丙醇∶HCl(24∶1v/v)，停止反应。MTT的还原导致甲臢的产生。通过使用微量移液器，溶解甲臢，并相对于适当的对照在570nm的波长在微量培养板读数器中测定光密度(O.D.)。使用下述方程式，确定细胞增殖的抑制百分比：
％抑制＝100-[(试验O.D.-对照O.D.)/对照O.D.]。
分别在表28和29中显示了使用人膀胱癌细胞系RT4用MpRNC低(参见实施例3、表6；第三种组合物)+受控的草分枝杆菌细胞含量和MpRNC中间(实施例3、表6；第二种组合物)+受控的草分枝杆菌细胞含量得到的结果。使用PharmPC v4.2(MicrocomputerSpecialists，Philadelphia，PA，美国)，确定相对于草分枝杆菌的效能测定。
表28.高压灭菌的MpRNC低、高压灭菌的草分枝杆菌或不同比例的高压灭菌的MpRNC(低)和高压灭菌的草分枝杆菌的组合对RT4膀胱癌细胞增殖的抑制
表29.MpRNC中间、高压灭菌的草分枝杆菌或不同比例的高压灭菌的MpRNC中间和高压灭菌的草分枝杆菌的组合对RT-4膀胱癌细胞增殖的抑制
结果表明，MpRNC低和MpRNC中间具有抗癌活性，并且与含有添加的草分枝杆菌(其与在MpRNC低或MpRNC高中的草分枝杆菌等效)的MpRNC相比，高压灭菌的草分枝杆菌(即，包含完整分枝杆菌细胞的制品)对RT4膀胱癌细胞具有更低的抗增殖活性。此外，含有完整草分枝杆菌的MpRNC组合物具有小于最适的抗增殖活性。没有添加完整分枝杆菌细胞的MpRNC相对于含有递增的完整分枝杆菌细胞含量的MpRNC的相对效能的计算证实，两种分枝杆菌RNC比完整草分枝杆菌明显更有效(MpRNC低和中间分别为91倍和263倍)。10％w/w或更大的完整分枝杆菌细胞的添加导致效能的显著下降，并且最佳的完整分枝杆菌细胞含量是≤1.0％w/w，取决于完整分枝杆菌细胞含量的初始程度(MpRNC中间为0％，MpRNC低为1％)。因此，MRNC组合物和意图用于抗癌应用的制剂会受益于低完整分枝杆菌细胞含量。
实施例28
MpRNC中间针对Lewis肺癌的抗癌活性
本实施例用于表明，MpRNC中间在体外和在体内都具有抗癌活性。应当理解，使用MpRNC中间作为MRNC的一个例子，并且在本实施例中教导的原理可适用于得自分枝杆菌科的MRNC。
使用Lewis肺癌(LLC)细胞系，测定了根据本发明的方法制备并在无RNA酶的水中配制的MpRNC中间的直接抗癌活性。LLC细胞得自ATCC(马纳萨斯，VA，美国)。LLC被广泛地用于化疗和免疫治疗抗癌剂的开发中(参见例如Kimura，Y.New Anticancer agents：Invitro and in vivo evaluation of antitumor and antimetastatic action ofvarious compounds isolated from medicinal plants.in vivo 2005；19：37-60)。在5％CO2气氛中，在含有10％v/v热灭活的胎牛血清(56℃30min)(得自Wisent，St-Bruno，Québec，加拿大)和10.0μg/mL硫酸庆大霉素(Sigma-Aldrich，Oakville，Ontario，加拿大)的DMEM培养基(得自Wisent，St-Bruno，Québec，加拿大)中，在37℃维持LLC细胞。以4.0x104个细胞/0.1mL体积，将在不含庆大霉素的DMEM/10％热灭活的FBS中的LLC细胞接种在96-孔平底组织培养微量培养板中，并将MpRNC中间悬浮液(0.1mL)加入一式三份孔，达到0.01-100.0μg/mL的终浓度。然后在5％CO2气氛中在 37℃温育平板48小时。如在实施例27中关于RT4膀胱癌细胞系(甲臢还原)所述，测定MpRNC的抗增殖活性。结果显示在表30中。
表30.MpRNC中间对LLC细胞增殖的抑制
显示的结果是2个实验的平均值±SD。
在表30中显示的结果证实，MpRNC对LLC细胞具有剂量相关的抗癌活性，正如通过增殖抑制的测量所确定的。因此，实施例27和本实施例(实施例28)证实，MpRNC的直接抗癌活性不是癌细胞类型特异性的，并扩展为不是癌症特异性的。
远部位转移是癌症相关的死亡的主要原因(Kim等人，Carcinoma producedfactors activate myeloid cells via TLT2 to stimulate metastasis.Nature2009；457：102-106)。通过将LLC细胞注射进脾中，可以产生实验性肝转移(Ligo等人，Therapeutic activity and tissue distribution of ME2303，a new anthracyclinecontaining fluorin，and its metabolites in mice bearing hepatic metastases ofLewis lung carcinoma.Anti-Cancer Drugs 1990；1：77-82和Alino等人Morpho-functional study of vascular fluorochrome delivery to lung and livermetastases of Lewis lung carcinoma (3LL)，Tumori1991；77：206-211)。通过脾内注射LLC细胞在肝脏中诱导的肿瘤部位，被视作向肝脏的转移性扩散模型，并且其中通过用角叉菜胶阻断枯否细胞(衬在肝脏血窦内的专门化巨噬细胞)的活性，会增加肿瘤部位的数目。因此，该模型会提供一种用于研究肝转移的不同方面的有用工具(Kopper等人，Experimental model for liver metastasis formation using Lewis lungtumor.J.Cancer Res and Clin.Oncol.1982；103：31-38)。下述研究的目的是，确定MpRNC悬浮液在静脉内(IV)施用以后用于治疗在C57BL/6小鼠中通过脾内注射LLC细胞诱导的实验性肝转移的效力。
如上所述，在含有10％v/v热灭活的胎牛血清的DMEM培养基中维持LLC细胞。每3-4天连续传代细胞，并在第2-3代时使用。通过胰蛋 白酶消化(4min，37℃)收获细胞，在不含胎牛血清和硫酸庆大霉素的DMEM培养基中洗涤2次，在4℃在250xg离心5min，并将细胞沉淀物悬浮于不含胎牛血清和硫酸庆大霉素的DMEM培养基中。在使用锥虫蓝排除测定细胞生存力并在血球计数器中计数以后，将细胞的数目调至所需的浓度。在脾内注射之前，将细胞保持在冰上。
10-12周龄的雌性C57BL/6小鼠得自Charles River Laboratories Ltd.，St.Constant，Québec，加拿大。该小鼠品系是LLC细胞同源的。通过在全身麻醉下脾内注射LLC细胞(1.0-3.0x105个LLC细胞/100μL体积)，诱导肝转移。在癌细胞注射以后，切离脾。首先检查在LLC注射之前(预防性处理)或LLC细胞注射之后(治疗性处理)治疗小鼠的作用。使用各组的10只小鼠，在LLC细胞注射之前1天(预防方案)、LLC细胞注射以后第2、5、7、9和12天(治疗方案)、或LLC细胞注射以后第-1、2、45、7、9和12天(预防和治疗方案)，注射MpRNC中间。以100μL的剂量体积(与5mg/kg体重的剂量对应)，施用如在实施例3中所述在无RNA酶的注射用水中配制的MpRNC中间。在LLC细胞注射以后第15天，测定肝转移的数目。结果(表31)表明，治疗性+预防性施用方案是最有效的处理方案，其次是预防性处理方案，并且治疗性处理方案的有效性最低。因此，就LLC肝转移的治疗而言，预防性和治疗性疗法的组合是最有效的。
表31.MpRNC中间对实验性的LLC肝转移的治疗
这些数据证实，MRNC中间作为单独疗法或在新辅助场合和辅助场合中用于自含了癌症的用途，将会有益地减少由原发性癌的转移引起的肿瘤。在表31中显示的结果与下述效果相一致：暴露于癌细胞之前靶器官中的宿主-防御机制的活化(预防活性)，从而导致在肝脏中减少的肿瘤细胞传播，以及在癌细胞最初植入靶器官中以后对癌细胞的治疗效果(治疗活性)。在表30中证实的针对LLC细胞靶标的直接抗癌的表现支 持这样的作用模式。
使用预防/治疗方案在更大数目的动物中进行第二项研究，以确定MpRNC中间悬浮液治疗对LLC肝转移的影响。使用各组的20只小鼠，如上所述建立实验性的LLC肝转移。并以5mg/kg体重的剂量用MpRNC中间进行预防性/治疗性处理。
该研究的结果表明，在对照组中存在141±72(平均值±SD)个转移，并且通过使用如上所述的预防性和治疗性处理方案，MpRNC中间治疗显著地减少转移数目至62±41(平均值±SD，p＜0.0002，Mann-Whitney U-检验)，因此证实了针对实验性地诱导的肝转移的显著体内抗癌活性。因此，在体外针对LLC细胞表现出的抗癌活性被证实为在体内针对肝转移的发展的抑制作用的预测措施。
实施例29
分枝杆菌RNC的抗癌活性
本实施例用于表明，MRNC具有抗癌活性。应当理解，在本实施例中教导的原理可适用于得自分枝杆菌科的MRNC。
使用癌细胞增殖抑制测定，确定了如在实施例3和4中制备的分枝杆菌RNC的抗癌活性。本领域技术人员公知，已知这样的研究会预测体内抗癌活性。在本实施例中，使用膀胱癌细胞系作为一般癌细胞系的代表，并且应当理解，本领域技术人员会立即明白，使用这样的癌细胞系的抗癌活性研究可以容易地外推至其它癌细胞系。
在本实施例中使用了共4种人膀胱癌细胞，它们都得自ATCC(马纳萨斯，VA，美国)。按照ATCC的推荐，培养细胞系。在表32中显示了膀胱癌细胞系的细节。
表32.膀胱癌细胞系特征
以5x105个细胞/ml的浓度，将膀胱癌系细胞铺板在96-孔组织培养板(50μL体积)内的补充了10％热灭活的FBS(得自Wisent)和10μg/mL庆大霉素(Sigma-Aldrich)的DMEM培养基(得自Wisent)中，并使其在5％CO2气氛中在37℃的温度附着孔表面过夜。将在50μL体积的组织培养基中的如实施例3和实施例4所述制备的分枝杆菌RNC中间加给细胞，达到0.0016、0.016、0.16、1.6、16和80μg/mL的MpRNC终浓度。然后将细胞在5％CO2气氛中在37℃温育48小时。使用MTT((3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴化物)还原测定，确定抗增殖活性。简而言之，在温育48小时以后，将10μL MTT溶液(5mg/mL在PBS中)加入每个孔中，并继续温育另外4小时。然后通过加入100μL异丙醇∶HCl(24∶1v/v)停止反应。MTT的还原导致甲臢的产生。通过使用微量移液器，溶解甲臢，并使用KC Junior软件包(BioTekInstruments)，使用ELx-808IU微量培养板读数器(BioTek Instruments，Winooski，VT，美国)，在570nm的波长相对于适当的对照测定光密度(O.D.)。使用下述方程式，确定癌细胞增殖的抑制百分比：
％抑制＝100-[(试验O.D.-对照O.D.)/对照O.D.]。
使用PharmPC v4.2(Computer Associates，Philadelphia，PA)，确定MRNC组合物的效能。
在表33中显示了使用4种人膀胱癌细胞系用MRNC得到的结果。所有MRNC组合物表现出针对膀胱癌细胞系的剂量依赖性的抗增殖活性。得自牛分枝杆菌菌株BCG的MbRNC的有效性最低，从而证实了剂量相关的抗增殖活性，在最高试验剂量具有～20-40％的抑制(取决于膀胱癌细胞系)。所有的其它MRNC表现出剂量相关的抗增殖活性，在最高试验剂量具有～35-70％抑制(取决于膀胱癌细胞系)。由于该原因，确定了不同的MRNC相对于得自牛分枝杆菌菌株BCG的MRNC的效能，结果显示在表33中。
表33.MRNC相对于牛分枝杆菌BCG MbRNC的抗增殖效能
就膀胱癌增殖的抑制而言，最有效的MRNC是得自牝牛分枝杆菌的MRNC，按照效能递减次序，其次是得自草分枝杆菌的MpRNC、得自耻垢分枝杆菌的MsRNC和得自牛分枝杆菌菌株BCG的MbRNC。对于所有4种膀胱癌细胞系，不论它们的起源(低等级、高等级)或突变状态，分枝杆菌RNC组合物的效能等级和次序得到维持，牝牛分枝杆菌MvRNC和草分枝杆菌MpRNC的有效性分别是牛分枝杆菌BCG MbRNC的～6800倍和～4000倍。
应当认识到，本实施例教导了3个重要原理。首先，从不同的分枝杆菌种(致病性的、非致病性的、快速生长的、缓慢生长的)制备的MRNC具有抗癌活性，并且因此，这样的活性可适用于从分枝杆菌科家族的成员物种制备的MRNC。其次，癌细胞靶标的突变状态似乎不在决定抗癌活性中起作用。实际上，用具有已知的治疗抗性的基因型(p53和p21突变)和MDR表型(例如HT1376)的癌细胞系观察到显著的抗癌活性。本领域技术人员知道，这样的突变和抗性表型是一般癌症的特征，且不限于膀胱癌细胞，并且会明白，MRNC的抗癌活性因此可适用于许多其它癌症类型。第三，从3种快速生长的分枝杆菌种制备的MRNC比从缓慢生长的分枝杆菌种(诸如牛分枝杆菌菌株BCG)制备的MRNC更有效。
实施例30
含有鸟分枝杆菌副结核亚种RNA的组合物(MapRNC)的制备和抗癌活性的测定
在本实施例中，首先通过低速离心洗涤完整的鸟分枝杆菌副结核亚种细胞以除去培养基组分，然后如在实施例3中所述，使用高压均质化用Avestin EmulsiFlex-C5高压匀浆器破碎。在高压均质化以后，通过差速离心，使用为任何残余的、完整的且未破碎的分枝杆菌的受控除去优化的相对离心力，除去剩余的完整分枝杆菌。通过在更高的相对离心力的离心洗涤，进一步纯化除去了分枝杆菌细胞的级分(其包含与分枝杆菌细胞壁碎片相混合的分枝杆菌核酸和最佳抗癌活性所需的且受控量的完整分枝杆菌细胞)，以除去可溶性的污染物。在高相对离心力离心洗涤以后，分离出MapRNC作为沉淀物。然后将MapRNC在121℃热处理5-30min。如在实施例8和9中所述，使用代表主要癌细胞类型的癌细胞系，测定MapRNC的抗癌活性。结果表明，热处理过的MapRNC对癌细胞系和对肝转移具有剂量相关的抗增殖活性。
实施例31
草分枝杆菌的总RNA的抗癌活性
使用癌细胞增殖测定，确定了得自草分枝杆菌细胞的总RNA制品的生物活性。在使用FastPrep FP120珠子破碎装置(Savant，Thermo-Fisher， Nepean，ON，加拿大)在水平4.5在FastRNA Blue-Tubes(Bio-101 Inc.)中裂解细胞1min以后，使用Trizol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA，美国)，根据生产商的说明书制备RNA。然后根据生产商的说明书(Ambion，Austin，TX，美国)，用‘无DNA的’试剂处理RNA制品，以除去残余的基因组DNA。以2x105个细胞/ml的浓度，将RT4(ATCC目录号HTB-2)和HT1376人膀胱癌细胞(ATCC目录号CRL-1472)铺板在96-孔组织培养板内的补充了10％FBS(得自Wisent)和10μg/ml庆大霉素(Sigma-Aldrich)的DMEM培养基(得自Wisent)(50μL体积)中，并使其在5％CO2气氛中在37℃的温度附着孔表面过夜。将在50μL体积的组织培养基中的总RNA加给细胞，达到0.01、0.1、1.0μg/mL的RNA终浓度。然后将细胞在37℃在5％CO2气氛中温育72小时。使用MTT((3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴化物)还原测定，确定针对癌细胞系的抗增殖活性。简而言之，在温育72小时以后，将10μL MTT溶液(5mg/mL在PBS中)加入每个孔中，并继续温育另外4小时。然后通过加入100μL异丙醇∶HCl(24∶1 v/v)停止反应。MTT的还原导致甲臢的产生。通过使用微量移液器，溶解甲臢，并相对于适当的对照在570nm的波长在微量培养板读数器中测定光密度(O.D.)。使用下述方程式，确定细胞增殖的抑制百分比：
％抑制＝100-[(试验O.D.-对照O.D.)/对照O.D.]。
结果表明草分枝杆菌的总RNA针对HT1376的中等抗癌活性(0.1ug/mL、1.0μg/mL和10.0μg/mL的RNA的分别具有2.2％、7.1％和6.8％的抑制活性)，以及针对RT4的稍微更高的抑制活性(0.1μg/mL、1.0μg/mL和10.0μg/mL的RNA分别具有3.1％、7.6％和18.6％的增殖抑制)。与在实施例27或实施例29(其中分枝杆菌RNA是与分枝杆菌细胞壁混合的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸形式)中得到的结果相比，显然，当使用分枝杆菌细胞壁RNA组合物(或其它药学上可接受的载体诸如聚氨基葡糖或阳离子脂质体)时，就生物活性而言得到了不同的且意外的优点。
实施例32
分枝杆菌细胞壁RNC的整体效能指数的确定
本发明的分枝杆菌细胞壁RNC(MRNC)具有通过2种不同的受体系统刺激免疫系统和抑制癌细胞分裂的能力，并因而是三功能的治疗性组合物。使用得自实施例29、17和19(分别是抗增殖效能、NOD2活化效能和TLR2活化效能)的数据，确定了MpRNC中间、MsRNC中间和MvRNC中间相对于MbRNC中间的整体效能指数，作为整合总抗癌和免疫刺激活性的方式。因为不同测定之间的相对效能的宽数值范围(≥3数量级)，在该测定中使用了自然对数(log)转化，并累加每种活性的值。给MbRNC分配1的效能，相对于MbRNC确定其它MRNC的效能。应当理解，1的自然对数是0。结果显示在表34中。
表34.MRNC中间的整体效能指数
显然，尽管所有MRNC就TLR2活化而言具有类似的、可比较的效能，MpRNC、MsRNC和MvRNC就抗癌活性而言都比MbRNC更有效。但是，MpNAC就NOD2活化而言是最有效的MRNC。整体效能指数的确定表明，MpRNC具有最高的总效能，按照递减次序，其次是MvRNC、MsRNC和MbRNC。
实施例33
用于免疫刺激的含有受控量的完整分枝杆菌细胞的MpRNC组合物的制备
如下方便地制备含有受控量的高压灭菌的完整分枝杆菌的MpRNC：制备MpRNC低(如在实施例2和实施例3中详述)，并将高压灭菌的完整分枝杆菌细胞加入MpRNC中，达到对于免疫应答的诱导而言最佳的期望比例。一般而言，发明人已经发现，诱导免疫应答所需的完整草分枝杆菌细胞的最佳比例是在约5-50重量％范围内，这样的比例产生最佳的免疫刺激活性。
实施例34
用于免疫刺激的含有受控量的完整分枝杆菌细胞的MRNC组合物的制备
如下方便地从分枝杆菌科的给定分枝杆菌种(诸如但不限于牛分枝杆菌菌株BCG、鸟分枝杆菌副结核亚种、耻垢分枝杆菌或牝牛分枝杆菌)制备MRNC：制备MpRNC低(如在实施例3中关于MpRNC所述)，并将高压灭菌的完整分枝杆菌细胞加入MRNC中，达到对于免疫应答的诱导而言最佳的期望比例。一般而言，发明人已经发现，诱导免疫应答所需的完整草分枝杆菌细胞的最佳比例是在约5-50重量％范围内，这样的比例产生最佳的免疫刺激活性。
实施例35
用核糖核酸酶-A处理MpRNC
用核糖核酸酶处理MpRNC(例如，在实施例10中描述的酶消化条件)会导致在MRNC或MpRNC组合物中含有的RNA的量显著减少。这样的减少会显著降低MRNC或MpRNC的充当治疗剂的能力。
如在实施例3中所述制备MpRNC中间，但是在最终的2个高压均质化循环之前，将洗涤过的MpRNC中间沉淀物再悬浮于含或不含RNA酶A(Sigma，终浓度10μg/mL；分别是MpRNC-RNA酶和MpRNC-对照)的注射用水中在37℃保持3小时。然后通过高速离心洗涤MpRNC以除去RNA酶A，并以1mg/mL的浓度再悬浮于注射用水中。随后将悬浮液均质化，并最终灭菌。如在实施例27中所述，使用膀胱癌细胞系HT1376和RT-4，测定MpRNC-RNA酶和MpRNC对照的抗癌活性。使用PharmPC v4.2(Microcomputer Specialists，Philadelphia，PA，美国)，从剂量-响应曲线的线性部分计算出2种MpRNC制剂的相对效能。
两种MpRNC制剂以剂量相关的方式抑制HT1376和RT-4膀胱癌细胞的增殖(分别见表35和36)。但是，RNA酶处理导致MpRNC对两种膀胱癌细胞系的抗增殖活性的下降。
表35.RNA酶处理会降低MpRNC对HT1376膀胱癌细胞的抗增殖活性
表36.RNA酶处理会降低MpRNC对RT-4膀胱癌细胞的抗增殖活性
在表37中显示了MpRNC中间-RNA酶处理相对于MpRNC中间-对照处理对HT-1376和RT-4膀胱癌细胞系的抗增殖效能。
表37.RNA酶处理会降低MpRNC中间的抗癌效能
RNA酶处理引起的MpRNC中间中的RNA的除去，会导致抗癌效能的显著下降(对HT1376和RT-4膀胱癌细胞分别下降4倍和7倍)，从 而证实，RNA在MpRNC中的保留是最佳抗癌活性的必要条件。
实施例36
含有BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的阳离子脂质体制剂和抗癌活性的测定
所有下述操作都在无菌条件下进行。如下制备BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC：使用高压均质化破碎完整的细菌、分枝杆菌或草分枝杆菌，通过在低RCF离心，除去未破碎的细菌、分枝杆菌或草分枝杆菌，并使用苯酚/氯仿/异戊醇和乙醇沉淀，提取RNC组合物。通过在121℃热处理5min，降低在RNC组合物中的提取的RNA的链长度，以制备含有大约20-40个碱基的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸。如下制备由1∶1摩尔比的1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺/1，2-二油酰基-3-三甲铵-丙烷(DOPE/DOTAP)组成的阳离子脂质体：将磷脂和阳离子脂质溶解在无水氯仿(1mg/mL)中，随后通过在圆底烧瓶中在减压下旋转蒸发，形成磷脂/脂质薄膜。如下制备对照脂质体：将所需体积的NaCl(0.85％w/v)加入磷脂/脂质薄膜，并在65℃搅拌以形成脂质体。如下制备含有BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的阳离子脂质体：将含有BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的NaCl溶液以0.1mg/mL的浓度加入磷脂/脂质薄膜，并在65℃搅拌以形成脂质体。含有BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的阳离子脂质体将具有大约825nm的平均直径和大约+36mV的ζ-电势。使用0.01-10μg/mL的脂质体BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC浓度范围，如在实施例27中所述进行鼠B16黑素瘤增殖抑制测定。使用对应浓度的对照阳离子脂质体或非脂质体BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC，进行对照温育。如在实施例27中所述进行MTT还原，并测定细胞增殖抑制的量。结果表明，含有BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的阳离子脂质体以剂量依赖性的方式抑制B16黑素瘤细胞的增殖，并且单独的阳离子脂质体不具有抑制活性。含有BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的阳离子脂质体的抑制活性显著大于单独的BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、 MapRNC和MvRNC。这些数据证实，阳离子脂质体制剂会充当BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的药物递送系统。
应当理解，RNA可以分离自革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌，以及分离自分枝杆菌、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种和牝牛分枝杆菌，并如在本实施例中所述用阳离子脂质体配制，无需加入得自这些物种的细胞壁。
应当认识到，B16黑素瘤细胞在本实施例中用作典型癌细胞的代表，并且阳离子脂质体在本实施例中用作NA的典型药物递送系统，本领域技术人员将明白使用这些类型的药物递送系统和制剂治疗一般癌症的适用性。
实施例37
含有BRNC、MRNC、MRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的聚氨基葡糖纳米颗粒制剂和抗癌活性的测定
所有下述操作都在无菌条件下进行。如下制备BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC：使用高压均质化破碎完整的细菌、分枝杆菌或草分枝杆菌，通过在低RCF离心，除去未破碎的细菌、分枝杆菌或草分枝杆菌，并使用苯酚/氯仿/异戊醇和乙醇沉淀，提取RNC。通过在121℃高压灭菌5min，降低提取的RNA的链长度，以制备含有大约20-40个碱基的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸。如下制备聚氨基葡糖纳米颗粒：将等体积的三聚磷酸盐(0.5mg/mL在水中)和聚氨基葡糖(平均分子量500,000，在水中的浓度为1mg/mL)在20℃混合2min，以形成对照聚氨基葡糖纳米颗粒，或者将等体积的细菌、分枝杆菌或草分枝杆菌寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸(BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC，0.5mg/mL在水中)和聚氨基葡糖(平均分子量500,000，在水中的浓度为1mg/mL)在20℃混合2min。BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC在聚氨基葡糖纳米颗粒中的掺入是100％。通过离心，洗涤聚氨基葡糖纳米颗粒，并测定它们的大小和ζ-电势(颗粒表面电荷的间接量度)。聚氨基葡糖纳米颗粒具有在大约200-1000nm范围内的大小和大约-20至-35mV的ζ-电势。在补充了MEM非必需氨基酸、庆大霉素 (50μg/mL)和10％v/v热灭活的胎牛血清的MEM中，在37℃和5％CO2培养B16黑素瘤细胞至汇合。通过胰蛋白酶消化，收获细胞，将其再悬浮于MEM组织培养基中，并铺板在组织培养板的孔中(96孔板，100μL含有5x103个细胞)，使其在5％CO2中在37℃附着3小时。然后将含有BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的聚氨基葡糖纳米颗粒加给B16黑素瘤细胞(ATCC)，达到在0.001-100μg/mL范围内的BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC终浓度。将对照聚氨基葡糖纳米颗粒或不含BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的聚氨基葡糖纳米颗粒加给B16黑素瘤细胞，达到与BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC聚氨基葡糖纳米颗粒可比较的浓度。在37℃/5％CO2温育鼠B16黑素瘤细胞48小时，并使用MTT还原测定确定细胞在该时间内的生长。使用ELISA平板读数器，在570nm测定还原的MTT的水平，其与活细胞的数目相对应。结果表明，含有BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的聚氨基葡糖纳米颗粒以剂量依赖性的方式抑制B16黑素瘤细胞的增殖，并且单独的聚氨基葡糖纳米颗粒不具有抑制活性，含有BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的聚氨基葡糖纳米颗粒的抑制活性显著大于单独的BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC。这些数据证实，聚氨基葡糖纳米颗粒制剂会充当BRNC、MRNC、MpRNC、MbRNC、MsRNC、MapRNC和MvRNC的药物递送系统。
应当理解，RNA可以分离自革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌，以及分离自分枝杆菌、草分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、耻垢分枝杆菌、鸟分枝杆菌副结核亚种和牝牛分枝杆菌，并如在本实施例中所述用聚氨基葡糖纳米颗粒配制，无需加入得自这些物种的细胞壁。
应当认识到，B16黑素瘤细胞在本实施例中用作典型癌细胞的代表，并且聚氨基葡糖纳米颗粒在本实施例中用作NA的典型药物递送系统，本领域技术人员将明白使用这些类型的药物递送系统和制剂治疗一般癌症的适用性。
实施例38
含有鸟分枝杆菌副结核亚种RNA的组合物(MapRNC)的制备
在本实施例中，首先通过低速离心洗涤完整的鸟分枝杆菌副结核亚种细胞以除去培养基组分，然后使用高压均质化用Avestin EmulsiFlex-C5高压匀浆器破碎。在高压均质化以后，通过差速离心，使用为任何残余的、完整的且未破碎的分枝杆菌的受控除去优化的相对离心力，除去剩余的完整分枝杆菌。通过在更高的相对离心力的离心洗涤，进一步纯化除去了分枝杆菌细胞的级分(其包含与分枝杆菌细胞壁碎片相混合的分枝杆菌核酸和最佳抗癌活性所需的且受控量的完整分枝杆菌细胞)，以除去可溶性的污染物。在高相对离心力离心洗涤以后，分离出除去分枝杆菌细胞的级分作为沉淀物。然后将除去分枝杆菌细胞的级分在121℃热处理5-30min，并用作得自副结核分枝杆菌的分枝杆菌RNC(MapRNC)。
实施例39
MapRNC中的核酸的分析
在本实施例中，确定了MapRNC中的核酸类型、寡核糖核苷酸链长度和含量。如在实施例38中所述制备MapRNC。使用下述操作，提取核酸。用无DNA酶的且无RNA酶的溶菌酶(得自Sigma-Aldrich Canada，Oakville，Ontario)消化700μL浓度为1mg/ml的等分试样，随后灭活，并用无DNA酶的且无RNA酶的蛋白水解酶K(得自Sigma-Aldrich Canada，Oakville，Ontario)进一步消化。用苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1 v/v)提取核酸，并通过加入糖原、醋酸钠和乙醇进行沉淀。用80％冰冷的乙醇洗涤沉淀物，并再悬浮于50μL蒸馏水中。通过在紫外分光光度计中测量在260/280nm的吸光度，测定浓度。确定每种组合物的核酸含量。
使用Bioanalyze系统(Bioanalyze#2100型，Agilent，Santa Clara，CA，美国)，对在热处理(121℃，30min)之前和之后收集的MapRNC制品进行关于它们的核酸分布的电泳分析。将核酸级分稀释至30ng/μL的浓度。使用RNA6000纳米试剂盒(Agilent#5067-1511)，用Bioanalyze电泳单元完成提取的核酸的长度的电泳分析。该试剂盒会提供关于在25-6000个核苷酸的大小范围内的RNA的质量的信息。然后使用小RNA试剂盒(AgilentTechnologies Canada Inc.，St.Laurent，Québec，加拿大，试剂盒编号5067-1548)，进一步分析在高压灭菌以后的MapRNC，所述试剂盒 设计用于分析在6-150个核苷酸的大小范围内的小核酸。当使用RNA纳米6000试剂盒分析时，在热处理之前的MapRNC具有在大约25个碱基至4000个碱基之间且接近后者的核酸分布。结果证实，高压均质化步骤(不同的循环压力和次数)用于制备MapRNC的用途，会产生这样的组合物：其含有链长度为25-4000个碱基的多核糖核苷酸。在热处理以后，MapRNC显示出更紧凑的分布。MapRNC具有在20-40个碱基之间达到最大值的寡核糖核苷酸峰，且具有5-60个碱基长度的核酸分布。MapRNC组合物仅具有微量的在100个碱基处洗脱的核酸和甚至更少的在约150个碱基长度处洗脱的寡核糖核苷酸材料。结果证实，高压均质化和热处理步骤(不同的循环压力和次数以及高压灭菌)用于制备MapRNC的用途，会产生这样的组合物：其含有链长度小于60个碱基的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸。
首先如下分析在实施例38中制备的MapRNC的DNA与RNA之比：使用RNA酶-A对提取的核酸进行酶消化，随后进行Bioanalyze2100电泳绘图，并使用Agilent小RNA试剂盒(试剂盒编号5067-1548)，定量寡核糖核苷酸含量。使用无DNA酶的核糖核酸酶A(RNA酶A，在100℃处理30min，以除去DNA酶活性)，对提取的核酸进行RNA酶-A消化(0.1μg酶，在37℃保持2h)。所述RNA酶A得自Ameresco(Solon，OH，美国)。使用Bioanalyze，分析RNA酶A处理过的核酸的样品(20ng/μL)。使用下述方程式，确定在MapRNC中的DNA和RNA的量：
DNA含量＝(总核酸含量-RNA酶-A处理以后的核酸含量)。MapRNC的分析表明DNA和RNA在MapRNC的提取物中的存在。
如下分析本发明的MapRNC中的DNA与RNA之比。使用Microsep 1K单元(分子量截止＝1000Da，Sciences，Ann Arbor，MI，美国)，通过超滤来回收核酸级分。然后按照Liang报道的操作(Liang等人，Ann.Chim.Acta 2009，650：106-110)，使用核酸酶P1(Sigma-Aldrich，Oakville，ON，加拿大)将核酸溶液消化成5’-单磷酸核苷的混合物。为了确保最佳的核酸酶P1消化，在95-100℃在水浴中加热共50μL要研究的核酸水溶液10min，随后立即在冰上冷却。在含有0.5mM ZnCl2的30mM醋酸钠缓冲液(pH5.3)中，制备5单位/μL的核酸酶P1。对于酶消化，将50μL核酸水溶液与相同体积的核酸酶P1溶液混合，然后在50℃温育30min。将得到的混合物冷却至室温，并通过在室温在10,000g离心 20min，穿过Nanosep10K过滤器进行过滤，然后进行HPLC分析。
还对单核苷酸标准品(5’-脱氧核糖核苷酸和5’-核糖核苷酸，Sigma-Aldrich)的混合物的系列稀释物(其含有100、10、5、2.5、1ng/μL的每种存在于DNA和RNA中的单核苷酸)进行核酸酶P1处理，并过滤，用作HPLC分析的标准品。通过对比各种核苷酸在相同HPLC条件下的保留时间，确认这些核苷酸的洗脱次序。使用1200系列HPLC系统(Agilent，St-Laurent，Quebec，加拿大)进行HPLC分析，所述系统配有具有脱气器的四元泵、自动采样器、柱加热器和多波长紫外检测器。使用Zorbax Bonus-RP柱(Agilent)，并且流动相包含10mM磷酸钾缓冲液(pH7.2)和甲醇(0-10％甲醇)的线性梯度。在260nm检测单核苷酸。在确定DNA和RNA含量以后，确定DNA∶RNA比。结果证实，除了DNA以外，RNA存在于MapRNC中。
实施例40
MapRNC会诱导人病原体相关分子模式受体(PAMP)NOD2的活化
使用经工程改造成表达人NOD2受体驱动的NF-κB和下游信号传递标志物IL-8的HEK-293细胞，评价了如在实施例38中制备的MapRNC的NOD2活化活性。
在补充了10％胎牛血清(得自Wisent，St-Bruno，Québec，加拿大)、100μg/mLNormocinTM和10μg/mL杀稻瘟素(二者得自InvivoGen)的高葡萄糖DMEM(得自Wisent，St-Bruno，Québec，加拿大)中，在含有5％CO2的增湿气氛下，在37℃培养和维持人HEK293-NOD2细胞系(InvivoGen，San Diego，CA，美国)。以5x105个细胞/mL，将HEK293-NOD2细胞接种在无菌的96-孔平底组织培养微量培养板内的0.2mL体积的上述细胞培养基中，并在含有5％CO2的增湿气氛下，与0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80和160μg/mL的MapRNC一起在37℃温育48小时。在温育后收集上清液，在4℃在4,000xRCF离心5min以除去细胞和碎片，并在-20℃保存上清液用于分析。在与MapRNC一起培养48小时以后，借助于商业的酶联免疫吸附测定(ELISA)(得自BioSource，Camarillo，CA，USA)，测量上清液中的人IL-8。使用KC Junior软件包(Bio Tek Instruments，Winooski，VT，美国)，从ELISA平板读数器(ELx-808IU BioTek Instruments，Winooski，VT，美国)捕获数据，并以 pg/mL表示合成的IL-8。MapRNC会以剂量依赖性的方式诱导IL-8的合成和分泌。因此，结果表明，MapRNC通过以剂量依赖性的方式诱导NOD2驱动的IL-8释放而起NOD2激动剂的作用。
实施例41
MapRNC具有人TLR2活化活性
使用经工程改造成表达人TLR2受体的HEK-293细胞，测量如在实施例38中制备的MapRNC的TLR2活化活性。
人体HEK293-TLR2细胞系得自InvivoGen，San Diego，CA，USA。用置于NF-kB基因控制下的TLR2基因和TLR2受体驱动的分泌型胚性碱性磷酸酶基因(SEAP)稳定地转染HEK293-TLR2细胞。因此，TLR2的活化会导致碱性磷酸酶活性在细胞培养基中的产生，所述活性用于定量受体活化。在含有5％CO2的增湿气氛下，在补充了10％胎牛血清(得自Wisent，St-Bruno，Québec，加拿大)和1x NormocinTM(InvivoGen)的高葡萄糖DMEM(得自Wisent，St-Bruno，Québec，加拿大)中，在37℃培养和维持所述细胞。以5x105个细胞/mL，将HEK293-TLR2细胞接种于在无菌的96-孔平底组织培养微量培养板内的0.2mL体积的HEK-BlueTM检测培养基(InvivoGen)中，并在含有5％CO2的增湿气氛下，与0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80和160μg/mL的MapRNC一起在37℃温育18小时。加入所述孔中的HEK-BlueTM检测培养基设计用于检测NF-kB诱导的可溶性的胚性碱性磷酸酶酶活性(SEAP活性)。在温育18小时以后，使用微量培养板分光光度计读数器(ELx-808IU型，Bio Tek Instruments，Winooski，VT，美国)，在630nm测定光密度(其与通过TLR2结合活化的NF-kB成比例)。使用KC Junior软件包(BioTek Instruments)，捕获数据。在MapRNC处理以后，细胞上清液中的SEAP活性以剂量相关的方式增加。因此，结果表明，MapRNC能够以剂量依赖性的方式活化TLR2(即，MapRNC充当TLR2激动剂)。
实施例42
MapRNC的抗癌活性
使用代表主要癌细胞类型的癌细胞系，测定如在实施例38中制备的MapRNC的抗癌活性。以5x105个细胞/mL的浓度，将RT4人膀胱 癌细胞(ATCC目录号HTB-2TM)铺板在DMEM培养基(50μL体积)中，并将CT26鼠结肠癌细胞系(ATCC目录号CRL-2638TM)铺板在RPMI 1640培养基(50μL体积)中，两种培养基均补充了10％热灭活的FBS(二者得自Wisent)和10μg/mL庆大霉素(Sigma-Aldrich)，并在96-孔组织培养板中，并使所述细胞在37℃的温度在5％CO2气氛中附着孔表面过夜，然后处理。以1x106个细胞/mL的浓度，将人白血病细胞Jurkat(ATCCTIB-152TM)悬浮于在96-孔组织培养板内的补充了10％热灭活的FBS和10μg/mL庆大霉素的DMEM培养基(50μL体积)中。将在50μL体积的组织培养基中的热处理过的MapRNC(例如121℃，30min)加给细胞，以达到0.01、0.1、1.0和10μg/mL的MapRNC终浓度。然后将细胞在5％CO2气氛中在37℃温育48小时。使用MTT((3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑溴化物)还原测定，测定针对癌细胞系的抗增殖活性。简而言之，在温育48小时以后，将10μL MTT溶液(5mg/mL在PBS中)加入每个孔中，并继续温育另外4小时。然后通过加入100μL异丙醇∶HCl(24∶1v/v)，停止反应。MTT的还原导致甲臢的产生。通过使用微量移液器，溶解甲臢，并相对于适当的对照在570nm的波长在微量培养板读数器中测定光密度(O.D.)。使用下述方程式，确定细胞增殖的抑制百分比：
％抑制＝100-[(试验O.D.-对照O.D.)/对照O.D.]。
结果表明，热处理过的MapRNC对RT4膀胱癌细胞和CT26结肠癌细胞以及Jurkat白细胞细胞具有剂量相关的抗增殖活性。因此，MapRNC具有不限于癌症类型的抗癌活性。
实施例43
用于免疫刺激的联合MRNC制剂
本领域技术人员在阅读上述实施例以后将会使用MRNC的适当组合来实现对于目标适应症而言最佳的治疗活性。因而，MpRNC和MvRNC的组合将会产生对于免疫刺激和细胞因子诱导而言最佳的NOD2和TLR2活化。类似地，MpRNC和MvRNC的组合将会产生最佳的抗癌活性和免疫刺激。
实施例44
MRNC与用于治疗癌症的治疗剂的组合
为了增强临床有效性，将本发明的MRNC组合物与化学疗法和/或免疫疗法相组合。MRNC向下述化疗方案中的添加，无意成为穷尽列表(这样的列表可在例如The ElsevierGuide to Oncology Drugs and Regimens，2006中得到，它描述了超过220种在癌症的治疗中常见的药物方案)，并且应当理解，本领域技术人员在阅读本发明的实施例以后，将会在癌症的治疗中在具有最适当的化疗方案的新辅助或辅助场合使用本发明的组合物。下述的2个方案用于例证如何与化学疗法和免疫疗法联合使用MRNC的原理：
结肠和直肠癌：具有局部晚期疾病的结肠和直肠癌患者处于肝转移(通过肝脏的肝门静脉传播)的高危中。经常在外科手术切除术之前或之后(新辅助或辅助场合)开始化学疗法，其目的是，减少肝转移和随后向其它器官的二次转移的发生率。5-氟尿嘧啶经常用于治疗转移性或晚期疾病，其中使用1000mg/m2的方案，每天静脉内输注连续5天，每28天进行重复。在用5-氟尿嘧啶治疗之前、过程中或之后，本发明的MRNC可以以治疗活性剂量(通过临床评价研究确定)作为静脉内推注或输注来施用。可以以在临床前试验和临床评价(1期、2期和3期临床研究)中确定为最有效的剂量，施用MRNC制剂。这样的剂量将在每剂0.00001mg/kg至约100mg/kg的范围内。与接受单独的5-氟尿嘧啶疗法的患者相比，接受联合治疗的患者会受益于达到复发的时间增加、转移的减少、肿瘤负荷的减少或肿瘤的根除。可以使用本领域技术人员已知的其它化疗方案，诸如但不限于：5-氟尿嘧啶、亚叶酸和奥沙利铂，用或不用贝伐单抗；伊立替康、亚叶酸和5-氟尿嘧啶，用或不用西妥昔单抗；或丝裂霉素c和5-氟尿嘧啶，而不限制MRNC的有效性。
肺癌：与其它化学治疗剂联合使用的环磷酰胺被用于治疗以前未治疗过的患者，或者具有晚期的、复发的或转移的癌症的患者。典型的方案是，但不限于，环磷酰胺、多柔比星(亚德里亚霉素)和依托泊苷(CAE)，其中在第1天以1000mg/m2的剂量静脉内施用环磷酰胺，在第1天以45mg/m2的剂量静脉内施用多柔比星，并在第1-3天以100mg/m2的剂量静脉内施用依托泊苷。每28天重复治疗循环。在每个化疗药物治疗 循环之前、过程中或之后，以在临床前试验和临床评价(1期、2期和3期临床研究)中确定为最有效地增强巨噬细胞和粒细胞产生(通过MU-CSF、G-CSF和GM-CSF的刺激)的最佳剂量，施用本发明的MRNC作为静脉内推注。这样的剂量将在每剂0.00001mg/kg至约100mg/kg的范围内。与用单独的化学疗法治疗的患者相比，用MRNC治疗的患者具有减少的传染性发作发病率以及与化学疗法诱导的单核细胞和嗜中性粒细胞数减少有关的延迟的治疗循环。可以使用用于治疗肺癌(原发性或转移性)的其它化疗方案，而不限制MRNC的有效性。
宫颈癌：宫颈癌与HPV感染有关。尽管15个HPV类型是致癌的，认为HPV16和16会引起所有宫颈癌中的70％。当前的免疫接种方案可有效地防止感染，但是不能有效地治疗既存的感染。在宫颈癌的治疗中存在未得到满足的需求：如果要保留子宫功能，需要针对癌细胞和发展中的病毒感染的疗法。在第1天用卡铂(50-100mg/m2，静脉内)和多柔比星(45-60mg/m2，静脉内)治疗晚期的、复发的或转移性的疾病，并每21天重复该循环。在化学疗法之前、过程中或之后，以通过先前的临床研究确定为对于免疫刺激而言最佳的剂量，通过颈内注射将MRNC局部地施用进子宫颈中。可以以在临床前试验和临床评价(1期、2期和3期临床研究)中确定为最有效的剂量，施用MRNC制剂。这样的剂量将在每剂0.00001mg/kg至约100mg/kg的范围内。MRNC具有2种效应：首先，通过诱导免疫应答，产生针对病毒感染的细胞的免疫应答，使在子宫颈中的HPV病毒(包括HPV16和18)的病毒载量减少，其次通过诱导MU-CSF、G-CSF和GM-CSF，增加化学治疗剂的临床有效性。
上面引用的所有专利、出版物和摘要都通过引用整体并入本文。应当理解，前述内容仅仅涉及本发明的不同实施方案，在其中可以做出许多修改或改变，而不背离在下述权利要求中限定的本发明的精神和范围。

Claims (29)

1.组合物，其包含：
从分枝杆菌细胞分离的分枝杆菌RNA；和
从分枝杆菌细胞分离的分枝杆菌细胞壁，其中所述组合物不含苯酚或链霉蛋白酶，且所述RNA是寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸的形式，
其中所述寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸的长度是2至150个碱基。
2.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物另外包含完整的分枝杆菌细胞。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸的长度是2至40个碱基。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸的长度是20至40个碱基。
5.根据权利要求2所述的组合物，其中所述完整的分枝杆菌细胞占所述组合物的0.05重量%至95重量%。
6.根据权利要求2所述的组合物，其中所述完整的分枝杆菌细胞占所述组合物的0.19重量%至19.6重量%。
7.根据前述权利要求中的任一项所述的组合物，所述组合物另外包含药学上可接受的载体或递送系统。
8.制备根据权利要求1所述的组合物的方法，所述方法包括下述相继步骤：
A) 破碎分枝杆菌细胞生物质，以产生破碎的分枝杆菌细胞、完整的分枝杆菌细胞、破碎的分枝杆菌细胞壁和RNA；
B) 任选地将完整的分枝杆菌细胞与所述破碎的分枝杆菌细胞壁和RNA分离；和
C) 将所述破碎的分枝杆菌细胞的一部分的可溶性的细胞溶质内容物与所述破碎的分枝杆菌细胞壁和RNA分离，以得到分枝杆菌细胞壁、核糖核酸组合物；和
D) 在足以产生2至150个碱基的寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸的温度下，进行加热，其中将所述完整的分枝杆菌细胞灭活。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸的长度是2至40个碱基。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述寡核糖核苷酸和多核糖核苷酸的长度是20至40个碱基。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述破碎步骤A包括在约10,000 psi或更高下的高压均质化。
12.根据权利要求8所述的方法，其中在所述分离步骤B或C之前，将所述破碎步骤A重复2-5次。
13.根据权利要求8所述的方法，所述方法另外包括：在所述分离步骤C之后，重复所述破碎步骤A 2-5次。
14.根据权利要求8所述的方法，其中所述分离步骤B是低速离心，且所述分离步骤C是高速离心。
15.根据权利要求8所述的方法，所述方法另外包括下述相继步骤：
重复步骤A)和B)，以控制完整的分枝杆菌细胞的数目。
16.根据权利要求1-6中的任一项所述的组合物，其用于治疗癌症。
17.根据权利要求7所述的组合物，其用于治疗癌症。
18.根据权利要求1-6中的任一项所述的组合物，其用于刺激免疫系统。
19.根据权利要求7所述的组合物，其用于刺激免疫系统。
20.根据权利要求18所述的组合物，其中刺激免疫系统包括：刺激一种或多种造血祖细胞的分化，增加细胞因子或趋化因子的分泌，增加造血生长因子的合成，活化核苷酸结合寡聚化结构域2 (NOD2)受体，或活化Toll-样受体2 (TLR2)受体。
21.根据权利要求19所述的组合物，其中刺激免疫系统包括：刺激一种或多种造血祖细胞的分化，增加细胞因子或趋化因子的分泌，增加造血生长因子的合成，活化核苷酸结合寡聚化结构域2 (NOD2)受体，或活化Toll-样受体2 (TLR2)受体。
22.根据权利要求1-6中的任一项所述的组合物，其用于刺激造血生长因子的合成。
23.根据权利要求7所述的组合物，其用于刺激造血生长因子的合成。
24.根据权利要求20、21或23所述的组合物，其中所述分枝杆菌是草分枝杆菌，并且所述造血生长因子选自巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、间质细胞衍生的因子-1α(SDF-1a)和白血病抑制因子(LIF)及其组合。
25.根据权利要求22所述的组合物，其中所述分枝杆菌是草分枝杆菌，并且所述造血生长因子选自巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、间质细胞衍生的因子-1α(SDF-1a)和白血病抑制因子(LIF)及其组合。
26.根据权利要求1-6中的任一项所述的组合物，其用作癌症治疗的佐剂或用作免疫刺激治疗的佐剂。
27.根据权利要求7所述的组合物，其用作癌症治疗的佐剂或用作免疫刺激治疗的佐剂。
28.根据权利要求1-6中的任一项所述的组合物，其中所述RNA和所述细胞壁从所述细胞组合地分离。
29.根据权利要求7所述的组合物，其中所述RNA和所述细胞壁从所述细胞组合地分离。
CN201180059883.8A 2010-10-13 2011-10-13 细菌核糖核酸细胞壁组合物及其制备和使用方法 Active CN103354833B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610282359.1A CN105943559A (zh) 2010-10-13 2011-10-13 细菌核糖核酸细胞壁组合物及其制备和使用方法

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US39249810P 2010-10-13 2010-10-13
US61/392,498 2010-10-13
US61/392498 2010-10-13
US39358910P 2010-10-15 2010-10-15
US61/393,589 2010-10-15
US61/393589 2010-10-15
PCT/IB2011/054539 WO2012049654A1 (en) 2010-10-13 2011-10-13 Bacterial ribonucleic acid cell wall compositions and methods of making and using them

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610282359.1A Division CN105943559A (zh) 2010-10-13 2011-10-13 细菌核糖核酸细胞壁组合物及其制备和使用方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103354833A CN103354833A (zh) 2013-10-16
CN103354833B true CN103354833B (zh) 2016-11-16

Family

ID=45937957

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201180059883.8A Active CN103354833B (zh) 2010-10-13 2011-10-13 细菌核糖核酸细胞壁组合物及其制备和使用方法
CN201610282359.1A Pending CN105943559A (zh) 2010-10-13 2011-10-13 细菌核糖核酸细胞壁组合物及其制备和使用方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610282359.1A Pending CN105943559A (zh) 2010-10-13 2011-10-13 细菌核糖核酸细胞壁组合物及其制备和使用方法

Country Status (19)

Country Link
US (5) US9044422B2 (zh)
EP (1) EP2571979B1 (zh)
JP (1) JP6163425B2 (zh)
KR (2) KR20160083968A (zh)
CN (2) CN103354833B (zh)
AR (1) AR083443A1 (zh)
AU (1) AU2011315093B2 (zh)
BR (1) BR112013008727A2 (zh)
CA (1) CA2799442C (zh)
DK (1) DK2571979T3 (zh)
ES (1) ES2829416T3 (zh)
HU (1) HUE052413T2 (zh)
IL (1) IL225718A (zh)
MX (1) MX340143B (zh)
RU (1) RU2013121577A (zh)
SG (1) SG189365A1 (zh)
UY (1) UY33668A (zh)
WO (1) WO2012049654A1 (zh)
ZA (1) ZA201302722B (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160083968A (ko) 2010-10-13 2016-07-12 텔레스타 쎄라퓨틱스 아이피 인크. 세균 리보핵산 세포벽 조성물 및 이들의 제조 및 사용 방법
US10434171B2 (en) 2016-12-23 2019-10-08 United States of America as Represented by Secretary of Agriculture Microfluidized Mycobacterium avium fragments as an adjuvant and carrier for mucosal vaccine delivery
US20200237904A1 (en) * 2017-01-26 2020-07-30 Immune Therapeutics Inc. Methods and Compositions Useful for Treating Cancer
KR102115468B1 (ko) * 2017-11-06 2020-05-26 서울대학교산학협력단 마이코박테리움 파라고르도네의 항암 면역치료법 용도
CN111000978B (zh) * 2019-11-22 2023-03-10 中山大学附属第五医院 Tlt-2在制备治疗结核病药物中的应用
CN112156719B (zh) * 2020-08-26 2022-02-22 夏文杰 一种两性糖脂生物表面活性剂及其制备方法
CN113341023B (zh) * 2021-06-30 2022-12-23 大连医科大学附属第一医院 一种基于液质联用的血清二氨基庚二酸的检测试剂盒及检测方法与应用
CN114958831A (zh) * 2022-06-30 2022-08-30 上海纳米技术及应用国家工程研究中心有限公司 一种难裂解细菌基因组dna提取方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5759554A (en) * 1993-01-29 1998-06-02 Vetrepharm, Inc. Immunostimulatory bacterial cell wall traction
CN1290171A (zh) * 1998-02-18 2001-04-04 比奥尼斯生命科学公司 用于治疗膀胱癌的组合物和方法

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5328989B2 (zh) * 1974-05-27 1978-08-17
US4744984A (en) * 1985-10-08 1988-05-17 Vetrepharm Research, Inc. Antiviral immunotherapeutic agent and preparation thereof
DE4422859C2 (de) * 1994-06-30 2000-10-05 Laves Arzneimittel Gmbh Wäßrige Zellextrakte aus Mykobacterien
AUPO359396A0 (en) * 1996-11-13 1996-12-05 Amrad Operations Pty. Limited A method of treatment and pharmaceutical compositions useful for same
BR9807917A (pt) * 1997-04-02 2000-02-22 Bioniche Inc Método para estimular o sistema imunológico de um animal a prevenir, tratar ou eliminar uma doença parasìtica ou protozoária
AU736450B2 (en) * 1997-08-05 2001-07-26 Bioniche Urology Ip Inc. Composition and method for regulating cell proliferation and cell death
JP4380922B2 (ja) * 1998-12-04 2009-12-09 バイオニケ ライフ サイエンシーズ インコーポレイテッド 化学療法の組成物及び方法
US6809081B1 (en) 1998-12-04 2004-10-26 Bioniche Life Sciences, Inc. Chemotherapeutic composition and method
WO2000033879A1 (en) 1998-12-04 2000-06-15 Bioniche Life Sciences Inc. Method for the treatment of inflammation
US6794368B1 (en) 1999-04-01 2004-09-21 Bioniche Life Sciences Inc. Composition and method for inducing apoptosis in prostate cancer cells
US6890541B1 (en) * 1999-07-23 2005-05-10 Bioniche Life Sciences, Inc. Method for enhancing production performance in an animal
NZ520312A (en) * 1999-12-28 2003-08-29 Bioniche Life Sciences Inc Hyaluronic acid in the treatment of cancer
UA79952C2 (en) * 2001-12-10 2007-08-10 Kabulesh Mafatlal Khamar MYCOBACTERIUM w APPLICATIONS FOR CANCER TREATMENT
KR20160083968A (ko) 2010-10-13 2016-07-12 텔레스타 쎄라퓨틱스 아이피 인크. 세균 리보핵산 세포벽 조성물 및 이들의 제조 및 사용 방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5759554A (en) * 1993-01-29 1998-06-02 Vetrepharm, Inc. Immunostimulatory bacterial cell wall traction
CN1290171A (zh) * 1998-02-18 2001-04-04 比奥尼斯生命科学公司 用于治疗膀胱癌的组合物和方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"The use of mycobacterial adjuvant-based agents for immunotherapy of cancer";J.M. Grangea 等;《Vaccine》;20080915;第26卷(第39期);第4984-4990页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN103354833A (zh) 2013-10-16
UY33668A (es) 2012-08-31
IL225718A0 (en) 2013-06-27
KR20160083968A (ko) 2016-07-12
US9044422B2 (en) 2015-06-02
AR083443A1 (es) 2013-02-27
MX340143B (es) 2016-06-28
US20130142828A1 (en) 2013-06-06
JP2014502256A (ja) 2014-01-30
CA2799442A1 (en) 2012-04-19
IL225718A (en) 2016-04-21
SG189365A1 (en) 2013-05-31
RU2013121577A (ru) 2014-11-20
AU2011315093A1 (en) 2013-01-10
US20160151475A1 (en) 2016-06-02
US9220765B2 (en) 2015-12-29
US9180176B2 (en) 2015-11-10
EP2571979B1 (en) 2020-06-24
CN105943559A (zh) 2016-09-21
CA2799442C (en) 2015-07-14
DK2571979T3 (da) 2020-09-28
EP2571979A4 (en) 2013-12-11
US20140322372A1 (en) 2014-10-30
US20140170189A1 (en) 2014-06-19
ZA201302722B (en) 2014-06-25
BR112013008727A2 (pt) 2016-06-28
MX2013004044A (es) 2013-08-15
US20150224183A1 (en) 2015-08-13
ES2829416T3 (es) 2021-05-31
KR20140031168A (ko) 2014-03-12
AU2011315093A8 (en) 2013-01-17
US9180177B2 (en) 2015-11-10
EP2571979A1 (en) 2013-03-27
AU2011315093B2 (en) 2013-10-17
JP6163425B2 (ja) 2017-07-12
HUE052413T2 (hu) 2021-04-28
WO2012049654A1 (en) 2012-04-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103354833B (zh) 细菌核糖核酸细胞壁组合物及其制备和使用方法
US11944657B2 (en) Agent for inducing interferon production containing lactic acid bacteria
CN105228450B (zh) 用于活化“干扰素基因刺激因子”-依赖性信号传导的组合物和方法
Doshi et al. Systemic nano-delivery of low-dose STING agonist targeted to CD103+ dendritic cells for cancer immunotherapy
JP2021518414A (ja) 細菌株を含む組成物
JP2018111695A (ja) がんの治療のためのワクチン及びワクチン有効性を増強するための組成物
KR20230145050A (ko) 세포외 소포체 제제
CN111481565A (zh) 戈氏副拟杆菌的脂多醣用于抑制发炎反应的医药组合物的用途
US20230372476A1 (en) Novel use of mycobacterium tuberculosis extract
Altaee et al. Evaluation for the cytotoxic Effect of exotoxin a produced by Pseudomonas aeruginosa on mice by using cytogenetic parameters
CN118185785A (zh) 一株短双歧杆菌及其应用
AU2013203806B2 (en) Vaccines for the treatment or prevention of cancer
KR101642776B1 (ko) 줄기세포를 포함하는 항생 조성물
Yamaoka et al. WS/PP-024b-11 Spatiotemporal regulation of heat shock protein 90-chaperoned self-DNA and CpG-oligodeoxynucleotide for type-I interferon induction via targeting to static early endosome Y. Tamura, K. Saito, K. Okuya, T. Torigoe, N. Sato. Sapporo Medical University School of Medicine, Sapporo, Japan
CN116867502A (zh) 细菌的固体剂型

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: Ontario, Canada

Applicant after: Tele Star therapy for intellectual property

Address before: Ontario, Canada

Applicant before: Bioniche Urology IP Inc.

COR Change of bibliographic data
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant